Summary
توضح هذه المقالة طريقة قوية تحديد حجم الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في الخلايا الحية. مزيج الأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي ضد علامات السطح يسمح التحديد الكمي لهذه العضيات في الخلايا المختلطة السكان، مثل الخلايا الابتدائية تحصد من عينات الأنسجة، باستخدام قياس التدفق متعدد الألوان.
Abstract
خلايا T الاستفادة من البرامج الأيضية المختلفة لتتناسب مع احتياجاتها الوظيفية خلال التمايز وانتشارها. الميتوكوندريا عناصر حاسمة الخلوية المسؤولة عن إمداد الطاقة الخلية؛ ومع ذلك، تنتج الميتوكوندريا الزائدة أيضا أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي يمكن أن تتسبب في موت الخلايا. ولذلك، يجب تعديل عدد الميتوكوندريا باستمرار لتناسب احتياجات الخلايا. ويتحقق هذا التنظيم الحيوي في الجزء من خلال وظيفة lysosomes إزالة الفائض/تلف العضيات والجزيئات. ومن ثم، محتويات mitochondrial وتعويض الخلوية مؤشرات أساسية لتقييم التكيف الأيضي للخلايا. مع تطور التحقيقات العضيات، يحلول تتسم جيدا أو الأصباغ الميتوكوندريا على حدة قد أصبحت متاحة في أشكال مختلفة لتسمية lysosomes الخلوية والميتوكوندريا. قياس التدفق متعدد الألوان هي أداة مشتركة لتعمل الخلية الشخصية، ولديها القدرة على أن تكون متكاملة مع فحوصات أخرى. نقدم هنا، على بروتوكول مفصلة لكيفية الجمع بين الأصباغ عضية على حدة مع السطح علامات تلطيخ لقياس مقدار lysosomes والميتوكوندريا في السكان مختلفة تي خلية على سيتوميتير تدفق.
Introduction
التنشيط وتكاثر الخلايا T خطوات حاسمة لتركيب الاستجابات المناعية ناجحة. التقدم الذي أحرز مؤخرا تشير إلى أن الأيض الخلوية يرتبط محكم مع كل من التنمية ووظائف خلايا تي. على سبيل المثال، خلايا السذاجة تي تعتمد إلى حد كبير على الفسفرة (أوكسفوس) لتلبية الطلب على الطاقة خلال تداولها فيما بين الأجهزة اللمفاوية الثانوية. عند التنشيط، الخضوع السذاجة تي خلايا جذرية الأيضية إعادة البرمجة، بما في ذلك تنظيم دورات تعريفية لتحلل الهوائية لزيادة إنتاج ATP والوفاء بمطالب الأيضية هائلة خلال تمايز الخلايا وانتشارها. الخلايا التي لا تتبع من خلال احتياجات الأيضية يموت قبل المبرمج1،2. أثناء إعادة برمجة التمثيل الغذائي، الميتوكوندريا دوراً هاما نظراً لأنهم العضيات مسؤولة إلى حد كبير عن إنتاج ATP إمداد الطاقة للخلية، ومحتوى الميتوكوندريا الخلوية يتقلب أثناء تبديل التمثيل الغذائي في جميع أنحاء تي خلية التنمية والتنشيط3. ومع ذلك، يمكن أن تنتج تراكم الميتوكوندريا زائدة عن الحاجة أو التالفة روس الزائدة التي تضر الدهون والبروتينات والحمض النووي، ويمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى الخلية الموت4
تتم إزالة الميتوكوندريا المفرطة أو التالفة الناتجة عن التغيرات الاستقلابية بشكل متخصصة من أوتوفاجي5، المعروفة باسم ميتوفاجي. الميتوكوندريا هي ملفوفة أوتوفاجوسوميس وتنصهر ثم مع lysosomes للتدهور. إغلاق هذه الاتصالات بين الميتوكوندريا و lysosomes أثارت اهتمام كبير6،7. على سبيل المثال، يحفز الأكسدة الميتوكوندريا شكل حويصلات المستمدة من الميتوكوندريا (مدفس) التي تستهدف lysosomes للتدهور في homolog الفوسفاتيز وتنزين (فتن)-التي يسببها كيناز المفترضة 1 (PINK1) وباركين (E3 ubiquitin ليجاسى) تعتمد طريقة8. ووجد أيضا أن ميتوفاجي أمر ضروري للانتقال adipocyte بيج إلى الأبيض9،10. الأهم من ذلك، ليسوسوميس ليست مجرد حجرة تدهور، ولكن أيضا منظم للإشارات الخلوية. تراكم الركازة المفرطة الناجمة عن نقص إنزيم ينتج خلل الليزوزومية بتعطيل نفاذية غشاء الليزوزومية ويؤثر على Ca2 + التوازن11. خلية T العيوب الفنية في lipase حمض الليزوزومية (ال)12 أو المستقلب الليزوزومية الناقل خروج المغلوب الماوس نموذج13 كما أظهرت أهمية lysosomes في الحفاظ على التوازن خلية تي. الميتوكوندريا و lysosomes جزء لا يتجزأ من تنظيم الأيض الخلوية. ولذلك كان قياس محتوى المتقدرية الخلوية هي مؤشر حاسم لتقييم وضع الخلية تي الأيضية والوظيفية.
وتشمل فحوصات استخداماً لقياس محتويات المتقدرية أو الليزوزومية الخلوية immunoblot والمجهر الإلكتروني وتلطيخ (إذا كان) إيمونوفلوريسسينت وتحليل PCR mitochondrial DNA نسخ الأرقام14،15، 16. بينما يمكن مقارنة immunoblot كمياً مستويات البروتين عبر عينات مختلفة والالكترون، أو إذا كان الفحص المجهري يمكن أن تصور المورفولوجية السمات المميزة لهذه العضيات17، هذه فحوصات تحمل بعض العيوب التقنية. على سبيل المثال، أنها تستغرق وقتاً طويلاً للحصول على عدد كاف من الصور خلية مع تضخم عالية والقرار أو لمقارنة مستويات البروتين التعبير عبر العشرات من عينات، مما يجعل هذه الاختبارات تعتبر أساليب إنتاجية منخفضة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الاختبارات فقط للسكان خلية متجانسة، مثل خطوط الخلية، ولكن ليس لعينات الأنسجة التي تتكون من السكان مختلطة.
من الصعب أيضا أن تطبيق هذه الاختبارات على السكان النادرة، التي أرقام شرط الحد الأدنى من خلية من 106 إلى 108 من المستحيل أن تجتمع. وأخيراً، عادة تفكيك الخلايا أو ثابتة أثناء العملية، وجعلها متوافقة مع أساليب أخرى لاستخراج مزيد من المعلومات. مقارنة بالطرق التقليدية، قد فلوري-على أساس التدفق الخلوي إنتاجية عالية نسبيا-يمكن تحليل المعلومات من كافة الخلايا داخل عينة مؤلفة من الخلايا المختلطة السكان والتي جمعت في وقت واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء الكشف عن أكثر من 10 معلمات في نفس الخلية وفرز الخلايا استناداً إلى تعمل المطلوب لفحوصات إضافية. وقد استخدمت لتسمية lysosomes والميتوكوندريا في الخلايا الحية المسابير الفلورسنت رد الفعل ويمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي18،19. هذه المجسات الخاصة عضية الخلية نفاذية والخصائص الفيزيائية-الكيميائية التي تسمح لهم بأن تتركز في أماكن محددة سوبسيلولار أو العضيات. مريح، تتوفر هذه التحقيقات في مختلف صيغ الفلورسنت، مما يمكن تطبيقها لتحليل متعدد الألوان.
هذا البروتوكول ويصف بالتفصيل كيفية الجمع بين سطح علامة التلوين بالأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة لتسمية lysosomes أو يعيش الميتوكوندريا في الخلايا. وهذا مفيد بشكل خاص لعينات المتولدة من الابتدائي الأنسجة والأعضاء، التي تتكون غالباً من سكان الخلية غير متجانسة. يمكن تحديد السكان خلية من اهتمام بتعبيرها ماركر السطحية الباحثين وعلى وجه التحديد قياس محتويات الليزوزومية أو الميتوكوندريا عن طريق الأصباغ عضية على حدة في هذه الخلايا. هنا، علينا أن نظهر الإجراءات المفصلة لتحليل تدفق سيتوميتريك أن يقيم كتلة الليزوزومية أو الميتوكوندريا في الجمهرات الفرعية الرئيسية الخلية تي الطحال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ماوس الأنسجة الحصاد الإجراء الموضح هنا قد أقرها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة يانغ مينغ الوطنية.
1-إعداد تعليق اللمفاويات من الأجهزة اللمفاوية
- Euthanize الماوس بطريقة معتمدة مثل استنشاق أول أكسيد الكربون2 في دائرة اكريليك شفافة تليها التفكك عنق الرحم التأكد من الوفاة.
ملاحظة: الاحتفاظ بمعدل تدفق CO2 لتشريد 20% في الدقيقة الواحدة من الدائرة، ولا يزيد عن 5 رطل/بوصة مربعة (رطل لكل بوصة مربعة). يستغرق 2-3 دقيقة لماوس ليفقد وعيه. الإبقاء على تدفق2 CO على الأقل 1 دقيقة بعد توقف الحيوان في التنفس (5-7 دقيقة عموما). - ضع الماوس على ظهرها على متنها نظيفة (مثل لوحة بلاستيكية البوليستيرين) وإصلاح أطرافه مع الشريط. شطف مع الإيثانول 70%.
- لحصاد الطحال، قص وفتح تجويف البطن مع مقص تشريح 11-سم (الطحال أسفل المعدة وفوق الكلية اليسرى). إزالة الطحال بالملقط ونظيفة من الأنسجة الضامة (استخدام المقص إذا لزم الأمر).
- حصاد الغدة الصعترية، قطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري من كلا الجانبين مع تشريح المقص. استخدام الملقط لرفع القص لتكشف عن كامل تجويف الصدر. فصل الغدة الصعترية بعناية من المحيطة الأنسجة مع مقص، وإزالة أي بقايا النسيج الضام على منشفة ورقية ترطب مع برنامج تلفزيوني.
- ميكانيكيا ننأى بالانسجة مع المكبس حقنه في طبق 6-سم يحتوي على 5 مل المثلج نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1 مم يدتا). نقل تعليق خلية واحدة إلى أنبوب 15 مل الطرد مركزي؛ أغسل الطبق 6-سم مع المخزن المؤقت الإضافي 2 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية والجمع بين الغسيل مع تعليق خلية كذلك.
- الطرد المركزي من تعليق خلية (300 x ز، لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية. إعادة تعليق بيليه مع 2 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACK) ليسينج المخزن المؤقت (155 ملم NH4Cl، 10 مم كهكو3 و 0.1 ملم Na2يدتا) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) خلايا الدم الحمراء. تحييد المخزن المؤقت ACK بإضافة 10 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت إلى تعليق خلية.
- الطرد المركزي من تعليق خلية (300 x ز، لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية. تعليق إعادة الخلايا في 5 مل من إكمال ربمي المتوسطة (المتوسط RPMI 1640، تستكمل مع 44 مم ناكو3، 10 ملم 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس)، 100 يو/مليلتر البنسلين، ستربتوميسين 100 ملغ/مل، 2 مم L-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم، الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 1% و 10% FBS).
- تعليق خلية التصفية من خلال مصفاة خلية (المسام حجم 70 ميكرومتر) لإزالة كتل الخلية. حساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية.
2-التحديد الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس
ملاحظة: إجراء الصبغة الخاصة عضية تلطيخ أولاً لأن الشرط المصبوغة الأمثل لهذه الأصباغ الحضانة عند 37 درجة مئوية. تلطيخ العلامة السطحية يمكن إلى حد كبير تخفيض بسبب وضع سقف للأجسام المضادة والاستيعاب في أن درجة الحرارة.
- إضافة 1 × 106 خلايا الجولة-أسفل أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية والطرد المركزي خلايا (300 x ز، لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية.
- تمييع التحقيق والحلول الأسهم لتركيز العمل النهائي (100 نانومتر الأخضر ميتوتراكير أو ليسوتراكير الخضراء؛ من الآن فصاعدا صبغ الميتوكوندريا أو يحلول محددة، على التوالي) في المتوسطة ثقافة خالية من المصل قبل حرارة 37 درجة مئوية. وهذا حل عملي لصبغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة.
ملاحظة: اختبار تركيزات متعددة بما في ذلك العامل التركيزات التي اقترحتها الشركة المصنعة (20-200 نانومتر لصبغ الميتوكوندريا على حدة) وشمال البحر الأبيض المتوسط 50-75 لصبغ يحلول المحددة المستخدمة هنا من أجل الحصول على أفضل تلطيخ الكفاءة. اختر عدد سكانها خلية ومن المعروف أن التعبير الجيد لتلطيخ المستهدفة (مثل ليسوسوميس) كمراقبة إيجابية (مثل CD14 البشرية+ وحيدات). اختر تركيز العمل استناداً إلى فصل جيدة بين السلبية والإيجابية تلطيخ، فضلا عن صلاحية خلية جيدة. - ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من يحلول أو الميتوكوندريا محددة صبغ حل عملي واحتضان في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو 30 دقيقة، على التوالي.
- أضف 1 مل من المثلج المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لوقف رد الفعل. بيليه الخلايا بالطرد المركزي (300 x ز، لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية. خلايا جاهزة الآن لتلطيخ العلامة السطحية.
3-السطحية علامة تلطيخ
- مستقبلات Fc كتلة مع 100 ميليلتر من قبل معاير هيبريدوما 2.4G2 طافية على الجليد للخلايا الغسيل 10 دقيقة مع 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وأجهزة الطرد المركزي (300 x ز، لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
- احتضان الخلايا مع 50 ميليلتر جسم مترافق fluorescence معاير قبل تركيبة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية على الجليد لتجنب الضوء 20 دقيقة.
ملاحظة: إعداد الخلايا المفردة الملطخة بالألوان التي تشمل جميع الأجسام المضادة الفلورية الموجودة في جسم التعامل فقط مع صبغ عضية على حدة لتحديد الفولتية كل الأسفار الكاشف وتعويض التكيف على تدفق تركيبة والخلايا سيتوميتير. وبالمثل، يعد Fluorescence ناقص واحد (FMO) كعناصر أساسية باستخدام الخلايا الملون مع جميع الأجسام المضادة، ولكن دون تلطيخ مع الأصباغ عضية على حدة. - غسل الخلايا بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وبيليه بالطرد المركزي (300 x ز، لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت الذي يحتوي على يوديد propidium ميكروغرام/ملليلتر 1 (PI) وتحليل العينات في تدفق سيتوميتير فورا.
4-نموذج جمع في تدفق سيتوميتير
- قم بتشغيل الكمبيوتر وأي أجهزة أخرى التبعي اعتماداً على منصة آلة cytometer تدفق، البرامج اقتناء نظام مراقبة الأصول الميدانية. قم بتشغيل برنامج تلفزيوني لمدة حوالي 1 دقيقة لضمان خط تدفق مليء ببرنامج تلفزيوني وغمد المخزن المؤقت. تأكد من أن تدفق تيار يعمل بسلاسة.
- فتح التجربة الجديدة وحدد المعلمات cytometer (الفلورية كاشفات) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تصفية الخلايا عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر ودوامه قبل الحصول على كل عينة لتجنب كتل ويبنوا تشكيل.
- جعل المؤامرات دوت المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC)، التي تمثل حجم الخلية والتفاصيل، على التوالي. تحسين الفولتية منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب للتأكد من أن تظهر الخلايا ذات الاهتمام في المؤامرات. جعل المؤامرات دوت منتدى التعاون الأمني-أ مقابل منتدى التعاون الأمني-W (أو منتدى التعاون الأمني-H) ورسم بوابة للخلايا المفردة.
- جعل دوت قطع كل معلمة الفلورسنت. استخدام خلايا أونستينيد لتحديد الإشارات الخلفية واستخدام عناصر تحكم مفردة الملطخة بالألوان لضبط الفولتية لكل معلمة الفلورسنت، حيث أن السكان خلية الإيجابية والسلبية يمكن تمييزها الواضح وداخل النطاق الديناميكي لاقتناء.
- بعد أن يتم تعيين جميع الفولتية، استخدام السيارات-تعويض إذا كان متوفراً، أو يدوياً ضبط التعويض مع ضوابط ملطخة باللون أونستينيد وواحدة لتصحيح آثار الطيفية. تطبيق التعويض للعينات.
- جعل مؤامرة نقطة لكل معلمة ورسم غيتس وفقا لمجموعة التجريبية الخاصة بك. على سبيل المثال، منتدى التعاون الأمني-أ مقابل منتدى التعاون الأمني-ح (أو منتدى التعاون الأمني-W) استبعاد doublets، تليها منتدى التعاون الأمني، مقابل SSC-أ اللمفاويات النابضة؛ بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل PI (الخلايا الحية) وخلايا CD4 مقابل CD8 (الشكل 1).
- جمع ما يكفي الأحداث (عدد الخلايا الإجمالي) لمقارنة ذات مغزى بين السكان. عادة، تحتاج الأحداث 1,000 على الأقل في عدد سكان الفائدة الحصول على20.
- بعد أن يتم الحصول على جميع العينات، تصدير تدفق البيانات يتم تحليلها بواسطة برمجيات تحليل التدفق الخلوي. حفظ التجربة كقالب المحافظة على الإعداد سيتوميتير والمعلمات لتطبيق تجارب مماثلة في المستقبل.
5-بيانات التحليل
ملاحظة: هناك العديد من الأدوات لتحليل تدفق سيتوميتريك البيانات، والبرمجيات التجارية والحرة على حد سواء. يمكن أيضا عمل برامج اكتساب من سيتوميتيرس تدفق لتحليل البيانات. هنا استخدمنا فلوجو كمثال.
- بدء تشغيل البرنامج واسحب الملفات FCS إلى مساحة العمل. انقر فوق نموذج لفتح نافذة رسم. حدد المعلمات لتقديمها على المحور X و Y بالنقر على المحاور X و Y. استخدم شريط الأدوات رسم غيتس وفقا لعلامات أعرب خلطات أو تعمل محددة من السكان الخلية.
- إضافة بوابات لكل معلمة كما هو مبين في الشكل 1. اسحب البوابات لجميع العينات في مساحة العمل، بحيث أنها تحصل على مطابقة النابضة.
- اسحب القطع إلى محرر تخطيط لإنشاء تقارير رسومية.
- عرض كثافة fluorescence يعني (MFI) لكل السكان من اهتمام بالنقر فوق الزر إحصائيات (Σ) في إطار رسم واختيار "تعني" والمعلمة المناسبة، على سبيل المثال، القناة المستخدمة للكشف عن صبغ عضية على حدة. ثم انقر فوق "إضافة".
- انقر على أيقونة محرر الجدول واسحب مؤسسة مونتانيار لمحرر الجدول لإنشاء تقارير إحصائية. حفظ كملف Excel أو نص أو CSV لحساب دلتا "مؤسسة مونتانيار" (ΔMFI) كمؤسسة مونتانيار (الأصباغ عضية على حدة)-"مؤسسة مونتانيار" (FMO).
ملاحظة: لا تحسب مؤسسة مونتانيار بين العينات المكتسبة مع سيتوميتير مختلفة الإعدادات (الفولتية أو قنوات الفلورسنت أو التعويض). مقارنات بين القيم المستمدة من التجارب باستخدام إعدادات مختلفة بلا معنى ومتحيزة. - تصدير كافة القيم من مساحة العمل وقطع من محرر تخطيط لجعل الجداول والأرقام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد مجموعات فرعية رئيسية تي الخلية في الطحال والغدة الصعترية
وباختصار، تعليق خلية مفردة من الطحال والغدة الصعترية تم تفكيك خلايا الدم الحمراء، المحتضنة مع المادة طافية 2.4G2، متبوعاً بصبغة محددة عضية وعلامة السطحية تلطيخ مع الأجسام المضادة مترافق الفلورية (الجدول 1). يمكن وصف التقدم التنموي من الثيموسيه باستخدام الأجسام المضادة لمستقبلات المشارك CD8 و CD4. لا تعبر عن خلايا CD4 أو CD8 الثيموسيه آخر غير ناضجة وتسمى النفي المزدوج (DN). ثم متابعة تنظيم خلايا CD4 و CD8 وتصبح إيجابية مزدوجة (DP). وأخيراً، أنها أسفل-تنظيم CD4 أو CD8 وتصبح ناضجة الإيجابية (SP) خلايا مفردة استعداد لترك الجهاز. المراحل الأولى من التنمية الخلية T، عندما لا تعبر الخلايا مستقبلات المشارك CD4 و CD8، يمكن كذلك تصنيف على أساس التعبير CD44 و CD25. هي موروث أقرب CD44+ CD25– (DN1)، وبعد ذلك البدء في الإعراب عن CD25 وتصبح CD44+CD25+ (DN2) الخلايا. وبعد ذلك، أسفل-تنظيم CD44 الخلايا وتصبح CD44–CD25+ (DN3) الخلايا، وأخيراً، أنها لأسفل-تنظيم CD25، فضلا عن أن تصبح CD44–CD25– الخلايا (DN4) التي في طريقها إلى التعبير عن خلايا CD4 و CD8، وأصبحت مزدوج-إيجابية الخلايا (DP).
في الطحال، يمكن تقسيم الخلايا T إلى CD8 السامة للخلايا+ ومساعد CD4+ تي الخلايا. كل من هذه المجموعات السكانية يمكن تقسيمها إلى مجموعات فرعية من السذاجة، والمستجيب، والذاكرة على أساس CD62L و CD44 كذلك تلطيخ. ويرد في الشكل 1استراتيجية مفصلة النابضة.
التحديد الكمي لكتلة الميتوكوندريا في مجموعات فرعية مختلفة تي الخلية
واستخدمت الأصباغ الميتوكوندريا على حدة لقياس كميات الميتوكوندريا في الخلية تي السكان. وجدنا أن محتويات المتقدرية كانت الأدنى في DN1، وبلغت ذروتها في DN2-DN3، وثم قليلاً تراجع في نمو DN4 و DP وكانت أكثر انخفاضا في نمو خلايا CD4 و CD8 ليرة سورية (الشكل 2أ). بيد أن نمو خلايا CD4 أو CD8 س الميتوكوندريا أعلى تلطيخ مؤسسة مونتانيار من خلايا CD4 أو CD8 تي الطحال (الشكل 2ب). هذه الملاحظات تشير إلى أن محتوى المتقدرية يتقلب أثناء تطوير خلية T مع نمو غير ناضجة تحتوي على الميتوكوندريا أكثر مما يفعل نظراؤهم ناضجة، والخلايا T من السذاجة أن أوافيكم بالدم الغني بالأكسجين حتى أقل كتلة المتقدرية. من المثير للاهتمام، هذا الحد من محتويات المتقدرية كان أكثر بروزا في CD8 من نسب CD4 T (الشكل 2ب)، وتنشيط الخلية تي كذلك انخفض فإنه. بين تنشيط خلايا تي، خلايا CD4+ خلايا الذاكرة T قد الميتوكوندريا أكثر قليلاً بالمقارنة مع المستجيبة؛ ومع ذلك، كان العكس الحال بالنسبة CD8+ تي الخلايا: CD8+ خلايا الذاكرة T كان أدنى كتلة المتقدرية بين مجموعات فرعية كل خلية T (الشكل 2ب).
قياس محتوى الليزوزومية في مختلف الفئات السكانية الفرعية للخلايا T
استخدام صبغة يحلول محددة، لاحظنا منخفضة نسبيا، لكن لا يمكن اكتشافها، الليزوزومية محتويات كل خلية T السكان، مع وجود أكثر بروزا من lysosomes في DN1 الثيموسيه (الشكل 3أ). لم يوجد أي اختلاف كبير بين المجموعات ثيموسيتي من DN1 فصاعدا. في المحيط، تم العثور على عدد كبير نسبيا من lysosomes في الذاكرة والمستجيب CD8+ تي الخلايا. هذه الظاهرة ما يتفق مع الدراسات السابقة تبين أن تنشيط CD8+ تي الخلايا زيادة التعبير عنها من غشاء الليزوزومية المرتبطة بالبروتين 1 (مصباح-1)21،22، مما يعكس حيازتها حبيبات الليزوزومية-السامة للخلايا (الشكل 3ب)
الشكل 1 : النابضة استراتيجية الخلايا اللمفية الطحال والثيموسيه. وكانت الزنزانات بوابات مسبقاً في منتدى التعاون الأمني/SSC وبي– للحصول على نوع الحية. (أ) نمو إجمالي من الفئران كانت ملطخة CD4، CD8، CD44، و CD25. واستخدمت تعبيرات CD4 و CD8 لتمييز خلايا CD4+CD8– SP، وخلايا CD4–CD8+ SP، خلايا CD4+CD8+ موانئ دبي، وخلايا CD4–CD8– DN مجموعات فرعية. CD4–CD8– DN فرعية أخرى قسمت إلى CD44+CD25– DN1، CD44+CD25+ DN2، CD44–CD25+ DN3، و CD44–CD25– DN4 الفئات السكانية الفرعية. (ب) كانت ملطخة سبلينوسيتيس مجموع من الفئران في TCRβ وخلايا CD4، CD8, CD44 و CD62L. تم فصل الخلايا TCRβ+ إلى خلايا CD4+ و CD8+ تي الخلايا التي قسمت أيضا إلى السذاجة (CD44–CD62L+)، الذاكرة (CD44+CD62L+)، والمستجيب (CD44+CD62L -) والسكان. تمثل النتائج ثلاث تجارب مستقلة مع n = 3-4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الممثل رسوم بيانية تظهر الميتوكوندريا تلطيخ كل سكان الخلية. الخلايا كانت ملطخة بصبغ الميتوكوندريا على حدة لمدة 15 دقيقة في ˚C 37، متبوعاً بعلامة السطحية تلطيخ. كان اكتسبها cytometer تدفق إشارة الفلورسنت الخلايا الملون وتحليلها على. (أ) الميتوكوندريا تلطيخ من نمو DN و DP. (ب) الميتوكوندريا تلطيخ الثيموسيه CD4SP و CD8SP والطحال تي خلية من السكان. ΔMFI = مؤسسة مونتانيار (الميتوكوندريا تلطيخ)-"مؤسسة مونتانيار" (FMO). يمثل الخط الأحمر الخالص الميتوكوندريا تلطيخ، يظهر الخط الأزرق الصلبة التحكم FMO، وخط أحمر متقطع fluorescence متوسط كثافة الميتوكوندريا تلطيخ في كل السكان. تمثل النتائج ثلاث تجارب مستقلة مع n = 3-4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الممثل رسوم بيانية تبين يحلول تلطيخ في الخلايا اللمفية الطحال والثيموسيه. الخلايا كانت ملطخة بصبغ يحلول محددة لمدة 30 دقيقة في ˚C 37، متبوعاً بعلامة السطحية تلطيخ. كان اكتسبها cytometer تدفق إشارة الفلورسنت الخلايا الملون وتحليلها. (أ) يحلول تلطيخ من نمو DN و DP. (ب) يحلول تلطيخ الثيموسيه CD4SP و CD8SP والطحال تي خلية من السكان. ΔMFI = مؤسسة مونتانيار (تلطيخ يحلول)-"مؤسسة مونتانيار" (FMO). يمثل الخط الأخضر الخالص يحلول تلطيخ، يظهر الخط الأزرق الخالص FMO، وخط أحمر متقطع fluorescence متوسط كثافة يحلول تلطيخ في كل السكان. تمثل النتائج تجربة واحدة مع n = 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: تصاميم لوحة قياس التدفق متعدد الألوان- يتم هنا سرد فلوروتشرومي وتركيز الأصباغ الأجسام المضادة/عضية في الخلائط المصبوغة. من المستحسن بشدة تيتراتي واختبار كل جسم عند إعداد جديدة تلوين لوحات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يجمع هذا البروتوكول الأصباغ عضية على حدة وعلامة السطحية تلطيخ لتحديد مقدار الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في السكان مختلفة تي الخلية. تم تطوير هذا الأسلوب للتغلب على الحد متطلبات الخلية عدد والتجانس للأساليب التقليدية، مثل الميكروسكوب الإلكتروني وتحليل إيمونوبلوت. أنها مفيدة بشكل خاص في تحليل الخلية نادرة السكان، ودراسة أنواع خلايا متعددة في وقت واحد في نفس الوقت.
مدة الإجراءات، ودرجة حرارة الحضانة هي أهم العوامل في هذا البروتوكول. وسم عضية السليم يتطلب معايرة دقيقة من الأصباغ عضية على حدة. ينبغي أيضا إبقاء الخلايا على الجليد لتعزيز استمرارية وتجنب وضع سقف للأجسام المضادة واستيعاب تماما. وباﻹضافة إلى ذلك، الأسفار من هذه الأصباغ عضية على حدة عرضه لتغيرات درجات الحرارة والتعرض الخفيفة. وهكذا، تحليل العينات بمجرد اكتمال الإجراء المصبوغة الفوري مهم جداً. كنا دائماً قادرة على استكمال التجربة كلها خلال ساعتين.
نظراً لهذا البروتوكول يعتمد على القدرة على الكشف عن الأسفار متعدد الألوان بتدفق سيتوميتير لتقييم عناصر داخل الخلايا، الحصول على الإعدادات (مثل الفولتية PMT) وتعويض الأطياف تتداخل (امتداد الأسفار إلى القنوات المجاورة) يمكن أن تؤثر بشدة على شدة الإشارة. هذا ذات الصلة وبخاصة عند زيادة العلامات السطحية اللازمة للتعرف على أنواع الخلايا ذات الصلة أعلاه ستة. في هذه الحالة، يصبح خبرة في تصميم متعدد الألوان التدفق الخلوي تجارب هامة جداً للحصول على بيانات عالية الجودة.
الجهاز المناعي يحمي الجسم من الشتائم مسببات الأمراض والإصابات، وتنشيط خلية T له دور محوري في توفير إشارات أساسية للخلايا المناعية الأخرى. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن السكان مختلفة تي خلية البرامج الأيضية فريدة من نوعها، ومحتويات mitochondrial وتعويض مؤشرات حاسمة للتغيرات الاستقلابية. ومع ذلك، أن هذه الظاهرة ليست فريدة من نوعها للخلايا T. التمايز، وتنشيط خلايا المناعة الفطرية، مثل بلعم والخلايا الجذعية، ترتبط أيضا عن كثب على حالة ايضية23،24. وميزة هذا البروتوكول أنه يمكن تكييفها لدراسة السكان خلية أي اهتمام باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات خاصة بالنسب. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع سائر الأصباغ عضية على حدة، مثل معرف ER أو الخلوي، لديه القدرة على تقييم مختلف العضيات أو مقصورات الهاتف الخلوي في أنواع مختلفة من الخلايا.
إنشاء هذه الميتوكوندريا أو يحلول الأسلوب الكمي ليس فقط مفيداً لدراسة الأيض في خلايا تي، ولكن أيضا لديها إمكانات كبيرة للاستفادة من البحوث التي تركز على التغيرات الاستقلابية في إعدادات الأمراض، مثل السرطان أو أمراض المناعة الذاتية،من2526.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.
Acknowledgments
وأيد وضع هذا البروتوكول المنح التي تقدمها "تايوان وزارة العلوم" والتكنولوجيا (معظم) NSC103-2320-B-010-002-MY2 و MOST104-2628-B-010-002-MY4 إلى هسو البنود. وي C.W. مستلم "ممتازة أطروحة جائزة من معهد لعلم الأحياء الدقيقة" وعلم المناعة، جامعة يانغ مينغ الوطنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
