Summary
Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.
Abstract
T-cellen maken gebruik van verschillende metabole programma's op maat van hun functionele behoeften tijdens de differentiatie en proliferatie. Mitochondriën zijn cruciale cellulaire componenten verantwoordelijk voor het verstrekken van de energie van de cel; overtollige mitochondriën produceren echter ook reactieve zuurstof soorten (ROS), die leiden celdood tot kan. Het aantal mitochondriën moet daarom voortdurend worden aangepast aan de noden van de cellen. Deze dynamische verordening wordt ten dele bereikt door de functie van lysosomen dat overschot/beschadigde organellen en macromoleculen verwijderen. Vandaar, cellulaire mitochondriale en lysosomale inhoud zijn belangrijke indicatoren voor de evaluatie van de metabole aanpassing van cellen. Met de ontwikkeling van sondes voor organellen, zijn goed gekarakteriseerd lysosoom of mitochondriën-specifieke kleurstoffen beschikbaar gekomen in verschillende formaten om te etiketteren cellulaire lysosomen- en mitochondriën. Multicolor stroom cytometry is een gemeenschappelijk instrument om profiel cel fenotypen, en heeft de mogelijkheid om te worden geïntegreerd met andere testen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol over het organel-specifieke kleurstoffen combineren met oppervlakte markeringen voor het meten van de hoeveelheid lysosomen- en mitochondriën in andere T-cel populaties op een stroom cytometer kleuring.
Introduction
De activering en de proliferatie van T cellen zijn kritische stappen voor de montage van de succesvolle immuunrespons. Recente vooruitgang suggereren dat het cellulaire metabolisme strak gekoppeld aan zowel de ontwikkeling en de functies van T-cellen is. Bijvoorbeeld, vertrouwen naïef T cellen grotendeels op oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) om te voldoen aan de vraag naar energie tijdens de recirculatie onder secundaire lymfoïde organen. Na activatie ondergaan naïef T cellen drastische metabole herprogrammering, met inbegrip van de inductie van aërobe glycolyse ATP productie te verhogen en om te voldoen aan de enorme metabole eisen tijdens celdifferentiatie en proliferatie. De cellen die niet te volgen via de metabolische behoeften sterven door apoptosis1,2. Tijdens de metabole herprogrammering, spelen mitochondria een belangrijke rol omdat zij de organellen grotendeels verantwoordelijk voor de productie van ATP om energie voor de cel, en de inhoud van de cellulaire mitochondriën tijdens metabole schakelaars schommelt in de gehele T cel ontwikkeling en activering3. Echter, de accumulatie van overtollige of beschadigde mitochondriën overtollige ROS die schade van DNA, lipiden en proteïnen, en kan uiteindelijk leiden tot de dood4 cel kan produceren
De mitochondriën van het overmatig of beschadigd ten gevolge van metabolische omzetting worden verwijderd door een gespecialiseerde vorm van autophagy5, bekend als mitophagy. Mitochondriën zijn verpakt door autophagosomes en vervolgens gesmolten met lysosomen voor afbraak. Dit sluit communicatie tussen mitochondriën en lysosomen hebben gegenereerd grote belangstelling6,7. Bijvoorbeeld, oxidatieve stress stimuleert mitochondriën om te vormen van de mitochondriën-derived vesicles (MDVs) die op lysosomen voor afbraak in een fosfatase en Tenzin homolog (PTEN gericht zijn)-geïnduceerde putatief kinase 1 (PINK1) en parkin (een E3 ubiquitin ligase) afhankelijke wijze8. Ook bleek dat mitophagy is essentieel voor beige-naar-wit adipocyte overgang9,10. Nog belangrijker, zijn lysosomen niet alleen een aantasting van het compartiment, maar ook een regulator van cellulaire signalering. Buitensporige substraat accumulatie te wijten aan de tekortkomingen van het enzym leidt tot een lysosomale dysfunctie door het verstoren van de lysosomale membraan permeabiliteit en Ca2 + homeostase11beïnvloedt. De T cel functionele defecten in lysosomale zure lipase (LAL)12 of lysosomale metaboliet vervoerder knockout muis model13 bleek verder het belang van lysosomen in het handhaven van de T cel homeostase. Mitochondriën zowel lysosomen zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden delen van cellulaire metabole verordening. Daarom is de meting van het cellulaire mitochondriale een cruciale indicator om te evalueren van de T cel metabole en functionele status geweest.
Gebruikte te kwantificeren van cellulaire mitochondriale of lysosomale inhoud testen omvatten immunoblot, elektronenmicroscopie immunefluorescentie (IF) kleuring en PCR analyse van mitochondriaal DNA kopie nummers14,15, 16. terwijl immunoblot kwantitatief eiwitniveaus over verschillende monsters en elektron of vergelijken kan als microscopie morfologische kenmerken van deze organellen17kunt visualiseren, deze gehaltebepalingen dragen bepaalde technische nadelen. Bijvoorbeeld, is het tijdrovend te verwerven van voldoende aantal cel beelden met hoge vergroting en resolutie of wilt vergelijken in de niveaus van de expressie van een proteïne over tientallen monsters, maken deze gehaltebepalingen beschouwd als lage doorvoersnelheid methoden. Deze testen kunnen bovendien alleen worden toegepast, tot homogene celpopulatie, zoals cellijnen, maar niet tot weefselsteekproeven dat bestaat uit een gemengde bevolking.
Het is ook moeilijk toe te passen deze gehaltebepalingen op zeldzame populaties, waarvoor de eis voor minimale cel nummers van 106 tot 108 onmogelijk is om te voldoen aan. Ten slotte, cellen zijn meestal lysed of vaste tijdens het proces, waardoor ze onverenigbaar zijn met andere methoden verder om informatie te extraheren. Vergeleken met de traditionele methoden, TL gebaseerde stroom cytometry heeft een relatief hoge doorvoersnelheid - de informatie van alle cellen binnen een steekproef samengesteld van gemengde cel bevolking kan worden geanalyseerd en gelijktijdig verzameld. Daarnaast kan detecteren meer dan 10 parameters op dezelfde cel en sorteren van de cellen op basis van gewenste fenotypen voor verdere testen. Reactieve fluorescerende sondes zijn gebruikt om het label lysosomen- en mitochondriën in levende cellen en kunnen worden gedetecteerd door stroom cytometry18,19. Deze organel-specifieke sondes zijn cel doorlaatbare en fysisch-chemische eigenschappen die de mogelijkheid moet worden geconcentreerd in de specifieke subcellular locaties of organellen. Deze sondes zijn gunstig, beschikbaar in verschillende TL formaten, zodat hun toepassing voor multicolor analyse.
Dit protocol beschrijft in detail hoe combineren oppervlakte marker kleuring met lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen aan label lysosomen of mitochondriën in levende cellen. Dit is vooral handig voor monsters die zijn gegenereerd op basis van primaire weefsels en organen, die vaak bestaan uit heterogene cel populaties. Onderzoekers kunnen identificeren cel populaties van belang door hun oppervlakte marker-expressie en specifiek meten de lysosomale of mitochondrial inhoud via organel-specifieke kleurstoffen in deze cellen. Hier tonen we de gedetailleerde procedure voor flow cytometrische analyse die wordt geëvalueerd als de lysosomale of mitochondrial massa in de grote milt T cel subpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De muis weefsel oogst beschreven procedure hier is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de nationale universiteit van de Yang-Ming.
1. voorbereiding van de lymfocyt schorsing van lymfoïde organen
- De muis door een erkende methode zoals CO2 inademing in een transparant acryl kamer gevolgd door cervicale dislocatie om dood euthanaseren.
Opmerking: Houd het debiet van CO2 voor een verplaatsing van de 20% per minuut van de kamer, en niet hoger dan 5 psi (pond per vierkante inch). Het duurt 2-3 min voor een muis aan het bewustzijn verliezen. Gedurende de CO2 stroom ten minste 1 min nadat het dier is gestopt met ademen (5-7 min algemene). - Plaats de muis op de rug op een schoon bord (bijvoorbeeld een polystyreen plastic board) en monteren van de ledematen met tape. Spoel met 70% ethanol.
- Oogst van de milt, gesneden en openen van de buikholte met een 11-cm ontleden schaar (de milt is onder de buik en boven de linker nier). Verwijder de milt met pincet en reinig van bindweefsel (gebruik schaar indien nodig).
- Het verkrijgen van de zwezerik, knippen het middenrif en de ribbenkast aan weerszijden met het ontleden van de schaar. Gebruik pincet te verheffen van het borstbeen te onthullen de hele borstholte. Scheiden van de thymus zorgvuldig uit de omliggende weefsels met een schaar, en verwijder eventuele resterende bindweefsel op een papieren handdoek bevochtigd met PBS.
- Mechanisch distantiëren de weefsels met een zuiger van de spuit in een 6-cm schotel met 5 mL ijskoud FACS buffer (PBS aangevuld met 2% foetale runderserum (FBS) en 1 mM EDTA). Breng de eencellige een centrifugebuis 15 mL; wassen van de 6-cm schotel met extra 2 mL FACS buffer en de wash combineren met celsuspensie ook.
- Centrifugeer de celsuspensie (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 2 mL van Ammonium-Chloride-kalium (ACK) lysing van buffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 en 0.1 mM nb2EDTA) voor 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) lyse van de rode bloedcellen. Neutraliseer de ACK buffer door het toevoegen van 10 mL FACS buffer aan de celsuspensie.
- Centrifugeer de celsuspensie (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 5 mL van volledige RPMI medium (RPMI 1640 medium, aangevuld met 44 mM NaHCO310 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 100 U/mL penicilline, 100 mg/mL streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 1% MEM niet-essentiële aminozuren en 10% FBS).
- Filter celsuspensie door een zeef (porie grootte 70 µm) van de cel te verwijderen van de bosjes van de cel. Cellen tellen met een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.
2. kwantificering van Mitochondria en lysosomen
Opmerking: Voer het organel-specifieke kleurstof vlekken eerst omdat de optimale kleuring voorwaarde voor deze kleurstoffen incubatie bij 37 ° C. is De oppervlakte marker kleuring kan aanzienlijk worden verkleind door antilichaam aftopping en internalisering bij die temperatuur.
- 1 x 106 cellen om ronde-onderlaag FACS buizen, centrifugeer cellen (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) en weggeworpen toevoegen.
- Verdun de voorraadoplossingen van de sonde te werken eindconcentratie (100 nM MitoTracker Green of LysoTracker Green; voortaan mitochondriën - of lysosoom-specifieke kleurstof, respectievelijk) in serumvrij cultuurmedium voorverwarmde 37 ° C. Dit is de werkoplossing voor lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstof.
Opmerking: Test meerdere concentraties, met inbegrip van het aantal werkende concentraties voorgesteld door fabrikant (20-200 nM voor de mitochondriën-specifieke kleurstof) en 50-75 nM voor de lysosoom-specifieke kleurstof gebruikt hier om het verkrijgen van de beste kleuring van efficiëntie. Kies een celpopulatie die erom bekend te hebben goede uitdrukking voor de kleuring van de doelgroep (bijvoorbeeld lysosomen) als positieve controle (bijvoorbeeld menselijke CD14+ monocyten). Kies van de concentratie van de werken op basis van goede scheiding tussen positieve en negatieve kleuring, evenals een levensvatbaarheid van de goede cellen. - Resuspendeer de cellen in 100 µL van de lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstof werkoplossing en incubeer in 5% CO2 incubator bij 37 ° C voor 15 min of 30 min, respectievelijk.
- Voeg 1 mL ijskoud FACS buffer om te stoppen met de reactie. Pellet cellen door middel van centrifugeren (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) en weggeworpen. Cellen zijn nu klaar voor oppervlakte marker kleuring.
3. oppervlakte Marker kleuring
- Blok Fc receptoren met 100 µL van gepretitreerde 2.4G2 hybridoma supernatant op ijs voor 10 min. Wash cellen met 1 mL van FACS buffer en centrifuge (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C). Vloeistof wordt weggeworpen.
- Incubeer de cellen met 50 µL gepretitreerde fluorescentie-geconjugeerde antilichaam combinatie in FACS buffer op ijs gedurende 20 minuten licht.
Opmerking: Bereiden afzonderlijke kleur gebeitste cellen omvatten alle de fluorescerende antilichamen aanwezig in het antilichaam combinatie en cellen behandeld slechts organel-specifieke kleurstof voor het instellen van spanningen van elke fluorescentie detector en compensatie aanpassing op stroom cytometer. Op dezelfde manier bereiden de fluorescentie min één (FMO) als achtergrond controles met behulp van cellen met alle de antilichamen, maar zonder kleuring met organel-specifieke kleurstoffen gekleurd. - De cellen door toevoeging van 1 mL van FACS buffer en pellet door middel van centrifugeren (300 x g, voor 5 min bij 4 ° C) wassen. Vloeistof wordt weggeworpen.
- Resuspendeer de cellen in 300 µL van FACS buffer met 1 µg/mL propidium jodide (PI) en onmiddellijk het analyseren van de monsters op stroom cytometer.
4. sample collectie op stroom Cytometer
- Inschakelen van de computer, stroom cytometer, FACS acquisitie software en andere accessoire apparaten afhankelijk van het platform van de machine. Voer PBS voor ongeveer 1 minuut om de stroom lijn is gevuld met PBS en schede buffer. Zorg ervoor dat de stroom stroom op wieltjes loopt.
- Open nieuw experiment en selecteer cytometer parameters (fluorescerende detectoren) volgens instructies van de fabrikant. Filteren van cellen tot en met 70-µm cel zeef en vortex voorafgaand aan de overname van elk monster klontjes en doublet vorming te voorkomen.
- Maken van dot percelen van voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC), die respectievelijk Celgrootte en granulariteit, vertegenwoordigen. Optimaliseer de spanningen van de FSC en SSC om ervoor te zorgen dat de cellen van belang in de percelen worden weergegeven. Maken van de dot percelen van FSC-A vs. FSC-W (of FSC-H) en teken een poort voor de afzonderlijke cellen.
- Stip percelen van elke fluorescerende parameter maken Onbevlekt cellen worden gebruikt voor het bepalen van de achtergrond signaal en één kleur gebeitste besturingselementen gebruiken en aan te passen spanningen van elke fluorescerende parameter, zodat positieve en negatieve cel populaties duidelijk te onderscheiden zijn binnen het dynamisch bereik van de overname.
- Nadat alle de spanningen zijn ingesteld, gebruik van auto-compensatie indien beschikbaar, of handmatig aanpassen van de schadevergoeding met onbevlekt en één kleur gebeitste besturingselementen te corrigeren van de spectrale spill-over. Toepassing van de vergoeding op monsters.
- Maak een stip plot voor elke parameter en poorten volgens uw experimentele reeks stelt. Bijvoorbeeld FSC-A vs. FSC-H (of FSC-W) uit te sluiten van paren, gevolgd door FSC-A vs. SSC-A voor lymfocyt gating; SSC-A vs. PI (levende cellen) en CD4 vs. CD8 (Figuur 1).
- Het verzamelen van genoeg gebeurtenissen (totale celaantal) voor zinvolle vergelijking tussen populaties. Normaal gesproken moeten ten minste 1.000 gebeurtenissen in de bevolking van belang20worden verkregen.
- Nadat alle monsters zijn verworven, stroom gegevens exporteren naar door stroom cytometry analysesoftware worden geanalyseerd. Het experiment opslaan als sjabloon de cytometer instelling en de parameters voor de toepassing van soortgelijke experimenten in de toekomst te bewaren.
5. de gegevensanalyse
Opmerking: Er zijn veel tools om stroom cytometrische gegevens, zowel commercieel als vrije software te analyseren. De software van de overname van de flow cytometers kan ook werken voor data-analyse. Hier wordt FlowJo gebruikt als voorbeeld.
- Start de software en sleep de FCS-bestanden naar de werkruimte. Klik op een voorbeeld om een grafisch venster te openen. Selecteer parameters worden gepresenteerd op X- en Y-as door te klikken op de X- en Y-assen. Gebruik de werkbalk om te tekenen poorten volgens differentially uitgedrukte markeringen of gedefinieerde fenotypes van cel populaties.
- Toevoegen van poorten van elke parameter zoals aangegeven in Figuur 1. Sleep poorten naar alle monsters in de werkruimte, zodat ze identiek gating.
- Sleep de percelen aan layout editor om grafische rapporten te maken.
- De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elke bevolking van belang weergeven door te klikken op de knop Statistieken (Σ) in een grafisch venster en "Verstaan" en de juiste parameter, bijvoorbeeld het kanaal gebruikt voor het opsporen van organel-specifieke kleurstof te kiezen. Klik vervolgens op "Toevoegen".
- Klik op het tabelpictogram editor en sleep MFI naar tabel editor om statistische rapporten te maken. Opslaan als Excel-, tekst- of CSV-bestand voor het berekenen van de delta MFI (ΔMFI) als MFI (organel-specifieke kleurstoffen) - MFI (FMO).
Opmerking: Kan niet berekenen MFI tussen monsters verworven met verschillende cytometer instellingen (spanningen, fluorescerende kanalen of compensatie). Vergelijkingen van de waarden die zijn afgeleid van experimenten met verschillende instellingen zijn zinloos en vooringenomen. - Alle waarden uit de werkruimte en de percelen van de redacteur van de lay-out exporteren voor het maken van tabellen en figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identificatie van belangrijke T cel subsets in de milt en de thymus
Kortom, waren eencellige schorsingen van de milt en de thymus lysed van rode bloedcellen, geïncubeerd met 2.4G2 supernatant, gevolgd door organel-specifieke kleurstof en oppervlakte marker kleuring met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (tabel 1). De ontwikkelingstoxiciteit progressie van thymocytes kan worden beschreven met behulp van antilichamen tegen de co receptoren CD8 en CD4. De meest onvolwassen thymocytes doen niet express CD4 of CD8 en dubbel negatief (DN) worden genoemd. Vervolgens zij omhoog-regelen zowel CD4 en CD8 en worden dubbele positief (DP). Tot slot zij down-reguleren CD4 of CD8 en worden volwassen enige positieve (SP) cellen klaar om te vertrekken van het orgel. De vroegste stadia van de ontwikkeling van de T cel, wanneer de cellen niet doen de co receptoren te uiten CD4 en CD8, kan verder worden geclassificeerd op basis van CD44 en CD25 expressie. De vroegste progenitoren zijn CD44+ CD25- (DN1), en dan beginnen met het uitspreken van CD25 en CD44 worden+CD25+ (DN2) cellen. Na dat, de cellen CD44 down-reguleren en worden CD44-CD25+ (DN3) cellen en ten slotte zij naar beneden-regelen CD25 alsook om te worden CD44-CD25- (DN4) cellen die op de weg naar CD4 en CD8 uitspreken en steeds dubbel-positieve (DP) cellen.
In de milt, de T-cellen kunnen worden onderverdeeld in cytotoxische CD8+ en helper CD4+ T cellen. Beide van deze populaties kunnen verder worden onderverdeeld in subsets van het naïef, effector en geheugen op basis van CD62L en CD44 vlekken. De gedetailleerde gating strategie is afgebeeld in Figuur 1.
Kwantificering van mitochondriën massa in verschillende T cel subsets
Mitochondriën-specifieke kleurstoffen werden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid mitochondriën in T-cel populaties. We vonden dat de mitochondriale inhoud de laagste in DN1 waren, DN2-DN3, bedroeg iets in de DN4 en DP thymocytes daalde en zelfs lager in CD4 en CD8 SP thymocytes(Figuur 2 waren). CD4 of CD8 SP thymocytes had echter hogere mitochondriën MFI kleuring dan milt CD4 of CD8 T cellen (Figuur 2B). Deze opmerkingen suggereren dat mitochondriale inhoud tijdens de ontwikkeling van de T cel met onrijpe thymocytes met meer mitochondriën schommelt dan hun oudere collega's doen, en de naïeve T-cellen die in zuurstofrijk bloed recirculate zelfs lager hebben mitochondriale massa. Interessant is dat deze reductie van de mitochondriale inhoud meer prominent in de CD8 dan de CD4 T-lijn (Figuur 2B) was, en T-cel activatie verder daalde het. Geactiveerd onder T-cellen, CD4+ T-geheugencellen had iets meer mitochondriën in vergelijking met effectoren; echter het tegendeel was het geval voor CD8+ T cellen: CD8+ T-geheugencellen had de laagste mitochondriale massa onder alle T cel subsets (Figuur 2B).
Lysosomale inhoud meting in verschillende subpopulaties van T cellen
Met behulp van lysosoom-specifieke kleurstof, waargenomen we relatief laag, maar aantoonbaar, lysosomale inhoud in alle T-cel populaties, met prominentere aanwezigheid van lysosomen in DN1 thymocytes (Figuur 3A). Geen significant verschil werd gevonden onder de thymocyte subsets van DN1 verder. In de periferie, bleek een relatief hoog aantal lysosomen in geheugen en effector CD8+ T cellen. Dit verschijnsel is in overeenstemming met eerdere studies waaruit blijkt dat geactiveerd van CD8+ T cellen steeg hun uitdrukking van lysosomale-geassocieerde membraan eiwit 1 (LAMP-1)21,22, als gevolg van hun bezit van Lysosomale-cytotoxische korrels (Figuur 3B)
Figuur 1 : Gating strategie van milt lymfocyten en thymocytes. Cellen waren vooraf gated op FSC/SSC en PI- om te verkrijgen live onderhemden. (A) de totale thymocytes van muizen werden gekleurd met CD4, CD8, CD44 en CD25. CD4 en CD8 uitingen werden gebruikt om te onderscheiden van CD4+CD8- SP, CD4-CD8+ SP, CD4+CD8+ DP, en CD4-CD8- DN deelverzamelingen. De CD4-CD8- DN deelverzameling was verder onderverdeeld in CD44+CD25- DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44-CD25+ DN3, en CD44-CD25- DN4 subpopulaties. (B) totale splenocytes van muizen werden gekleurd met TCRβ, CD4 CD8, CD44 en CD62L. De TCRβ+ cellen werden onderverdeeld in CD4+ en CD8+ T cellen, die waren onderverdeeld in naïef (CD44-CD62L+), geheugen (CD44+CD62L+), en effector (CD44+CD62L -) populaties. De resultaten zijn vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten met n = 3-4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief histogrammen tonen mitochondriën kleuring in elke celpopulatie. Cellen werden met mitochondriën-specifieke kleurstof gedurende 15 minuten bij 37 ˚C, gevolgd door het oppervlakte marker kleuring gekleurd. Fluorescerende signaal van gekleurde cellen werd overgenomen door stroom cytometer en geanalyseerd op. (A) Mitochondria kleuring van DN en DP thymocytes. (B) Mitochondria kleuring van CD4SP en CD8SP thymocytes en milt T-cel populaties. ΔMFI = MFI (mitochondriën kleuring) - MFI (FMO). De stevige rode lijn geeft mitochondriën kleuring, de ononderbroken blauwe lijn toont FMO aansturing, en de rode stippellijn geeft gemiddelde fluorescentie intensiteit van mitochondriën kleuring in elk volk. De resultaten zijn vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten met n = 3-4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger histogrammen tonen lysosoom kleuring in milt lymfocyten en thymocytes. Cellen werden gekleurd met lysosoom-specifieke kleurstof gedurende 30 minuten bij 37 ˚C, gevolgd door het oppervlakte marker kleuring. Fluorescent signaal van gekleurde cellen werd overgenomen door stroom cytometer en geanalyseerd. (A) lysosoom kleuring van DN en DP thymocytes. (B) lysosoom kleuring van CD4SP en CD8SP thymocytes en milt T-cel populaties. ΔMFI = MFI (lysosoom kleuring) - MFI (FMO). De solide groene lijn geeft lysosoom kleuring, de ononderbroken blauwe lijn toont FMO, en de rode stippellijn geeft gemiddelde fluorescentie intensiteit van lysosoom kleuring in elk volk. De resultaten representatief zijn voor een experiment met n = 5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: Multicolor stroom cytometry panel ontwerpen. De fluorescerende en concentratie van de antistoffen/organel kleurstoffen in de kleuring mengsels worden hier opgesomd. Het is raadzaam Titreer en testen van elke antilichaam bij het opzetten van nieuwe kleuring panelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol combineert organel-specifieke kleurstoffen en oppervlakte marker vlekken om te kwantificeren van het bedrag van de mitochondriën of lysosomen in andere T-cel populaties. Deze methode is ontwikkeld om te overwinnen de beperking van cel nummer en homogeniteit eisen voor traditionele methoden, zoals elektronenmicroscopie en immunoblot analyse. Het is vooral nuttig in zeldzame cel populaties te analyseren en gelijktijdig behandeling van meerdere celtypen tegelijk.
De duur van de procedure en de temperatuur van de incubatie zijn de meest cruciale factoren in dit protocol. Juiste organel labeling vereist nauwkeurige titratie van organel-specifieke kleurstoffen. Cellen moeten ook strikt worden gehouden op ijs de levensvatbaarheid verbeteren en antilichaam aftopping en internalisering te vermijden. Daarnaast is de fluorescentie van deze organel-specifieke kleurstoffen kwetsbaar voor lichte blootstelling en temperatuur veranderingen. Onmiddellijke analyse van monsters zodra de kleuring procedure wordt voltooid is dus zeer belangrijk. Wij hebben consequent geweest kundig voor vullen het hele experiment binnen 2 uur.
Aangezien dit protocol is gebaseerd op het vermogen van het opsporen van multicolor fluorescentie door stroom cytometer te evalueren van intracellulaire componenten, overlappen de overname-instellingen (bijvoorbeeld bet spanningen) en de compensatie van spectra (de spill-over van fluorescentie in naburige kanalen) kan sterk de intensiteit van het signaal beïnvloeden. Dit is met name relevant wanneer de oppervlakte markeringen die nodig zijn voor het identificeren van de relevante celtypes boven de zes verhogen. In deze situatie wordt ervaring in het ontwerpen van multicolor stroom cytometry experimenten zeer belangrijk voor hoge kwaliteit data-acquisitie.
Het immuunsysteem beschermt het lichaam tegen pathogeen beledigingen en infecties, en T-cel activatie heeft een centrale rol bij het verstrekken van essentiële signalen naar andere immune cellen. Recente studies suggereren dat andere T-cel populaties unieke metabole's hebt, en mitochondriale en lysosomale inhoud cruciale indicatoren van metabole veranderingen zijn. Dit verschijnsel is echter niet uniek voor T cellen. De differentiatie en de activering van het aangeboren immuun cellen, zoals macrophage en dendritische cellen, zijn ook nauw verbonden met hun metabole status23,24. Het voordeel van dit protocol is dat het aangepast worden kan aan elke cel populaties van belang bestuderen met behulp van antilichamen tegen geslacht-specifieke markeringen. Bovendien, in combinatie met andere organel-specifieke kleurstoffen, zoals ER - of Cyto-ID, het heeft de potentie om verschillende organellen of cellulaire compartimenten in verschillende soorten cellen te evalueren.
De oprichting van deze mitochondriën of lysosoom kwantificering methode is niet alleen instrumentaal studie van het metabolisme in de T-cellen, maar heeft ook een groot potentieel om te profiteren van onderzoek dat zich op metabole veranderingen in de instellingen van de ziekte, zoals kanker richt of auto-immune ziekten25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De ontwikkeling van dit protocol werd gesteund door subsidies van de Taiwan ministerie van wetenschap en technologie (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 en MOST104-2628-B-010-002-MY4 voor C.L. Hsu. C.W. Wei is een ontvanger van uitstekende Thesis Award Instituut van microbiologie en immunologie, National Yang-Ming University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
