Summary
Este artículo ilustra un método eficaz para cuantificar las mitocondrias o lisosomas en las células vivas. La combinación de tintes específicos lisosomas o las mitocondrias con fluorescente conjugados anticuerpos contra marcadores de superficie permite la cuantificación de estos orgánulos en poblaciones de mezclado de la célula, como células primarias extraídas muestras de tejido, mediante el uso de Citometría de flujo multicolor.
Abstract
Las células de T utilizan diferentes programas metabólicos para que coincida con sus necesidades funcionales durante la diferenciación y proliferación. Las mitocondrias son componentes celulares cruciales responsables de suministro de energía de la célula; sin embargo, las mitocondrias exceso también producen especies reactivas de oxígeno (ROS) que podrían causar la muerte celular. Por lo tanto, el número de mitocondrias debe ajustarse constantemente para satisfacer las necesidades de las células. Esta regulación dinámica se consigue en parte mediante la función de los lisosomas que eliminar macromoléculas y organelos superávit o dañado. Por lo tanto, contenido lisosomal y mitocondrial celular es indicadores clave para evaluar la regulación metabólica de las células. Con el desarrollo de sondas para organelos, bien caracterizado lisosoma o tintes específicos de las mitocondrias se han convertido en disponibles en varios formatos para etiquetar las mitocondrias y los lisosomas celulares. Citometría de flujo multicolor es una herramienta común a fenotipos de células de perfil y tiene la capacidad de integrarse con otros ensayos. Aquí, presentamos un protocolo detallado de cómo combinar tintes organelas específicas con marcadores de superficie de tinción para medir la cantidad de lisosomas y mitocondrias en la célula de T de diferentes poblaciones en un citómetro de flujo.
Introduction
La activación y proliferación de células T son pasos críticos para montar respuesta inmune exitosa. Los avances recientes sugieren que el metabolismo celular está estrechamente asociado con el desarrollo y funciones de las células. Por ejemplo, las células Naive T dependen en gran medida fosforilación oxidativa (OXPHOS) para satisfacer la demanda de energía durante la recirculación entre los órganos linfoides secundarios. Tras la activación, ingenuo T células sufren drásticas reprogramación metabólica, incluyendo la inducción de la glucólisis aeróbica para aumentar la producción de ATP y para satisfacer las demandas metabólicas tremenda durante la proliferación y diferenciación celular. Las células que no siga a través de las necesidades metabólicas mueren por apoptosis1,2. Durante la reprogramación metabólica, las mitocondrias tienen un papel importante ya que son los organelos en gran parte responsables de la producción de ATP para suministrar energía para la célula, y el contenido de la mitocondria celular fluctúa durante cambios metabólicos a lo largo del desarrollo y la activación de la célula de T3. Sin embargo, la acumulación de mitocondrias superfluas o dañadas puede producir exceso ROS que dañan los lípidos, proteínas y ADN y eventualmente puede conducir a la célula de la muerte4
La mitocondria excesiva o daña resultante de alteraciones del metabolismo es eliminada mediante una forma especializada de autofagia5, conocida como mitofagia. Las mitocondrias son envuelto por autophagosomes y luego se fusionan con lisosomas para su degradación. Estos cierran comunicaciones entre mitocondrias y lisosomas han generado gran interés6,7. Por ejemplo, el estrés oxidativo estimula las mitocondrias para formar vesículas derivadas de las mitocondrias (MDVs) que se dirigen a los lisosomas para su degradación en un homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN)-inducida supuesta quinasa 1 (PINK1) y parkin (un E3 ubiquitina ligasa) manera dependiente8. Se encontró también que mitofagia es esencial para la transición de color beige con blanco adipocito9,10. Lisosomas son lo más importante, no sólo un compartimiento de degradación, pero también un regulador de la señalización celular. Acumulación de sustrato excesiva debido a las deficiencias de la enzima resulta en disfunción lisosomal alteran la permeabilidad de la membrana lisosomal y afecta a Ca2 + homeostasis11. Los defectos funcionales de la célula de T en la lipasa ácida lysosomal (LAL)12 o lysosomal metabolito transportador knockout mouse modelo13 adicional demostraron la importancia de los lisosomas en el mantenimiento de la homeostasis de la célula de T. Lisosomas y las mitocondrias son partes inseparables de regulación metabólica celular. Por lo tanto, la medición del contenido mitocondrial celular ha sido un indicador fundamental para evaluar el estado metabólico y funcional de la célula de T.
Ensayos usados para cuantificar el contenido lisosomal o mitocondrial celular incluyen immunoblot, microscopía electrónica, tinción de inmunofluorescencia (IF) y análisis por PCR de mitocondrial ADN copia números14,15, 16. mientras immunoblot puede comparar cuantitativamente los niveles de proteínas en diferentes muestras y electrón o si la microscopia puede visualizar las características morfológicas de estos organelos17, estos ensayos tienen ciertos inconvenientes técnicos. Por ejemplo, es mucho tiempo para adquirir un número suficiente de imágenes de células con alta magnificación y resolución o para comparar los niveles de expresión de una proteína a través de decenas de muestras, hacer estos ensayos considerados métodos de bajo rendimiento. Además, estos ensayos pueden aplicarse sólo a la población celular homogénea, como líneas celulares, pero no a las muestras de tejido que se componen de poblaciones mixtas.
También es difícil para estos ensayos se aplican a poblaciones raras, para que el requisito de la mínima célula números de 106 a 108 es imposible de cumplir. Finalmente, las células son generalmente lisis o fijo durante el proceso, lo que los hace incompatibles con otros métodos para extraer más información. En comparación con los métodos tradicionales, citometría de flujo fluorescente-basado tiene un relativamente alto rendimiento - la información de todas las células dentro de una muestra compuesta por poblaciones de mezclado de la célula puede ser analizada y recopilada simultáneamente. Además, uno puede detectar más de 10 parámetros en la misma celda y ordenar las células basadas en fenotipos deseados para otros ensayos. Sondas fluorescentes reactivas han sido usadas para etiqueta de lisosomas y mitocondrias en células vivas y pueden ser detectadas por el flujo cytometry18,19. Estas sondas específicas de organelo celular permeable y tengan características fisico-químicas que permiten que se concentre en localizaciones subcelulares específicas u organelos. Convenientemente, estas sondas están disponibles en varios formatos fluorescentes, lo que permite su aplicación para el análisis multicolor.
Este protocolo describe en detalle cómo combinar marcador superficial de tinción con colorantes específicos lisosomas o las mitocondrias a los lisosomas de etiqueta o viven de las mitocondrias en las células. Esto es especialmente útil para muestras generadas de los principales tejidos y órganos, que a menudo se componen de poblaciones celulares heterogéneas. Los investigadores pueden identificar poblaciones celulares de interés por su expresión superficial del marcador y medir específicamente el contenido lisosomal o mitocondrial a través de tintes de organelas específicas en estas células. Aquí, demostramos el procedimiento detallado de análisis cytometric del flujo que evalúa la masa lisosomal o mitocondrial en las subpoblaciones principales esplénico T cell.
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Protocol
El procedimiento de cosecha de tejido de ratón descrito aquí ha sido aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Nacional de Yang Ming.
1. preparación de la suspensión de linfocitos de órganos linfoides
- Eutanasia el ratón por un método aprobado como inhalación de CO2 en una cámara de acrílico transparente seguida por dislocación cervical para asegurar la muerte.
Nota: Mantener la tasa de flujo de CO2 para un desplazamiento de 20% por minuto de la cámara y no superior a 5 psi (libra por pulgada cuadrada). Tarda 2-3 minutos para un ratón a perder el conocimiento. Mantener el flujo de CO2 por lo menos durante 1 minuto después de que el animal ha dejado de respirar (5-7 min total). - Coloque el ratón en su parte posterior sobre un tablero limpio (por ejemplo, un tablero de plástico de poliestireno) y fijar las extremidades con cinta. Enjuagar con etanol al 70%.
- Bazo de la cosecha, cortar y abrir la cavidad abdominal con tijeras de disección de 11 cm (el bazo está debajo del estómago y sobre el riñón izquierdo). Extirpar el bazo con pinzas y limpieza de los tejidos conectivos (utilizar tijeras si es necesario).
- Para el timo de la cosecha, cortar el diafragma y las costillas de ambos lados con tijeras de disección. Utilice pinzas para levantar el esternón a la cavidad torácica completa. Separar cuidadosamente el timo de los tejidos circundantes con las tijeras y retirar cualquier tejido conectivo residual en una toalla de papel humedecida con PBS.
- Disocian mecánicamente los tejidos con un émbolo de la jeringa en un recipiente de 6 cm que contiene 5 mL de tampón de FACS helada (PBS suplementadas con 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1 mM EDTA). Transferir la suspensión unicelular a un tubo de centrífuga de 15 mL; lavar el plato de 6 cm con buffer adicional 2 mL FACS y combinar el lavado con suspensión de la célula.
- Centrifugue la suspensión de células (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) y descarte el sobrenadante. Resuspender el sedimento con 2 mL de amonio cloruro de potasio (ACK), lisis (155 m m de NH4Cl, 10 mM KHCO3 y 0,1 mM de Na2EDTA) buffer durante 1 min a temperatura ambiente (RT) para lisar los glóbulos rojos. Neutralizar el búfer ACK añadiendo 10 mL de tampón de FACS para la suspensión de células.
- Centrifugue la suspensión de células (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) y descarte el sobrenadante. Resuspenda las células en 5 mL de Medio RPMI completo (Medio RPMI 1640, suplementado con NaHCO3de 44 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES), 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1% MEM no esenciales aminoácidos y 10% FBS).
- Suspensión de la célula del filtro a través de un colador celular (poro tamaño 70 μm) para eliminar grupos de células. Contar celdas con un hemocitómetro o contador de células automatizado.
2. cuantificación de las mitocondrias y lisosomas
Nota: Realizar el tinte de organelas específicas tinción primero porque la condición tinción óptima para estos tintes es incubación a 37 ° C. La coloración superficial del marcador puede reducirse significativamente debido a anticuerpos que capsula e internalización a esa temperatura.
- Añadir 1 x 106 células FACS tubos de fondo redondo, centrifugar las células (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) y deseche el sobrenadante.
- Diluir las soluciones stock de sonda a concentración final de trabajo (100 nM MitoTracker Green o LysoTracker Green; en lo sucesivo mitocondria lisosoma-específicas o tinte, respectivamente) en medio de cultivo libre de suero con 37 ° C. Esta es la solución de tinte específico lisosomas o las mitocondrias.
Nota: Para probar múltiples concentraciones incluyendo el rango de concentraciones de trabajo sugerido por el fabricante (20-200 nM para el colorante específico de las mitocondrias) y 50-75 nM para el tinte de lisosoma específico utilizado aquí para obtener la mejor eficiencia de coloración. Elegir una población celular que se sabe que tiene buena expresión de destino (por ejemplo, lisosomas) como control positivo de la tinción (por ejemplo humanos CD14+ monocitos). Elegir la concentración de trabajo basada en la buena separación entre negativo y positivo de tinción, así como viabilidad celular buena. - Resuspender las células en 100 μl de lisosoma mitocondria-específicas o solución de trabajo del tinte e incuban en 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 15 min o 30 min, respectivamente.
- Añadir 1 mL de tampón de FACS helada para detener la reacción. Pellet de células por centrifugación (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) y descartar el sobrenadante. Las células están listas para la coloración superficial del marcador.
3. manchas de marcador superficial
- Receptores de Fc de bloque con 100 μl de 2.4G2 previamente valorada hibridoma sobrenadante en el hielo para las celdas de lavado de 10 minutos con 1 mL de tampón FACS y centrífuga (300 x g, durante 5 min a 4 ° C). Deseche el sobrenadante.
- Incubar las células con 50 μl combinación de anticuerpo conjugado con fluorescencia previamente valorada en tampón FACS en el hielo durante 20 min Evite luz.
Nota: Preparar células teñidas de color que incluyen todos los anticuerpos fluorescentes presentan en el anticuerpo de combinación y las células trataron solamente con tinte de organelas específicas para ajustar los voltajes de cada ajuste de detector y compensación de fluorescencia en el flujo de citómetro. Asimismo, preparar la fluorescencia menos uno (FMO) como controles de fondo mediante el uso de células teñidas con los anticuerpos, pero sin tinción con tintes de organelas específicas. - Lavar las células añadiendo 1 mL de tampón FACS y pellets por centrifugación (300 x g, durante 5 min a 4 ° C). Deseche el sobrenadante.
- Resuspender las células en 300 μL de tampón FACS que contiene yoduro de propidio de 1 μg/mL (PI) y analizar inmediatamente las muestras en citómetro de flujo.
4. muestra colección en citómetro de flujo
- Encienda el ordenador, citómetro de flujo, software de adquisición de FACS y otros dispositivos de accesorio dependiendo de la plataforma de la máquina. Ejecutar PBS para alrededor de 1 minuto para asegurar la línea de flujo se llena con tampón PBS y la vaina. Asegúrese de que la corriente de flujo funciona sin problemas.
- Abrir nuevo experimento y seleccionar los parámetros de la citometría (detectores fluorescentes) según instrucciones del fabricante. Filtro de las células a través de colador de celular de 70 μm y vortex antes de la adquisición de cada muestra para evitar grumos y formación de doblete.
- Hacer punto parcelas forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC), que representan el tamaño de la célula y granularidad, respectivamente. Optimizar los voltajes de FSC y SSC para asegurarse de que las células de interés aparecen en las parcelas. Hacer diagramas de punto de FSC y FSC-W (o FSC-H) y dibuja una puerta para las células.
- Hacer diagramas de punto de cada parámetro fluorescente. Utilizar células sin manchas para determinar la señal de fondo y solo controles teñidos de color para ajustar los voltajes de cada parámetro fluorescente, para que poblaciones de células positivas y negativas son claramente distinguibles y dentro de la gama dinámica de la adquisición.
- Después de ajustan todos los voltajes, utilice compensación automática si está disponible, o ajustar manualmente la compensación con controles teñidos de color sin manchas y solo para corregir el derrame espectral. La indemnización se aplica a las muestras.
- Hacer un diagrama de punto de cada parámetro y elaboración de puertas según su sistema experimental. Por ejemplo, FSC y FSC-H (o FSC-W) excluir dobletes, seguido por la FSC-A vs SSC-A para bloquear linfocitos; SSC-A vs PI (células vivas) y CD4 y CD8 (figura 1).
- Recoge suficientes eventos (número total de la célula) para la comparación significativa entre poblaciones. Por lo general, menos de 1.000 eventos en la población de interés necesitan obtener20.
- Después de todas las muestras son adquiridas, exportar los datos de flujo para ser analizadas por el software de análisis de citometría de flujo. Guardar el experimento como plantilla para conservar la configuración de citómetro y parámetros para aplicar a experimentos similares en el futuro.
5. Análisis de datos
Nota: Hay muchas herramientas para analizar datos de citometría de flujo, software libre y comercial. También puede trabajar el software de adquisición de los citómetros de flujo para análisis de datos. Aquí utilizamos FlowJo como ejemplo.
- Inicie el software y arrastrar los archivos de la FCS en el espacio de trabajo. Haga clic en una muestra para abrir una ventana gráfica. Seleccionar los parámetros para ser presentado en el eje X e Y haciendo clic en los ejes X e Y. Utilice la barra de herramientas para dibujar puertas según marcadores diferencialmente expresados o fenotipos definidos de poblaciones celulares.
- Añadir puertas de cada parámetro como se muestra en la figura 1. Arrastre puertas a todas las muestras en el espacio de trabajo, por lo que consiguen idénticos que bloquean.
- Arrastre las parcelas a editor de layout para crear informes gráficos.
- Mostrará la intensidad de fluorescencia media (IFM) para cada población de interés mediante clic en el botón estadísticas (Σ) en una ventana gráfica y elegir "Significa" y el parámetro, por ejemplo, el canal utilizado para detectar tinte orgánulo específico. Haga clic en "Agregar".
- Haga clic en el icono de editor de tabla y arrastre MFI al editor de la tabla para crear informes estadísticos. Guardar como archivo de Excel, texto o CSV para calcular delta MFI (ΔMFI) como IMF (organelas específicas tintes) - MFI (FMO).
Nota: No calcular la IMF entre muestras adquiridas con citómetro de diferentes parámetros (tensión, canales de fluorescentes o compensación). Las comparaciones de valores derivados de experimentos con diferentes ajustes son sin sentido y sesgada. - Exportar todos los valores desde el área de trabajo y de la parcelas desde el editor de diseño para la fabricación de tablas y figuras.
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Representative Results
Identificación de subconjuntos principales de la célula T en bazo y timo
En breve, suspensiones de la célula del bazo y el timo fueron lisis de glóbulos rojos, se incubaron con sobrenadante 2.4G2, seguidos por organelas específicas tinte y superficial del marcador tinción con anticuerpos conjugados con fluorescencia (tabla 1). La progresión en el desarrollo de los timocitos puede describirse usando los anticuerpos a los receptores Co CD8 y CD4. Los timocitos más inmaduros no expresan CD4 o CD8 y se llaman doble negativos (DN). Luego, para arriba-regular el CD4 y CD8 y se convierten en doble positivo (DP). Finalmente, abajo-regulan CD4 o CD8 y se convierten en solo positivo (SP) células maduras listas para dejar el órgano. Las primeras etapas de desarrollo de las células T, cuando las células no expresan los receptores Co CD4 y CD8, se pueden clasificar más lejos sobre la base de expresión CD44 y CD25. Los primeros progenitores son CD44+ CD25– (DN1), y luego expresan CD25 y CD44 a ser+CD25+ (DN2) las células. Después de eso, las células de abajo-regulan CD44 y CD44 a ser–CD25+ (DN3) las células y, finalmente, abajo-regulan CD25 así para convertirse en CD44–CD25– (DN4) células que se encuentran en la manera de expresar CD4 y CD8 y convertirse en células de doble positivo (DP).
En el bazo, los linfocitos T pueden dividirse en citotóxicas CD8+ y helper CD4+ T las células. Ambos de estas poblaciones pueden ser divididas en ingenuo, memoria y efectoras subconjuntos basados en CD62L y CD44 tinción. La estrategia bloquea detallada se muestra en la figura 1.
Cuantificación de la masa de las mitocondrias en la célula de T diferentes subconjuntos
Mitocondrias-específicos de colorantes fueron utilizados para medir la cantidad de mitocondrias en la célula de T poblaciones. Encontramos que el contenido mitocondrial fueron los más bajos de DN1, DN2 DN3, alcanzó ligeramente disminuyó en timocitos DN4 y DP y fueron incluso inferior en timocitos CD4 y CD8 SP (figura 2A). Sin embargo, los timocitos CD4 o CD8 SP tenían mitocondrias mayor IMF la coloración de las células CD4 o linfocitos T CD8 esplénicas (figura 2B). Estas observaciones sugieren que el contenido mitocondrial fluctúa durante el desarrollo de la célula de T con timocitos inmaduros que contienen más mitocondrias que sus contrapartes maduros y las células ingenuas T que recirculan en sangre rica en oxígeno tienen incluso más bajo masa mitocondrial. Curiosamente, esta reducción de contenido mitocondrial fue más prominente en los CD8 que del linaje de T CD4 (figura 2B), y activación de células T más lo disminuyó. Entre activado células de T, CD4+ las células de memoria T tenían un poco más mitocondrias en comparación con los efectores; sin embargo, lo contrario es el caso de CD8+ T células: CD8+ células T memoria tenían la masa mitocondrial más baja entre todos los subconjuntos de la célula de T (figura 2B).
Medición de contenido lisosomal en diferentes subpoblaciones de células T
Usando colorante específico de lisosoma, observamos relativamente baja, pero detectable, contenido lisosomal en todas las poblaciones de la célula de T, con más presencia de lisosomas en timocitos DN1 (figura 3A). No se encontraron diferencias significativas entre los subconjuntos de timocitos de DN1 adelante. En la periferia, se encontró un número relativamente alto de lisosomas en memoria y efectoras CD8+ T las células. Este fenómeno está en consonancia con estudios anteriores que muestran que activa CD8+ T las células aumentaron la expresión de la proteína de la membrana lisosomal asociada 1 (lámpara-1)21,22, reflejando su posesión de gránulos lisosomales citotóxicos (figura 3B)
Figura 1 : Compuerta estrategia de esplénicos linfocitos y timocitos. Las células fueron previamente cerradas en FSC/SSC y PI– para obtener camisetas vivo. (A) Total timocitos de ratones fueron manchados y CD4, CD8, CD44, CD25. Expresiones de CD4 y CD8 se solían distinguir CD4+CD8– SP, CD4–CD8+ SP, CD4+CD8+ DP y CD4–CD8 subconjuntos de DN de– . El CD4–CD8 subconjunto de DN de– se divide en CD44+CD25– DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44–CD25+ DN3 y CD44–CD25– DN4 subpoblaciones. (B) Total esplenocitos de ratones fueron manchados con TCRβ, CD4, CD8, CD44 y CD62L. Las células TCRβ+ se separaron en CD4+ y CD8+ T las células que se dividen en ingenuo (CD44–CD62L+), memoria (CD44+CD62L+) y efectoras (CD44+CD62L -) poblaciones. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes con n = 3-4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Representante histogramas mostrando las mitocondrias la coloración en cada población celular. Las células se tiñeron con colorante específico de las mitocondrias durante 15 min a 37 ° c, seguido por la coloración superficial del marcador. Señal fluorescente de células fue adquirida por el citómetro de flujo y analizado. (A) coloración de las mitocondrias de timocitos DN y DP. (B) las mitocondrias coloración de timocitos CD4SP y CD8SP y poblaciones de la célula de T esplénico. ΔMFI = IMF (tinción de mitocondrias) - MFI (FMO). La línea roja continua representa las mitocondrias la coloración, la línea azul muestra el control de la FMO, y la línea roja punteada representa la intensidad de fluorescencia media de mitocondrias la coloración en cada población. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes con n = 3-4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: histogramas representativos mostrando lisosoma tinción en linfocitos de bazo y en timocitos. Las células fueron teñidas con tinte de lisosoma específicos durante 30 min a 37 ° c, seguido por la coloración superficial del marcador. Señal fluorescente de células fue adquirida por el citómetro de flujo y analizado. (A) lisosoma coloración de timocitos DN y DP. (B) lisosoma coloración de timocitos CD4SP y CD8SP y poblaciones de la célula de T esplénico. ΔMFI = IMF (lisosoma manche) - MFI (FMO). La línea verde representa coloración lisosoma, la línea azul muestra FMO, y la línea roja punteada representa la intensidad de fluorescencia media de lisosoma coloración en cada población. Los resultados son representativos de un experimento con n = 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: diseños de panel de citometría de flujo Multicolor. El fluorocromo y la concentración de anticuerpos/organelo tintes en las mezclas de tinción se enumeran aquí. Se recomienda valorar y probar cada anticuerpo al configurar nuevos paneles de la coloración.
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Discussion
Este protocolo combina tintes específicos de organelas y marcador superficial de coloración para cuantificar la cantidad de mitocondrias o lisosomas en poblaciones de células T diferentes. Este método fue desarrollado para superar la limitación de los requisitos de número y homogeneidad celular por métodos tradicionales, como la microscopia electrónica y el análisis de immunoblot. Es especialmente útil en el análisis de poblaciones celulares raros y examinar simultáneamente múltiples tipos de células al mismo tiempo.
La duración del procedimiento y la temperatura de incubación son los factores más importantes en el presente Protocolo. Organelo correcto etiquetado requiere titulación precisa de tintes de organelas específicas. Células deben mantenerse estrictamente en el hielo para mejorar la viabilidad y evitar anticuerpo capsular y la internalización. Además, la fluorescencia de estos tintes específicos de organelas es vulnerable a cambios de exposición y la temperatura de la luz. Así, el análisis inmediato de las muestras una vez terminado el procedimiento de tinción es muy importante. Siempre hemos sido capaces de completar el experimento entero dentro de 2 horas.
Puesto que este protocolo se basa en la capacidad de detectar fluorescencia multicolor por el citómetro de flujo para evaluar componentes intracelulares, la configuración de la adquisición (por ejemplo, tensiones de la PMT) y la compensación de los espectros superponen (el derrame de fluorescencia a las vecinas canales) puede influir fuertemente la intensidad de la señal. Esto es especialmente relevante cuando los marcadores superficiales necesarios para identificar los tipos celulares relevantes aumentan por encima de seis. En esta situación, experiencia en el diseño de experimentos de citometría de flujo multicolor se convierte en muy importante para la adquisición de datos de alta calidad.
El sistema inmune protege al organismo de infecciones y de insultos de patógeno, y activación de células T tiene un papel fundamental en la prestación esenciales señales a otras células inmunes. Estudios recientes sugieren que poblaciones de células T diferentes programas metabólicos únicos, y el contenido lisosomal y mitocondrial es fundamentales indicadores de cambios metabólicos. Sin embargo, este fenómeno no es exclusivo de las células T. La diferenciación y activación de células inmunes innatas, como macrófagos y células dendríticas, están también estrechamente relacionados con su estado metabólico23,24. La ventaja de este protocolo es que se puede adaptar para examinar cualquier poblaciones celulares de interés mediante el uso de anticuerpos específicos contra los marcadores específicos del linaje. Además, en combinación con otros tintes de organelas específicas, tales como ER - o Cyto-ID, tiene el potencial para evaluar distintos orgánulos o compartimentos celulares en varios tipos de células.
El establecimiento de esta mitocondria lisosoma método de cuantificación no es sólo instrumental para estudiar el metabolismo en las células T, pero también tiene un gran potencial en beneficio de la investigación que se centra en cambios metabólicos en la configuración de la enfermedad, como cáncer o enfermedades autoinmunes25,26.
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Disclosures
Los autores declaran no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
El desarrollo de este protocolo fue apoyado por becas de Taiwán Ministerio de ciencia y tecnología (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 y MOST104-2628-B-010-002-MY4 a C.L. Hsu. C.W. Wei es un receptor de excelente tesis Premio del Instituto de Microbiología e Inmunología, Universidad Nacional de Yang Ming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
