Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

doi: 10.3791/58844 Published: January 9, 2019

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.

Abstract

T-Zellen nutzen verschiedene metabolische Programme mit ihren funktionalen Bedürfnissen während der Differenzierung und Proliferation. Mitochondrien sind wichtige zelluläre Komponenten verantwortlich für die Energieversorgung der Zelle; überschüssige Mitochondrien produzieren jedoch auch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die Zelle Tod verursachen könnte. Daher muss die Anzahl der Mitochondrien ständig angepasst werden die Bedürfnisse der Zellen. Diese dynamischen Regelung erreichen teilweise durch die Funktion der Lysosomen, die Überschuß/beschädigtes Organellen und Makromoleküle zu entfernen. Zellulären Mitochondrien und lysosomale Inhalte sind daher wichtige Indikatoren zur Bewertung der metabolische Anpassung der Zellen. Mit der Entwicklung von Sonden für Organellen sind gut charakterisierten Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe in verschiedenen Formaten zu zellulären Lysosomen und Mitochondrien label geworden. Multicolor Durchflusszytometrie wird sehr häufig verwendet, Profil Zelle Phänotypen und hat die Fähigkeit, mit anderen Tests integriert werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll wie Organell-spezifische Farbstoffe mit Oberflächenmarker Färbung um den Lysosomen und Mitochondrien in verschiedenen T-Zell-Populationen auf einem Durchflusszytometer messen zu kombinieren.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen sind wichtige Schritte für erfolgreiches Immunantworten Montage. Die jüngsten Fortschritte legen nahe, dass der Zellstoffwechsel eng verknüpft mit der Entwicklung und Funktionen des T-Zellen ist. Beispielsweise greifen naive T-Zellen weitgehend auf Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), während die Rückführung unter sekundären lymphatischen Organe den Energiebedarf zu decken. Nach der Aktivierung unterziehen naive T-Zellen, drastische metabolische Neuprogrammierung, einschließlich die Induktion der aeroben Glykolyse, ATP-Produktion zu erhöhen und die enormen metabolische Anforderungen während der Zelldifferenzierung und Verbreitung zu erfüllen. Die Zellen, die nicht durch die metabolischen Bedürfnisse Folgen sterben durch Apoptose1,2. Während die metabolische Neuprogrammierung Mitochondrien eine wichtige Rolle da sie weitgehend verantwortlich für die Produktion von ATP zur Energieversorgung für die Zelle Organellen, und der zellulären Mitochondrien Inhalt während metabolische Schalter schwankt in der gesamten T Zelle Entwicklung und Aktivierung3. Allerdings kann die Ansammlung von überflüssigen oder beschädigte Mitochondrien überschüssige ROS führen, die Lipiden, Proteinen und DNA-Schäden, und kann schließlich zu Tod4 Zelle führen

Stoffwechselveränderungen infolge übermäßigen oder beschädigten Mitochondrien werden durch eine spezielle Form der Autophagie5, bekannt als Mitophagy entfernt. Mitochondrien sind durch Autophagosom gewickelt und dann mit Lysosomen zum Abbau verschmolzen. Diese schließen Kommunikation zwischen Mitochondrien und Lysosomen haben großes Interesse6,7erzeugt. Zum Beispiel oxidativer Stress stimuliert Mitochondrien Mitochondrien stammenden Vesikeln (MDVs) zu bilden, die auf Lysosomen zum Abbau in einer Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) ausgerichtet sind-induzierte vermeintliche Kinase 1 (PINK1) und Parkin (eine E3-Ubiquitin-Ligase) abhängig von Art und Weise8. Ferner wurde festgestellt, dass diese Mitophagy für wichtig Beige-weiß Adipocyte Übergang9,10. Lysosomen sind noch wichtiger ist, nicht nur ein Abbau-Fach, sondern auch ein Regulator der zellulären Signalisierung. Übermäßige Substrat Akkumulation durch Enzymmangel führt zu lysosomalen Dysfunktion durch Unterbrechung lysosomale Membranpermeabilität und Ca2 + Homöostase11betrifft. Die T-Zell-Funktionsstörungen lysosomale saure Lipase (LAL)12 oder lysosomalen Metabolit Transporter Knockout Maus Modell13 ergab ferner die Bedeutung der Lysosomen in T-Zell-Homöostase. Mitochondrien und Lysosomen sind untrennbare Bestandteile des zellulären Stoffwechselregulation. Daher wurde die Messung des zellulären Mitochondrien ein entscheidender Indikator, der T-Zell-metabolische und funktionellen Status zu bewerten.

Assays, die häufig verwendet, um die zellulären Mitochondrien oder lysosomalen Inhalt zu quantifizieren sind Immunoblot, Elektronenmikroskopie, immunofluorescent (IF) Färbung und PCR-Analyse der mitochondrialen DNA Kopie Zahlen14,15, 16. während Immunoblot quantitativ vergleichen kann Proteingehalte in verschiedenen Proben und Elektron oder Mikroskopie morphologischen Kennzeichen dieser Organellen17visualisieren kann, tragen diese Tests bestimmte technische Nachteile. Zum Beispiel ist es zeitaufwendig, ausreichende Anzahl von Zelle Bilder mit hoher Vergrößerung und Auflösung zu erwerben oder um den Ausdruck eines Proteins über Dutzende von Proben, machen diese Tests als niedriger Durchsatz Methoden vergleichen. Darüber hinaus können diese Tests nur angewendet werden, nicht homogene Zellpopulation, wie Zell-Linien, aber Gewebeproben, die aus gemischten Populationen bestehen.

Es ist auch schwierig, diese Assays für seltene Populationen gelten für die Anforderung des minimalen Zelle von 10 Zahlen6 bis 108 ist unmöglich zu erfüllen. Zu guter Letzt sind Zellen in der Regel lysiert oder festen während des Prozesses, so dass sie nicht kompatibel mit anderen Methoden, um weitere Informationen zu extrahieren. Im Vergleich mit den traditionellen Methoden, fluoreszierend-basierte Durchflusszytometrie hat einen relativ hohen Durchsatz - Informationen aller Zellen innerhalb einer Stichprobe bestehend aus gemischten Zellpopulationen analysiert und gleichzeitig gesammelt werden kann. Darüber hinaus kann eine mehr als 10 Parameter auf dieselbe Zelle erkennen und sortieren die Zellen basierend auf gewünschte Phänotypen für weitere Tests. Reaktive fluoreszierende Sonden wurden verwendet, um Lysosomen und Mitochondrien in lebenden Zellen zu kennzeichnen und durch Flow Cytometry18,19detektiert werden. Diese Organellen-spezifischen Sonden sind Zelle durchlässig und physikalisch-chemischen Eigenschaften, die ihnen ermöglichen, in bestimmten subzellulären Orten oder Organellen konzentriert werden. Praktischerweise sind diese Sonden in verschiedenen fluoreszierenden Formaten, so dass ihre Anwendung für die mehrfarbigen Analyse.

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, Surface Marker Färbung mit Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe zu Label Lysosomen zu kombinieren oder Mitochondrien in lebende Zellen. Dies ist besonders nützlich für Proben aus primären Gewebe und Organe, die oft heterogenen Zellpopulationen bestehen generiert. Forscher identifizieren Zell-Populationen von Interesse durch ihre Oberfläche Marker Ausdruck und speziell den lysosomalen oder mitochondriale Inhalt durch Organell-spezifische Farbstoffe in diesen Zellen zu messen. Hier zeigen wir die Einzelheiten des Verfahrens der durchflusszytometrischen Analyse, die die lysosomale oder mitochondriale Masse in den großen Milz T-Zell-Subpopulationen auswertet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Das hier beschriebene Maus Gewebe Ernte Verfahren wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der National Yang-Ming University genehmigt.

1. Vorbereitung der Lymphozyten Aussetzung aus lymphatischen Organen

  1. Einschläfern der Maus von einer anerkannten Methode wie CO2 Inhalation in einer transparenten Acryl Kammer gefolgt von zervikale Dislokation Tod sicherzustellen.
    Hinweis: Halten Sie die Durchflussmenge des CO2 für eine Verschiebung der 20 % pro Minute der Kammer, und nicht höher als 5 Psi (Pfund pro Quadratzoll). Es dauert ca. 2-3 min für eine Maus, um das Bewusstsein verlieren. Pflegen Sie den CO2 -Fluss mindestens für 1 min, nachdem das Tier aufgehört hat zu atmen (insgesamt ca. 5-7 min).
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken auf einem sauberen Brett (z.B. Polystyrol Kunststoffplatte) und befestigen Sie der Gliedmaßen mit Klebeband. Spülen Sie mit 70 % Ethanol.
  3. Milz zu ernten, schneiden und die Bauchhöhle mit 11 cm sezierenden Schere (die Milz ist unterhalb des Magens und oberhalb der linken Niere) zu öffnen. Die Milz mit einer Pinzette entfernen und reinigen von Bindegewebe (Schere verwenden, falls erforderlich).
  4. Um die Thymusdrüse zu ernten, schneiden Sie das Zwerchfell und den Brustkorb von beiden Seiten mit Präparierscheren. Verwenden Sie Zange zum Anheben des Brustbeins, der gesamte Brusthöhle zu offenbaren. Trennen Sie der Thymus sorgfältig aus den umliegenden Geweben mit einer Schere zu, und entfernen Sie alle verbleibenden Bindegewebe auf ein Papiertuch mit PBS benetzt.
  5. Distanzieren Sie das Gewebe mechanisch mit Spritzenkolben in eine 6-cm-Schüssel mit 5 mL eiskaltes FACS Puffer (PBS ergänzt mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 mM EDTA). Übertragen Sie die Single-Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen; Waschen Sie die 6-cm-Schüssel mit zusätzlichen 2 mL FACS-Puffer und kombinieren Sie die Wäsche mit Zellsuspension sowie.
  6. Zentrifugieren der Zellsuspension (300 X g, für 5 min bei 4 ° C) und den Überstand verwerfen. Wieder aussetzen Sie das Pellet mit 2 mL des Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lyse Puffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 und 0,1 mM Na2EDTA) für 1 min bei Raumtemperatur (RT), die roten Blutkörperchen lysiert. Den ACK-Puffer zu neutralisieren, indem die Zellsuspension 10 mL FACS Puffer hinzugefügt.
  7. Zentrifugieren der Zellsuspension (300 X g, für 5 min bei 4 ° C) und den Überstand verwerfen. Zellen in 5 mL des kompletten RPMI Medium erneut aussetzen (RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 100 U/mL Penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 44 mM Nahco33, 1 mM Natrium Pyruvat, 1 % MEM nicht-essentiellen Aminosäuren und 10 % FBS).
  8. Filter-Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (Pore Größe 70 µm), Zelle Klumpen zu entfernen. Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler.

2. Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen

Hinweis: Führen Sie den Organell-spezifische Farbstoff Färbung zuerst, denn die optimale Färbung Voraussetzung für diese Farbstoffe Inkubation bei 37 ° C. Die Färbung der Oberfläche Marker kann wegen Antikörper capping und Verinnerlichung bei dieser Temperatur deutlich reduziert werden.

  1. Fügen Sie 1 x 106 Zellen um Rundboden FACS Röhren, Zentrifugieren Zellen (300 X g, für 5 min bei 4 ° C) und überstand verwerfen hinzu.
  2. Verdünnen Sie die Sonde auf lagerlösungen auf Arbeit Endkonzentration (100 nM MitoTracker Green oder LysoTracker Green; fortan Mitochondrien oder Lysosomen-spezifische färben, bzw.) in serumfreien Kulturmedium vorgewärmten 37 ° C. Dies ist die funktionierende Lösung für Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Färbung.
    Hinweis: Testen Sie mehrere Konzentrationen einschließlich arbeiten Konzentrationen von Hersteller (20-200 nM für die Mitochondrien-spezifischen Farbstoff) und 50-75 nM für den Lysosomen-spezifischen Farbstoff verwendet hier vorgeschlagen um die beste Effizienz Färbung zu erhalten. Wählen eine Zellpopulation, die bekannt ist, guten Ausdruck der Färbung Ziel (z. B. Lysosomen) als Positivkontrolle haben (z.B. menschliche CD14+ Monozyten). Wählen Sie die Arbeiten Konzentration auf gute Trennung zwischen negativen und positiven Färbung sowie gute Zellviabilität basiert.
  3. Aufschwemmen der Zellen in 100 µL der Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische funktionierende Lösung zu färben und in 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C inkubieren für 15 min oder 30 min, beziehungsweise.
  4. Fügen Sie 1 mL eiskaltes FACS-Puffer, um die Reaktion zu stoppen. Pellet-Zellen durch Zentrifugation (300 X g, für 5 min bei 4 ° C) und überstand verwerfen. Zellen sind nun bereit für Surface Marker zu beflecken.

3. Oberfläche Marker Färbung

  1. Block-Fc-Rezeptoren mit 100 µL vor betitelten 2.4G2 Hybridom Überstand auf Eis für 10 min. Waschen Zellen mit 1 mL FACS-Puffer und Zentrifuge (300 X g, für 5 min bei 4 ° C). Verwerfen Sie überstand.
  2. Inkubation der Zellen mit 50 µL vor betitelten Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern Kombination in FACS-Puffer auf dem Eis für 20 min. leicht vermeiden.
    Hinweis: Bereiten Sie Farbe gebeizt Einzelzellen, die enthalten alle die fluoreszierende Antikörper in der Antikörper Kombination und Zellen behandelt nur mit Organell-spezifischen Farbstoff für Einstellung Spannungen jeder Fluoreszenz-Detektor und Entschädigung Korrektur am Fluss CYTOMETER. Ebenso bereiten Sie die Fluoreszenz Minus eins (FMO) als Hintergrund-Kontrollen mithilfe von Zellen mit den Antikörpern, aber ohne Färbung mit Organell-spezifischen Farbstoffen gefärbt.
  3. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 mL der FACS-Puffer und Pellet durch Zentrifugieren (300 X g, für 5 min bei 4 ° C). Verwerfen Sie überstand.
  4. Aufschwemmen der Zellen in 300 µL der FACS-Puffer mit 1 µg/mL Propidium Jodid (PI) und sofort analysieren die Proben am Durchflusszytometer.

(4) Probenentnahme am Durchflusszytometer

  1. Schalten Sie den Computer, Durchflusszytometer, FACS-Datenerfassungs-Software und andere Zusatzgeräte je nach Maschinenplattform. Führen Sie PBS für etwa 1 min Sicherstellung der Flusslinie mit PBS und Mantel Puffer gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass der Durchfluss reibungslos abläuft.
  2. Öffnen Sie neues Experiment zu und wählen Sie Cytometer Parameter (fluoreszierende Detektoren) nach Anleitung des Herstellers. Filtern Sie Zellen bis 70 µm Zelle Sieb und Wirbel vor der Übernahme von jeder Probe, Klumpen und Wams-Bildung zu vermeiden.
  3. Stellen Sie Punkt plottet der forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC), die Zellengröße und Granularität, bzw. darstellen. Optimieren Sie die Spannungen der FSC und SSC um sicherzustellen, dass die Zellen von Interesse in den Parzellen erscheinen. Machen Sie Punkt plottet der FSC-A vs. FSC-W (oder FSC-H) und zeichnen Sie ein Tor für die Einzelzellen zu.
  4. Stellen Sie Punkt plottet der einzelnen fluoreszierende Parameter. Verwenden Sie ungefärbte Zellen zu bestimmen Hintergrundsignal und einzelne Farbe gebeizt Steuerelemente verwenden, um die Spannungen der einzelnen fluoreszierende Parameter anpassen, so dass positive und negative Zellpopulationen klar unterscheidbar sind und innerhalb des dynamischen Bereichs des Erwerbs.
  5. Nachdem alle Spannungen eingestellt sind, verwenden Sie Auto-Entschädigung, falls vorhanden, oder manuell passen Sie an, die Entschädigung mit ungefärbten und einzelne Farbe gebeizt Kontrollen, das spektrale übergreifen zu korrigieren. Gelten Sie die Entschädigung für Proben.
  6. Machen Sie einen Dot-Plot der einzelnen Parameter und aufzustellen Sie Tore nach Ihren experimentellen Satz. Zum Beispiel FSC-A vs. FSC-H (oder FSC-W) auszuschließende Dubletten, gefolgt von FSC-A vs. SSC-A für die Lymphozyten Anspritzung; SSC-A vs. PI (lebende Zellen) und CD4 und CD8 (Abbildung 1).
  7. Sammeln Sie genug Veranstaltungen (insgesamt Handynummer) für einen aussagekräftigen Vergleich zwischen Populationen. In der Regel müssen mindestens 1.000 Ereignisse in der Bevölkerung von Interesse20bezogen werden.
  8. Nachdem alle Proben erworben werden, exportieren Sie Bewegungsdaten von Flow Cytometry Analysesoftware ausgewertet werden. Speichern Sie das Experiment als Vorlage zur Erhaltung der Cytometer Einstellung und Parameter für die Anwendung auf ähnliche Experimente in der Zukunft.

(5) Datenanalyse

Hinweis: Es gibt viele Tools, durchflusszytometrischen Bewegungsdaten, kommerzieller und freier Software zu analysieren. Die Software zur Datenerfassung von fließen Cytometers kann auch für die Datenanalyse arbeiten. Hier haben wir FlowJo als Beispiel verwendet.

  1. Starten Sie die Software und ziehen Sie die FCS-Dateien in den Arbeitsbereich. Klicken Sie auf eine Probe, ein Grafik-Fenster zu öffnen. Wählen Sie die Parameter am vorgelegt werden X und Y Achse durch Klicken auf die X- und y-Achsen. Mithilfe der Symbolleiste Tore nach differentiell exprimierten Marker oder definierten Phänotypen Zellpopulationen zu zeichnen.
  2. Fügen Sie Tore der einzelnen Parameter hinzu, wie in Abbildung 1dargestellt. Tore für alle Proben in den Arbeitsbereich ziehen, so dass sie identisch gating.
  3. Ziehen Sie die Grundstücke in Layout-Editor zum Erstellen von grafischen Berichten.
  4. Anzeigen der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jede Bevölkerung von Interesse durch Klicken auf die Schaltfläche Statistik (Σ) in einem grafischen Fenster und wählen Sie "Bedeuten" und den entsprechenden Parameter, z. B. Kanal Organell-spezifische Färbung zu erkennen. Klicken Sie dann auf "Hinzufügen".
  5. Klicken Sie auf die Tabelle Editor-Symbol und ziehen Sie MFI in Tabellen-Editor zum Erstellen von statistischen Berichten. Speichern Sie als Excel, Text oder CSV-Datei, Delta MFI (ΔMFI) als MFI (Organell-spezifische Farbstoffe) - MFI (FMO) zu berechnen.
    Hinweis: Berechnen nicht MFI zwischen Proben mit verschiedenen Cytometer erworbenen Einstellungen (Spannungen, fluoreszierende Kanäle oder Entschädigung). Vergleiche von Werten abgeleitet aus Experimenten mit unterschiedlichen Einstellungen sind bedeutungslos und voreingenommen.
  6. Exportieren Sie alle Werte aus dem Arbeitsbereich und Grundstücke aus Layout-Editor für die Herstellung von Tabellen und Abbildungen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Identifikation der großen T Zelle Teilmengen in Milz und thymus

Kurz gesagt, wurden einzelne Zellsuspensionen von Milz und Thymus der Erythrozyten lysiert, mit 2.4G2 überstand inkubiert, gefolgt von Organell-spezifische Farbe und Oberfläche Marker Färbung mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern (Tabelle 1). Die Entwicklung Fortschreiten der Thymozyten kann mithilfe von Antikörpern gegen die Co-Rezeptoren beschrieben werden CD8 und CD4. Die unreifen Thymozyten CD4 oder CD8 nicht ausdrücklich und doppelte Verneinung (DN) genannt. Dann, sie regulieren bis CD4 und CD8 und werden doppelt positiv (DP). Endlich, sie nach unten regulieren CD4 oder CD8 und werden Reifen positiv (SP) Einzelzellen bereit, die Orgel zu verlassen. Die frühesten Stadien der T-Zell-Entwicklung, wenn die Zellen nicht die Co-Rezeptoren ausdrücken CD4 und CD8, kann auf der Grundlage von CD44 und CD25 Ausdruck weiter klassifiziert werden. Die frühesten Vorfahren sind CD44+ CD25 (DN1), und dann sie beginnen mit dem Ausdruck CD25 und CD44+CD25+ (DN2) Zellen. Danach die Zellen Down-Regulierung CD44 und CD44 werdenCD25+ (DN3) Zellen und schließlich sie Down-Regulierung CD25 CD44 sowie zuCD25 (DN4) Zellen, die auf dem Weg zum Ausdruck CD4 und CD8 und immer Doppel-positiv (DP) Zellen.

In der Milz, die T-Zellen können unterteilt werden zytotoxische CD8+ und Helfer CD4+ T Zellen. Beide dieser Populationen können weiter unterteilt werden naiv, Effektor und Gedächtnis Teilmengen basierend auf CD62L und CD44 Färbung. Die detaillierte gating-Strategie ist in Abbildung 1dargestellt.

Quantifizierung der Mitochondrien Masse in verschiedenen T Zelle Teilmengen

Mitochondrien-spezifische Farbstoffe wurden verwendet, um die Beträge der Mitochondrien in T-Zell-Populationen zu messen. Wir fanden, dass die mitochondriale Inhalt den niedrigsten DN1, DN2-DN3, seinen Höchststand und dann leicht verringerte sich im DN4 und DP Thymozyten waren und noch tiefer in CD4 und CD8 SP Thymozyten (Abb. 2A). Thymozyten CD4 oder CD8 SP hatte jedoch höhere Mitochondrien Färbung MFI als Milz CD4 oder CD8 T-Zellen (Abbildung 2B). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die mitochondriale Inhalt schwankt während der T-Zell-Entwicklung mit unreifen Thymozyten mit mehr Mitochondrien als ihre älteren Kollegen tun, und die naive T-Zellen, die sauerstoffreiches Blut umwälzen sogar noch niedriger haben mitochondriale Masse. Interessant ist, diese Reduktion der mitochondrialen Inhalt ist noch ausgeprägter in den CD8 als der CD4-T-Linie (Abbildung 2B) und T-Zell-Aktivierung ging es weiter. Unter aktiviert T-Zellen, CD4+ T-Gedächtniszellen hatte etwas mehr Mitochondrien im Vergleich zu Effektoren; Doch das Gegenteil war der Fall für CD8+ T Zellen: CD8+ T-Gedächtniszellen hatte die niedrigsten mitochondriale Masse unter allen T Zelle Teilmengen (Abbildung 2B).

Lysosomalen Inhalts Messung in verschiedenen Subpopulationen von T-Zellen

Mit Lysosomen-spezifischen Farbstoff, beobachteten wir relativ niedrig, aber nachweisbar, lysosomale Inhalt in allen T-Zell-Populationen mit mehr prominente Präsenz der Lysosomen in DN1 Thymozyten(Abbildung 3). Keinen signifikanten Unterschied zwischen der Thymocyte Teilmengen DN1 weiter ergab sich. In der Peripherie, fand sich eine relativ hohe Anzahl von Lysosomen in Erinnerung und Effektor CD8+ T Zellen. Dieses Phänomen steht im Einklang mit früheren Studien, die zeigen, die CD8 aktiviert+ T Zellen erhöht ihren Ausdruck der lysosomalen verbundenen Membranprotein 1 (Lampe-1)21,22, reflektieren ihren Besitz lysosomale zytotoxischen Granulat (Abbildung 3B)

Figure 1
Abbildung 1 : Strategie der Milz Lymphozyten und Thymozyten gating. Zellen wurden bereits geschlossenen auf FSC/SSC und PI live Unterhemden zu erhalten. (A) insgesamt Thymozyten von Mäusen waren mit CD4, CD8, CD44 und CD25 befleckt. CD4 und CD8 Ausdrücke wurden verwendet, um CD4 zu unterscheiden+CD8 SP, CD4CD8+ SP, CD4+CD8+ DP, und CD4CD8 DN Teilmengen. Die CD4CD8 DN Teilmenge wurde weiter unterteilt in CD44+CD25 DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44CD25+ DN3, und CD44CD25 DN4 Subpopulationen. (B) insgesamt Splenocyten von Mäusen waren mit TCRβ, CD4, CD8, CD44 und CD62L befleckt. Die TCRβ+ -Zellen wurden getrennt in CD4+ und CD8+ T-Zellen, die naive weiter unterteilt wurden (CD44CD62L+), Speicher (CD44+CD62L+), und Effektor (CD44+CD62L -) Populationen. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängigen Experimenten mit n = 3-4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative Histogramme zeigen Mitochondrien Färbung in jede Zellpopulation. Zellen wurden mit Mitochondrien-spezifischen Farbstoff für 15 min bei 37 ° c, gefolgt von Surface Marker Färbung gefärbt. Fluoreszenzsignal gefärbten Zellen wurde von Durchflusszytometer erworben und analysiert auf. (A) Mitochondrien Färbung des DN und DP Thymozyten. (B) Mitochondrien Färbung des CD4SP und CD8SP Thymozyten und Milz T-Zell-Populationen. ΔMFI = MFI (Mitochondrien Färbung) - MFI (FMO). Die durchgezogene rote Linie stellt Mitochondrien Färbung, die durchgezogene blaue Linie zeigt FMO-Steuerelement und die gestrichelte rote Linie dar mittlere Fluoreszenzintensität der Mitochondrien Färbung in jeder Bevölkerung. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängigen Experimenten mit n = 3-4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: repräsentative Histogramme zeigen Lysosomen Färbung in Milz Lymphozyten und Thymozyten. Zellen wurden mit Lysosomen-spezifischen Farbstoff für 30 min bei 37 ° c, gefolgt von Surface Marker Färbung gefärbt. Fluoreszenzsignal gefärbten Zellen wurde von Durchflusszytometer erworben und analysiert. (A) Lysosomen Färbung des DN und DP Thymozyten. (B) Lysosomen Färbung des CD4SP und CD8SP Thymozyten und Milz T-Zell-Populationen. ΔMFI = MFI (Lysosomen Färbung) - MFI (FMO). Die solide grüne Linie stellt Lysosomen Färbung, die durchgezogene blaue Linie zeigt FMO, und die gestrichelte rote Linie dar mittlere Fluoreszenzintensität der Lysosomen Färbung in jeder Bevölkerung. Die Ergebnisse sind repräsentativ für ein Experiment mit n = 5. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Table 1
Tabelle 1: Multicolor Flow Cytometry Panel Design. Die Fluorochrom und die Konzentration der Antikörper/Organelle Farbstoffe in den befleckenden Mischungen finden Sie hier. Es wird dringend empfohlen zu titrieren und jeder Antikörper zu testen, bei der Einrichtung von neuen Färbung Platten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dieses Protokoll verbindet Organell-spezifische Farbstoffe und Oberfläche Marker Färbung um die Menge der Mitochondrien oder Lysosomen in verschiedenen T-Zell-Populationen zu quantifizieren. Diese Methode wurde entwickelt, um die Beschränkung der Zelle Nummer und Homogenität zum traditionellen Methoden, z. B. Elektronenmikroskopie und Immunoblot Analyse zu überwinden. Es ist besonders nützlich in seltenen Zellpopulationen zu analysieren und gleichzeitig mehrere Zelltypen gleichzeitig untersuchen.

Die Dauer des Verfahrens und die Temperatur der Inkubationszeit sind die wichtigsten Faktoren in diesem Protokoll. Richtige Organelle Kennzeichnung erfordert genaue Titrierung Organell-spezifische Farbstoffe. Zellen sollten auch streng gehalten werden, auf dem Eis zu erhöhen die Rentabilität und vermeiden Antikörper capping und Internalisierung. Darüber hinaus ist die Fluoreszenz dieser Organellen-spezifische Farbstoffe anfällig für Licht Belichtung und Temperatur verändert. Sofortige Analyse der Proben nach Abschluss der Färbeverfahren ist daher sehr wichtig. Wir haben durchweg in der Lage, das ganze Experiment innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen worden.

Da dieses Protokoll stützt sich auf die Fähigkeit der Erkennung von mehrfarbigen Fluoreszenz von Durchflusszytometer, intrazelluläre Komponenten bewerten, überschneiden sich die Übernahme Einstellungen (z.B. PMT Spannungen) und zur Vergütung von Spektren (das Übergreifen der Fluoreszenz in benachbarte Kanäle) kann die Intensität des Signals stark beeinflussen. Dies ist besonders relevant, wenn die Oberflächenmarker benötigt, um die entsprechende Zelle Arten identifizieren über sechs zu erhöhen. In diesem Fall wird Erfahrung in multicolor Flow Cytometry Versuchsplanung sehr wichtig für die hochwertige Datenerfassung.

Das Immunsystem schützt den Körper vor Beleidigungen Erreger und Infektionen und T-Zell-Aktivierung hat zentrale Rolle bei der Bereitstellung von wesentlichen Signale an andere Immunzellen. Neuere Studien legen nahe, dass verschiedene T-Zell-Populationen einzigartige metabolische Programme haben und mitochondriale und lysosomale Inhalte wichtige Indikatoren für die metabolischen Veränderungen sind. Dieses Phänomen ist jedoch nicht nur für T-Zellen. Die Differenzierung und Aktivierung des angeborenen immunen Zellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen, sind ihre Stoffwechsellage23,24auch eng verbunden. Der Vorteil dieses Protokolls ist, dass es Zell-Populationen von Interesse zu untersuchen, indem Sie mit Antikörpern gegen Geschlecht-spezifische Marker angepasst werden kann. Darüber hinaus in Kombination mit anderen Organell-spezifische Farbstoffe, wie ER oder Zyto-ID hat es das Potenzial verschiedener Organellen oder zellulare Fächer in verschiedenen Arten von Zellen zu bewerten.

Die Einrichtung dieser Mitochondrien oder Lysosomen Quantifizierungsmethode ist nicht nur entscheidend für den Stoffwechsel in T-Zellen zu studieren, aber auch hat großes Potenzial, um Forschung zu profitieren, die schwerpunktmäßig mit metabolischen Veränderungen in Einstellungen, Krankheit, wie Krebs oder Autoimmunkrankheiten25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Unterstützt wurde die Entwicklung dieses Protokolls durch Zuschüsse aus Taiwan-Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 und MOST104-2628-B-010-002-MY4, C.L. Hsu. C.w. Wei ist ein Empfänger der ausgezeichnete Dissertation Award des Institut für Mikrobiologie und Immunologie, National Yang-Ming University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated) Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) Dimeda
15 mL centrifuge tube Thermo Fisher Scientific 339650
5 mL syringe TERUMO 
6 cm Petri dish α-plus
70 µm nylon cell strainer SPL Lifesciences 93070
Ammonium chloride (NH4Cl)    Sigma A9434
Anti-mouse CD25 Biolegend 102007 Clone:PC61
Anti-mouse CD4 Biolegend 100453 Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44 Biolegend 103029 Clone:IM7
Anti-mouse CD62L Biolegend 104407 Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8 Biolegend 100713 Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ Biolegend 109233 Clone:H57-579
BD LSRFortessa BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio basic 6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) BD Biosciences 352052
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone ATD161145
Flowjo, LLC BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma H4034
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
LysoTracker Green DND26 Thermo Fisher Scientific L7526
MEM Non-essential amino acids (100X) Gibco 11140050
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3) J.T.baker 298-14-6
Propidium iodide solution Sigma 25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder) Gibco 31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212, (9), 1345-1360 (2015).
  2. Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136, (4), 363-369 (2012).
  3. Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182, (7), 4046-4055 (2009).
  4. Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
  5. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, (1), 9-14 (2011).
  6. Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500, (1), 87-93 (2018).
  7. Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
  8. McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33, (4), 282 (2014).
  9. Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (10), 607 (2016).
  10. Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24, (3), 402-419 (2016).
  11. Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (5), 283-296 (2013).
  12. Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174, (3), 944-956 (2009).
  13. Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23, (8), 2330-2341 (2018).
  14. Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22, (3), 485-498 (2015).
  15. Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281, (1), 324-333 (2006).
  16. Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (20), 7681-7686 (2004).
  17. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393, (7), 547-564 (2012).
  18. van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (35), 14336 (2013).
  19. Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85, (2), 169-178 (2013).
  20. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
  21. Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175, (7), 4392-4399 (2005).
  22. Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199, (7), 925-936 (2004).
  23. Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17, (3), 684-696 (2016).
  24. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15, (1), 18-29 (2015).
  25. Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
  26. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17, (1), 29 (2015).
Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).More

Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter