Summary
Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.
Abstract
Células T utilizam diferentes programas metabólicos para combinar com suas necessidades funcionais durante a proliferação e diferenciação. As mitocôndrias são componentes celulares cruciais responsáveis pelo fornecimento de energia da célula; no entanto, as mitocôndrias em excesso também produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem causar morte celular. Portanto, o número de mitocôndrias constantemente deve ser ajustado para atender às necessidades das células. Este regulamento dinâmico é alcançado em parte através da função de lisossomos que removem macromoléculas e organelas excedente/danificado. Portanto, o conteúdo mitocondrial e dos lisossomos celular é indicadores-chave para avaliar a adaptação metabólica das células. Com o desenvolvimento de sondas para organelas, bem caracterizada lisossoma ou corantes específicos de mitocôndrias tornaram-se disponíveis em vários formatos para rotular as mitocôndrias e lisossomos celulares. Citometria de fluxo multicolor é uma ferramenta comum de fenótipos de célula de perfil e tem a capacidade de ser integrado com outros ensaios. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado de como combinar os corantes específicos organela com marcadores de superfície coloração para medir a quantidade de lisossomos e mitocôndrias em populações diferentes de células T em um citômetro de fluxo.
Introduction
A ativação e proliferação de células T são passos críticos para a montagem de sucesso respostas imunes. Avanços recentes sugerem que o metabolismo celular é fortemente associado com o desenvolvimento e as funções das células T. Por exemplo, ingênuo T células dependem em grande parte a fosforilação oxidativa (OXPHOS) para atender a demanda de energia durante a recirculação entre os órgãos linfoides secundários. Após a ativação, ingênuo T células passam por drásticas reprogramação metabólica, incluindo a indução da glicólise aeróbica para aumentar a produção de ATP e para atender as demandas metabólicas tremenda durante a proliferação e diferenciação celular. As células que não conseguem cumprir as necessidades metabólicas morrem por apoptose1,2. Durante a reprogramação metabólica, mitocôndrias desempenham papéis importantes, uma vez que eles são as organelas em grande parte responsáveis pela produção de ATP para fornecer energia para a célula, e o conteúdo de mitocôndrias celulares flutua durante switches metabólicas em toda a célula T desenvolvimento e ativação3. No entanto, o acúmulo de mitocôndrias supérfluos ou danificadas pode produzir excesso ROS que danificam lipídeos, proteínas e DNA e pode eventualmente levar a célula a morte4
As mitocôndrias excessivas ou danos resultantes de alterações metabólicas são removidas por uma forma especializada de autofagia5, conhecido como mitophagy. Mitocôndrias são delimitadas por autophagosomes e então fundidas com lisossomos para degradação. Estas fechem as comunicações entre mitocôndrias e lisossomos têm gerado grande interesse6,7. Por exemplo, o estresse oxidativo estimula mitocôndrias para formar vesículas mitocôndrias-derivado (MDVs) que são alvo de lisossomos para degradação em um homólogo fosfatase e tensin (PTEN)-induzido putativa quinase 1 (PINK1) e Pereira Barbosa (um E3 ubiquitina ligase) dependente da forma8. Verificou-se também que mitophagy é essencial para a transição de adipócito branco bege-para9,10. Mais importante, lisossomos não são meramente um compartimento de degradação, mas também um regulador de sinalização celular. Acumulação excessiva de substrato devido a deficiência enzimática resulta em disfunção dos lisossomos por perturbar a permeabilidade da membrana dos lisossomos e afeta Ca2 + homeostase11. Os defeitos funcionais de células T em lipase ácida lisossômica (LAL)12 ou metabólito lisossomal transportador nocaute do mouse modelo13 revelou ainda a importância de lisossomos na manutenção da homeostase de células T. Tanto as mitocôndrias e lisossomos são partes inseparáveis da regulação metabólica celular. Portanto, a medição de conteúdo mitocondrial celular tem sido um indicador fundamental para avaliar o status de metabólica e funcional de células T.
Ensaios comumente usados para quantificar o conteúdo mitocondrial ou dos lisossomos celular incluem immunoblot, microscopia eletrônica, imunofluorescência (IF) coloração e análise PCR de mitochondrial DNA copiar números14,15, 16. enquanto immunoblot quantitativamente pode comparar níveis de proteína em diferentes amostras e elétron ou se microscopia pode visualizar as características morfológicas destas organelas17, estes ensaios suportar certas desvantagens técnicas. Por exemplo, é demorado para adquirir um número suficiente de imagens de células com alta ampliação e resolução ou para comparar os níveis de expressão de uma proteína em dezenas de amostras, tornando estes ensaios considerados métodos de baixa taxa de transferência. Além disso, estes ensaios só podem ser aplicados à população da pilha homogénea, tais como linhas de celular, mas não para amostras de tecido que são compostas de populações mistas.
Também é difícil de aplicar estes ensaios para populações raras, para as quais a exigência de mínima célula números de 106 108 é impossível de encontrar. Finalmente, as células são geralmente lysed ou fixo durante o processo, tornando-os incompatíveis com outros métodos para extrair mais informações. Comparado com os métodos tradicionais, citometria de fluxo fluorescente-based tem um relativamente alto throughput - as informações de todas as células dentro de uma amostra compostas de populações de células mistas podem ser analisadas e coletadas simultaneamente. Além disso, um pode detectar mais de 10 parâmetros na mesma célula e classificar as células com base em fenótipos desejados para mais ensaios. Sondas fluorescentes reativas tem sido usadas para rotular lisossomos e mitocôndrias em células vivas e podem ser detectadas por citometria de fluxo18,19. Estas sondas específicas das organelas são célula permeável e têm características físico-químicas que lhes permitam concentrar-se em locais específicos subcellular ou organelas. Convenientemente, estes testes estão disponíveis em vários formatos fluorescentes, permitindo assim a sua aplicação para análise multicolor.
Este protocolo descreve em detalhes como combinar o marcador de superfície a coloração com corantes lisossomo mitocôndria-específico ou de lisossomos rótulo ou as mitocôndrias em células vivem. Isso é especialmente útil para amostras geradas a partir de tecidos primários e órgãos, que muitas vezes são compostos de populações de células heterogêneas. Pesquisadores podem identificar populações de células de interesse pela sua expressão do marcador de superfície e medir especificamente o conteúdo dos lisossomos ou mitocondrial através de corantes específicos organela nestas células. Aqui, demonstramos o procedimento detalhado de análise de fluxo cytometric que avalia a massa dos lisossomos ou mitocondrial em subpopulações o major esplênica T cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O procedimento de colheita de tecidos rato descrito aqui foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade Nacional de Yang-Ming e institucional Cuidado Animal.
1. preparação da suspensão de linfócitos de órgãos linfoides
- Eutanásia o mouse por um método aprovado como inalação de CO2 em uma câmara de acrílico transparente, seguida por deslocamento cervical para garantir a morte.
Nota: Manter a taxa de fluxo de CO2 para um deslocamento de 20% por minuto da câmara e não superior a 5 libras por polegada quadrada (libra por polegada quadrada). Demora 2-3 min para um mouse para perder a consciência. Manter o fluxo de2 CO pelo menos por 1 min após o animal parou de respirar (total de 5-7 min). - Coloque o mouse em sua parte traseira em uma placa limpa (por exemplo, uma placa de plástico poliestireno) e corrigir os membros com fita adesiva. Enxágue com etanol a 70%.
- Para colher o baço, cortar e abrir a cavidade abdominal com uma tesoura de dissecação de 11 cm (o baço está abaixo do estômago e acima do rim esquerdo). Remover o baço com fórceps e limpeza de tecidos conjuntivos (se necessário, use tesoura).
- Para colher o timo, corte o diafragma e a caixa torácica de ambos os lados com tesoura de dissecação. Use fórceps para levantar o esterno para revelar toda a cavidade torácica. Separar o Timo cuidadosamente dos tecidos circundantes, com uma tesoura e remover qualquer tecido conjuntivo residual em uma toalha de papel humedecido com PBS.
- Mecanicamente, dissocia os tecidos com um êmbolo da seringa em um prato de 6 cm, contendo 5 mL gelada FACS buffer (PBS suplementado com 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM EDTA). Transferir a suspensão de célula única para um tubo de centrífuga de 15 mL; lavar o prato de 6 cm com adicional de 2 mL FACS e combinar a lavagem com suspensão de células também.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com 2 mL de amónio-cloreto de potássio (ACK) lise buffer (155 mM NH4Cl, 10mm KHCO3 e 0,1 mM Na2EDTA) para 1 min à temperatura ambiente (RT) para lisar células vermelhas do sangue. Neutralize o buffer ACK, adicionando 10 mL de tampão de FACS à suspensão de células.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI completo (meio RPMI 1640, suplementado com NaHCO3de 44 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) 100 penicilina U/mL, estreptomicina 100 mg/mL, 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio de 1 mM, 1% MEM não aminoácidos essenciais e 10% FBS).
- Suspensão de células de filtro através de um filtro de célula (poros tamanho 70 µm) para remover grupos de célula. Contar as células com um hemocytometer ou contador automatizado de células.
2. quantificação das mitocôndrias e lisossomos
Nota: Executar a organela específica tintura coloração primeiro porque a condição ideal de coloração para estes corantes é incubação a 37 ° C. A mancha de marcador de superfície pode ser significativamente reduzida por causa do anticorpo tampando e internalização a essa temperatura.
- Adicione 1 x 106 células para fundo redondo FACS tubos, centrifuga células (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante.
- Diluir as soluções estoque de sonda para concentração final de trabalho (100 nM MitoTracker Green ou LysoTracker Green; doravante mitocôndrias lisossoma-específico ou tingir, respectivamente) em meio de cultura livre de soro previamente aquecido a 37 ° C. Esta é a solução para o lisossomo mitocôndria-específico ou tintura.
Nota: Testar várias concentrações, incluindo o intervalo de concentrações de trabalho sugerida pelo fabricante (20-200 nM para a tintura de mitocôndrias específicas) e 50-75 nM para a tintura do lisossoma específico usada aqui para obter a melhor eficiência de coloração. Escolha uma população de células que é conhecida por ter boa expressão de coloração alvo (por exemplo, lisossomos) como controle positivo (por exemplo, CD14 humana+ monócitos). Escolha a concentração de trabalho baseada na boa separação entre coloração positiva e negativa, bem como viabilidade celular bom. - Ressuspender as células em 100 µ l do lisossoma-mitocôndrias-específico ou tingem a solução de trabalho e incubam em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 15 min ou 30 min, respectivamente.
- Adicione 1 mL de tampão de FACS gelada para parar a reação. Células de pelotas por centrifugação (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante. Células estão agora prontas para a mancha de marcador de superfície.
3. superfície marcador coloração
- Receptores Fc de bloco com 100 µ l de pré-titulada 2.4G2 de hibridoma sobrenadante no gelo para células de lavagem de 10 min. com 1 mL de tampão de FACS e centrífuga (300 x g, durante 5 min a 4 ° C). Descarte o sobrenadante.
- Incube as celulas com 50 µ l pré-titulada anticorpo conjugado fluorescência combinação no buffer de FACS no gelo por 20 min. Evite luz.
Nota: Preparar células únicas manchas de cor que incluem todos os anticorpos fluorescentes presentes no anticorpo combinação e células tratadocom apenas com tintura de organela específica para a criação de tensões de cada ajuste de detector e compensação de fluorescência no fluxo citômetro. Da mesma forma, prepare a fluorescência menos um (FMO) como plano de fundo de controles usando células coradas com todos os anticorpos, mas sem a coloração com corantes específicos das organelas. - Lave as células, adicionando 1 mL de tampão de FACS e pelota por centrifugação (300 x g, durante 5 min a 4 ° C). Descarte o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 300 µ l de tampão de FACS contendo iodeto de propidium 1 µ g/mL (PI) e imediatamente analisar as amostras no citômetro de fluxo.
4. amostra coleção no citômetro de fluxo
- Ligue o computador, citômetro de fluxo, software de aquisição de FACS e quaisquer outros dispositivos acessórios, dependendo da plataforma de máquina. Execute PBS durante cerca de 1 min para garantir a linha de fluxo é preenchido com tampão PBS e bainha. Certifique-se que o fluxo de fluxo é executado sem problemas.
- Abra a nova experiência e selecione citômetro parâmetros (detectores fluorescentes) de acordo com as instruções do fabricante. Filtre as células através de filtro de célula de 70 µm e vórtice antes da aquisição de cada amostra para evitar aglomerações e formação de gibão.
- Fazer lotes do ponto de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC), que representam o tamanho da célula e granularidade, respectivamente. Otimize as tensões do FSC e SSC para certificar-se de que as células de interesse aparecem nas tramas. Faça lotes do ponto do FSC-A vs FSC-W (ou FSC-H) e desenhar um portão para as células únicas.
- Fazer lotes do ponto de cada parâmetro fluorescente. Use células imaculadas para determinar o sinal de fundo e usar controles de manchas de cor única para ajustar tensões de cada parâmetro fluorescente, para que as populações de células positivas e negativas são claramente distinguíveis e o intervalo dinâmico de aquisição.
- Depois de todas as tensões são definidas, use autocompensação se disponível, ou ajustar manualmente a compensação com controles de manchas de cor imaculados e único para corrigir as repercussões espectral. Aplica a compensação de amostras.
- Fazer um gráfico de ponto de cada parâmetro e elabore portões de acordo com seu conjunto experimental. Por exemplo, FSC-A vs FSC-H (ou FSC-W) para excluir parelhas, seguido pelo FSC-A vs CCD-A para a retenção de linfócitos; SSC-A vs PI (células vivas) e CD4 vs CD8 (Figura 1).
- Recolha o suficiente eventos (número total de células) para comparação significativa entre populações. Normalmente, pelo menos 1.000 eventos na população de interesse precisam ser obtidos20.
- Depois que todas as amostras são adquiridas, exporte dados do fluxo a ser analisados pelo software de análise de citometria de fluxo. Salve a experiência como modelo para preservar o citômetro configuração e parâmetros para a aplicação de experimentos semelhantes no futuro.
5. análise de dados
Nota: Existem muitas ferramentas para analisar os dados de fluxo cytometric, tanto comercial e software livre. O software de aquisição dos citômetros também pode funcionar para análise de dados. Aqui usamos o FlowJo como exemplo.
- Inicie o software e arraste os arquivos FCS em espaço de trabalho. Clique em uma amostra para abrir uma janela gráfica. Selecione os parâmetros a serem apresentados no eixo X e Y, clicando sobre os eixos X e Y. Use a barra de ferramentas para desenhar portões de acordo com marcadores diferencialmente expressos ou fenótipos definidos de populações de células.
- Adicione portas de cada parâmetro, conforme mostrado na Figura 1. Arraste os portões para todas as amostras na área de trabalho, para que eles fiquem idênticos gating.
- Arraste as parcelas para o editor de layout para criar relatórios gráficos.
- Exiba a intensidade média de fluorescência (IFM) para cada população de interesse clicando no botão de estatísticas (Σ) em uma janela gráfica e escolhendo "Quer dizer" e o parâmetro apropriado, por exemplo, o canal usado para detectar a tintura organela específica. Clique em "Adicionar".
- Clique no ícone do editor de tabela e arraste IFM para editor de tabela para criar relatórios estatísticos. Salve como arquivo Excel, texto ou CSV, para calcular o delta IFM (ΔMFI) como IFM (corantes específicos organela) - IFM (FMO).
Nota: Não calcular IFM entre amostras adquiridas com citômetro de diferente configurações (tensões, canais fluorescentes ou compensação). As comparações de valores derivados de experimentos com diferentes configurações são sem sentido e tendenciosa. - Exporte todos os valores do espaço de trabalho e parcelas do editor de layout para fazer tabelas e figuras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identificação dos principais células T subconjuntos no baço e Timo
Em breve, suspensões de célula única do baço e Timo foram lysed das células vermelhas do sangue, incubadas com sobrenadante 2.4G2, seguidas por organela específica tintura e marcador de superfície a coloração com anticorpos conjugados de fluorescência (tabela 1). A progressão do desenvolvimento de timócitos pode ser descrita usando anticorpos aos receptores co CD8 e CD4. Os mais timócitos não expressam CD4 ou CD8 e são chamados de dupla negação (DN). Então, eles se-regulam tanto CD4 e CD8 e tornar-se positivo duplo (DP). Finalmente, para baixo-regular CD4 ou CD8 e tornar-se único positivo (SP) células maduras prontas para deixar o órgão. Os primeiros estágios de desenvolvimento de células T, quando as células não expressam os receptores co CD4 e CD8, pode ainda ser classificados com base na expressão CD44 e CD25. Os primeiros progenitores são CD44+ CD25– (DN1), e então começam a expressar CD25 e se tornar CD44+CD25+ (DN2) células. Depois disso, as células para baixo-regular CD44 e se tornar CD44–CD25+ (DN3) células e, finalmente, eles para baixo-regulam CD25 também para se tornar CD44–CD25– (DN4) células que estão no caminho para expressar CD4 e CD8 e tornando-se células de duplo-positivo (DP).
No baço, as células T podem ser divididas em CD8 citotóxicos+ e auxiliar CD4+ T células. Ambas estas populações podem ser divididas em subconjuntos ingênuo, efetoras e de memória baseados em CD62L e CD44 coloração. A estratégia detalhada associada é mostrada na Figura 1.
Quantificação da massa de mitocôndrias em subconjuntos de célula T diferente
Corantes específicos de mitocôndrias foram usados para medir a quantidade de mitocôndrias em populações de células T. Achamos que o conteúdo mitocondrial foram os mais baixos no DN1, atingiu um pico de DN2-DN3, ligeiramente diminuída em timócitos DN4 e DP e eram ainda mais baixo em timócitos CD4 e CD8 SP(Figura 2). No entanto, timócitos CD4 ou CD8 SP tinham maiores mitocôndrias IFM de coloração de células de CD4 ou CD8 T esplênica (Figura 2B). Estas observações sugerem que o conteúdo mitocondrial oscila durante o desenvolvimento de células T com timócitos que contém mitocôndrias mais do que suas contrapartes maduros, e as células de ingênuo T que recircular no sangue rico em oxigênio tem ainda mais massa mitocondrial. Curiosamente, esta redução de conteúdo mitocondrial foi mais proeminente no CD8 do que a linhagem T CD4 (Figura 2B), e ativação de células T está mais fraco. Entre ativado células T CD4+ células da memória T tinham ligeiramente mais mitocôndrias em comparação com efetores; no entanto, o oposto foi o caso de CD8+ T células: CD8+ células da memória T tinham a menor massa mitocondrial entre todos os subconjuntos de células T (Figura 2B).
Medição de conteúdo lisossomal em diversas subpopulações de células T
Usar tintura de lisossoma específicas, observamos relativamente baixo, mas detectável, conteúdo lisossomal em todas as populações de células T, com presença mais proeminente de lisossomos em timócitos DN1(Figura 3). Não foi encontrada diferença significativa entre os subconjuntos de timócitos de DN1 em diante. Na periferia, um número relativamente elevado de lisossomos foi encontrado na memória e efetoras CD8+ T células. Este fenômeno está em consonância com estudos anteriores mostrando que ativadas CD8+ T células aumentaram sua expressão da proteína de membrana lisossomal-associado 1 (lâmpada-1)21,22, refletindo sua posse de grânulos lisossomais citotóxicos (Figura 3B)
Figura 1 : Gating estratégia de linfócitos no baço e timócitos. As células foram pre-gated na FSC/SSC e PI– para obter singletos ao vivo. (A) Total timócitos de ratos foram corados com CD4, CD8, CD44 e CD25. CD4 e CD8 expressões foram usadas para distinguir CD4+CD8– SP, CD4–CD8+ SP, CD4+CD8+ DP e CD4–CD8 subconjuntos de DN– . O CD4–CD8 subconjunto de DN– foi posteriormente dividido em CD44+CD25– DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44–CD25+ DN3 e CD44–CD25 subpopulações de DN4– . (B) Total splenocytes de ratos foram corados com TCRβ, CD4, CD8, CD44 e CD62L. As células TCRβ+ foram separadas em CD4+ e CD8+ T células, que foram subdivididas em ingênuo (CD44–CD62L+), memória (CD44+CD62L+) e efetoras (CD44+CD62L -) populações. Os resultados são representativos de três experimentos independentes com n = 3-4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante histogramas mostrando mitocôndrias coloração em cada população celular. As células foram coradas com corante mitocôndrias específicos para 15 min a 37 ˚ c, seguido pela mancha de marcador de superfície. Sinal fluorescente de células coradas foi adquirida pelo citômetro de fluxo e analisado. (A) mitocôndrias coloração de timócitos DN e DP. (B) mitocôndrias coloração de timócitos CD4SP e CD8SP e populações esplênica de células T. ΔMFI = IFM (mitocôndrias coloração) - IFM (FMO). A linha vermelha sólida representa mitocôndrias manchando, a linha azul contínua mostra controle FMO, e a linha tracejada vermelha representa a intensidade da fluorescência média das mitocôndrias coloração em cada população. Os resultados são representativos de três experimentos independentes com n = 3-4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representante histogramas mostrando lisossoma coloração em linfócitos no baço e timócitos. As células foram coradas com corante lisossoma específico por 30 min em 37 ˚ c, seguido pela mancha de marcador de superfície. Sinal fluorescente de células coradas foi adquirida pelo citômetro de fluxo e analisado. (A) lisossoma coloração de timócitos DN e DP. (B) lisossoma coloração de timócitos CD4SP e CD8SP e populações esplênica de células T. ΔMFI = IFM (lisossoma coloração) - IFM (FMO). Linha verde sólida representa lisossoma manchando, a linha azul contínua mostra FMO, e a linha tracejada vermelha representa a intensidade de fluorescência média do lisossoma coloração em cada população. Os resultados são representativos de um experimento com n = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: projetos de painel de citometria de fluxo Multicolor. O fluorocromo e concentração de corantes de anticorpos/organela nas misturas coloração estão listados aqui. É altamente recomendável para dosear e testar cada anticorpo ao configurar novos painéis de coloração.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo combina corantes específicos organela e marcador de superfície coloração para quantificar a quantidade de mitocôndrias ou lisossomos em populações diferentes de células T. Este método foi desenvolvido para superar a limitação da cela número e homogeneidade requisitos para os métodos tradicionais, tais como a microscopia eletrônica e análise de immunoblot. É especialmente útil na análise de populações de células raras e examinando simultaneamente vários tipos de células ao mesmo tempo.
A duração do procedimento e a temperatura de incubação são os fatores mais críticos no presente protocolo. Organela adequada rotulagem exige titulação precisa de corantes específicos das organelas. As células também devem ser mantidas estritamente no gelo para melhorar a viabilidade e evitar anticorpo tampando e internalização. Além disso, a fluorescência destes corantes específicos organela é vulnerável às mudanças de temperatura e exposição de luz. Assim, a análise imediata de amostras, uma vez que está concluído o processo de coloração é muito importante. Consistentemente, nós fomos capazes de completar todo o experimento dentro de 2 horas.
Desde que este protocolo baseia-se na capacidade de detecção de fluorescência multicolor por citômetro de fluxo para avaliar componentes intracelulares, as configurações de aquisição (por exemplo, tensões de PGTO) e a compensação dos espectros se sobrepõem (as repercussões de fluorescência em vizinhos canais) pode fortemente influenciar a intensidade do sinal. Isto é especialmente relevante quando os marcadores de superfície necessários para identificar os tipos de célula relevante aumentam acima de seis anos. Nesta situação, experiência em projetar experiências de citometria de fluxo multicolor torna-se muito importante para a aquisição de dados de alta qualidade.
O sistema imunológico protege o corpo de infecções e insultos do patógeno, e ativação de células T tem papel fundamental no fornecimento de sinais essenciais para outras células do sistema imunológico. Estudos recentes sugerem que as populações diferentes de células T têm programas exclusivos metabólicos, e conteúdo mitocondrial e dos lisossomos é indicadores cruciais de alterações metabólicas. No entanto, este fenómeno não é exclusivo de células T. A diferenciação e ativação de células do sistema imunológico inatas, como macrófagos e células dendríticas, estão também intimamente ligados ao seu estado metabólico23,24. A vantagem deste protocolo é que pode ser adaptado para examinar quaisquer populações de células de interesse usando anticorpos contra marcadores de linhagem específica. Além disso, em combinação com outros corantes específicos das organelas, tais como ER - ou cito-ID, tem o potencial para avaliar diferentes organelas ou compartimentos celulares em vários tipos de células.
O estabelecimento deste mitocôndrias ou lisossoma método de quantificação não é apenas instrumental para estudar o metabolismo nas células T, mas também tem um grande potencial para beneficiar a pesquisa que se concentra em mudanças metabólicas em configurações de doença, como câncer ou doenças auto-imunes25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesses.
Acknowledgments
O desenvolvimento deste protocolo foi apoiado por concessões do Taiwan Ministério da ciência e tecnologia (a maioria) NSC103-2320-B-010-002-MY2 e MOST104-2628-B-010-002-MY4 de C.L. Hsu. C.W. Wei é um receptor de excelente tese prêmio do Instituto de Microbiologia e Imunologia, Universidade Nacional de Yang-Ming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
