Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

doi: 10.3791/58844 Published: January 9, 2019

Summary

Denne artikel illustrerer en kraftfuld metode til at anslå mitokondrier eller lysosomer i levende celler. Kombinationen af lysosomet eller mitokondrier specifikke farvestoffer med fluorescently konjugerede antistoffer mod celleoverflademarkører giver mulighed for kvantificering af disse organeller i blandet cellepopulationer, som primær celler høstet fra vævsprøver, ved hjælp af flerfarvet flowcytometri.

Abstract

T-celler udnytte forskellige metaboliske programmer til at matche deres funktionelle behov under differentiering og spredning. Mitokondrier er afgørende cellulære komponenter, der er ansvarlige for at levere celle energi; dog producere overskydende mitokondrier også reaktive ilt arter (ROS), som kunne forårsage celledød. Antallet af mitokondrier skal derfor hele tiden justeres for at passe behov af celler. Denne dynamiske forordning opnås delvis gennem funktionen af lysosomer at fjerner overskud/beskadiget organeller og makromolekyler. Derfor, cellulære mitokondrie og lysosomale indhold er vigtige indikatorer til at vurdere den metaboliske justering af celler. Med udviklingen af sonder til organeller, er godt karakteriseret lysosomet eller mitokondrier-specifikke farvestoffer blevet tilgængelige i forskellige formater til at mærke cellulære lysosomer og mitokondrier. Flerfarvet flowcytometri er et fælles redskab til profil celle fænotyper, og har kapacitet til at blive integreret med andre assays. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol af hvordan man kan kombinere organelle-specifikke farvestoffer med celleoverflademarkører farvning for at måle mængden af lysosomer og mitokondrier i forskellige T-cellepopulationer på en flow Flowcytometret.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aktivering og spredning af T-celler er kritiske trin til montering vellykket immunrespons. De seneste fremskridt tyder på, at den cellulære metabolisme er tæt forbundet med både udvikling og funktioner af T-celler. For eksempel, stole naive T celler i vid udstrækning på oxidativ fosforylering (OXPHOS) til at opfylde efterspørgslen efter energi under recirkulation blandt sekundære lymfoide organer. Ved aktivering undergår naive T celler drastiske metaboliske omprogrammering, inklusive induktion af aerobe glykolyse at øge ATP produktionen og opfylde de enorme metaboliske krav under Celledifferentiering og spredning. De celler, der undlader at følge gennem metaboliske behov dør af apoptose1,2. Under den metaboliske omprogrammering, spiller mitokondrier en vigtig rolle siden de er de hovedansvarlige for produktionen af ATP til at levere energi til cellens organeller, og cellulære mitokondrier indhold svinger under metaboliske switche hele T-celle udvikling og aktivering3. Men ophobning af overflødige eller beskadigede mitokondrier kan producere overskydende ROS, der skader lipider, proteiner og DNA, og kan i sidste ende føre til celle død4

Overdreven eller beskadigede mitokondrier skyldes stofskifteforandringer er fjernet af en specialiseret form for autophagy5, kendt som mitophagy. Mitokondrier er pakket med autophagosomes og derefter sammensmeltet med lysosomer for nedbrydning. Disse tæt kommunikation mellem mitokondrier og lysosomer har skabt stor interesse6,7. For eksempel, oxidativ stress stimulerer mitokondrier at danne mitokondrier-afledte vesikler (MDVs), der er målrettet til lysosomer for nedbrydning i en fosfatase og tensin homolog (PT)-induceret formodede kinase 1 (PINK1) og parkin (en E3 ubiquitin ligase) afhængige måde8. Det konstateredes også, at mitophagy er afgørende for beige til hvid adipocyt overgang9,10. Endnu vigtigere, er lysosomer ikke blot en nedbrydning rum, men også en regulator af cellulær signalering. Overdreven substrat ophobning på grund af enzymet mangler resulterer i lysosomale dysfunktion ved at forstyrre lysosomale membran permeabilitet og påvirker Ca2 + homøostase11. T-celle funktionelle defekter i lysosomale syre lipase (LAL)12 eller lysosomale metabolit transporter knockout mus model13 viste yderligere betydningen af lysosomer for opretholdelsen af T celle homøostase. Både mitokondrier og lysosomer er uadskillelige dele af cellulære metaboliske forordning. Derfor, måling af cellulære mitokondrie indhold har været en afgørende indikator til at evaluere T-celle metaboliske og funktionelle status.

Assays almindeligvis anvendes til at kvantificere cellulære mitokondrie eller lysosomale indholdet omfatter immunblot, elektronmikroskopi, immunfluorescent (IF) farvning og PCR analyse af mitokondriel DNA kopi numre14,15, 16. mens immunblot kan kvantitativt sammenligner protein niveauer på tværs af forskellige prøver og elektron eller hvis mikroskopi kan visualisere morfologiske kendetegnende for disse organeller17, disse assays bærer visse tekniske ulemper. For eksempel, er det tidskrævende at erhverve tilstrækkeligt antal celle billeder med høj forstørrelse og opløsning eller til at sammenligne udtryk niveauet af et protein på tværs af snesevis af prøver, hvilket gør disse assays, anses for at være lav dataoverførselshastighed metoder. Desuden kan disse assays kun anvendes til homogen celle population, såsom cellelinjer, men ikke til vævsprøver, der består af blandede befolkninger.

Det er også vanskeligt at anvende disse assays til sjældne populationer, som krav om minimal celle numre fra 106 108 er umuligt at opfylde. Endelig er celler normalt mængden eller fast under processen, hvilket gør dem uforenelige med andre metoder til at ekstrahere yderligere oplysninger. Sammenlignet med de traditionelle metoder, fluorescerende-baserede flowcytometri har en relativt høj overførselshastighed - oplysninger for alle celler i en stikprøve bestående af blandet cellepopulationer kan analyseres og indsamlet samtidig. Derudover kan registrere mere end 10 parametre på den samme celle og sortere cellerne baseret på ønskede fænotyper for yderligere assays. Reaktiv fluorescerende sonder har været brugt til at mærke lysosomer og mitokondrier i levende celler og kan påvises ved flow flowcytometri18,19. Disse organelle-specifikke sonder har celle gennemtrængelige og fysisk-kemiske egenskaber, som tillader dem at være koncentreret i bestemte subcellulært steder eller organeller. Bekvemt, disse sonder er tilgængelige i forskellige fluorescerende formater, således at deres ansøgning om multicolor analyse.

Denne protokol beskriver i detaljer hvordan man kan kombinere overflade markør farvning med lysosomet eller mitokondrier specifikke farvestoffer til etiketten lysosomer eller mitokondrier i levende celler. Dette er især nyttigt for prøver genereret fra primære væv og organer, der ofte består af heterogene cellepopulationer. Forskere kan identificere cellepopulationer af interesse ved deres overflade markør udtryk og specielt måle lysosomale eller mitokondrie indholdet gennem organelle-specifikke farvestoffer i disse celler. Her viser vi en detaljeret procedure for flow cytometric analyse, der evaluerer den lysosomale eller mitokondrie masse i de store milt T celle delpopulationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musen væv høst proceduren beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af National Yang-Ming University.

1. forberedelse af lymfocyt Suspension fra lymfoide organer

  1. Aflive mus en godkendt metode som CO2 ved indånding i en gennemsigtig akryl kammer efterfulgt af cervikal dislokation at sikre død.
    Bemærk: Hold strømningshastigheden af CO2 for en 20% forskydning pr. minut for afdeling, og ikke er højere end 5 psi (pund pr. kvadrattomme). Det tager 2-3 min for en mus til at miste bevidstheden. Vedligeholde CO2 flow i det mindste for 1 min efter dyret har stoppet vejrtrækning (5-7 min overordnede).
  2. Placer musen på ryggen på en ren board (f.eks. en polystyren plast bord) og lave lemmer med tape. Skyl med 70% ethanol.
  3. At høste milt, skære og åbne bughulen med 11-cm dissekere saks (milten er under maven og over venstre nyre). Fjerne milten med pincet og rense fra bindevævet (bruge saks, hvis nødvendigt).
  4. For at høste thymus, skære mellemgulvet og brystkassen fra begge sider med dissekere saks. Bruge pincet til at opløfte brystbenet til at afsløre hele brysthulen. Adskille thymus omhyggeligt fra omkringliggende væv med en saks, og fjerne enhver resterende bindevæv på et stykke køkkenrulle chloroformvædet med PBS.
  5. Mekanisk adskille væv med en sprøjte stemplet i en 6-cm parabol der indeholder 5 mL iskold FACS buffer (PBS suppleret med 2% føtal bovint serum (FBS) og 1 mM EDTA). Overføre encellede suspension til en 15 mL centrifugeglas; vaske 6-cm parabol med yderligere 2 mL FACS buffer og kombinere vask med cellesuspension så godt.
  6. Centrifugeres cellesuspension (300 x g, i 5 min. ved 4 ° C) og supernatanten. Genopslæmmes pellet med 2 mL af Ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysing buffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 og 0,1 mM Na2EDTA) i 1 minut ved stuetemperatur (RT) til lyse røde blodlegemer. Neutralisere ACK buffer ved at føje 10 mL FACS buffer til cellesuspension.
  7. Centrifugeres cellesuspension (300 x g, i 5 min. ved 4 ° C) og supernatanten. Genopslæmmes celler i 5 mL af komplet RPMI medium (RPMI 1640 medium, suppleret med 44 mM NaHCO3, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer og 10% FBS).
  8. Filter cellesuspension gennem en celle si (pore størrelse 70 µm) at fjerne celle klumper. Tælle celler med en hemocytometer eller automatiseret celle counter.

2. kvantificering af mitokondrier og lysosomer

Bemærk: Udføre organelle-specifikke farvestoffet farvning først fordi den optimale farvning betingelse for disse farvestoffer er inkubation ved 37 ° C. Overflade markør farvning kan reduceres markant på grund af antistof udjævningen og internalisering ved denne temperatur.

  1. Tilføj 1 x 106 celler for at runde-bunden FACS rør, centrifugeres celler (300 x g, i 5 min. ved 4 ° C) og kassér supernatanten.
  2. Fortyndes sonde stamopløsninger til endelig arbejder koncentration (100 nM MitoTracker grøn eller LysoTracker Green; fremover mitokondrier eller lysosomet specifikke farvestof, henholdsvis) i pre varmede 37 ° C serumfrit næringssubstratet. Dette er brugsopløsning for lysosomet - eller mitokondrier-specifikke farvestoffet.
    Bemærk: Teste flere koncentrationer herunder vifte af arbejdende koncentrationer foreslået af fabrikanten (20-200 nM til mitokondrier-specifikke farvestoffet) og 50-75 nM for lysosomet-specifikke farvestoffet anvendes her for at få den bedste farvning effektivitet. Vælg en celle population, der er kendt for at have gode udtryk for farvning mål (fx lysosomer) som positiv kontrol (f.eks. human CD14+ monocytter). Vælge orden koncentration baseret på god adskillelse mellem negative og positive farvning, samt god cellernes levedygtighed.
  3. Resuspend celler i 100 µL af lysosomet - eller mitokondrier-specifikke farvestof brugsopløsning og Inkuber i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 15 min eller 30 min, henholdsvis.
  4. Der tilsættes 1 mL iskold FACS buffer til at stoppe reaktionen. Pellet celler ved centrifugering (300 x g, i 5 min. ved 4 ° C) og kassér supernatanten. Cellerne er nu klar til overflade markør farvning.

3. overflade markør farvning

  1. Blok Fc receptorer med 100 µL af pre titreret 2.4G2 hybridom supernatanten i isbad i 10 min. vask celler med 1 mL af FACS buffer, og der centrifugeres (300 x g, i 5 min. ved 4 ° C). Kassér supernatanten.
  2. Inkuber celler med 50 µL pre titreret fluorescens-konjugeret antistof kombination i FACS buffer på isen i 20 min. undgå lys.
    Bemærk: Forberede enkelt farve-farvede celler, der omfatter alle de fluorescerende antistoffer til stede i antistoffet kombination og celler behandles kun med organelle-specifikke farvestoffet for indstilling spændinger af hver fluorescens detektor og kompensation justering på flow forskellige. Ligeledes, forberede fluorescens Minus én (FMO) som baggrund kontrol ved hjælp af celler farves med alle antistofferne, men uden farvning med organelle-specifikke farvestoffer.
  3. Cellerne vaskes ved tilsætning af 1 mL af FACS buffer og pellet ved centrifugering (300 x g, i 5 min. ved 4 ° C). Kassér supernatanten.
  4. Resuspend celler i 300 µL af FACS buffer indeholdende 1 µg/mL propidium Iodid (PI) og straks analysere prøver på flow Flowcytometret.

4. prøvetagning på Flow forskellige

    5. dataanalyse

    Bemærk: Der er mange værktøjer til at analysere flow cytometric data, både kommercielle og gratis software. Flow cytometers erhvervelse software kan også arbejde for dataanalyse. Her brugte vi FlowJo som et eksempel.

    1. Start programmet og trække FCS filer i arbejdsområdet. Klik på en prøve at åbne en grafisk vindue. Vælg parametre skal forelægges på X- og Y-aksen ved at klikke på X- og Y-akser. Bruge værktøjslinjen til at trække gates varierende udtrykt markører eller definerede fænotyper af cellepopulationer.
    2. Tilføje gates af hver parameter, som vist i figur 1. Træk gates til alle prøver i arbejdsområdet, så de bliver identiske gating.
    3. Træk parceller til Layouteditor til at oprette grafiske rapporter.
    4. Vise den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) for hver befolkning af interesse ved at klikke på knappen statistik (Σ) i et grafisk vindue og vælge "Betyder" og parameteren passende, for eksempel, den kanal bruges til at registrere organelle-specifikke farvestoffet. Klik på "Tilføj".
    5. Klik på ikonet tabel editor og træk MFI til tabel editor til at oprette statistiske rapporter. Gemme som Excel, tekst eller CSV-fil til at beregne delta MFI (ΔMFI) som MFI (organelle-specifikke farvestoffer) - MFI (FMO).
      Bemærk: Undlad at beregne MFI mellem prøver erhvervet med forskellige forskellige indstillinger (spændinger, fluorescerende kanaler eller kompensation). Sammenligninger af værdier afledt af eksperimenter med forskellige indstillinger er meningsløs og forudindtaget.
    6. Eksportere alle værdier fra arbejdsområdet og parceller fra Layouteditor til at lave tabeller og figurer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Identifikation af store T celle subsets i milt og thymus

    I korte, var enkelt celle suspensioner fra milt og thymus mængden af røde blodlegemer, inkuberes med 2.4G2 supernatanten, efterfulgt af organelle-specifikke farve og overflade markør farvning med fluorescens-konjugerede antistoffer (tabel 1). Udviklingsmæssige progression af thymocytter kan beskrives ved hjælp af antistoffer til co-receptorer CD8 og CD4. De mest umodne thymocytter udtrykke ikke CD4 eller CD8 og kaldes dobbelt negativ (DN). Så, op-regulere både CD4 og CD8 og blive dobbelt positive (DP). Endelig, de ned-regulere CD4 eller CD8 og blive modne enkelt positivt (SP) celler klar til at forlade organ. De tidligste stadier af T-celle udvikling, når cellerne ikke udtrykke Co receptorer CD4 og CD8, kan yderligere klassificeres på grundlag af CD44 og CD25 udtryk. De tidligste ophav er CD44+ CD25- (DN1), og så begynde at udtrykke CD25 og blive CD44+CD25+ (DN2) celler. Efter at cellerne ned-regulere CD44 og bliv CD44-CD25+ (DN3) celler, og endelig de ned-regulere CD25 samt at blive CD44-CD25- (DN4) celler, der er på måde at udtrykke CD4 og CD8 og bliver dobbelt-positive (DP) celler.

    I milten, T-celler kan opdeles i cytotoksiske CD8+ og helper CD4+ T celler. Begge af disse befolkninger kan opdeles yderligere i naiv, effektor og hukommelse delmængder baseret på CD62L og CD44 farvning. Den detaljerede gating strategi er vist i figur 1.

    Kvantificering af mitokondrier massen i forskellige T celle subsets

    Mitokondrier-specifikke farvestoffer blev brugt til at måle beløb af mitokondrier i T-cellepopulationer. Vi fandt, at mitokondriel indholdet var det laveste i DN1, toppede DN2-DN3, og derefter lidt faldt i DN4 og DP thymocytter og var endnu lavere i CD4 og CD8 SP thymocytter (fig. 2A). Imidlertid havde CD4 eller CD8 SP thymocytter højere mitokondrier farvning MFI end milt CD4 eller CD8 T celler (figur 2B). Disse observationer tyder på, at mitokondriel indhold svinger i løbet af T-celle udvikling med umodne thymocytter indeholdende flere mitochondrier end deres ældre kolleger gør, og de naive T-celler, der recirkulerer i ilt-rige blod har endnu lavere mitokondrie masse. Interessant, denne reduktion af mitokondrie indholdet var mere fremtrædende i CD8 end CD4 T lineage (figur 2B), og T-celle aktivering faldt det yderligere. Blandt aktiverede T-celler CD4+ memory T celler havde lidt flere mitochondrier i forhold til effektorer; men modsat var tilfældet for CD8+ T celler: CD8+ memory T celler havde den laveste mitokondrie masse blandt alle T celle subsets (figur 2B).

    Lysosomale indhold måling i forskellige delpopulationer af T-celler

    Bruger lysosomet-specifikke farvestoffet, observeret vi relativt lav, men kan spores, lysosomale indholdet i alle T-cellepopulationer, med mere fremtrædende tilstedeværelse af lysosomer i DN1 thymocytter (fig. 3A). Ingen signifikant forskel blev fundet blandt thymocyte delmængder fra DN1 fremefter. I periferien, et relativt højt antal lysosomer blev fundet i hukommelse og effektor CD8+ T celler. Dette fænomen er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser viser, aktiveres CD8+ T celler forøget deres udtryk for lysosomale-associerede membranen protein 1 (lampe-1)21,22, som afspejler deres besiddelse af lysosomale-cytotoksiske granulat (fig. 3B)

    Figure 1
    Figur 1 : Gating strategi af milt lymfocytter og thymocytter. Celler var præ indhegnede på FSC/SSC og PI- at få live slåbrokker. (A) samlede thymocytter fra mus var plettet med CD4, CD8, CD44 og CD25. CD4 og CD8 udtryk blev brugt til at skelne CD4+CD8- SP, CD4-CD8+ SP, CD4+CD8+ DP, og CD4-CD8- DN undersæt. CD4-CD8- DN delmængde blev yderligere opdelt i CD44+CD25- DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44-CD25+ DN3, og CD44-CD25- DN4 delpopulationer. (B) samlede splenocytes fra mus var farves med TCRβ, CD4, CD8, CD44 og CD62L. TCRβ+ celler blev opdelt i CD4+ og CD8+ T celler, som blev yderligere opdelt i naive (CD44-CD62L+), hukommelse (CD44+CD62L+), og effektor (CD44+CD62L -) populationer. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg med n = 3-4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2 : Repræsentant histogrammer viser mitokondrier farvning i hver celle population. Celler var plettet med mitokondrier-specifikke farvestoffet for 15 min på 37 ˚C, efterfulgt af overflade markør farvning. Fluorescerende signal af farvede celler blev erhvervet af flow forskellige og analyseret på. (A) mitokondrier farvning af DN og DP thymocytter. (B) mitokondrier farvning af CD4SP og CD8SP thymocytter og milt T-cellepopulationer. ΔMFI = MFI (mitokondrier farvning) - MFI (FMO). Den røde streg repræsenterer mitokondrier farvning, den blå streg viser FMO kontrol, og den stiplede røde linje repræsenterer gennemsnitlige fluorescens intensiteten af mitokondrier farvning i hver befolkning. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg med n = 3-4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3: repræsentative histogrammer viser lysosomet farvning i milt lymfocytter og thymocytter. Celler var plettet med lysosomet-specifikke farvestoffet for 30 min på 37 ˚C, efterfulgt af overflade markør farvning. Fluorescerende signal af farvede celler blev erhvervet af flow forskellige og analyseret. (A) lysosomet farvning af DN og DP thymocytter. (B) lysosomet farvning af CD4SP og CD8SP thymocytter og milt T-cellepopulationer. ΔMFI = MFI (lysosomet farvning) - MFI (FMO). Den grønne streg repræsenterer lysosomet farvning, den blå streg viser FMO, og den stiplede røde linje repræsenterer gennemsnitlige fluorescens intensiteten af lysosomet farvning i hver befolkning. Resultaterne er repræsentative for et eksperiment med n = 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Table 1
    Tabel 1: Multifarve flow flowcytometri panel design. Fluorokrom og koncentration af antistoffer/organelle farvestoffer i farvning blandinger er angivet her. Det anbefales kraftigt at titrere og teste hver antistof, når du opretter nye farvning paneler.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Denne protokol kombinerer organelle-specifikke farvestoffer og overflade markør farvning for at kvantificere mængden af mitokondrier eller lysosomer i forskellige T-cellepopulationer. Denne metode blev udviklet for at overvinde begrænsningen af celle nummer og homogenitet krav til traditionelle metoder, såsom elektronmikroskopi og immunblot analyse. Det er især nyttigt i at analysere sjældne cellepopulationer og samtidig undersøge flere celletyper på samme tid.

    Procedurens varighed og temperaturen af inkubation er de mest kritiske faktorer i denne protokol. Ordentlig organelle mærkning kræver nøjagtig titrering af organelle-specifikke farvestoffer. Celler bør også holdes strengt på isen for at forbedre levedygtigheden og undgå antistof udjævningen og internalisering. Derudover er fluorescens af disse organelle-specifikke farvestoffer sårbare over for lys eksponering og temperatur ændringer. Øjeblikkelig analyse af prøver når farvning proceduren er afsluttet er således meget vigtigt. Vi har konsekvent kunnet fuldføre hele eksperimentet indenfor 2 timer.

    Da denne protokol bygger på afsløring multicolor fluorescens af flow forskellige evne til at evaluere intracellulære komponenter, overlapper erhvervelse indstillinger (f.eks. ydelse spændinger) og godtgørelse af spektre (afsmitning af Fluorescens til omkringliggende kanaler) kan stærkt påvirke intensiteten af signalet. Dette er især relevant, når celleoverflademarkører nødvendige for at identificere de relevante celletyper øge over seks. I denne situation bliver erfaring i at designe multicolor flow flowcytometri eksperimenter meget vigtig for høj kvalitet dataopsamling.

    Immunforsvaret beskytter kroppen mod patogenet fornærmelser og infektioner, og T-celle aktivering har afgørende rolle i forbindelse med vigtige signaler til andre immunceller. Nylige undersøgelser tyder på at forskellige T-cellepopulationer har unikke metaboliske programmer, og mitokondriel og lysosomale indholdet er afgørende indikatorer for metaboliske ændringer. Men fænomenet er ikke unikke for T-celler. Differentiering og aktivering af medfødte immun celler, makrofager og dendritiske celler er også tæt knyttet til deres metaboliske status23,24. Fordelen ved denne protokol er at det kan tilpasses til at undersøge enhver cellepopulationer af interesse ved hjælp af antistoffer mod afstamning-specifikke markører. Desuden, i kombination med andre organelle-specifikke farvestoffer, som ER - eller Cyto-ID, det har potentiale til at evaluere forskellige organeller eller cellulære rum i forskellige typer af celler.

    Oprettelsen af denne mitokondrier eller lysosomet kvantificering metode er ikke alene medvirkende til at studere metabolisme i T-celler, men også har et stort potentiale til gavn for forskning, som fokuserer på metaboliske ændringer i indstillinger for sygdom, som kræft eller autoimmune sygdomme25,26.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

    Acknowledgments

    Udviklingen af denne protokol blev støttet af tilskud fra Taiwan Ministeriet for videnskab og teknologi (mest) NSC103-2320-B-010-002-MY2 og MOST104-2628-B-010-002-MY4 til CL Hsu. C.W. Wei er en modtager af fremragende afhandling Award af Institut for Mikrobiologi og Immunologi, National Yang-Ming University.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    10 cm Graefe forceps (straight and serrated) Dimeda
    11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) Dimeda
    15 mL centrifuge tube Thermo Fisher Scientific 339650
    5 mL syringe TERUMO 
    6 cm Petri dish α-plus
    70 µm nylon cell strainer SPL Lifesciences 93070
    Ammonium chloride (NH4Cl)    Sigma A9434
    Anti-mouse CD25 Biolegend 102007 Clone:PC61
    Anti-mouse CD4 Biolegend 100453 Clone:GK1.5
    Anti-mouse CD44 Biolegend 103029 Clone:IM7
    Anti-mouse CD62L Biolegend 104407 Clone:MEL-14
    Anti-mouse CD8 Biolegend 100713 Clone:53-6.7
    Anti-mouse TCRβ Biolegend 109233 Clone:H57-579
    BD LSRFortessa BD Biosciences
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio basic 6381-92-6
    FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) BD Biosciences 352052
    Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone ATD161145
    Flowjo, LLC BD Biosciences
    Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma H4034
    L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
    LysoTracker Green DND26 Thermo Fisher Scientific L7526
    MEM Non-essential amino acids (100X) Gibco 11140050
    MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514
    Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
    Potassium bicarbonate (KHCO3) J.T.baker 298-14-6
    Propidium iodide solution Sigma 25535-16-4
    RPMI 1640 medium (powder) Gibco 31800089
    Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
    Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212, (9), 1345-1360 (2015).
    2. Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136, (4), 363-369 (2012).
    3. Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182, (7), 4046-4055 (2009).
    4. Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
    5. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, (1), 9-14 (2011).
    6. Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500, (1), 87-93 (2018).
    7. Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
    8. McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33, (4), 282 (2014).
    9. Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (10), 607 (2016).
    10. Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24, (3), 402-419 (2016).
    11. Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (5), 283-296 (2013).
    12. Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174, (3), 944-956 (2009).
    13. Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23, (8), 2330-2341 (2018).
    14. Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22, (3), 485-498 (2015).
    15. Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281, (1), 324-333 (2006).
    16. Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (20), 7681-7686 (2004).
    17. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393, (7), 547-564 (2012).
    18. van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (35), 14336 (2013).
    19. Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85, (2), 169-178 (2013).
    20. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
    21. Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175, (7), 4392-4399 (2005).
    22. Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199, (7), 925-936 (2004).
    23. Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17, (3), 684-696 (2016).
    24. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15, (1), 18-29 (2015).
    25. Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
    26. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17, (1), 29 (2015).
    Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).More

    Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter