Summary
מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.
Abstract
תאי T לנצל תוכניות מטבוליות שונות כדי להתאים לצרכיהם תפקודית במהלך התמיינות והתפשטות. המיטוכונדריה הם רכיבים חיוניים הסלולר אחראית לאספקת אנרגיה תא; עם זאת, המיטוכונדריה עודף גם מייצרים מינים חמצן תגובתי (ROS) שעלולה לגרום מוות של תאים. לכן, ומספר המיטוכונדריה עליך להתאימם כל הזמן להתאים את הצרכים של התאים. תקנה דינמית זו מושגת באופן חלקי באמצעות הפונקציה של lysosomes להסיר את עודף/פגום organelles ו מקרומולקולות. לפיכך, תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי, lysosomal הם מחווני מפתח להערכת ההתאמה חילוף החומרים של התאים. עם התפתחות זונדי organelles, ליזוזום מאופיין היטב או צבע ספציפי המיטוכונדריה הפכו זמינים בפורמטים שונים כדי להדביק תווית lysosomes הסלולר ועל המיטוכונדריה. Cytometry זרימה ססגוניות הוא כלי נפוץ פרופיל תא פנוטיפים, יש לו את היכולת להיות משולב עם מבחני אחרים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד לשלב צבעים ספציפיים אברון עם סמנים משטח מכתים כדי למדוד את כמות lysosomes של המיטוכונדריה באוכלוסיות שונות תא T על cytometer זרימה.
Introduction
הפעלת ושגשוגם של תאי T הם שלבים קריטיים להרכבת תגובות חיסוניות מוצלחת. התפתחויות אחרונות מראים כי החומרים הסלולר קשורה באופן הדוק פיתוח והן פונקציות של תאי T. לדוגמה, תאים נאיביים T מסתמכים בעיקר על זרחון חמצוני (OXPHOS) את הביקוש אנרגיה במהלך מחזור בין איברי הלימפה משני. בעת ההפעלה, תמים T תאים עוברים דרסטית מטבולית התכנות, כולל את אינדוקציה של אירובי גליקוליזה כדי להגביר את ייצור ATP וכדי למלא את דרישות המטבולית אדירה במהלך התמיינות תאים והתפשטות. התאים מתקשה להבין. דרך לצרכים מטבוליים למות על ידי אפופטוזיס1,2. במהלך התיכנות מטבולית המיטוכונדריה לשחק תפקידים חשובים מאז הם organelles אחראי במידה רבה הייצור של ATP לאספקת אנרגיה של התא, התוכן המיטוכונדריה הסלולר תנודות במהלך מתגים מטבולית ברחבי T cell פיתוח והפעלה3. אולם, ההצטברות של המיטוכונדריה מיותר או פגום יכול לייצר עודפי ROS נזק שומנים, חלבונים ו- DNA, והוא יכול להוביל בסופו של דבר לתא המוות4
המיטוכונדריה מוגזם או נזק הנובעים שינויים מטבוליים יוסרו על ידי צורה מיוחדת של autophagy5, המכונה mitophagy. המיטוכונדריה הם עטוף autophagosomes, ואז התמזגו עם lysosomes עבור השפלה. אלה סגור תקשורת בין המיטוכונדריה, lysosomes יצרו עניין רב6,7. לדוגמה, סטרס חמצוני מעוררת את המיטוכונדריה ליצור שלפוחית נגזר המיטוכונדריה (MDVs) המיועדים כדי lysosomes על השפלה פוספטאז, tensin homolog (PTEN)-induced בשם קינאז 1 (PINK1) ואת פרקין (ליגאז אוביקוויטין E3) אופן התלויים8. גם נמצאו ש-mitophagy הזה הוא חיוני עבור adipocyte בז ללבן המעבר9,10. חשוב מכך, lysosomes אינם רק תא השפלה, אלא גם מווסת של איתות. הצטברות מוגזמת המצע עקב ליקויים האנזים מתבטא בתפקוד lysosomal באמצעות שיבוש חדירות הממברנה lysosomal ומשפיע על Ca2 + הומאוסטזיס11. פגמים פונקציונלי תא T ליפאז lysosomal חומצה (LAL)12 או המטבוליט lysosomal טרנספורטר נוקאאוט העכבר דגם13 נוסף הראה את החשיבות של lysosomes בשמירה על הומאוסטזיס תא T. המיטוכונדריה וגם lysosomes הם חלקים בלתי נפרדים של רגולציה חילוף החומרים הסלולר. לכן, מדידה של תכנים סלולריים מיטוכונדריאלי כבר חיווי חיוני כדי להעריך את מצב מטבולי ופונקציונליים של תא T.
מבחני נפוץ לכמת תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי או lysosomal כוללים immunoblot, מיקרוסקופ אלקטרונים, immunofluorescent מכתים (אם), וניתוח PCR מיטוכונדריאלי DNA עותק מספרי14,15, 16. בעוד immunoblot יכול באופן כמותי משווים רמות החלבון בין דוגמאות שונות, אלקטרון או אם מיקרוסקופ ניתן להמחיש את מבוקשם מורפולוגי של אלה organelles17, אלה מבחני לשאת חסרונות טכניים מסוימים. לדוגמה, זה זמן רב כדי לרכוש מספר מספיק של התא תמונות בהגדלה וברזולוציה או להשוות את רמות הביטוי של חלבון על פני עשרות של דגימות, ביצוע מבחני אלה נחשבת שיטות תפוקה נמוכה. יתר על כן, מבחני אלה ניתן להחיל רק אוכלוסייה הומוגנית התא, כגון שורות תאים, אך לא דגימות רקמה המורכב של אוכלוסיות מעורבות.
. זה גם קשה להחיל את מבחני אלה אוכלוסיות נדירה, שבה הדרישה תא מינימלי של מספרים מ-106 עד 108 בלתי אפשרי לפגוש. לבסוף, התאים בדרך כלל lysed או קבוע במהלך תהליך שהופך אותם עולה בקנה אחד עם שיטות אחרות כדי לחלץ מידע נוסף. לעומת שיטות מסורתיות, cytometry זרימה מבוססי פלורסנט בעלת תפוקה גבוהה יחסית של - המידע של כל התאים בטווח מדגם המורכב אוכלוסיות מעורבות לתאים יכול להיות מנותח ואסף בו זמנית. בנוסף, אחד יכול לזהות יותר מ- 10 פרמטרים באותו התא, למיין את התאים בהתאם פנוטיפים הרצוי עבור עוד מבחני. תגובתי הגששים פלורסנט שימשו לה תווית lysosomes, המיטוכונדריה בתאים חיים, ניתן להבחין לזרום cytometry18,19. הגששים אברון ספציפיים אלה תא חדיר, יש מאפיינים הכימי פיזיקלי, אשר מאפשרות להם מרוכזים מיקומים ספציפיים subcellular או organelles. בנוחות, רגשים אלו זמינים במגוון פורמטים פלורסנט, ובכך מאפשר היישום שלהם לניתוח ססגוניות.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לשלב סמן משטח מכתים עם ליזוזום-המיטוכונדריה ספציפיים או צבע כדי lysosomes תווית או במיטוכונדריה לחיות תאים. הדבר שימושי במיוחד עבור דגימות המופקים העיקרי רקמות ואיברים, אשר לעיתים קרובות מורכבים של אוכלוסיות הטרוגניות התא. החוקרים ניתן לזהות אוכלוסיות תאים עניין על-ידי ביטוי סמן משטח שלהם, במיוחד למדוד את התוכן lysosomal או מיטוכונדריאלי באמצעות צבעי אברון ספציפי בתאים אלה. . הנה, נדגים ההליך מפורט של ניתוח cytometric תזרים המעריכה את המיסה lysosomal או מיטוכונדריאלי subpopulations תא T הטחול הגדולות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
העכבר רקמות הקציר ההליך המתואר כאן אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.
1. הכנת לימפוציט השעיה של איברי הלימפה
- המתת חסד העכבר על ידי שיטה שאושרו כגון CO2 שאיפת בתא אקרילי שקוף ואחריו נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
הערה: לשמור על קצב הזרימה של CO2 עבור 20% לעקירה לדקה של התא, ומעלה לא מאשר 5 psi (פאונד לאינץ מרובע). זה לוקח 2-3 דקות בשביל עכבר איבד את ההכרה. לשמור על הזרימה2 CO לפחות עבור 1 דקות אחרי החיה הפסיק לנשום (5-7 דקות הכוללת). - הנח את העכבר על גבו על לוח נקי (למשל לוח פלסטיק פוליסטירן) ולתקן את הגפיים עם קלטת. לשטוף עם 70% אתנול.
- הקציר הטחול, לחתוך ולפתוח את חלל הבטן במספריים ויבתר 11-ס"מ (הטחול הוא מתחת לבטן, מעל הכליה השמאלית). להסיר את הטחול עם מלקחיים ולנקות של רקמות החיבור (להשתמש במספריים במידת הצורך).
- הקציר בלוטת התימוס, חותכים את הסרעפת, הצלעות משני הצדדים עם לנתח מספריים. להשתמש מלקחיים להרים את החזה כדי לחשוף את כל חלל בית החזה. להפריד התימוס בקפדנות סביב רקמות עם מספריים, ולהסיר כל רקמת חיבור שיורית על מגבת נייר שנרטבו עם PBS.
- מכנית מביצועם הרקמות עם פומפה מזרק בקערה 6 ס מ המכיל 5 מ"ל כקרח FACS מאגר (PBS שיושלם עם 2% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1 מ מ EDTA). להעביר את המתלים תא בודד שפופרת צנטרפוגה 15-mL; כדי לבשל 6 ס מ עם מאגר נוסף 2 מ"ל FACS ומשלבים בכביסה עם תא ההשעיה גם כן.
- Centrifuge התליה תא (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C) וזורקים את תגובת שיקוע. מחדש להשעות את גלולה עם 2 מ"ל של אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) lysing מאגר (155 מ מ NH4קלרנית, 10 מ מ KHCO3 ו- 0.1 מ מ נה2EDTA) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי lyse כדוריות דם אדומות. לנטרל את המאגר אישור על-ידי הוספת 10 מ"ל FACS מאגר התליה תא.
- Centrifuge התליה תא (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C) וזורקים את תגובת שיקוע. להשעות מחדש תאים ב 5 מ של בינוני RPMI מלאה (RPMI 1640 בינוני, שיושלם עם 44 מ מ NaHCO3, חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 10 מ מ 4 (HEPES), פניצילין U/mL 100, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 1 מ מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן הכרחיות MEM 1% ו-10% FBS).
- ההשעיה תא סינון דרך מסננת תא (נקבוביות בגודל 70 מיקרומטר) כדי להסיר תאים גושים. ספירת תאים עם hemocytometer או מונה תא אוטומטית.
2. כימות של המיטוכונדריה, Lysosomes
הערה: בצע לצבוע אברון ספציפיים מכתים קודם כי התנאי מכתימים אופטימלית צבעים אלה הוא הדגירה ב 37 º C. ההכתמה סמן משטח ניתן להפחתה בגלל נוגדנים מיצוי, הפנמה בטמפרטורה הזו.
- להוסיף 1 x 10 תאים6 למטה לסיבוב צינורות FACS, צנטריפוגה תאים (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C), למחוק את תגובת שיקוע.
- לדלל את הפתרונות מלאי רגש ריכוז בעבודה הסופית (100 ננומטר MitoTracker ירוק או ירוק LysoTracker; מעתה ואילך ספציפיים המיטוכונדריה או ליזוזום לצבוע, בהתאמה) מראש ומחוממת-37 ° C ללא סרום תרבות בינוני. זהו הפתרון עובד עבור צבע ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה.
הערה: בדיקת ריכוזים מרובים כולל טווח ריכוזים עבודה שהוצעה על ידי היצרן (20-200 ננומטר לצבוע המיטוכונדריה ספציפי) ו- 50-75 ננומטר בשביל לצבוע ליזוזום ספציפי המשמש כאן על מנת לקבל את הטוב ביותר מכתים יעילות. לבחור אוכלוסיה תא מוכרת יש הבעה טובה של צביעת המטרה (למשל lysosomes) כפקד חיובית (למשל אדם CD14+ ומונוציטים). בחר את הריכוז בעבודה המבוססת על הפרדה טובה בין ואתאיזם מכתים, כמו גם הכדאיות תא טוב. - Resuspend תאי µL 100 של ליזוזום המיטוכונדריה ספציפיים או לצבוע את הפתרון עובד, דגירה ב- 5% CO2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או 30 דקות, בהתאמה.
- להוסיף 1 מ"ל של מאגר FACS קרח כדי לעצור את התגובה. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C) ולמחוק את תגובת שיקוע. התאים מוכנים כעת סמן משטח מכתים.
3. משטח סמן מכתים
- Fc לחסום קולטנים עם 100 µL של לפני, טיטרציה 2.4G2 ליפידים supernatant על הקרח עבור 10 דקות לשטוף תאים עם 1 מ"ל של מאגר FACS, צנטריפוגה (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
- דגירה התאים בשילוב לפני, טיטרציה נוגדן מצומדת זריחה µL 50 במאגר FACS בקרח במשך 20 דק. הימנע אור.
הערה: להכין תאים בודדים שהוכתמו צבע זה כוללים את כל הנוגדנים פלורסנט להציג בהנוגדן שילוב תאים שטופלו רק לצבוע אברון ספציפיים להגדרת המתחים של גלאי קרינה פלואורסצנטית כל כיוונון פיצוי על זרימה cytometer. באופן דומה, להכין את פלורסצנטיות מינוס אחד (FMO) כפקדים רקע באמצעות תאים צבעונית עם כל הנוגדנים, אך ללא צביעת עם צבעי אברון ספציפיים. - לשטוף את התאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר FACS, גלולה על ידי צנטריפוגה (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend תאי µL 300 FACS מאגר המכיל 1 µg/mL propidium יודיד (PI) ולנתח באופן מיידי את הדוגמאות על זרימה cytometer.
4. המדגם אוסף זרימה Cytometer
- הפעל את המחשב, זרימה cytometer, FACS רכישת תוכנה, אביזר התקנים אחרים בהתאם פלטפורמת מחשב. הפעל PBS עבור בסביבות 1 דקות על מנת להבטיח את זרימת קו מלא מאגר PBS, נדן. ודא שזרימת הזרם רץ בצורה חלקה.
- פתח ניסוי חדש ובחר cytometer פרמטרים (גלאי פלורסנט) על פי הוראות היצרן. לסנן התאים דרך מסננת תא 70-מיקרומטר ו מערבולת לפני רכישת כל דגימה כדי למנוע גושים ויצירת כפיל.
- להפוך חלקות נקודה של פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס), אשר מייצגים את גודל התא, צפיפות, בהתאמה. למטב את המתחים של FSC האס כדי לוודא שהתאים עניין להופיע החלקות. להפוך נקודה חלקות FSC-A לעומת FSC-W (או FSC-H) וצייר שער עבור התאים יחיד.
- להפוך נקודה חלקות כל פרמטר פלורסנט. להשתמש תאים וללא רבב כדי לקבוע רקע אות ושימוש בפקדים שהוכתמו צבע יחיד כדי להתאים את המתחים של כל פרמטר פלורסנט, כך שאוכלוסיות תא חיוביים ושליליים ניתן להבחנה ברורה ואת בתוך הטווח הדינמי של רכישה.
- לאחר כל החשמלי נקבעים, השתמש אוטומטית-פיצויים אם הוא זמין, או להתאים ידנית את הפיצוי עם וללא רבב, רווק שהוכתמו צבע שולט לתיקון העודפים ספקטרלי. להחיל את הפיצוי על דגימות.
- להפוך את מגרש נקודה של כל פרמטר וצייר השערים על-פי ניסיוני הסט שלך. לדוגמה, FSC-A לעומת FSC-H (או FSC-W) כדי לא לכלול doublets, ואחריו FSC-A לעומת האס-A עבור לימפוציט gating; האס-A לעומת PI (תאים חיים) ו CD4 לעומת CD8 (איור 1).
- לאסוף מספיק אירועים (cell סך הכל מספר) משמעות להשוואה בין אוכלוסיות. בדרך כלל, לפחות 1,000 אירועים באוכלוסייה עניין צריך להשיג20.
- לאחר כל הדגימות נרכשים, לייצא זרימת הנתונים כדי להיות מנותח על-ידי תוכנת ניתוח cytometry זרימה. שמור את הניסוי תבנית כדי לשמר את cytometer הגדרת פרמטרים עבור החלה על ניסויים דומים בעתיד.
5. ניתוח נתונים
הערה: ישנם כלים רבים כדי לנתח נתונים cytometric זרימה, מסחרי ותוכנות חינם. רכישת התוכנה של cytometers הזרימה יכולה לעבוד גם לניתוח נתונים. כאן השתמשנו FlowJo כדוגמה.
- להפעיל את התוכנה, גרור את הקבצים FCS לתוך סביבת העבודה. לחץ על דוגמה כדי לפתוח חלון גרפיקה. בחר פרמטרים יוצגו על ציר X ו- Y על ידי לחיצה על הצירים X ו- Y. השתמש בסרגל הכלים כדי לצייר שערים לפי סמני ביטוי באופן שונה או מוגדר פנוטיפים של אוכלוסיות תאים.
- הוסף שערי כל פרמטר כמוצג באיור1. גרור שערי כל דוגמאות בסביבת העבודה, כך הם מקבלים זהים gating.
- גרור החלקות פריסה עורך ליצירת דוחות גרפיים.
- הצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) עבור כל אוכלוסיית עניין על-ידי לחיצה על לחצן סטטיסטיקת (סיגמא) בחלון הגרפיקה ובחירה "מתכוון" ואני הפרמטר המתאים, לדוגמה, את הערוץ המשמשים לזיהוי צבע ספציפי אברון. לחץ על 'הוסף'.
- לחץ על הסמל עורך טבלה וגרור MFI עורך טבלה כדי ליצור דוחות סטטיסטיים. שמור כקובץ Excel, טקסט או CSV כדי לחשב דלתא MFI (ΔMFI) כמו MFI (צבע ספציפי אברון) - MFI (FMO).
הערה: לא לחשב MFI בין דגימות רכשה עם cytometer שונים הגדרות (מתח, ערוצי פלורסנט או פיצויים). השוואות של ערכים נגזר ניסויים עם הגדרות שונות הינם חסרי משמעות משוחד. - לייצא את כל הערכים סביבת העבודה ואת חלקות מעורך פריסה עבור ביצוע טבלאות ואיורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי של קבוצות משנה עיקריים T cell הטחול, בלוטת התימוס
בקצרה, המתלים תא בודד מן הטחול ואת בלוטת התימוס lysed של כדוריות דם אדומות, מודגרות עם תגובת שיקוע 2.4G2, ואחריו צבע ספציפי אברון, סמן משטח מכתים עם נוגדנים מצומדת קרינה פלואורסצנטית (טבלה 1). התקדמות התפתחותית thymocytes יכולה להיות מתוארת באמצעות נוגדנים קולטני שיתוף CD8 ו CD4. Thymocytes הכי ילדותי לא מבטא CD4 או CD8, והם נקראים כפול שלילי (DN). לאחר מכן, הם למעלה-לווסת CD4 והן CD8 ולהיות חיובי זוגי (DP). לבסוף, הם למטה-לווסת CD4 או CD8 ולהיות אחד חיובי (SP) התאים בוגרים מוכן לעזוב את האיבר. בשלבים המוקדמים של פיתוח תא T, כאשר התאים שאינם מבטאים קולטנים שיתוף CD4 ו CD8, יכולים להיות עוד יותר מסווגים על בסיס CD44 ו CD25 הביטוי. המוצא לאגס המוקדמים ביותר הם CD44+ CD25– (DN1), ואז הם מתחילים לבטא CD25, הופכים CD44+CD25+ (DN2) תאים. לאחר מכן, התאים למטה-לווסת את CD44 ולהיות CD44–CD25+ (DN3) תאים ו, לבסוף, הם למטה-לווסת CD25 גם להפוך CD44–CD25– (DN4) תאים שנמצאים על הדרך לבטא CD4 ו CD8 והופך זוגיות-חיוביות (DP) תאים.
בהטחול, ניתן לחלק את תאי T CD8 ציטוטוקסיות+ , המסייע CD4+ T תאים. שתי אוכלוסיות אלה ניתן לחלק נוספת לערכות תמימה, אפקטור וזיכרון המבוססת על CD62L ועל CD44 מכתים. האסטרטגיה המגביל מפורט מוצג באיור1.
כימות של המיטוכונדריה המיסה תא T שונים קבוצות משנה
צבע ספציפי המיטוכונדריה שימשו כדי למדוד את הכמויות של המיטוכונדריה באוכלוסיות תא T. מצאנו כי התכנים מיטוכונדריאלי היו הנמוך בכל DN1, לשיאה ב- DN2-DN3, מעט ירד ב- thymocytes DN4 ו DP וגם היו נמוכות אפילו ב- thymocytes CD4 ו CD8 SP (איור 2א). עם זאת, thymocytes CD4 או CD8 SP היה גבוה יותר המיטוכונדריה מכתים MFI מאשר תאי CD4 או CD8 T הטחול (איור 2B). מקרים אלה מצביעים על תוכן מיטוכונדריאלי תנודות במהלך הפיתוח תא T עם thymocytes לא בוגר המכיל המיטוכונדריה יותר מאשר עמיתיהם בוגר לעשות, התאים תמים T recirculate ב דם עשיר בחמצן יש אפילו נמוך מסה מיטוכונדריאלי. מעניין, הפחתה זו תוכן מיטוכונדריאלי היה בולט יותר ב- CD8 השושלת CD4 T (איור 2B), הפעלת תא T נוסף ירד זה. בין הפעלת תאי T, CD4+ בתאי T הזיכרון היה המיטוכונדריה מעט יותר בהשוואה ל- effectors; עם זאת, ההיפך הוא המקרה של CD8+ T תאים: CD8+ בתאי T הזיכרון היה המסה מיטוכונדריאלי הנמוך ביותר בין כל תא T תת קבוצות (איור 2B).
Lysosomal מדידה תוכן ב- subpopulations שונים של תאי T
באמצעות צבע ספציפי ליזוזום, הבחנו יחסית נמוך, אבל לזיהוי, תכנים lysosomal כל האוכלוסיות תא T, עם נוכחות בולטת יותר של lysosomes ב DN1 thymocytes (איור 3א). אין הבדל משמעותי נמצאה בין תת-קבוצות thymocyte של DN1 ואילך. בפריפריה, מספר גבוה יחסית של lysosomes נמצאה אפקטור CD8 והזיכרון+ T תאים. תופעה זו עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהראו כי הופעל CD8+ T תאים מוגברת שלהם ביטוי חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (המנורה-1)21,22, המשקף עירה של lysosomal-ציטוטוקסיות גרגירים (איור 3)
איור 1 : Gating אסטרטגיה של לימפוציטים הטחול, thymocytes. התאים היו מראש מגודרת-FSC/האס ו- PI– להשיג ללבישה בשידור חי. (א) thymocytes הכולל של עכברים היו מוכתמים CD4, CD8, CD44 ו CD25. ביטויים CD4 ו CD8 שימשו כדי להבחין CD4+CD8– SP, CD4–CD8+ SP, CD4+CD8+ DP, ו CD4–CD8 קבוצות משנה DN– . CD4–CD8 משנה DN– חולקה עוד יותר CD44+CD25– DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44–CD25+ DN3, ו- CD44–CD25– DN4 subpopulations. (B) splenocytes הכולל של עכברים היו מוכתמים TCRβ, CD4, CD8, CD44 ו- CD62L. התאים TCRβ+ נפרדו CD4+ ו CD8+ T תאים, אשר חולקו עוד יותר תמים (CD44–CD62L+), זיכרון (CD44+CD62L+), ואת אפקטור (CD44+CD62L -) אוכלוסיות. התוצאות הן נציג של 3 ניסויים עצמאית עם n = 3-4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : נציג היסטוגרמות מציג המיטוכונדריה מכתים כל אוכלוסיית תא. התאים היו מוכתמים צבע ספציפי המיטוכונדריה למשך 15 דקות ב הלעפה תרוטרפמט 37, ואחריו סמן משטח מכתים. אות ניאון של תאים מוכתם על ידי זרימת cytometer וניתח על. (א) המיטוכונדריה כתמים thymocytes DN ו DP. (B) המיטוכונדריה כתמים thymocytes CD4SP, CD8SP אוכלוסיות תא T הטחול. ΔMFI = MFI (המיטוכונדריה מכתים) - MFI (FMO). הקו האדום מוצק מייצג המיטוכונדריה מכתים, הקו הכחול מוצק מראה שליטה FMO, ומייצג קו מקווקו אדום קרינה פלואורסצנטית רשע האינטנסיביות של המיטוכונדריה מכתים כל האוכלוסייה. התוצאות הן נציג של 3 ניסויים עצמאית עם n = 3-4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג היסטוגרמות מציג ליזוזום מכתים לימפוציטים הטחול, thymocytes. התאים היו מוכתמים צבע ספציפי ליזוזום למשך 30 דקות-הלעפה תרוטרפמט 37, ואחריו סמן משטח מכתים. אות ניאון של תאים מוכתם שרכשה זרימה cytometer, ניתח. (א) ליזוזום כתמים thymocytes DN ו DP. (B) ליזוזום כתמים thymocytes CD4SP, CD8SP אוכלוסיות תא T הטחול. ΔMFI = MFI (ליזוזום צביעת) - MFI (FMO). הקו הירוק מוצק מייצג ליזוזום מכתים, הקו הכחול מוצק מראה FMO, ומייצג קו אדום מקווקו פלורסצנטיות כלומר עוצמת ליזוזום מכתים כל האוכלוסייה. התוצאות הן נציג של ניסוי אחד עם n = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: עיצובים לוח cytometry זרימה ססגוניות. Fluorochrome ואת ריכוז של נוגדנים/אברון צבעי ב תערובות מכתימים מפורטים כאן. מומלץ מאוד titrate ולבדוק כל נוגדן בעת הגדרת חדש צביעת לוחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה משלב צבעים ספציפיים אברון סמן משטח מכתים לכמת את כמות המיטוכונדריה או lysosomes באוכלוסיות שונות תא T. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על המגבלה של מספר תאים הומוגניות דרישות עבור שיטות מסורתיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח immunoblot. זה שימושי במיוחד ניתוח נדיר תא אוכלוסיות ובדיקת סוגי תאים מרובים בו-זמנית באותו זמן.
משך ההליך הטמפרטורה של דגירה הגורמים הקריטיים ביותר פרוטוקול זה בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. תיוג אברון תקין דורש טיטור מדויק של צבע ספציפי אברון. תאים צריך גם לשמור בקפדנות על קרח כדי לשפר את הכדאיות למנוע מיצוי נוגדן הפנמה. בנוסף, ידי קרינה פלואורסצנטית של אלה צבעים ספציפיים אברון חשוף לשינויים קלים חשיפה וטמפרטורה. לפיכך, ניתוח מיידי של דגימות עם סיום ההליך מכתימים חשוב מאוד. בעקביות הצלחנו להשלים את הניסוי כולו בתוך שעתיים.
מאז פרוטוקול זה מסתמך על היכולת של זיהוי קרינה פלואורסצנטית ססגוניות על ידי זרימת cytometer להעריך רכיבים תאיים, ההגדרות רכישה (למשל המתחים PMT), הפיצוי של ספקטרה חופפים (העודפים של קרינה פלואורסצנטית לתוך השכנה ערוצים) בכבדות יכול להשפיע על עוצמת האות. זה רלוונטי במיוחד כאשר סמני פני נחוץ כדי לזהות את סוגי תאים הרלוונטיים להגדיל מעל שש. במצב זה, ניסיון בתכנון ניסויים cytometry זרימה ססגוניות הופכת לחשובה ביותר עבור רכישת נתונים באיכות גבוהה.
מערכת החיסון מגן על הגוף מפני עלבונות הפתוגן, זיהומים, הפעלת תא T יש תפקיד מרכזי במתן אותות חיוניים כדי תאים חיסוניים אחרים. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי אוכלוסיות שונות תא T יש תוכניות ייחודיות מטבולית, תוכן מיטוכונדריאלי, lysosomal הם אינדיקטורים מכריע של שינויים מטבוליים. עם זאת, התופעה אינה ייחודית בתאי T. הבידול והפעלה של תאים חיסוניים מולדים, כגון מקרופאג תאים דנדריטים, קשר הדוק גם מקושרים שלהם מצב מטבולי23,24. היתרון של פרוטוקול זה הוא שזה יכול להיות מותאם כדי לבחון כל אוכלוסיות תאים עניין באמצעות נוגדנים נגד שושלת היוחסין הספציפי סמנים. יתר על כן, בשילוב צבעי אברון ספציפיים אחרים, כגון ER-Cyto-מזהה או, יש את הפוטנציאל להעריך organelles שונים או התאית בתאים סוגים שונים של תאים.
הקמתה של המיטוכונדריה או ליזוזום כימות שיטה אינה רק אינסטרומנטלית ללמוד את חילוף החומרים בתאי T, אבל יש גם פוטנציאל גדול לטובת מחקר המתמקד שינויים מטבוליים בהגדרות המחלה, כמו סרטן או מחלות אוטואימוניות25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין קונפליקטים של אינטרסים.
Acknowledgments
הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים משרד טייוואן המדע, הטכנולוגיה (רובם) NSC103-2320-B-010-002-MY2, MOST104-2628-B-010-002-MY4 מודיע Hsu. . סי-וו ווי היא נמען של מעולה התזה פרס של המכון של מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
