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Immunology and Infection

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

doi: 10.3791/58844 Published: January 9, 2019

Summary

Questo articolo viene illustrato un metodo potente per quantificare i mitocondri o i lisosomi delle cellule viventi. La combinazione di coloranti specifici lisosoma o mitocondri con anticorpi fluorescente coniugati contro marcatori di superficie permette la quantificazione di questi organelli in popolazioni di cellule miste, come primario cellule ottenute da campioni di tessuto, utilizzando citometria a flusso multicolor.

Abstract

Le cellule T utilizzano programmi metabolici differenti per soddisfare le loro esigenze funzionale durante il differenziamento e la proliferazione. I mitocondri sono componenti cruciali cellulare responsabile della fornitura di energia delle cellule; Tuttavia, i mitocondri in eccesso producono anche le specie reattive dell'ossigeno (ROS) che potrebbero causare la morte delle cellule. Di conseguenza, il numero dei mitocondri costantemente deve essere regolato per soddisfare le esigenze delle cellule. Questa regolazione dinamica avviene in parte attraverso la funzione dei lisosomi che rimuovere macromolecole e organelli avanzo/danneggiato. Quindi, il contenuto cellulare di lisosomiale e mitocondriale è indicatori chiave per valutare la regolazione metabolica delle cellule. Con lo sviluppo di sonde per organelli, lisosoma ben caratterizzato o mitocondri specifici coloranti sono diventati disponibili in vari formati per etichettare i mitocondri e lisosomi cellulari. Citometria a flusso multicolor è uno strumento comune per fenotipi cellulari di profilo e ha la capacità di essere integrato con altri dosaggi. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato di come combinare organello specifici coloranti con marcatori di superficie macchiatura per misurare la quantità dei lisosomi e dei mitocondri in popolazioni differenti delle cellule T su un citometro a flusso.

Introduction

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L'attivazione e la proliferazione delle cellule di T sono passaggi critici per il successo delle risposte immunitarie di montaggio. Gli avanzamenti recenti suggeriscono che il metabolismo cellulare è strettamente associato con lo sviluppo e la funzioni delle cellule T. Ad esempio, le cellule T naive si basano in gran parte su fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per soddisfare la domanda di energia durante il ricircolo tra organi linfoidi secondari. Al momento dell'attivazione, le cellule T naive subiscono drastica metabolica riprogrammazione, compresa l'induzione di glicolisi aerobica per aumentare la produzione di ATP e per soddisfare l'enorme richiesta metabolica durante la proliferazione e differenziazione cellulare. Le cellule che non riescono a seguire attraverso il fabbisogno metabolico die da apoptosi1,2. Durante la riprogrammazione metabolico, i mitocondri svolgono un ruolo importante poiché essi sono gli organelli in gran parte responsabili per la produzione di ATP per la fornitura di energia per la cellula, e il contenuto di mitocondri cellulari fluttua durante il metabolici interruttori in tutto cellula T sviluppo e attivazione3. Tuttavia, l'accumulo di mitocondri superflui o danneggiati possa produrre ROS in eccesso che danneggiare lipidi, proteine e DNA e può finalmente condurre a cellule morte4

I mitocondri danneggiati o eccessivi derivanti da alterazioni metaboliche vengono rimossi da una forma specializzata di autofagia5, noto come mitophagy. I mitocondri sono avvolto da autofagosomi e quindi fusi con i lisosomi per la degradazione. Questi vicino comunicazioni tra mitocondri e lisosomi hanno generato grande interesse6,7. Ad esempio, lo sforzo ossidativo stimola i mitocondri per formare vescicole mitocondri-derivato (MDVs) che sono mirate al lisosomi per la degradazione in un omologo fosfatasi e tensin (PTEN)-indotto putativa chinasi 1 (PINK1) e parkin (una E3 ubiquitina ligasi) modo dipendente8. È emerso inoltre che mitophagy è essenziale per la transizione dell'adipocita bianco-beige9,10. Ancora più importante, i lisosomi non sono semplicemente un vano di degrado, ma anche un regolatore di segnalazione cellulare. Accumulo eccessivo di substrato a causa di carenze di enzima provoca la disfunzione lysosomal interrompendo la permeabilità della membrana lisosomiale e colpisce il Ca2 + omeostasi11. Difetti funzionali delle cellule T in lipasi acida lysosomal (LAL)12 o metabolita lysosomal transporter knockout mouse modello13 ha mostrato ulteriormente l'importanza dei lisosomi nel mantenimento dell'omeostasi delle cellule T. Sia i mitocondri ed i lisosomi sono parti inseparabili di regolazione metabolica cellulare. Misura del contenuto cellulare mitocondriale è stato quindi un indicatore fondamentale per valutare lo stato metabolico e funzionale di cellule T.

Analisi comunemente usate per quantificare il contenuto cellulare mitocondriale o lysosomal includono immunoblot, microscopia elettronica, colorazione di immunofluorescenza (IF) e l'analisi PCR di mitocondriale del DNA copia numeri14,15, 16. mentre immunoblot quantitativamente è in grado di confrontare i livelli della proteina attraverso diversi campioni ed elettrone o se microscopia può visualizzare le caratteristiche morfologiche di questi organelli17, questi saggi sopportano alcuni inconvenienti tecnici. Ad esempio, è molto tempo per acquisire sufficiente numero di cellulare immagini con alto ingrandimento e risoluzione o per confrontare i livelli di espressione di una proteina attraverso decine di campioni, rendendo questi saggi considerati metodi di basso rendimento. Inoltre, queste analisi possono essere applicate solo a popolazione omogenea delle cellule, ad esempio linee cellulari, ma non per i campioni di tessuto che sono composte da popolazioni miste.

È anche difficile applicare tali saggi a popolazioni rari, per cui il requisito di cellule minimal numeri da 106 -108 è impossibile da rispettare. Infine, le cellule sono solitamente lisate o fisso durante il processo, rendendoli incompatibili con altri metodi per estrarre ulteriori informazioni. Rispetto ai metodi tradizionali, basati su fluorescente flusso cytometry ha un relativamente alto throughput - le informazioni di tutte le celle all'interno di un campione composto da popolazioni miste di cellule possono essere analizzate e raccolti simultaneamente. In più, uno in grado di rilevare più di 10 parametri sulla stessa cellula e ordinare le celle basate sui fenotipi desiderati per ulteriori analisi. Sonde fluorescenti reattivi sono stati usati per etichettare i lisosomi e mitocondri in cellule vive e possono essere rilevati da flusso cytometry18,19. Queste sonde di organelli specifici sono cellulare permeabile e hanno caratteristiche fisico-chimiche che permettono loro di essere concentrata in determinate località subcellulare o organelli. Convenientemente, queste sonde sono disponibili in vari formati fluorescenti, permettendo così la loro applicazione per l'analisi multicolor.

Questo protocollo viene descritto in dettaglio come combinare marcatore di superficie colorazione con coloranti specifici lisosoma o mitocondri lisosomi etichetta o mitocondri in cellule vivono. Ciò è particolarmente utile per campioni generati da tessuti primari e gli organi, che sono spesso composte da popolazioni eterogenee delle cellule. Ricercatori è in grado di identificare popolazioni cellulari di interesse dalla loro espressione di superficie dell'indicatore e misurare specificamente il contenuto lisosomiale o mitocondriale attraverso degli organelli specifici coloranti in queste cellule. Qui, dimostriamo la procedura dettagliata di analisi cytometric di flusso che valuta la massa lisosomiale o mitocondriale nelle sottopopolazioni principali splenico delle cellule T.

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Protocol

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La procedura di raccolta del tessuto del mouse qui descritta è stata approvata dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della National Yang-Ming University.

1. preparazione della sospensione del linfocita da organi linfoidi

  1. Eutanasia il mouse da un metodo approvato come l'inalazione di CO2 in un alloggiamento acrilico trasparente seguito da dislocazione cervicale per assicurare la morte.
    Nota: Mantenere il tasso di flusso di CO2 per uno spostamento di 20% al minuto della camera e non superiore a 5 psi (libbra per pollice quadrato). Ci vogliono 2-3 minuti per un mouse a perdere coscienza. Mantenere il flusso di CO2 almeno per 1 min dopo che l'animale ha smesso di respirare (5-7 min complessiva).
  2. Posizionare il mouse sul dorso su un bordo pulito (ad esempio un bordo di plastica polistirolo) e difficoltà degli arti con nastro adesivo. Sciacquare con etanolo al 70%.
  3. Per raccogliere la milza, tagliare e aprire la cavità addominale con le forbici per dissezione 11 cm (la milza è sotto lo stomaco e sopra il rene di sinistra). Rimuovere la milza con le pinzette e pulire da tessuti connettivi (se necessario, usare le forbici).
  4. Per raccogliere il timo, tagliare il diaframma e la gabbia toracica da entrambi i lati con le forbici di dissezione. Utilizzare pinze per sollevare lo sterno per rivelare tutta la cavità toracica. Separare con cura il timo dai tessuti circostanti con le forbici e rimuovere qualsiasi residuo tessuto connettivo su un tovagliolo di carta inumidito con PBS.
  5. Meccanicamente dissociare i tessuti con un stantuffo della siringa in un piatto di 6 cm contenente 5 mL di tampone ghiacciata di FACS (PBS completato con 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 mM EDTA). Trasferire la sospensione unicellulare in una provetta per centrifuga 15 mL; lavare il piatto di 6 cm con buffer di ulteriori 2 mL FACS e combinare il lavaggio con sospensione cellulare pure.
  6. Centrifugare la sospensione cellulare (300 x g, per 5 min a 4 ° C) e scartare il surnatante. Risospendere il pellet con 2 mL di ammonio-cloruro-potassio (ACK) Lisi tampone (155 mM NH4Cl, 10mm KHCO3 e 0,1 mM Na2EDTA) per 1 min a temperatura ambiente (TA) a lisare cellule rosse del sangue. Neutralizzare il buffer ACK aggiungendo 10 mL di tampone di FACS alla sospensione di cellule.
  7. Centrifugare la sospensione cellulare (300 x g, per 5 min a 4 ° C) e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno RPMI completo (medium RPMI 1640, integrato con NaHCO3di 44 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 100 U/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 2 mM L-Glutammina, piruvato di sodio di 1 mM, 1% MEM non essenziali aminoacidi e 10% FBS).
  8. Filtro sospensione cellulare attraverso un colino di cella (poro dimensioni 70 µm) per rimuovere gruppi di cellule. Contare le celle con un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.

2. quantificazione dei mitocondri e lisosomi

Nota: Eseguire la tintura di organelli specifici macchiatura in primo luogo perché la condizione di colorazione ottima per questi coloranti è incubazione a 37 ° C. La macchiatura di superficie dell'indicatore può essere notevolmente ridotto a causa dell'anticorpo tappatura e interiorizzazione a quella temperatura.

  1. Aggiungere 1 x 106 cellule per turno-fondo FACS tubi, centrifugare le cellule (300 x g, per 5 min a 4 ° C) ed eliminare il surnatante.
  2. Diluire le soluzioni stock sonda alla concentrazione finale di lavoro (100 nM MitoTracker Green o LysoTracker Green; d'ora in poi specifici mitocondri o lisosoma tingere, rispettivamente) nel mezzo di coltura privo di siero pre-riscaldato 37 ° C. Questa è la soluzione di lavoro per tintura lisosoma - o mitocondrio-specifica.
    Nota: Test concentrazioni multiple compreso l'intervallo di concentrazioni di lavoro suggerito dal produttore (20-200 nanometro per la tintura di mitocondrio-specifica) e 50-75 nM per la tintura di lisosoma-specifico usata qui per ottenere la migliore efficienza di colorazione. Scegliere una popolazione di cellule che è noto per avere buona espressione di macchiatura di destinazione (ad es. i lisosomi) come controllo positivo (ad esempio umano CD14+ monociti). Scegliere la concentrazione di lavoro basata sulla buona separazione tra la macchiatura negativa e positiva, come pure buona attuabilità.
  3. Risospendere le cellule in 100 µ l del lisosoma-mitocondri-specifici o tingono la soluzione di lavoro ed incubare 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 15 min o 30 min, rispettivamente.
  4. Aggiungere 1 mL di tampone di FACS ghiacciata per arrestare la reazione. Pellet di cellule mediante centrifugazione (300 x g, per 5 min a 4 ° C) ed eliminare il surnatante. Le cellule sono ora pronte per la colorazione di superficie dell'indicatore.

3. superficie dell'indicatore colorazione

  1. Recettori Fc di blocco con 100 µ l di pretitolata ibridoma 2.4G2 surnatante sul ghiaccio per 10 min. celle di lavaggio con 1 mL di tampone di FACS e centrifugare (300 x g, per 5 min a 4 ° C). Gettare il surnatante.
  2. Incubare le cellule con 50 µ l anticorpo coniugato fluorescenza pretitolata combinazione nel buffer di FACS in ghiaccio per 20 min. evitare luce.
    Nota: Preparare singole cellule colore tinto che includono tutti gli anticorpi fluorescenti presentano nell'anticorpo combinazione e cellule trattate solo con tintura di organelli specifici per impostare la tensione di ogni regolazione del rivelatore e compensazione di fluorescenza sul flusso citometro. Allo stesso modo, preparare la fluorescenza meno uno (FMO) come sfondo controlli utilizzando le cellule colorate con tutti gli anticorpi, ma senza colorazione con coloranti specifici organelli.
  3. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone di FACS e pellet mediante centrifugazione (300 x g, per 5 min a 4 ° C). Gettare il surnatante.
  4. Risospendere le cellule in 300 µ l di tampone di FACS contenente 1 µ g/mL di ioduro di propidio (PI) e analizzare immediatamente i campioni il citometro a flusso.

4. campionario il citometro a flusso

  1. Accendere il computer, citometro a flusso, software di acquisizione di FACS e altri eventuali dispositivi accessori a seconda della piattaforma di macchina. Eseguire PBS per circa 1 min per garantire la linea di flusso è riempito con il tampone PBS e guaina. Assicurarsi che il flusso di flusso senza intoppi.
  2. Aprire un nuovo esperimento e selezionare citometro parametri (fluorescente rivelatori) seguendo le istruzioni del produttore. Filtrare le cellule attraverso il filtro cella 70 µm e vortex prima dell'acquisizione di ciascun campione per evitare grumi e formazione doppietto.
  3. Fare appezzamenti di puntino di forward scatter (FSC) e side scatter (SSC), che rappresentano la dimensione della cella e granularità, rispettivamente. Ottimizzare le tensioni del FSC e SSC per assicurarsi che le celle di interesse vengono visualizzati nelle trame. Fate appezzamenti di puntino di FSC-A vs FSC-W (o FSC-H) e disegnare un cancello per le singole celle.
  4. Fare appezzamenti di puntino di ogni parametro fluorescente. Utilizzare cellule non macchiate per determinare il segnale di fondo e utilizzare singoli colore tinto controlli per regolare le tensioni di ogni parametro fluorescente, affinché le popolazioni delle cellule positive e negative sono chiaramente distinguibili e all'interno della gamma dinamica di acquisizione.
  5. Una volta impostate tutte le tensioni, utilizzare auto-compensazione se disponibile, oppure regolate manualmente la compensazione con controlli non macchiate e singoli colore-tinto per correggere spillover spettrale. Applicare la compensazione ai campioni.
  6. Fare una trama di punti di ogni parametro e redige cancelli secondo il tuo set sperimentali. Ad esempio, FSC-A vs FSC-H (o FSC-W) escludere doppietti, seguita da FSC-A vs SSC-A per gating dei linfociti; SSC-A vs PI (cellule vive) e CD4 e CD8 (Figura 1).
  7. Raccogliere abbastanza eventi (numero totale delle cellule) per confronto significativo tra popolazioni. In genere, almeno 1.000 eventi nella popolazione di interesse devono essere ottenuti20.
  8. Dopo che tutti i campioni vengono acquisiti, esportare i dati di flusso per l'analisi mediante software di analisi di citometria a flusso. Salvare l'esperimento come modello per preservare il citometro impostazione e parametri per l'applicazione a esperimenti simili in futuro.

5. analisi dei dati

Nota: Ci sono molti strumenti per analizzare i dati di flusso cytometric, sia il software libero commerciale. Il software di acquisizione di citometri a flusso può funzionare anche per l'analisi dei dati. Qui abbiamo usato FlowJo come un esempio.

  1. Avviare il software e trascinare i file FCS nell'area di lavoro. Fare clic su un campione di aprire una finestra grafica. Selezionare i parametri per essere presentato su assi X e Y facendo clic sugli assi X e Y. Utilizzare la barra degli strumenti per disegnare cancelli secondo differenzialmente espressi marcatori o definiti fenotipi di popolazioni cellulari.
  2. Aggiungere porte di ogni parametro, come illustrato nella Figura 1. Trascinare cancelli a tutti i campioni nell'area di lavoro, in modo che ottengono identici gating.
  3. Trascinare le trame di editor di layout per creare report grafici.
  4. Visualizzare l'intensità media di fluorescenza (MFI) per ciascuna popolazione di interesse facendo clic sul pulsante Statistiche (Σ) in una finestra grafica e scegliendo "Significa" e il parametro appropriato, ad esempio, il canale utilizzato per rilevare specifiche organello tintura. Fare clic su "Aggiungi".
  5. Fare clic sull'icona editor tabella e trascinare MFI tabella editor per creare report statistici. Salvare come file CSV, testo o Excel per calcolare il delta IFM (ΔMFI) come MFI (organelli specifici coloranti) - MFI (FMO).
    Nota: Non calcolare MFI tra campioni acquisiti con citometro a diversa impostazioni (tensioni, canali fluorescente o compensazione). I confronti di valori derivati da esperimenti con diverse impostazioni sono prive di significato e prevenuto.
  6. Esportare tutti i valori dall'area di lavoro e grafici da editor di layout per la fabbricazione di tabelle e figure.

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Representative Results

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Identificazione dei sottoinsiemi principali delle cellule di T in milza e timo

In breve, sospensioni di cellule singole da milza e timo sono state lisate di cellule rosse del sangue, incubate con 2.4G2 surnatante, seguite da colorante specifico organello e marcatore di superficie macchiando con gli anticorpi coniugati a fluorescenza (tabella 1). La progressione dello sviluppo dei timociti può essere descritto usando gli anticorpi per i corecettori CD8 e CD4. I timociti più immaturi non esprimono CD4 o CD8 e sono chiamati doppio negativo (DN). Poi, up-regolare sia CD4 e CD8 e diventare doppia positiva (DP). Infine, down-regolano CD4 o CD8 e diventare unico positivo (SP) cellule mature pronte a lasciare l'organo. Prime fasi di sviluppo delle cellule T, quando le cellule non esprimono i co-recettori CD4 e CD8, possono essere ulteriormente classificati in base alla espressione di CD44 e CD25. I primi progenitori sono CD44+ CD25 (DN1), e poi iniziare a esprimere CD25 e diventare CD44+CD25+ (DN2) cellule. Dopo di che, le cellule down-regolano CD44 e diventare CD44CD25+ (DN3) cellule e, infine, giù-regolano CD25 pure per diventare CD44CD25 (DN4) cellule che sono sulla strada per esprimere CD4 e CD8 e diventando cellule di doppio-positive (DP).

Nella milza, le cellule T possono essere suddivisi in CD8 citotossici+ e helper CD4+ T cellule. Entrambe queste popolazioni possono essere ulteriormente suddivisi in sottoinsiemi ingenuo, effector e memoria basati su CD62L e CD44 macchiatura. La strategia di gating dettagliata è illustrata nella Figura 1.

Quantificazione della massa di mitocondri in sottogruppi differenti delle cellule T

Mitocondrio-specifica coloranti sono stati usati per misurare la quantità di mitocondri in popolazioni di cellule T. Abbiamo trovato il contenuto mitocondriale era i più bassi in DN1, raggiunse la posizione DN2-DN3 e poi leggermente diminuita in timociti DN4 e DP che era anche più basso in timociti CD4 e CD8 SP (Figura 2A). Tuttavia, timociti CD4 o CD8 SP avevano più mitocondri MFI di colorazione di cellule spleniche di CD4 o CD8 T (Figura 2B). Queste osservazioni suggeriscono che il contenuto mitocondriale fluttua durante lo sviluppo delle cellule T con timociti immaturi contenenti più mitocondri di loro controparti maturi, e le cellule T naive che ricircolare nel sangue ricco di ossigeno hanno ancora più basso massa mitocondriale. Interessante, questa riduzione di contenuto mitocondriale era più prominente nel CD8 rispetto il lignaggio di CD4 T (Figura 2B), e l'attivazione delle cellule T ulteriore ha fatto diminuire. Tra le cellule T, CD4 attivate+ le cellule T di memoria avevano leggermente più mitocondri rispetto ad effettori; Tuttavia, l'opposto è stato il caso per CD8+ T cellule: CD8+ le cellule T di memoria ha avuto la massa mitocondriale più basso tra tutti i sottoinsiemi a cellula T (Figura 2B).

Misurazione del contenuto lisosomiale in varie sottopopolazioni di cellule T

Utilizzando specifiche del lisosoma colorante, abbiamo osservato relativamente basso, ma rilevabile, lysosomal contenuto in tutte le popolazioni di cellule T, con la presenza più prominente dei lisosomi in timociti DN1 (Figura 3A). Nessuna differenza significativa è stata trovata fra le sottopopolazioni di timociti da DN1 in poi. In periferia, un numero relativamente elevato dei lisosomi è stato trovato in memoria ed effettrici CD8+ T cellule. Questo fenomeno è in linea con precedenti studi che mostrano che attivati CD8+ T cellule aumentato loro espressione della proteina 1 della membrana lisosomiale associati (lampada-1)21,22, riflettendo il loro possesso di granuli lisosomiali citotossici (Figura 3B)

Figure 1
Figura 1 : Gating strategia dei linfociti splenici e timociti. Le cellule sono state pre-gated il FSC/SSC e PI di ottenere dal vivo camiciole. (A) totale timociti di topi sono stati macchiati con CD4, CD8, CD44 e CD25. Espressioni di CD4 e CD8 sono state usate per distinguere CD4+CD8 SP, CD4CD8+ SP, CD4+CD8+ DP e CD4CD8 sottoinsiemi DN . Il CD4CD8 sottoinsieme DN è stato ulteriormente diviso in CD44+CD25 DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44CD25+ DN3 e CD44CD25 sottopopolazioni DN4 . (B) totale splenocytes dai topi erano macchiati con TCRβ, CD4, CD8, CD44 e CD62L. Le cellule TCRβ+ sono state separate in CD4+ e CD8+ T cellule, che sono stati ulteriormente divisi in ingenuo (CD44CD62L+), memoria (CD44+CD62L+) e dell'effettore (CD44+CD62L -) popolazioni. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con n = 3-4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Istogrammi rappresentativi mostrando i mitocondri macchiatura in ogni popolazione cellulare. Le cellule erano macchiate con tintura di mitocondrio-specifica per 15 min a 37 ° c, seguita dalla macchiatura di superficie dell'indicatore. Segnale fluorescente di cellule marcate è stato acquisito da citometro a flusso e analizzato su. (A) i mitocondri colorazione dei timociti DN e DP. (B) i mitocondri colorazione dei timociti CD4SP e CD8SP e popolazioni di cellule T splenico. ΔMFI = MFI (mitocondri macchiatura) - MFI (FMO). La linea rossa tinta rappresenta macchiatura, la solida linea blu Mostra controllo FMO, i mitocondri e la linea rossa tratteggiata rappresenta l'intensità di fluorescenza media dei mitocondri macchiatura in ogni popolazione. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con n = 3-4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: rappresentante istogrammi risultati lisosoma colorazione nei linfociti splenici e timociti. Le cellule erano macchiate con tintura lisosoma specifici per 30 min a 37 ° c, seguita dalla macchiatura di superficie dell'indicatore. Segnale fluorescente di cellule marcate è stato acquisito da citometro a flusso e analizzato. (A) lisosoma colorazione dei timociti DN e DP. (B) lisosoma colorazione dei timociti CD4SP e CD8SP e popolazioni di cellule T splenico. ΔMFI = MFI (colorazione lisosoma) - MFI (FMO). La linea verde continua rappresenta lisosoma macchiatura, la solida linea blu Mostra FMO, e la linea rossa tratteggiata rappresenta intensità media di fluorescenza del lisosoma macchiatura in ogni popolazione. I risultati sono rappresentativi di un esperimento con n = 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1: progetti di pannello di citometria a flusso Multicolor. Il fluorocromo e la concentrazione di anticorpi/organello coloranti nelle miscele colorazione sono elencate qui. Si consiglia fortemente di titolo e testare ogni anticorpo durante l'impostazione nuova colorazione pannelli.

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Discussion

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Questo protocollo combina organello specifici coloranti e marcatore di superficie macchiatura per quantificare la quantità di mitocondri o lisosomi in popolazioni differenti delle cellule T. Questo metodo è stato sviluppato per superare le limitazioni dei requisiti di numero e omogeneità di cella per i metodi tradizionali, come la microscopia elettronica e l'analisi di immunoblot. È particolarmente utile nell'analisi di popolazioni di cellule rare ed esaminare contemporaneamente più tipi di cellule allo stesso tempo.

La durata della procedura e la temperatura di incubazione sono i fattori più critici nel presente protocollo. Organello corretta etichettatura richiede accurata titolazione degli organelli specifici coloranti. Le cellule inoltre dovrebbero essere tenute rigorosamente su ghiaccio per migliorare la redditività ed evitare anticorpo tappatura e interiorizzazione. Inoltre, la fluorescenza di questi organelli specifici coloranti è vulnerabile ai cambiamenti di temperatura e l'esposizione luce. Pertanto, l'analisi immediata dei campioni, una volta completata la procedura di colorazione è molto importante. Siamo sempre stati in grado di completare l'intero esperimento entro 2 ore.

Poiché questo protocollo si basa sulla capacità di rilevazione di fluorescenza multicolore di citometro a flusso per valutare le componenti intracellulari, le impostazioni di acquisizione (ad es. tensioni PMT) e la compensazione degli spettri si sovrappongono (spillover di fluorescenza nella vicina canali) possa influenzare pesantemente l'intensità del segnale. Questo è particolarmente rilevante quando i marcatori di superficie necessari per identificare i tipi di cella relativa aumentano sopra i sei. In questo caso, esperienza nella progettazione di esperimenti di cytometry di flusso multicolor diventa molto importante per l'acquisizione di dati di alta qualità.

Il sistema immunitario protegge il corpo da infezioni e insulti di agente patogeno, e l'attivazione delle cellule T ha un ruolo fondamentale nel fornire segnali essenziali per altre cellule immuni. Gli studi recenti suggeriscono che popolazioni differenti delle cellule di T hanno programmi metabolici unici, e contenuti lisosomiali e mitocondriali sono cruciali indicatori dei cambiamenti metabolici. Tuttavia, questo fenomeno non è unico a cellule T. La differenziazione e l'attivazione di cellule dell'immunità innata, quali macrofagi e cellule dendritiche, sono anche strettamente legate alla loro condizione metabolica23,24. Il vantaggio di questo protocollo è che può essere adattato per esaminare eventuali popolazioni cellulari di interesse utilizzando anticorpi contro i marcatori lineage-specifici. Inoltre, in combinazione con altri coloranti specifici organelli, come ER - o Cyto-ID, ha il potenziale per valutare diversi organelli o compartimenti cellulari in vari tipi di cellule.

L'istituzione di questo mitocondri o lisosoma metodo di quantificazione non è solo strumentale per studiare il metabolismo in cellule di T, ma ha anche un grande potenziale a vantaggio della ricerca che si concentra sui cambiamenti metabolici nelle impostazioni di malattia, come il cancro o malattie autoimmuni25,26.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.

Acknowledgments

Lo sviluppo di questo protocollo è stato sostenuto da sovvenzioni da Taiwan Ministero della scienza e tecnologia (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 e MOST104-2628-B-010-002-MY4 a C.L. Hsu. C.W. Wei è un destinatario di eccellente tesi premio dell'Istituto di microbiologia e immunologia, National Yang-Ming University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated) Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) Dimeda
15 mL centrifuge tube Thermo Fisher Scientific 339650
5 mL syringe TERUMO 
6 cm Petri dish α-plus
70 µm nylon cell strainer SPL Lifesciences 93070
Ammonium chloride (NH4Cl)    Sigma A9434
Anti-mouse CD25 Biolegend 102007 Clone:PC61
Anti-mouse CD4 Biolegend 100453 Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44 Biolegend 103029 Clone:IM7
Anti-mouse CD62L Biolegend 104407 Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8 Biolegend 100713 Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ Biolegend 109233 Clone:H57-579
BD LSRFortessa BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio basic 6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) BD Biosciences 352052
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone ATD161145
Flowjo, LLC BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma H4034
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
LysoTracker Green DND26 Thermo Fisher Scientific L7526
MEM Non-essential amino acids (100X) Gibco 11140050
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3) J.T.baker 298-14-6
Propidium iodide solution Sigma 25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder) Gibco 31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T
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Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).More

Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

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