Summary
Denne artikkelen beskriver en kraftig metode for å kvantifisere mitokondrier eller lysosomer i levende celler. Kombinasjonen av lysosome - eller mitokondrier-spesifikk fargestoffer med fluorescently konjugert antistoffer mot overflate markører lar kvantifisering av disse organeller mikset-celle bestander, som primær celler høstet fra vevsprøver, ved hjelp av flerfarget flowcytometri.
Abstract
T celler benytte ulike metabolske programmer å matche sine funksjonelle behov under differensiering og spredning. Mitokondrier er avgjørende cellulære komponenter ansvarlig for å forsyne celle energi; imidlertid produserer overflødig mitokondrier også reaktive oksygen arter (ROS) som kan føre til celledød. Antall mitokondrier må derfor stadig justeres for å passe behovene til cellene. Denne dynamiske forskriften oppnås delvis gjennom funksjonen lysosomer som fjerne overskudd/skadet organeller og makromolekyler. Derfor er mobilnettet mitokondrie og lysosomale innholdet nøkkelindikatorer evaluere metabolske justering av celler. Med utviklingen av sonder for organeller blir godt karakterisert lysosome eller mitokondrier-spesifikke fargestoffer tilgjengelig i ulike formater å merke mobilnettet lysosomer og mitokondrier. Flerfarget flowcytometri er et felles verktøy til profil celle fenotyper, og har muligheten til å bli integrert med andre analyser. Her presenterer vi detaljerte protokollen hvordan kombinere organelle-spesifikke fargestoffer med overflate markører flekker for å måle hvor mye lysosomer og mitokondrier i ulike T celle populasjoner på en flyt cytometer.
Introduction
Aktivisering og spredning av T-celler er avgjørende skritt for montering vellykket immunreaksjoner. Nylige fremskritt foreslår at cellenes stoffskifte er tett forbundet med både utvikling og funksjoner av T-celler. For eksempel stole naiv T celler hovedsak på oxidative fosforylering (OXPHOS) for å møte etterspørselen etter energi under resirkulering blant andre lymfoide organer. Ved aktivering gjennomgå naiv T celler drastisk metabolske reprogramming, inkludert induksjon av aerobic Glykolysen å øke ATP produksjonen og for å oppfylle de enorme metabolske kravene under celledifferensiering og spredning. Celler som ikke følger gjennom metabolske behov dø av apoptose1,2. Under den metabolske reprogramming, spille mitokondrier viktige roller siden de er organelles ansvarlig for produksjon av ATP å levere energi for cellen, og mobilnettet mitokondrier innholdet varierer i metabolske brytere hele T celle utvikling og aktivisering3. Men kan opphopning av overflødig eller skadet mitokondrier produsere overflødig ROS som skader lipider, proteiner og DNA, og kan føre til celle død4
Overdreven eller skadet mitokondrier skyldes metabolske forandringer er fjernet av en spesialisert form av autophagy5, kjent som mitophagy. Mitokondrier er pakket av autophagosomes og deretter smeltet sammen med lysosomer til fornedrelse. Dette lukker kommunikasjon mellom mitokondrier og lysosomer har generert stor interesse6,7. For eksempel oksidativt stress stimulerer mitokondrier å danne mitokondrier-avledet blemmer (MDVs) som er rettet mot lysosomer for degradering av en fosfatase og tensin homolog (PTEN)-indusert antatte kinase 1 (PINK1) og parkin (en E3 ubiquitin ligase) avhengige måte8. Det ble også funnet at mitophagy er avgjørende for beige-til-hvite adipocyte overgang9,10. Enda viktigere, er lysosomer ikke bare en degradering kupé, men også en regulator mobilnettet signalnettverk. Overdreven substrat akkumulering på grunn av enzymet mangler resulterer i lysosomale dysfunksjon ved å forstyrre lysosomale membran permeabilitet og påvirker Ca2 + homeostase11. T celle funksjonelle mangler i lysosomale syre lipase (LAL)12 eller lysosomale metabolitten transporter knockout mus modell13 viste videre betydningen av lysosomer opprettholde T celle homeostase. Både mitokondrier og lysosomer er uatskillelige deler av mobilnettet metabolske regulering. Derfor er måling av mobilnettet mitokondrie innhold en viktig indikator å evaluere T celle metabolske og funksjonell status.
Analyser brukte å kvantifisere mobilnettet mitokondrie eller lysosomale innholdet inkluderer immunoblot, elektronmikroskop, immunofluorescent (hvis) flekker og PCR analyse av Mitokondrielt DNA kopi tall14,15, 16. mens immunoblot kan kvantitativt sammenligne protein nivå over forskjellige prøver og elektron eller hvis mikroskopi kan visualisere morfologiske kjennetegnene av disse organeller17, disse analyser bærer visse tekniske ulemper. For eksempel er det tidkrevende å skaffe tilstrekkelig antall celle bilder med høy forstørrelse og oppløsning eller sammenligne uttrykk nivåene av et protein på tvers av dusinvis av prøver, gjør disse analyser anses å være lav overføringshastighet metoder. Videre kan disse analyser brukes homogen celle befolkningen, som linjer, men ikke vevsprøver som består av blandet populasjoner.
Det er også vanskelig å bruke disse analyser på sjeldne befolkninger, som kravet til minimal celle tall fra 106 til 108 er umulig å oppfylle. Endelig er cellene vanligvis lysed eller fast under prosessen, slik at de er ikke kompatibel med andre metoder for å trekke ut ytterligere informasjon. Sammenlignet med tradisjonelle metoder, lysstoffrør-baserte flowcytometri har en relativt høy gjennomstrømning - informasjonen på alle cellene i et utvalg består av blandet celle populasjoner kan analyseres og samlet samtidig. I tillegg kan oppdage mer enn 10 parameterne i samme celle og sortere cellene basert på ønsket fenotyper for videre analyser. Reaktiv fluorescerende sonder har blitt brukt til å merke lysosomer og mitokondrier i levende celler og kan oppdages av flyt cytometri18,19. Disse organelle-spesifikke sonder har celle permeabel og fysikalsk-kjemiske egenskaper som tillater dem å være konsentrert i bestemte subcellular steder eller organeller. Beleilig, disse sonder er tilgjengelig i ulike fluorescerende formater, dermed aktivere programmet for multicolor analyse.
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan kombinere overflaten markør flekker med lysosome - eller mitokondrier-spesifikk fargestoffer til etiketten lysosomer eller mitokondrier i live celler. Dette er spesielt nyttig for prøver fra primære vev og organer, som ofte består av ulike celle populasjoner. Forskere kan identifisere celle populasjoner av interesse av deres overflate markør uttrykk og spesielt måle lysosomale eller mitokondrie innholdet gjennom organelle-spesifikke fargestoffer i disse cellene. Her viser vi detaljerte fremgangsmåten flyt cytometric analyse som evalueres lysosomale eller mitokondrie massen i store splenic T celle subpopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musen vev harvest fremgangsmåten som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av National Yang-Ming University.
1. forberedelse av lymfocytt suspensjon fra lymfoide organer
- Euthanize musen med en godkjent metode som CO2 innånding i en gjennomsiktig akryl kammer etterfulgt av cervical forvridning å sikre død.
Merk: Holde inntakets CO2 for en 20% per minutt forskyvning av kammeret, og ikke høyere enn 5 psi (pund per kvadrattomme). Det tar 2-3 minutter for en mus å miste bevisstheten. Opprettholde CO2 flyten minst for 1 min etter dyret har sluttet å puste (5-7 min generelle). - Plasser musen på ryggen på et rent bord (f.eks en polystyren plast bord) og fikse lemmer med tape. Skyll med 70% etanol.
- Å høste milt, kutt og åpne bukhulen med 11 cm dissecting saks (milten er under magen og over venstre nyre). Fjern milten med tang og rengjør fra forbinde tissues (bruk saks Hvis nødvendig).
- For å høste thymus, kuttet membranen og rib bur fra begge sider med dissekere saks. Bruk tang til å løfte opp sternum å avsløre hele bryst hulrom. Skille thymus nøye fra omkringliggende vev med saks, og fjern eventuelle gjenværende bindevev på et papirhåndkle wetted med PBS.
- Mekanisk dissociate vev med en sprøytestempelet i 6 cm parabol inneholder 5 mL iskald FACS buffer (PBS supplert med 2% fosterets bovin serum (FBS) og 1 mM EDTA). Overføre encellede suspensjon slik 15-mL sentrifuge; vask 6 cm parabolen med ytterligere 2 mL FACS buffer og kombinere vask med cellen suspensjon også.
- Sentrifuge celle suspensjon (300 x g i 5 min på 4 ° C) og kast nedbryting. Nytt utsette pellets med 2 mL av Ammonium klor kalium (ACK) lysing buffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 og 0,1 mM Na2EDTA) i 1 min i romtemperatur (RT) å lyse røde blodlegemer. Nøytralisere ACK bufferen ved å legge 10 mL FACS buffer til celle suspensjon.
- Sentrifuge celle suspensjon (300 x g i 5 min på 4 ° C) og kast nedbryting. Nytt suspendere celler i 5 mL av komplett RPMI medium (RPMI 1640 medium, supplert med 44 mM NaHCO3, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvate, 1% MEM ikke-essensielle aminosyrer, og 10% FBS).
- Filteret celle suspensjon gjennom en celle sil (pore størrelse 70 µm) fjerne celle klumper. Telle celler med hemocytometer eller automatisert celle telleren.
2. kvantifisering av mitokondrier og lysosomer
Merk: Utføre organelle-spesifikke fargestoff flekker først fordi den optimale flekker betingelsen for disse fargestoffer er inkubasjon på 37 ° C. Den overflaten markør flekker kan reduseres betydelig på grunn av antistoff capping og internalisering på denne temperaturen.
- Legge til 1 x 106 celler for å runde bunn FACS rør, sentrifuge celler (300 x g i 5 min på 4 ° C) og forkaste nedbryting.
- Fortynne de sonde lager løsningene på siste arbeider konsentrasjon (100 nM MitoTracker grønt eller LysoTracker Green; heretter mitokondrier - eller lysosome-spesifikk fargestoff, henholdsvis) i forvarmes 37 ° C serum-fri kultur medium. Dette er den arbeider løsningen for lysosome - eller mitokondrier-spesifikk fargestoff.
Merk: Prøv flere konsentrasjoner inkludert størrelsesorden arbeider konsentrasjoner foreslått av produsenten (20-200 nM for mitokondrier-spesifikke fargestoff) og 50-75 nM for lysosome-spesifikke fargestoff brukt her for å få best flekker effektivitet. Velg en celle befolkningen som er kjent for å ha godt uttrykk for farging mål (f.eks lysosomer) som positive kontroll (f.eks menneskelige CD14+ monocytter). Velg arbeider konsentrasjonen basert på god separasjon mellom negative og positive flekker, samt god celle levedyktighet. - Resuspend cellene i 100 µL av lysosome - eller mitokondrier-spesifikk fargestoff fungerende løsning og Inkuber i 5% CO2 inkubator på 37 ° C for 15 min eller 30 min, henholdsvis.
- Legg 1 mL av iskalde FACS buffer for å stoppe reaksjonen. Pellets celler med sentrifugering (300 x g i 5 min på 4 ° C) og kast nedbryting. Cellene er nå klar for overflate markør flekker.
3. overflate markør flekker
- Blokk Fc reseptorer med 100 µL av pre titrerte 2.4G2 hybridoma supernatant på is 10 min. vask celler med 1 mL av FACS buffer og sentrifuger (300 x g i 5 min på 4 ° C). Kast nedbryting.
- Inkuber cellene med 50 µL pre titrerte fluorescens-konjugerte antistoffer kombinasjon FACS buffer på is 20 min. unngå lys.
Merk: Forberede enkelt farge-farget celler som inneholder alle fluorescerende antistoffer presentere i antistoffer kombinasjon og cellene behandlet bare med organelle-spesifikke fargestoff for å angi spenninger for hver fluorescens detektor og kompensasjon justering på flyt cytometer. Likeledes forberede fluorescens Minus én (FMO) som bakgrunn kontroller ved hjelp av celler beiset med alle antistoffer, men uten flekker med organelle-spesifikke fargestoffer. - Vask cellene ved å legge til 1 mL av FACS buffer og pellets med sentrifugering (300 x g i 5 min på 4 ° C). Kast nedbryting.
- Resuspend cellene i 300 µL FACS bufferen som inneholder 1 µg/mL propidium iodide (PI) og umiddelbart analysere prøvene på flyt cytometer.
4. prøvetaking på Flow Cytometer
- Slå på datamaskinen, flyt cytometer, FACS oppkjøpet programvare og andre tilbehør enheter avhengig av maskinen plattform. Kjør PBS for rundt 1 min å sikre flyten linjen er fylt med PBS og kappe. Kontroller at strømmen strømmen går som smurt.
- Åpne nytt eksperiment og velg cytometer parametere (fluorescerende detektorer) i henhold til produsentens instruksjoner. Filtrere cellene til 70-µm celle sil og vortex før oppkjøpet av hver prøve å unngå klumper og doublet formasjon.
- Gjøre dot tomter frem xy (FSC) og siden xy (SSC), som representerer Cellestørrelse og detaljnivå, henholdsvis. Optimalisere spenninger FSC og SSC sørge for cellene rundt vises i tomter. Gjøre dot tomter FSC-A vs. FSC-W (eller FSC-H) og trekke en port for i enkeltceller.
- Gjøre dot tomter til hver fluorescerende parameter. Bruke unstained kvinne celler til å bestemme bakgrunn signal og bruke én farge-farget kontroller justere spenninger til hver fluorescerende parameter, slik at positive og negative celle populasjoner er klart kan skilles og dynamikkområdet oppkjøpet.
- Når alle spenninger er angitt, bruke auto-kompensasjon hvis tilgjengelig, eller manuelt justere erstatning med unstained kvinne og enkelt farge-farget rette spectral ringvirkninger. Gjelde kompensasjon for prøvene.
- Gjøre en dot tomt hver parameter og utarbeide gates ut din eksperimentelle sett. For eksempel FSC-A vs. FSC-H (eller FSC-W) å utelukke doublets, etterfulgt av FSC-A vs. SSC-en for lymfocytt gating; SSC-A vs. PI (levende celler) og CD4 og CD8 (figur 1).
- Samle nok hendelser (total-celle nummer) for meningsfull sammenligning mellom populasjoner. Vanligvis må minst 1.000 hendelser i befolkningen rundt innhentes20.
- Etter at alle prøvene er ervervet, eksportere flyt data som skal analyseres av flyt cytometri analyseprogramvare. Lagre eksperimentet som mal for å beholde cytometer innstillingen og parametere for bruk på lignende eksperimenter i fremtiden.
5. analyse
Merk: Det finnes mange verktøy for å analysere flyt cytometric data, både kommersielle og fri programvare. Kjøp programvare flyt cytometers kan også arbeide for dataanalyse. Her har vi brukt FlowJo som et eksempel.
- Start programvaren og dra FCS filene til arbeidsområdet. Klikk på en prøve å åpne et grafisk vindu. Velg parametere presenteres på X- og Y-aksen ved å klikke på X og Y aksene. Bruk verktøylinjen til å tegne gates etter ulikt uttrykt markører eller definerte fenotyper av celle populasjoner.
- Legge portene til hver parameter som vist i figur 1. Dra portene til alle prøvene i arbeidsområdet, slik at de får samme gating.
- Dra tomter til layout editor for å lage grafiske rapporter.
- Vise mener fluorescens intensiteten (MFI) for hver befolkningen rundt ved å klikke statistikk (Σ) i et grafisk vindu og velge "Betyr" og den riktige parameteren for eksempel kanalen brukes til å oppdage organelle-spesifikke fargestoff. Klikk "Legg til".
- Klikk på tabellikonet editor og dra MFI til redigeringsprogrammet for å lage statistiske rapporter. Lagre som Excel-, tekst- eller CSV-fil til å beregne delta MFI (ΔMFI) i MFI (organelle-spesifikke fargestoffer) - MFI (FMO).
Merk: Ikke regne MFI mellom prøvene kjøpt med forskjellige cytometer innstillinger (spenninger, lysrør kanaler eller kompensasjon). Sammenligninger av verdier avledet fra eksperimenter med ulike innstillinger er meningsløst og partisk. - Eksportere alle verdiene fra arbeidsområdet og tomter fra layout editor for å lage tabeller og figurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifikasjon av store T-celle delsett i milten og thymus
I korte trekk var enkeltcelle suspensjoner fra milten og thymus lysed av røde blodlegemer, inkubert med 2.4G2 nedbryting, etterfulgt av organelle-spesifikke fargestoff og overflate markør farging med fluorescens-konjugerte antistoffer (tabell 1). Utviklingsmessige progresjon av thymocytes kan beskrives ved hjelp av antistoffer mot co receptors CD8 og CD4. De mest umodne thymocytes uttrykke ikke CD4 eller CD8 og kalles dobbel negative (DN). Deretter de opp-regulere både CD4 og CD8 og bli dobbelt positive (DP). Endelig de ned-regulere CD4 eller CD8 og bli moden positiv (SP) enkeltceller klar til å forlate orgel. De tidligste stadiene av T celle utvikling, når cellene ikke uttrykke co receptors CD4 og CD8, kan videre klassifiseres på grunnlag av CD44 og CD25. Den tidligste forfedre er CD44+ CD25- (DN1), og de begynner å uttrykke CD25 og bli CD44+CD25+ (DN2) celler. Etter at cellene ned-regulere CD44 og bli CD44-CD25+ (DN3) celler og, endelig, de ned-regulere CD25 også å bli CD44-CD25- (DN4) celler som er på vei til uttrykke CD4 og CD8 og bli dobbel-positive (DP) celler.
I milten, de T-cellene kan deles inn i cytotoksisk CD8+ og hjelperen CD4+ T celler. Begge disse gruppene kan videre deles inn naiv, effektor og minne delsett basert på CD62L og CD44 flekker. Detaljert gating strategien er vist i figur 1.
Kvantifisering av mitokondrier i ulike T-celle delsett
Mitokondrier-spesifikke fargestoffer ble brukt til å måle antall mitokondrier i T celle populasjoner. Vi fant at mitokondrie innholdet var den laveste i DN1, nådde DN2-DN3, litt redusert i DN4 og DP thymocytes og enda lavere i CD4 og CD8 SP thymocytes (figur 2A). Men hadde CD4 eller CD8 SP thymocytes høyere mitokondrier flekker MFI enn splenic CD4 og CD8 T celler (figur 2B). Disse observasjonene foreslår at mitokondrie innhold svinger under utviklingen av T celle med umodne thymocytes inneholder flere mitokondrier enn sine eldre kolleger, og naiv T cellene recirculate i oksygenrikt blod ha enda lavere Mitokondrielt masse. Interessant, denne reduksjonen av mitokondrie innholdet var mer fremtredende i CD8 enn CD4 T linjen (figur 2B), og T celle aktivering ytterligere redusert den. Blant aktivert T celler, CD4+ minne T celler hadde litt mer mitokondrier sammenlignet effektor; men motsatt var tilfellet for CD8+ T celler: CD8+ minne T celler hadde lavest mitokondrie massen blant alle T-celle delsett (figur 2B).
Lysosomale innhold måling i ulike subpopulasjoner av T-celler
Bruker lysosome-spesifikke fargestoff, observerte vi relativt lav, men detectable, lysosomale innholdet i alle T celle populasjoner, med mer fremtredende tilstedeværelse lysosomer i DN1 thymocytes (Figur 3A). Ingen signifikant forskjell ble funnet blant thymocyte delsettene fra DN1 videre. I periferien, et relativt høyt antall lysosomer ble funnet i minne og effektor CD8+ T celler. Dette fenomenet er i tråd med tidligere studier som viser at aktivert CD8+ T celler økt deres uttrykk lysosomale-assosiert membran protein 1 (lampe-1)21,22, reflekterer deres besittelse av lysosomale-cytotoksiske granulater (Figur 3B)
Figur 1 : Gating strategi splenic lymfocytter og thymocytes. Celler var pre gated FSC/SSC og PI- for å få live singleter. (A) Total thymocytes fra mus var farget med CD4, CD8, CD44 og CD25. CD4 og CD8 ble brukt til å skille CD4+CD8- SP, CD4-CD8+ SP, CD4+CD8+ DP, og CD4-CD8- DN delsett. CD4-CD8- DN delsett ble delt i CD44+CD25- DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44-CD25+ DN3, og CD44-CD25- DN4 subpopulasjoner. (B) Total splenocytes fra mus var farget med TCRβ, CD4, CD8, CD44 og CD62L. TCRβ+ cellene var adskilt av CD4+ og CD8+ T celler som ble videre oppdelt i naiv (CD44-CD62L+), minne (CD44+CD62L+), og effektor (CD44+CD62L -) bestander. Resultatene er tre uavhengige eksperimenter med n = 3-4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant histogrammer viser mitokondrier farging i hver celle befolkningen. Celler var farget med mitokondrier-spesifikke fargestoff i 15 min på 37 grader, etterfulgt av overflaten markør flekker. Fluorescerende signal farget celler ble kjøpt av flyt cytometer og analysert på. (A) mitokondrier farging av DN og DP thymocytes. (B) mitokondrier farging av CD4SP og CD8SP thymocytes og splenic T celle populasjoner. ΔMFI = MFI (mitokondrier flekker) - MFI (FMO). Den solide røde linjen representerer mitokondrier flekker, den heltrukne blå linjen viser FMO kontroll, og den stiplede røde linjen representerer mener fluorescens intensiteten i mitokondrier farging i hver befolkningen. Resultatene er tre uavhengige eksperimenter med n = 3-4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant histogrammer viser lysosome farging i splenic lymfocytter og thymocytes. Celler var farget med lysosome-spesifikke fargestoff i 30 min på 37 grader, etterfulgt av overflaten markør flekker. Fluorescerende signal farget celler ble kjøpt av flyt cytometer og analysert. (A) Lysosome farging av DN og DP thymocytes. (B) Lysosome farging av CD4SP og CD8SP thymocytes og splenic T celle populasjoner. ΔMFI = MFI (Lysosome farging) - MFI (FMO). Den solide grønne linjen representerer lysosome flekker, den heltrukne blå linjen viser FMO, og den stiplede røde linjen representerer mener fluorescens intensiteten av lysosome farging i hver befolkningen. Resultatene er representant for et eksperiment med n = 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Multicolor flyt cytometri panel design. Fluorochrome og konsentrasjonen av antistoffer/organelle fargestoffer i flekker blandinger er oppført her. Det anbefales sterkt å sjarmere og teste hver antistoff når innfatning opp ny flekker paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen kombinerer organelle-spesifikke fargestoffer og overflate markør flekker for å kvantifisere mitokondrier eller lysosomer i ulike T celle populasjoner. Denne metoden ble utviklet for å overvinne begrensning av celle nummer og homogenitet krav til tradisjonelle metoder, for eksempel elektronmikroskop og immunoblot analyse. Det er spesielt nyttig i analysere sjeldne celle populasjoner og samtidig undersøker flere celletyper samtidig.
Hele prosedyren og temperaturen i inkubasjonstiden er de viktigste faktorene i denne protokollen. Riktig organelle merking krever nøyaktig Serine organelle-spesifikke fargestoffer. Cellene må også strengt holdes på is forbedre levedyktighet og unngå antistoff capping og internalisering. I tillegg er fluorescens av disse organelle-spesifikke fargestoffer utsatt for lys eksponering og temperatur endringer. Dermed er umiddelbar analyse av eksempler Når flekker prosedyren er ferdig svært viktig. Vi har konsekvent vært i stand til å fullføre hele eksperimentet innen 2 timer.
Siden denne protokollen er avhengig av evnen til å oppdage multicolor fluorescens av flyt cytometer å vurdere intracellular komponenter, overlapper oppkjøp innstillingene (f.eks avdrag spenninger) og erstatning av spectra (ringvirkninger av fluorescens i nabolandet kanaler) kan sterkt påvirke intensiteten av signalet. Dette er spesielt relevant når overflate markører for å identifisere de relevante celletyper øker over seks. I denne situasjonen blir erfaring i å designe multicolor flyt cytometri eksperimenter svært viktig for høykvalitets datainnsamling.
Immunsystemet beskytter kroppen mot patogen fornærmelser og infeksjoner og T celle aktivering har avgjørende rolle i å gi vesentlige signaler til andre immunceller. Nyere studier tyder på at ulike T celle populasjoner har unike metabolske programmer og mitokondrie og lysosomale innholdet er avgjørende indikatorer på metabolske forandringer. Dette fenomenet er imidlertid ikke enestående for T-celler. Differensiering og aktivering av medfødte immunceller, som macrophage og dendrittiske celler, er også nært knyttet til sine metabolske status23,24. Fordelen med denne protokollen er at det kan tilpasses til å undersøke noen celle populasjoner av interesse ved hjelp av antistoffer mot slektslinje kundespesifikk markører. Videre, i kombinasjon med andre organeller-spesifikke fargestoffer, som ER - eller Cyto-ID, har det potensial til å evaluere ulike organeller eller cellular rom i ulike typer celler.
Etableringen mitokondrier eller lysosome kvantifisering metoden er ikke bare instrumental å studere metabolismen i T-celler, men også har et stort potensial til forskning som fokuserer på metabolske forandringer i sykdom innstillinger, for eksempel kreft eller autoimmune sykdommer25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Utviklingen av denne protokollen ble støttet av tilskudd fra Taiwan departementet for vitenskap og teknologi (de fleste) NSC103-2320-B-010-002-MY2 og MOST104-2628-B-010-002-MY4 til CL Hsu. CW Wei er en utmerket oppgaven Award i Institutt for mikrobiologi og immunologi, National Yang-Ming University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
