Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8⁺ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Summary

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8⁺ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Abstract

Potentiëring van het vermogen van de tumor-doden van CD8⁺ T cellen in tumoren, samen met hun efficiënte tumor infiltratie, is een essentieel element van succesvol immuuntherapie. Verschillende studies hebben aangegeven dat de tumor infiltreren myeloïde cellen (bijvoorbeeld suppressor myeloïde-afgeleide cellen (MDSCs) en tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs)) de cytotoxiciteit van CD8 onderdrukken⁺ T cellen in de tumor-communicatie, en dat gericht op deze regelgeving myeloïde cellen kunnen immuuntherapie verbeteren. Hier presenteren we een systeem van in-vitro-assay om immuun onderdrukkende effecten van monocytic-MDSCs en TAMs op het vermogen van de tumor-doden van CD8⁺ T cellen. Te dien einde, we eerst gekweekt naïef milt CD8⁺ T cellen met anti-CD3/CD28 activerend antilichamen in de aanwezigheid of afwezigheid van suppressor cellen en vervolgens gekweekt mede de pre-geactiveerde T-cellen met kanker doelcellen in aanwezigheid van een fluorogenic caspase-3 substraat. Fluorescentie van het substraat in kankercellen werd ontdekt door real-time fluorescentie microscopie als een indicator van T-cel-geïnduceerde tumor cel apoptosis. In deze test, wij met succes kan detecteren van de stijging van de tumor cel apoptosis door CD8⁺ T cellen en de onderdrukking door pre cultuur met TAMs of MDSCs. Deze functionele test is nuttig voor het onderzoeken van CD8⁺ T cel mechanismen van onderdrukking door de regulatoire myeloïde cellen en identificeren druggable doelstellingen te overwinnen via hoge throughput screening.

Introduction

Het is bekend dat CD8⁺ T cellen kunnen elimineren van tumorcellen wanneer zij hun volledige cytotoxiciteit uitoefenen. Na activering van de T cel receptor (TCR), CD8⁺ T cellen vermenigvuldigen en differentiëren in cytotoxische effector cellen. De uitgebreide en geactiveerde CD8⁺ T cellen afscheiden cytotoxische korrels, met inbegrip van Perforine en granzymes, die worden overgebracht naar de doelcellen en initiëren van diverse lytische trajecten zoals caspase-3 gemedieerde apoptosis¹. CD8⁺ T cellen kunnen ook veroorzaken tumor cel apoptosis door activering van receptoren op doelcellen, zoals receptoren voor Tumornecrosefactor-α (TNF-α), eerste apoptosis signaal ligand (FasL) of TNF-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL). Bovendien, de geactiveerde CD8⁺ T cellen afscheiden interferon-γ (IFN-γ) die kan onderdrukken tumor celproliferatie en verhogen van de gevoeligheid van de tumorcellen aan CD8⁺ T cellen via de up-verordening voor FasL receptor¹. Gezien het potentieel voor CD8⁺ T tumor doden vermogen, verschillende strategieën ter bevordering van hun cytotoxiciteit (bv, checkpoint remmers, kanker vaccinatie en adoptief overdracht van chimeer antigeen receptor (auto) T cellen uiten) zijn vastgesteld en getoond aanzienlijke therapeutische effecten op bepaalde soorten kanker². Echter accumuleren bewijs suggereert dat de tumor-infiltreren immuun zoals regulatoire T-cellen cellen, suppressor myeloïde-afgeleide cellen (MDSCs), en tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) CD8 onderdrukken kunnen⁺ T cel functies en werkzaamheid beperken van immuuntherapie^3,4,5. Ter verbetering van dergelijke immuuntherapie, het is belangrijk om te begrijpen hoe immuun suppressor cellen limiet CD8⁺ T cel cytotoxiciteit. De identificatie van CD8⁺ T cel zowel onderdrukking mechanismen als druggable doelstellingen te overwinnen, vergt de ontwikkeling en het gebruik van in-vitrotests.

De methode van de gouden standaard voor het meten van CD8⁺ T cel cytotoxiciteit is de chroom release assay waarin het vrijkomen van de radioactieve sonde (⁵¹Cr), uit target cellen die zijn lysed door CD8⁺ T cellen, is vastbesloten⁶. Deze bepaling heeft echter verscheidene nadelen met inbegrip van de relatief lage gevoeligheid, hoge achtergrond, onvermogen om te detecteren vroege apoptotic gebeurtenissen, gevaarlijke verwijdering problemen en beperkte compatibiliteit met geautomatiseerde liquid handling en detectie te ondersteunen hogere doorvoer toepassingen. Een andere gemeenschappelijke methode is stroom cytometrische analyses waarin apoptosis van doelcellen tumor wordt gedetecteerd door Annexine V⁷bindend. In deze test is het mogelijk om op te sporen van andere parameters zoals doel de dood van de cel met behulp van propidium jodide (PI) of 7-aminoactinomycin D (7-AAD) en effector cel activatie aangegeven door expressie van het CD107a of CD69, naast de apoptosis in de doelcellen⁷ . Deze test vereist echter grote aantallen suppressor cellen ten opzichte van de chroom release assay. Het vereist ook de detachement en het aggregatieniveau van aanhangend doelcellen en dit kan vertekening van de resultaten. Inderdaad, het Chroom release assay of flow cytometrische bepaling zijn niet algemeen wordt gebruikt om te onderzoeken suppressor cel effecten op T cel functies. In plaats daarvan, de meting van T-cel proliferatie aangegeven door verdunning van een fluorescente kleurstof (bv CFSE) vooraf geladen in T cellen wordt vaak gebruikt voor het evalueren van de remming van CD8⁺ functie van de T cel door suppressor cellen. Detectie van IFN-γ productie van gekweekte T cellen is een andere standaard methode om te evalueren van de effecten van de suppressor cellen op T-cel activatie^8,9. Nochtans, de resultaten van deze tests doen niet noodzakelijkerwijs correleren aan de doelcel doden vermogen van CD8⁺ T cellen.

Wij presenteren hier een alternatieve functionele test om effecten van suppressor cellen, met name de macrofagen in de gemetastaseerde tumoren, op de cytotoxiciteit van CD8⁺ T cellen. Deze methode bepaalt de cytotoxiciteit van CD8⁺ T cellen, vooraf gekweekt met of zonder de suppressor cellen in aanwezigheid van anti-CD3/CD28 activerend antilichamen, door het detecteren van tumor cel apoptosis, aangegeven door fluorescentie van een fluorogenic caspase-3 substraat met behulp van⁶ geautomatiseerd time-lapse microscopie (Figuur 1). Dit protocol heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere methoden; het vereist slechts een klein aantal cellen, mogelijk maakt detectie van de dood van de cel van de aanhangend tumor met hoge gevoeligheid, real-time effector-tot-streefpad interactie kan beeld en is vatbaar voor hoge throughput screening.

In dit protocol worden metastase-geassocieerde macrofagen (MAMs) en hun voorvader monocytic-MDSCs (M-MDSCs) geïsoleerd van uitgezaaide tumoren in muizen gebruikt als suppressor cellen. In muismodellen van uitgezaaide borstkanker, een aparte populatie van macrofagen gekenmerkt als F4/80^hoogLy6G^-CD11b^hogeLy6C^lage hoopt zich op in de longen met uitgezaaide tumoren. Deze macrofaag-bevolking is zelden gevonden in de normale Long en dus geroepen metastase-geassocieerde macrofagen (MAMs)¹⁰. In deze muismodellen, andere myeloïde cel bevolking, gedefinieerd als F4/80^hoogLy6G^-CD11b^hogeLy6C^hoge, ook accumuleert overwegend in de gemetastaseerde Long waar het leidt tot MAMs¹¹. Op basis van hun kenmerken, kunnen de CD11b^hogeLy6C^hoge MAM voorlopercellen M-MDSCs¹²vertegenwoordigen.

Protocol

Alle procedures waarbij muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met in licentie gegeven toestemming van UK Home Office (P526C60B3). Informatie over commerciële reagentia en apparatuur staan in de Tabel van materialen.

1. voorbereiding van de doelcellen die uitdrukking geven aan rood fluorescerende eiwit in hun kernen

1. Een doel muis kanker cellijn verkrijgen bij een geschikte voeding.
   Opmerking: In dit protocol, een zeer metastatische derivaat van E0771 muis borstklier tumor cellen (E0771-LG)¹³ gebruikt. Ouderlijke E0771 cellen zijn afkomstig uit C57BL/6 muizen¹⁴.
2. Ontdooien en onderhouden van een flacon van E0771-LG cellen met Dulbecco van bewerkt Eagles Medium (DMEM) met inbegrip van het foetale runderserum (FBS) 10% (v/v) in een cel cultuur incubator bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO₂.
   Opmerking: Het moet worden bevestigd dat cellen negatief voor mycoplasma zijn. Te dien einde cultuur E0771 cellen (of cellen te beproeven) voor 2-3 dagen zoals hierboven beschreven (bij gebrek aan antibiotica en Antimycotica), verzamelen 500 μL van kweekmedium. Centrifugeer het medium bij 12,419 x g gedurende 60 s te elimineren cel puin en Pipetteer supernatant in nieuwe buizen. Mycoplasma verontreiniging met behulp van een testkit verkrijgbare mycoplasma bepalen (Zie Tabel van materialen) en/of PCR¹⁵ volgens de instructies van de fabrikant.
3. Zaad 5 x 10³ E0771-LG cellen per putje in een 12-well plaat, en cultuur die de cellen met 10% (v/v) FBS-DMEM overnachting in een incubator bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO₂.
   Opmerking: Als het percentage van de proliferatie van de doelcellen laag is (populatieverdubbelingstijd groter dan 36 h), het aantal cellen kan worden verhoogd tot 1 x 10-⁴.
4. Het medium te vervangen door 1 mL 10% (v/v) FBS-DMEM met inbegrip van 10 μg/mL polybrene en voeg 25 μL van lentivirale deeltjes (1 x 10⁶ TU/mL) codering een nucleaire beperkt rood fluorescerende eiwit (mKate2, verwijzen naar de Tabel van de materialen).
5. Cultuur van de cellen gedurende 24 uur in een incubator bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO₂.
6. Het medium vervangen door 10% (v/v) FBS-DMEM en cultuur van de cellen gedurende 24-48 uur in een incubator bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO₂.
7. Het medium vervangen door 10% (v/v) FBS-DMEM met inbegrip van 1 μg/mL puromycin wanneer cellen beginnen te uiten rood fluorescerende eiwit, en cultuur van de cellen, totdat zij 80-90% heuvels zijn.
   Opmerking: Concentratie van puromycin zullen verschillend tussen doel celtypes en moet worden geoptimaliseerd met behulp van VN-transfected cellen.
8. Subcultuur de overlevende cellen voor 1-3 passages met 10% (v/v) FBS-DMEM met inbegrip van 1 μg/mL puromycin, en cryopreserve bestanden in een systeem voor opslag van vloeibare stikstof damp fase tot gebruik.

2. isolatie van suppressor cellen uit de tumoren in muizen

Opmerking: In dit protocol suppressor cellen (dat wil zeggen, MAMs en M-MDSCs) zijn geïsoleerd van de Long met gemetastaseerde tumoren opgericht door E0771-LG cellen. Voorwaarden voor weefsel dissociatie en sorteren van de cel moeten worden geoptimaliseerd om te isoleren van de cellen uit verschillende weefsels.

1. 1 x 10⁶ kankercellen (E0771-LG) injecteren in de ader van de staart van de syngeneic (C57BL/6), vrouwelijke, 7-10 week oude muizen.
2. Na 14 dagen, isoleren van de Long met gemetastaseerde tumoren en eencellige schorsingen uit de perfused longen via enzymatische spijsvertering als eerder beschreven¹¹te bereiden.
   Opmerking: Dit protocol, vier muizen worden geïnjecteerd met kankercellen en hun metastatische longen om te verkrijgen van voldoende suppressor cellen worden gecombineerd.
3. Incubeer de eencellige schorsingen met anti-muis CD16/CD32 antilichaam voor 30 min op ijs en vlek met fluorescerende antilichamen tegen CD45, F4/80, CD11b, Ly6C en Ly6G (Zie Tabel of Materials) voor een ander 30 min^{10,11 , 13}.
4. Wassen van de gekleurde cellen één keer met 1 mL PBS met 2% (g/v) bovien serumalbumine (BSA) en resuspendeer de pellet cel met 500-1000 μL van PBS met 2% (g/v) BSA.
5. Voeg 3 μM van DAPI, en sorteren van de M-MDSCs (DAPI^-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^-CD11b^hogeLy6C^hoge) en MAMs (DAPI^-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^-CD11b^hoog Ly6C^lage) met behulp van een cel sorter (aanvullende figuur 1).
   Opmerking: De drempel van Ly6C niveau te onderscheiden van MAMs (Ly6C^lage) en M-MDSCs (Ly6C^hoge) is gebaseerd op die van de ingezetene alveolaire macrofagen (RMAC). De zuiverheid van de gesorteerde cellen wordt gemeten via stroom cytometry met een verwachte zuiverheid van meer dan 90%.
6. Resuspendeer de gesorteerde cellen met 400 μL van DMEM met 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1% (v/v) niet-essentiële aminozuur, 1 mM natrium pyruvaat, en 50 nM 2-mercaptoethanol (genaamd verrijkt-DMEM, E-DMEM).
7. Het aantal levende cellen met behulp van de Trypan blauwe uitsluiting methode¹⁶ en aan te passen aan 2 x 10⁶ cellen/mL met E-DMEM.
8. De cellen in de ijskast houden tot gebruik.

3. isolatie van CD8⁺ T cellen van de milt van muizen

1. Isoleren van de milt van een muis die is syngeneic aan de doelgroep kanker cellijn (dat wil zeggen, C57BL/6 muizen in dit protocol) als volgt:
   1. Het dier euthanaseren CO₂ inademing.
   2. Plaats het dier op een schone dissectie-bord en veeg de huid met 70% (v/v) ethanol.
   3. Snijd de buikhuid schaar met bloot van de milt
   4. Isoleren van de milt, die inferieur aan de maag ligt, en plaats deze in een buis met 5 mL ijskoud PBS.
2. Met behulp van de innerlijke zuiger van de spuit van een steriele 5 mL, slijpen de milt op een 100 μm cel zeef instellen voor een tube van 50 mL.
3. De cellen passeren door het filter door middel van totale 10 mL PBS.
4. Centrifugeer de celsuspensie bij 337 x g gedurende 5 minuten, en het supernatant gecombineerd.
5. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS met 2 mM EDTA en 0,5% (w/v) BSA (uitgevoerd buffer) en filtreer door een zeef van de cel 40 μm.
6. Levende cellen tellen en aan te passen aan 1 x 10⁸ cellen/mL met behulp van de lopende buffer.
   Opmerking: Houd een kleine hoeveelheid van cellen als een pre verrijking monster voor een zuiverheid check.
7. Verrijken voor CD8⁺ T cellen met behulp van een negatieve selectie kit en een magnetische sorter (Zie Tabel van materialen).
   1. 1 x 10⁸ (1 mL) van de splenocytes cellen naar een polystyreen ronde-bodem-tube van 5 mL overbrengen.
   2. Voeg 50 l van biotinyleerd antilichamen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
   3. Voeg 125 μL van daar geconjugeerd magnetische kralen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   4. Voeg 1.325 mL van het runnen van de buffer, en zachtjes Meng door pipetteren.
   5. Plaats de buis in de magneet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2,5 minuten.
   6. De magneet halen, en giet de verrijkte celsuspensie in een nieuwe buis.
8. Resuspendeer de verrijkte cellen met 200 μL van E-DMEM (dwz., DMEM met 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1% (v/v) niet-essentiële aminozuur, 1 mM natrium pyruvaat en 50 nM 2-mercaptoethanol).
9. Het aantal levende cellen tellen en aan te passen aan 2 x 10⁶ cellen/mL met E-DMEM. Houd de cellen bij 37 ° C in een CO₂ incubator tot gebruik.
   Opmerking: Houd een kleine hoeveelheid van cellen als een monster na verrijking voor een zuiverheid check.
10. Bepalen van de zuiverheid van CD8⁺ T cellen door stroom cytometry als volgt:
    1. 1 x 10⁴ cellen uit pre verrijking (stap 3.6) of na verrijking (stap 3.9) monsters nemen en totale volume van elk 100 μl met lopende buffer aanpassen.
    2. Incubeer de eencellige schorsingen met anti-muis CD16/CD32 antilichaam voor 30 min op ijs en vlek met fluorescerende antilichamen tegen CD45, CD3 CD4 en CD8 (Zie Tabel of Materials) voor een ander 30 min.
    3. Wassen van de gekleurde cellen met 500 μL van PBS met 2% (g/v) BSA en resuspendeer de pellet cel met 500-1000 μL van PBS met 2% (g/v) BSA.
11. Toevoegen van 3 μM van DAPI en bepalen van het percentage van CD3⁺CD4^-CD8⁺ cellen in de totale CD45⁺ cel bevolking.

4. de activering en de uitbreiding van de geïsoleerde CD8⁺ T cellen

1. Aliquot 1 x 10⁵ cellen per 50 μl CD8⁺ T cellen (bereid in stap 3.9) in putjes van een U-onder 96-wells-plaat.
2. 1 x 10⁵ cellen per 50 μl suppressor cellen (bereid in stap 2.7) toevoegen of 50 μl van E-DMEM in de putjes.
3. Activering medium dat uit E-DMEM, 4 x 10⁴ U/mL kolonie-stimulerende factor 1 (CSF-1), 240 U/mL interleukin-2 (IL-2), 8 μg/mL anti-muis CD3ε antilichaam en 16 μg/mL anti-muis CD28 antilichaam bestaat voor te bereiden.
   Opmerking: CSF-1 is niet vereist voor T-cel activatie, maar is essentieel voor overleving van suppressor cellen in dit protocol (dat wil zeggen, MAMs en M-MDSCs). Dus, het wordt bewaard in de co cultuur van T-cellen met doel kankercellen om redenen van consistentie in de cultuuromstandigheden. Aangezien CSF-1 is gevonden in nano-molar concentraties in alle weefsels en vereist voor monocyt/macrofaag levensvatbaarheid in vivo is, is dit een fysiologische context voor deze cellen.
4. Voeg 50 l van activering medium (stap 4.3) en 50 μl van E-DMEM met of zonder reagentia te beproeven.
5. Plaats de plaat in een incubator bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO₂ en cultuur van de cellen voor 4 dagen.

5. setup van co cultuur van target cellen met pre-geactiveerde CD8⁺ T cellen

1. Voeg 30 μL van 1:100 verdunde groeifactor verminderde oplosbare kelder membraan matrix (Tabel van materialen) in de putjes van 96-wells-plaat van platte bodem geschikt voor microscopie en Incubeer bij 37 ° C in een CO₂ incubator voor ten minste 1 uur.
2. Doelcellen (dat wil zeggen, E0771-LG cellen uiten van nucleaire-beperkte rood fluorescerende eiwit) voor te bereiden.
   1. Incubeer de doelcellen met 1 mL 0,05% trypsine/EDTA bij kamertemperatuur voor 1 min en oogsten van de cellen door zachte pipetteren.
   2. Voeg 9 mL DMEM met inbegrip van 10% (v/v) FBS, en centrifugeren van de celsuspensie bij 337 x g gedurende 5 min.
   3. Resuspendeer de cellen met 500 μL van E-DMEM, en het aantal levende cellen.
      Opmerking: Voordat het tellen van de doelcellen, filtreer de cellen door een 40μm cel zeef tot één celsuspensie.
   4. De dichtheid aan 2 x 10⁴ cellen/mL (= 1 x 10³ cellen per 50 μl) aanpassen door het toevoegen van E-DMEM, en houden van de cellen op het ijs.
3. Bereiden effector cellen (dat wil zeggen, pre-geactiveerde CD8⁺ T cellen).
   1. Resuspendeer de cellen in een put van 96-wells-plaat (stap 4.5) grondig door pipetteren en overdracht de zwevende CD8⁺ T cellen in een nieuwe 1,5 mL-buis.
      Opmerking: MAMs en M-MDSCs strak houden naar de waterput en niet door de pipetteren losgekoppeld.
   2. Verzamelen van de resterende cellen, voeg 200 μL van PBS in de put en Pipetteer in de buis in stap 5.3.1.
   3. De cellen met 1 mL E-DMEM eens (centrifuge op 337 x g) gedurende 5 minuten wassen, gecombineerd en wordt weggeworpen) en resuspendeer hen met 100 μl van E-DMEM.
   4. Het aantal levende cellen (met behulp van de methode trypan blauwe uitsluiting), aanpassen van de dichtheid aan 1.6 x 10⁵ cellen/mL (= 4 x 10³ cellen/25 μL) en houden van de cellen op het ijs.
4. De kelder membraan matrix van elk putje van de plaat in stap 5.1 gecombineerd.
5. 1 x 10³ cellen/50 μl van doelcellen (stap 5.2.4) Voeg in ieder putje en meng goed.
   Opmerking: Voorkom randeffecten als gevolg van verdamping van medium, alleen de binnenste 60 putten van de 96 goed plaat moet worden gebruikt voor analyse.
6. Voeg toe 25 μL van E-DMEM met inbegrip van de 4 x 10³ U/mL IL-2 en 10 μM fluorogenic caspase-3 substraat (Zie Tabel van materialen).
7. 4 x 10³ cellen/25 μL van CD8 toevoegen⁺ T cellen (stap 5.3.4) in geval van putten en meng goed.
   Opmerking: De aanwezigheid van te veel cellen in een put bemoeilijkt de analyse. In dit model, een effector 4:1: doel verhouding (totale cel nummer 5 x 10³ cellen per putje) was optimaal, maar een 8:1-verhouding was suboptimaal. Putten met de volgende vier besturingselementen nodig zijn om te helpen met data-analyse: target cellen bij de dichtheid gebruikt voor de co cultuur putten (1 x 10³ cellen per putje) in medium met en zonder caspase-3 substraat, effector cellen (1 x 10³ cellen / goed) in medium met en zonder caspase-3 substraat.
8. Voeg 200 μL van PBS of steriel water in alle lege putjes (met name wells aan de rand van de plaat) ter vermindering van de verdamping van medium uit experimentele putten.
9. Zet de plaat in een time-lapse fluorescentie Microscoop die wordt bijgehouden op 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO₂.
   Opmerking: Schud de plaat in een kruis-patroon om alle cellen te verdelen, en laat de plaat blijven bij kamertemperatuur op een vlakke ondergrond voor 10-20 min voordat de overdracht naar de incubator.

6. beeldvorming van de cellen

Opmerking: Gedetailleerde afbeeldingsinstellingen overname zal verschillen met de Microscoop en fluorophores gebruikt; de volgende algemene acquisitie-parameters moeten worden gebruikt voor een optimaal resultaat.

1. Met behulp van een passende autofocus routine op de Microscoop, verwerven beelden die betrekking hebben op ten minste 25% van de totale oppervlakte in elk experimentele putje van de 96-wells-plaat.
2. Instellen van de Microscoop te verwerven van de beelden in fase contrast, alsmede een fluorescerende kanaal geschikt voor de nucleaire-beperkte rode fluorescente proteïne (mKate2) en een fluorescerende kanaal geschikt voor de groene fluorogenic geactiveerd caspase-3 substraat (met excitatie op 488 nm) (Figuur 2).
3. Opnamen in experimentele putten in fase contrast en de 2 tl kanalen elke 1 tot en met 3 h voor ten minste 72 uur.

7. de beeldanalyse met behulp van de software van de analyse van de afbeelding

Opmerking: Gedetailleerde analyse afbeeldingsinstellingen zal verschillen met de software die wordt gebruikt (Zie Tabel van materialen); de volgende algemene analyse-procedures moeten worden gebruikt voor een optimaal resultaat.

1. Bepalen of spectrale un-mengen is nodig om te scheiden van de fluorescent signaal dat wordt uitgezonden door target celkernen van die uitgestoten door apoptotic kernen en indien nodig, instellen van een analyse-protocol hiervoor;
   1. Weergave van een besturingselement goed waarin enige doelcellen (mkate2-label) in medium zonder caspase-3 substraat in het groene, fluorescerende kanaal.
   2. Observeren of groene fluorescentie is wordt uitgestoten door de rode kernen (kernen verschijnen groen)
   3. Als groene fluorescentie herkenbaar in de kernen is, de spectrale unmixing toegangscontrole in de beeldbewerkingssoftware en verhoging van het percentage van rode verwijderd van groen tot het groene signaal verdwijnt (in onze ervaring, dit is meestal 6-7% voor lichte mKate2 fluorescentie).
   4. Als groene fluorescentie niet herkenbaar in alle kernen is, is geen spectrale randverwijdering noodzakelijk.
      Opmerking: Deze spectrale unmixing correctie test kan ook worden uitgevoerd met behulp van een putje van doelcellen in medium dat caspase-3 substraat. Er is echter meestal een zeer laag niveau van spontane apoptosis in doelcellen (minder dan 10%), wat resulteert in een paar doel celkernen groene fluorescentie als gevolg van de activering van caspase-3 in plaats van fluorescentie afloopgebied via uitstoten. Ware fluorescentie bloeden door blijkt onder deze omstandigheden wanneer groene fluorescentie herkenbaar in alle kernen is.
   5. Een besturingselement putje met enige effector cellen (kernen ongelabelde) afzonderlijk in medium zonder caspase-3 substraat in het rode en groene kanaal weergeven.
   6. Observeren of ofwel groen of rood fluorescentie is wordt uitgestoten door de kernen. Als rode noch groene fluorescentie herkenbaar in de afzonderlijke kanalen is geen spectrale randverwijdering noodzakelijk.
      Opmerking: In onze ervaring, de muis CD8⁺ T cellen zijn niet auto-belichting fluorescerende en dus geen spectrale randverwijdering is noodzakelijk voor deze cellen. Deze spectrale unmixing correctie test kan ook worden uitgevoerd met behulp van een putje van effector cellen in medium dat caspase-3 substraat. Er is echter meestal enige mate van spontane apoptosis resulteert in effector celkernen uitstoten groene fluorescentie als gevolg van de activering van caspase-3. Ware fluorescentie bloeden door blijkt onder deze omstandigheden wanneer groene fluorescentie herkenbaar in alle kernen is.
2. Gebruik een fluorescentie achtergrond aftrekken methode (bijvoorbeeld TopHat), met relevante parameters voor de steekproef te lossen de fluorescerende objecten in beide TL kanalen.
   Opmerking: In het groene kanaal gebruikten we TopHat (kernen straal = 10.0 µm, groene fluorescentie drempel = 0.7 groene kalibratie-eenheden). In het rode kanaal gebruikten we TopHat (kernen straal = 10.0 µm, rode fluorescentie drempel = 0.5 rode kalibratie-eenheden).
3. Passende parameters gebruiken voor het splitsen van de rand op te lossen van individuele fluorescerende kernen.
   Opmerking: Wij gebruikten geen rand splitsen in het groene of rode fluorescentie-kanaal.
4. Afbeeldingen gebruiken in het rode kanaal de putjes met alleen de doelcellen (met caspase substraat) om te bepalen van de minimale omvang van doelgroep kernen.
   Opmerking: We 80 µm²gebruikt.
5. Gebruik afbeeldingen in het groene kanaal de putjes met alleen effector cellen (met caspase substraat) om te bepalen van de gemiddelde grootte van apoptotic effector kernen.
   Opmerking: Single apoptotic effector kernen varieerden van 40-80 µm² in deze experimenten.
6. Een analyseprocedure instellen om te tellen het aantal fluorescerende doel celkernen met behulp van een geschikte minimale grootte beperking (bijv. minimumoppervlakte, minimale diameter) (Figuur 2, Doelmasker detectie).
   Opmerking: We gebruikten een minimale kernen gebied (rode fluorescentie) = 80 µm².
7. Een analyseprocedure instellen om te tellen van het aantal apoptotic kernen die groter dan de gemiddelde omvang van apoptotic effector kernen (Figuur 2, grootte beperkt apoptosis masker zijn).
   Opmerking: Grootte filter is ingesteld op 80 µm² (dat wil zeggen, alleen gebieden van groene fluorescentie groter is dan deze werden geteld, aldus met uitzondering van enkele apoptotic effector kernen). Het gebruik van deze parameters verhoogt de nauwkeurigheid van de analyse in het tellen van apoptotic doel celkernen, hoewel sommige aggregaten van apoptotic effector cellen kunnen worden geteld.
8. Een analyseprocedure te tellen van het aantal apoptotic doelcellen door het tellen van de kernen instellen waar rood fluorescerende signaal (uit stap 7.6) en grootte-beperkte groen fluorescent signaal (uit stap 7.7) aanzienlijk mede lokaliseren (Figuur 2, R /G overlapping masker).
   Opmerking: Een passende co lokalisatie kan variëren van 30% tot 100% van de gemiddelde omvang van doelgroep kernen. Overlapping grootte filter is ingesteld op 40 µm².
9. Bepaal het aantal apoptotic doel celkernen alsmede het aantal doel celkernen in de putten voor elke experimentele voorwaarde in de loop van de hele tijd.

8. de data-analyse met behulp van de berekening en grafische software

1. Grafiek van het aantal apoptotic doel celkernen verkregen in stap 7,9 in de loop van de hele tijd voor de experimentele putten. Als meerdere wells werden gebruikt voor elke experimentele voorwaarde, grafisch presenteren de resultaten zoals bedoel ± standaardafwijking.
2. De apoptotic deel van de bevolking van doelcellen berekenen door het aantal apoptotic cellen in elk putje door het nummer van de doelcellen in elk putje op elk tijdstip te delen.
3. Grafiek van de resultaten verkregen in stap 8.2.
4. Het gebied onder de curve (AUC) voor elke curve te bepalen. De piek apoptotic deel van de bevolking voor elke kromme kan ook worden vastgesteld alsmede het tijdstip waartegen de piek optreedt, indien gewenst. Bepalen of de AUC bepaald voor de experimentele omstandigheden verschillen aanzienlijk met behulp van passende statistische proeven.
   Opmerking: De ongepaarde t-test met Welch's correctie werd toegepast op de resultaten van de AUC.

Representative Results

Deze methode is gebaseerd op eenvoudige co cultuur van doel kankercellen met effector CD8⁺ T cellen die vooraf hebben zijn gekweekt met of zonder suppressor cellen in aanwezigheid van anti-CD3/CD28 activerend antilichamen. Het detecteert CD8⁺ T-cel-geïnduceerde kanker cel apoptosis na verloop van tijd na co cultuur, waardoor de evaluatie van de effecten van de suppressor cellen op de cytotoxiciteit van CD8⁺ T cellen.

Normaal gesproken kankercellen verhogen groene fluorescentie in hun kernen na activering van een nucleaire-targeting caspase biosensor wanneer deze cellen maken contact met CD8⁺ T cellen die vooraf worden geactiveerd door antilichamen bij gebrek aan suppressor cellen () Figuur 3; Aanvullende film 1). Groene fluorescentie van het caspase-substraat was aantoonbaar voor ten minste 15 h na apoptosis werd ingeleid. Sommige spontane apoptosis van effector CD8⁺ T cellen ook na verloop van tijd werd waargenomen, zelfs als deze cellen werden gekweekt in isolatie (Figuur 4; Aanvullende film 2). Echter kernen maten van CD8⁺ T cellen zijn kleiner dan die van kankercellen en dus apoptotic 'effector' cellen kunnen worden uitgesloten van apoptotic 'target' cel telt door een grootte beeld analyse beperkingsmethode (Figuur 2 en Figuur 4). Hoewel sommige kankercellen doel een kleine afgeronde vorm zonder groene fluorescentie tonen, dit heeft geen invloed op de analyse zoals deze cellen mitose in plaats van apoptosis (aanvullende film 3) ondergaan, en dus worden uitgesloten van apoptotic 'target' graven van de cel door een rood/groene overlapping masker (aanvullende figuur 2). Spontane apoptosis van doelcellen kanker komt af en toe ook in de interne cultuur (aanvullende film 3). Echter, de co cultuur van doel kanker cellen met pre-geactiveerde CD8⁺ T cellen verhoogde tumor cel apoptosis boven de niveaus van spontane apoptosis in monocultuur van kankercellen (Figuur 4). In het algemeen, als u met een optimale verhouding van doel kankercellen effector cellen, een piek in het aantal apoptotic doel kankercellen kan worden waargenomen (figuur 5A). Deze piek is duidelijker bij de gegevens is uitgedrukt in de apoptotic breuk van de doelpopulatie cel (figuur 5B). In dit experiment bedroeg de basale apoptosis van doelcellen van de tumor in 24 h (= 0,08 met apoptotic Fractie), maar CD8⁺ T-cel-veroorzaakte apoptosis bereikt een maximumgehalte om 17u (met apoptotic fractie = 0,66).

Verder vonden we dat CD8⁺ T cellen vooraf geïncubeerd met MAMs of M-MDSCs kon maken contact met target kankercellen maar deze contactpersoon leek te resulteren in minder gevallen van kanker cel apoptosis in vergelijking met CD8⁺ T cellen vooraf geactiveerd zonder suppressor cellen (Figuur 3 en Figuur 4; Aanvullende Movie 4 en aanvullende Movie 5). Hoewel de CD8⁺ T cellen vooraf geïncubeerd met de myeloïde cellen af en toe veroorzaakt kanker cel apoptosis, was er ook sommige verspreiding van de kankercellen van het doel, die niet hebben zijn gestimuleerd om te ondergaan van apoptosis in de tijdsverloop van de experiment (aanvullende film 6). In overeenstemming met deze bevindingen, de Fractie van de piek van apoptotic kankercellen gekweekt met CD8⁺ T cellen vooraf geïncubeerd met myeloïde cellen (apoptotic breuk = 0.38 om 23u voor MDSC-E en 0,25 om 20u voor MAM-E) was aanzienlijk lager dan die van kankercellen gekweekte met CD8⁺ T cellen die waren niet vooraf bebroede met de suppressor cellen (Figuur 6).

Figuur 1: een schema met de experimentele procedure. Naïef milt CD8⁺ T cellen worden gekweekt met anti-CD3/CD28 activerend antilichamen met of zonder metastase-geassocieerde macrofagen (MAMs) of suppressor monocytic-myeloïde-afgeleide cellen (M-MDSCs). Na 4 dagen, drijvende CD8⁺ T cellen worden verzameld en samen met kanker doelcellen in aanwezigheid van fluorogenic caspase-3 substraat gekweekt. Apoptotic kankercellen worden gedetecteerd onder real-time fluorescentie microscopie. Beelden getoond werden verkregen met behulp van een levende cel-imaging platform (Zie Tabel van materialen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: identificatie van apoptotic doelcellen onderscheiden van apoptotic effector cellen. Bovenste rij: Beeldacquisitie in het rode kanaal maakt de identificatie van doel celkernen doordat detectie Doelmasker (roze analyse masker). Middelste rij: afbeeldingen die zijn verworven in het groene kanaal geven aan apoptotic effector en target cellen. Asize beperkt apoptosis masker (teal analyse maskeren; meer dan 80 µm²) kunnen enkel apoptotic effector cellen worden uitgesloten van de analyse. Onderste rij: samengestelde afbeeldingen samengevoegde rode en groene kanalen met fase contrast afbeelding (links) of rood/groen overlappen masker (rechts). Identificatie van mede gelokaliseerde, grootte-beperkte groene fluorescentie met rode fluorescentie (gele analyse masker), kunnen meer nauwkeurige detectie van apoptotic doel kernen (gele pijlpunt) met uitzondering van aggregaten van apoptotic effector cellen (wit pijlpunten). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Interactie tussen CD8⁺ T cellen en kankercellen. Stills uit representatieve time-lapse films van E0771-LG_NLR doelcellen (T) mede gekweekt met effector CD8⁺ T cellen (E) bij effector/doel 4:1 verhouding. MDSC-E en MAM-E geven effector cellen vooraf geïncubeerd met M-MDSCs en MAMs respectievelijk. Samengestelde afbeeldingen (inclusief afbeeldingen uit fase contrast, rode en groene kanalen) worden weergegeven. Pijlpunten zijn het bijhouden van de dezelfde cellen via de verschillende velden en tijd punten. Gele pijlpunten: een doel dat koppelt met effectoren en ondergaat apoptosis, witte pijlpunten: een doel dat is gekoppeld aan de effectoren maar geen apoptosis ondergaan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: detectie van apoptotic kankercellen. Representatieve velden time-lapse films op 18 h na imaging is onttrokken. Samengestelde afbeeldingen (links; fase contrast, rode en groene kanalen) en beelden van de rode kanaal zonder (midden) of met (rechts) rood/groen overlapping masker (geel) worden weergegeven. Gele stippen in de rechterkolom vertegenwoordigen apoptotic kankercellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: CD8⁺ T-cel-geïnduceerde kanker cel apoptosis. (A) aantal apoptotic kankercellen gekweekte met effector C8⁺ T cellen op verschillende effector doel/ratio (E:T). de Apoptotic (B) breuk van cel doelpopulatie. Gegevens zijn middelen ± SD. Mean gebied onder de curve (AUC) wordt ook weergegeven. Ongepaarde t-test met Welch's correctie werd gebruikt voor het analyseren van de AUC. * P < 0,0001 in vergelijking met E:T = 0:1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: Effecten van tumor-infiltreren myeloïde cellen op de cytotoxiciteit van CD8⁺ T cellen. (A) aantal-apoptotic kankercellen (doel: T) gekweekt met C8⁺ T cellen (effector: E) bij 4:1 verhouding van de E:T. CD8⁺ T cellen waren vooraf gekweekt bij afwezigheid (zwarte cirkel) of aanwezigheid van suppressor monocytic-myeloïde-afgeleide cellen (MDSC-E: blauwe cirkel) of metastase-geassocieerde macrofagen (MAM-E: rode cirkel). Gegevens zijn middelen ± Apoptotic SD. (B) breuk van cel doelpopulatie. Gegevens zijn middelen ± SD. bedoel AUC ook blijkt. Ongepaarde t-test met Welch's correctie werd gebruikt voor het analyseren van de AUC. * P < 0,0001 t.o.v. T alleen, ^#P < 0,0001 in vergelijking met E + T. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1. Gating strategie te isoleren van de suppressor cellen uit de uitgezaaide longkanker. (A) representatieve dot percelen te isoleren monocytic myeloïde afkomstige suppressor cellen (M-MDSCs) en metastase-geassocieerde macrofagen (MAMs). De drempel van Ly6C niveau te onderscheiden van MAMs (Ly6C^lage) en M-MDSCs (Ly6C^hoge) is gebaseerd op die van de ingezetene alveolaire macrofagen (RMAC). (B) zuiverheid van de gesorteerde M-MDSCs (CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^hoge) en MAMs (CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^laag). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Beelden van de vertegenwoordiger van de mitotische doelcellen. Stills uit representatieve time-lapse films van mono-cultuur van de cel van target E0771-LG_NLR. Top: samengestelde afbeeldingen met inbegrip van beelden uit fase contrast, rode en groene kanalen. Bodem: samengestelde afbeeldingen (rode en groene kanalen) met rood/groene overlappen masker. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3. Effecten van tumor-infiltreren myeloïde cellen op de proliferatie van CD8⁺ T cellen. (A) representatieve histogrammen tonen verdunning van fluorescerende labelen met CFSE in CD8⁺ T cellen. Naïef milt CD8⁺ T cellen werden geïsoleerd zoals beschreven in het Protocol-3 en gemarkeerd met 5 µM van CFSE bij 37 ° C gedurende 15 minuten. De gelabelde T-cellen werden gekweekt in aanwezigheid van de IL-2 en anti-CD3/CD28 antilichamen met of zonder myeloïde cellen activeren, zoals wordt beschreven in het Protocol 4. Na 4 dagen, werd groene fluorescentie in T-cellen ontdekt door stroom cytometer. (B) divisie index van CD8⁺ T cellen berekend als eerder beschreven¹⁷. Gegevens zijn middelen ± SEM. * P < 0,01 in vergelijking tot controle, ^#P < 0.05 αCD3/CD28 Ab. t.o.v. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 1. Film van de cijfers 3 en 4; E + T. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 2. Film van de cijfers 3 en 4; Effector (E). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 3. Film van de cijfers 3 en 4; Doel (T). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 4. Film van de cijfers 3 en 4; MDSC-E + T. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 5. Film van de cijfers 3 en 4; MAM-E + T. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 6. Film van de cijfers 3 en 4; MAM-E + T (proliferatie). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Deze methode is gebaseerd op twee stappen van de afzonderlijke co cultuur: samen kweken CD8⁺ T cellen met potentiële suppressor cellen, en mede het kweken van de 'vooraf geconditioneerde' CD8⁺ T cellen met tumor doelcellen (Figuur 1). De eerste stap van de co cultuur is vrij gelijkaardig aan die voor CD8⁺ T cel proliferatie testen vaak gebruikt om te bepalen van het effect van de suppressor cellen op CD8⁺ T cel functie. T-celproliferatie is echter niet altijd met hun cytotoxiciteit correleren. Bijvoorbeeld, we hebben gevonden die mede cultuur met M-MDSCs of MAMs verhoogd in plaats van verminderde proliferatie van CD8⁺ T cellen in aanwezigheid van CD3/CD28 activeren van antilichamen (aanvullende figuur 3), overwegende dat deze vooraf geconditioneerd CD8⁺ T-cellen aangetoond verminderd cytotoxiciteit tegen kanker doelcellen (Figuur 4en Figuur 5, Figuur 6). Deze resultaten wijzen op het belang van de evaluatie van de functionele activiteit, blijkt uit doel kanker cel apoptosis, aangeboden door deze CD8⁺ T cel cytotoxiciteit assay.

In deze test, hebben we vastgesteld dat CD8⁺ T cellen ongeveer 15 h van co cultuur nodig induceren maximale apoptosis van E0771-LG muis borstklier tumorcellen (Figuur 5). Deze vertraging zou kunnen te wijten zijn aan de lag tussen eerste contact effector cellen met de doelstellingen en de begeleidende immuun synaps formatie, evenals de tijd die nodig is voor het opwekken van apoptotic signalen in doelstellingen zoals gemeten door activering van caspase-3 (aanvullende film 1 ). Wij ook vastgesteld dat het aantal apoptotic tumorcellen bereikt een plateau na 24 h, die waarschijnlijk te wijten aan de eliminatie van doelstellingen door T cellen en/of verlies van fluorescent signaal uit dode cellen is. Dit vermogen om te identificeren van de tijd van piek apoptosis is een groot voordeel van deze test sinds bepaling van een optimale tijdstip belangrijk voor de juiste vergelijkingen tussen verschillende omstandigheden is. In ons geval bijvoorbeeld het verschil in cytotoxiciteit tussen controle CD8⁺ T cellen en MDSC/MAM-opgeleid CD8⁺ T cellen was veel groter bij 15-18 h ten opzichte van 72 h (Figuur 5), en dus een eindpunt experimenteren met behulp van een incubatietijd van 72 h misleidende resultaten zou opleveren.

Met deze methode kan ook visualisatie van real-time effector-to-target cel interactie, die zou zorgen voor meer inzicht in het mechanisme dat ten grondslag liggen aan de beperkte cytotoxiciteit van CD8⁺ T cellen vooraf geïncubeerd met suppressor cellen. Bijvoorbeeld, we merkten op dat CD8⁺ T cellen vooraf geïncubeerd met M-MDSCs of MAMs ondervonden en interactie met de doelgroep tumorcellen maar nog altijd geen apoptosis (aanvullende film 4, aanvullende film 5, aanvullende film 6) deed veroorzaken. Hoewel we dit evenement niet kwantificeren hebben, zou het haalbaar en interessant zijn om te kwantificeren en het aandeel van ontmoetingen en hun interactie tijd in correlatie met apoptose inductie te vergelijken. Een ander groot voordeel is dat deze methode een klein aantal cellen (bijvoorbeeld 1 x 10³ van doel) en 4 x 10,³ effector cellen per putje vereist. In feite, kan dit protocol worden verder verkleind voor de indeling van 384-well plaat indien gewenst. Daarom is deze test geschikt voor hoge throughput screening en experimenten waar cel nummers zijn beperkt, zoals in vitro testen met behulp van kostbare cellen afkomstig van in vivo of ex vivo monsters.

Aan de andere kant, is een beperking van de huidige bepaling de aanwezigheid van aanzienlijke aantallen dode effector cellen in sommige omstandigheden. Teneinde de nauwkeurigheid in apoptosis van doel kankercellen onderscheiden van die van effector CD8⁺ T cellen, de kernen van target cellen worden aangeduid en een beperking van de grootte (dat uitsluit effector cellen) wordt toegepast voor de analyse van de gegevens in deze kernen assay (Figuur 2). Er zijn echter enkele gevallen waar de overlay van aggregaten van (groen) apoptotic CD8⁺ T cellen op niet-apoptotic doel kankercellen, die de resultaten kunnen verwarren. Deze beperking kan worden verzacht door gebruik van een kolom van de verwijdering dode cel in effector cellen voorafgaand aan samen cultuur met doelcellen van tumor, uitgaande van voldoende aantallen effector cellen beschikbaar zijn. Met meer complexe systemen, microscopie, het ook mogelijk om de valse positieve signaal door het labelen van de effector CD8⁺ T cellen met een verschillend van de celkernen van het doel en het substraat fluorogenic caspase-3 fluorophore.

Tot nu toe, dit protocol is gebruikt voor het onderzoek naar de antigeen aspecifieke activatie van CD8⁺ T cellen. Hoewel MDSCs en TAMs in de tumor communicatie T cel functies door middel van antigeen aspecifieke mechanismen onderdrukken, onderdrukken MDSCs in de perifere lymfoïde weefsels T cel reacties in een antigeen specifieke wijze¹⁸. Om te onderzoeken immuun onderdrukkende functies van dergelijke celtypes, een proliferatie van in vitro-assay met behulp van CD8⁺ T cellen van OT-1 transgene muizen wordt vaak gebruikt. In deze test, de OT-1 T-cellen (ovoalbumine (OVA) specifieke T cel receptor uitdrukken) worden mede gekweekt met suppressor MDSCs in aanwezigheid van eicellen peptides, die geldt voor de eerste cultuur in onze cytotoxiciteit assay (dwz., activering van T cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van suppressors). Het is ook mogelijk om te manipuleren van de kankercellen van de doelstelling om uit te drukken van eicellen, die ertoe van antigeen-specifieke kanker cel doden door OT-1 T-cellen bewegen kunnen. De bepaling kan dus ook onderzoek naar de MAM/MDSC-gemedieerde onderdrukking van antigeen-specifieke T cel activatie. Het is ook mogelijk om te passen de assay voor het onderzoek naar menselijke cellen, zoals activering antilichamen tegen menselijke CD3 en CD28 commercieel beschikbaar zijn, en een protocol bij het isoleren van de menselijke TAMs van klinische monsters gevestigde¹⁹.

Collectief, deze test is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de cytotoxiciteit van andere immuun celtypes. Op dit moment in onze laboratoria, het te onderzoeken antigeen-afhankelijke cel cytotoxiciteit onder verschillende omstandigheden wordt uitgebreid en is ook ontwikkeld voor hoge doorvoer screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA (1X)	Gibco	25300-054
12-Well Cell Culture Plate	Freiner Bio-One	665-180
1x PBS	Gibco	14190-094
2-mercaptethanol	Sigma	M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube	FALCON	352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )	Costar	3799	Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom)	Nunc	165305	Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody	BIO-RAD	MCA497A647	Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody	Biolegend	100730	Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody	Biolegend	102111	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody	Biolegend	100314	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100236	Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody	Biolegend	128026	Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
Bovine Serum Albmin	Sigma	A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon)	FALCON	352360	To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon)	FALCON	352340	To filter the lung digestion
DAPI	Biolegend	422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium	Gibco	41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit	StemCell Technologies	19853
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100406	Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use	Gibco	A1596-01	Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent	Essen BioScience	4476	Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience		Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A	Essen BioScience		Analysis software
L-Glutamine (100X)	Gibco	A2916801
Lung Dissociation Kit	Miltenyi	130-095-927	Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
Non-essential amino acid (100X)	Gibco	11140-035
NucView488	Biotium	10403	Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127607	Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101216	Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
Pen Strep	Gibco	15140-122	Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103132	Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma	H9268
Puromycin	Gibco	A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301
Recombinant murine IL-2	Peprotech	212-12	Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X)	Gibco	11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	101320
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)  : Green channel excitation: 440 - 480 nm  : Green channel emission: 504 - 544 nm  : Red channel excitation: 565-605 nm  : Red channel emission: 625 - 705 nm