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Immunology and Infection

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

doi: 10.3791/58844 Published: January 9, 2019

Summary

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

Abstract

T 세포 감 별 법 그리고 확산 하는 동안 그들의 기능 요구에 맞게 다른 신진 대사 프로그램을 활용 합니다. 미토 콘 드리 아에는 중요 한 세포 구성 요소 셀 에너지; 공급에 대 한 책임 그러나, 초과 미토 콘 드리 아에는 또한 반응성 산소 종 (선생님) 세포 죽음을 일으킬 수 있는 생산. 따라서, 미토 콘 드리 아의 수 지속적으로 세포의 요구에 맞게 조정 해야 합니다. 이 동적 규칙 일부 흑자/손상 된 세포와 고분자를 제거 하는 리소좀의 기능을 통해 이루어집니다. 따라서, 세포 미토 콘 드리 아와 lysosomal 내용이 세포의 신진 대사 조정 평가 하는 주요 지표 이다입니다. 세포에 대 한 프로브 개발, 잘 특징이 리소좀 또는 미토 콘 드리 아-특정 염료는 세포 리소좀 및 미토 콘 드리 아를 다양 한 형태로 제공 되었다. 다 색 cytometry 프로필 셀 고기를 일반적인 도구 이며 다른 분석 실험와 통합 될 수 있다. 여기, 우리와 결합 하 여 세포 기관이 특정 염료 표면 마커 얼룩에 교류 cytometer 리소좀과 다른 T 세포 인구에 있는 미토 콘 드리 아의 양을 측정 하는 방법의 상세한 프로토콜을 제시.

Introduction

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활성화 및 T 세포의 확산 장착 성공적인 면역 반응에 중요 한 단계가 있습니다. 최근 진보 세포질 물질 대사는 개발 및 T 세포의 기능와 밀접 하 게 관련 된 것이 좋습니다. 예를 들어, naïve T 세포 산화 인 산화 (OXPHOS) 2 차 림프 기관 가운데 재순환 동안 에너지 수요를 충족 하기에 크게 의존 합니다. 활성화, naïve T 세포 과감 한 대사 프로그래밍, 호 기성 해당 분해 ATP 생산을 증가 하 고 세포 분화 및 증식 하는 동안 엄청난 대사 요구를 충족의 유도 포함 하 여 받 다. 신진 대사 요구를 통해 수행 하지 못하는 세포 apoptosis1,2다. 신진 대사 프로그래밍 하는 동안 미토 콘 드리 아에 중요 한 역할 때문에 그들은 크게는 셀에 대 한 에너지를 공급 하는 ATP의 생산에 대 한 책임 세포 세포 미토 콘 드리 아 콘텐츠 대사 스위치 중 변동 통해 T 세포 개발 및 활성화3. 그러나, 불필요 하거나 손상 된 미토 콘 드리 아의 축적 지질, 단백질 및 DNA를 손상 하 고 결국 죽음4 셀 이어질 수 초과 선생님을 생성할 수 있습니다.

과도 한 또는 손상 된 미토 콘 드리 아 대사 변경에서 발생 하는 특수 한 형태의 autophagy5, mitophagy로 알려진에 의해 제거 됩니다. 미토 콘 드리 아 autophagosomes에 의해 싸여 있으며 다음 성능 저하 lysosomes로 융합. 이 미토 콘 드리 아 간의 통신 닫고 리소좀 큰 관심6,7생성 합니다. 산화 스트레스를 미토 콘 드리 아에서 파생 된 소포 (MDVs) 리소좀 인산 가수분해 효소 및 tensin 체 (PTEN) 저하에 대 한 타겟으로하는 미토 콘 드리 아를 자극 하는 예를 들어-상 상속 키 니 아 제 1 (PINK1) 유도 및 parkin (E3 유비퀴틴 리가) 종속 방식8. 또한 그 mitophagy 베이 지 화이트 체형 전환9,10에 대 한 필수적입니다 발견 했다. 더 중요 한 것은, 리소좀 단지 저하 구획, 아니라 셀룰러 신호의 레 귤 레이 터 하지 않습니다. 효소 부족으로 인해 과도 한 기판 축적 lysosomal 부전 lysosomal 막 침투성을 방해 하 여 발생 하 고 캘리포니아2 + 항상성11에 영향을 줍니다. T 세포 기능 결함 lysosomal 산 성 리 파 제 (LAL)12 또는 lysosomal 대사 산물 운송업 자 녹아웃 마우스 모델13 에 추가 T 세포 항상성 유지에 리소좀의 중요성을 보여주었다. 미토 콘 드리 아와 리소좀 세포 신진 대사 조절의 불리할 수 없는 부분입니다. 따라서, 세포 미토 콘 드 리아 측정 T 세포 대사 및 기능 상태를 평가 하는 중요 한 표시기 되었습니다.

일반적으로 세포 미토 콘 드리 아 또는 lysosomal 내용을 정량화 하는 데 사용 하는 분석 실험 등 immunoblot, 전자 현미경, immunofluorescent (IF) 얼룩, 미토 콘 드리 아 DNA 복사 번호14,15, 의 PCR 분석 16. 이러한 분석 특정 기술적인 단점 부담 immunoblot 양적 다른 샘플 및 전자 현미경 검사 법17이러한 세포 형태학 적 특징을 시각화 수 있는 경우 전체 단백질 레벨을 비교할 수 있습니다, 하는 동안. 예, 그것은 시간이 걸리는 높은 배율과 해상도와 셀 이미지의 충분 한 번호를 취득 하거나 낮은 처리량 방법으로 간주 됩니다 이러한 분석을 만드는 샘플을 수십에서 단백질의 식 수준을 비교 하. 셀 라인, 같은 동종 세포 인구에 하지만 혼합 인구의 구성 된 조직 샘플을 또한,이 분석 실험의 적용할 수만 있습니다.

그것은 또한 드문 인구, 10에서 숫자는 최소 셀의 요구 사항에 이러한 분석을 적용 하기 어려운6 108 만날 수는 없습니다. 마지막으로, 셀 일반적으로 lysed 또는 호환 되지 않는 추가 정보를 추출 하는 다른 방법으로 그들을 만드는 과정 동안 고정. 전통적인 방법에 비해, 형광 기반 cytometry는 상대적으로 높은 처리량-모든 샘플 내의 셀 혼합된 셀 인구 구성의 정보를 분석 하 고 동시에 수집 된 수 있습니다. 또한, 하나의 동일한 셀에 10 개 이상의 매개 변수를 검색할 하 고 추가 분석에 대 한 원하는 고기에 따라 셀을 정렬할 수 있습니다. 반응 형광 프로브 리소좀 및 라이브 세포에서 미토 콘 드리 아를 사용 하 고 교류 cytometry18,19에 의해 검출 될 수 있다. 이러한 세포 기관이 전용 프로브 셀 침투성 고 특정 subcellular 위치 또는 세포에 집중 될 수 있도록 physico-화학 특성. 편리 하 게,이 프로브 따라서 다 색 분석에 대 한 그들의 응용 프로그램을 사용 하면 다양 한 형광 형식에서 사용할 수 있습니다.

표면 마커 라벨 리소좀을 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료와 염색 법을 결합 하는 방법을 자세하게에서 설명 합니다이 프로토콜 또는 미토 콘 드리 아에서 라이브 셀. 기본 조직 및 장기는 종종 다른 유형의 세포 인구 구성에서 생성 된 샘플에 대 한 특히 유용 합니다. 연구원은 그들의 표면 마커 식으로 관심의 세포 인구를 식별 하 고 이러한 세포에서 세포 기관이 특정 염료를 통해 lysosomal 또는 미토 콘 드리 아 내용을 구체적으로 측정 수 있습니다. 여기, 우리 주요 비장 T 세포 모집단에 lysosomal 또는 미토 콘 드리 아 질량을 계산 하는 흐름 cytometric 분석의 상세한 절차를 보여 줍니다.

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Protocol

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여기에 설명 된 마우스 조직 수확 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 국립 양 밍 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 림프 구 림프 기관에서 현 탁 액의 준비

  1. 투명 한 아크릴 챔버 죽음을 보장 하기 위해 자 궁 경관 탈 구 뒤에 CO2 흡입 등 승인 된 방법으로 마우스를 안락사.
    참고: CO2 챔버, 및 5 psi (평방 인치 당 파운드) 보다 분당 20% 변위에 대 한 유량을 유지 합니다. 그것은 식을 잃고 마우스에 대 한 2-3 분 걸립니다. 유지 CO2 흐름 적어도 1 분 동안 동물 (5-7 분 전체) 호흡을 멈춘 후.
  2. 깨끗 한 보드 (예: 폴리스 티 렌 플라스틱 보드)에 그것의 뒤에 마우스를 놓고 테이프로 사지를 수정 합니다. 70% 에탄올으로 씻어.
  3. 비장을 수확, 잘라내어 11 cm 해가 위 (비장은 위 아래 및 왼쪽된 신장 이상) 복 부 구멍을 엽니다. 집게로 비장을 제거 하 고 결합 조직 (필요한 경우가 위를 사용)에서 청소.
  4. Thymus 수확, 횡 경 막 위를 해 부와 양쪽에서 빗을 잘라. 집게를 사용 하 여 전체 흉 강을 흉 골 위로 올립니다. Thymus 신중 하 게가 위, 조직 주위에서 하 고 PBS를 가진 젖는 종이 타월에 어떤 잔여 결합 조직을 제거 합니다.
  5. 기계적으로 5 mL 차가운 FACS 버퍼 PBS (보충 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1 mM EDTA)를 포함 하는 6 cm 접시에 주사기 플런저와 조직 분리. 전송 단일 세포 현 탁 액 15 mL 원심 분리기 튜브; 추가적인 2 mL FACS 버퍼 6 cm 접시를 세척 하 고 세척 뿐만 아니라 셀 서 스 펜 션 결합.
  6. Centrifuge 세포 현 탁 액 (300 x g, 4 ° C에서 5 분) 하 고는 상쾌한 삭제. 다시 2 mL의 염화 염화 칼륨 (ACK) lysing 버퍼 (155mm NH4Cl, 10 m m KHCO3 와 0.1 m m 나2EDTA) 실 온 (RT) 붉은 혈액 세포를 lyse에서 1 분으로 펠 릿을 일시 중단 합니다. 세포 현 탁 액을 10 mL FACS 버퍼를 추가 하 여 ACK 버퍼를 중화.
  7. Centrifuge 세포 현 탁 액 (300 x g, 4 ° C에서 5 분) 하 고는 상쾌한 삭제. 다시 완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀을 일시 중단 (RPMI 1640 매체, 44 m m NaHCO3, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스, 2 mM L-글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 보충 1 %MEM 비필수 아미노산 및 10 %FBS).
  8. 필터 세포 현 탁 액 셀 덩어리를 제거 하려면 셀 스 트레이너 (숨 구멍 크기 70 µ m)를 통해. Hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 셀을 계산 합니다.

2입니다. 미토 콘 드리 아와 리소좀의 정량화

참고: 이러한 염료에 대 한 최적의 착 상태는 37 ° c.에 부 화 하기 때문에 먼저 얼룩 세포 기관이 특정 염료를 수행 표면 마커 얼룩 항 체 상한 및 해당 온도에서 국제화 크게 줄일 수 있습니다.

  1. 1 x 106 셀 라운드-하단 FACS 튜브 원심 셀 (300 x g, 4 ° C에서 5 분), 상쾌한 삭제 추가 합니다.
  2. 최종 작업 농도에 프로브 재고 솔루션을 희석 (100 nM MitoTracker 녹색 또는 LysoTracker 녹색; 이제 미토 콘 드리 아 또는 리소좀 특정 염료, 각각) 37 ° C에 미리 데워 진된 혈 청 무료 문화 매체에. 이것은 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료에 대 한 작업 솔루션 이다.
    참고: 테스트 (미토 콘 드리 아-특정 염료에 대 한 20-200 nM) 및 50-75 nM 여기 사용 리소좀 특정 염료에 대 한 제조 업체에 의해 제안 작업 농도의 범위를 포함 한 여러 농도 최고 효율 얼룩을 얻기 위하여. 대상 (예: 리소좀) 긍정적인 통제로 얼룩의 좋은 표현을 하는 세포 인구를 선택 (예: 인간의 CD14+ monocytes). 좋은 세포 생존 능력 뿐만 아니라 부정적이 고 긍정적인 얼룩, 사이 좋은 분리에 따라 작업 농도 선택 합니다.
  3. Resuspend 100 µ L의 리소좀 또는 미토 콘 드리 아-특정 셀 작업 솔루션 염색 하 고 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 품 어 15 분 또는 30 분, 각각.
  4. 반응을 중지를 얼음 처럼 차가운 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 원심 (300 x g, 4 ° C에서 5 분)에 의해 세포를 작은 고 상쾌한 삭제. 세포 표면 마커 얼룩에 대 한 준비가 지금입니다.

3. 표면 마커 얼룩

  1. FACS 버퍼 및 분리기 (300 x g, 4 ° C에서 5 분)의 1 mL와 함께 10 분 워시 셀에 대 한 얼음 표면에 뜨는 미리 적정 한 2.4G2 hybridoma의 100 µ L와 블록 Fc 수용 체. 상쾌한을 삭제 합니다.
  2. 20 분 피 빛에 대 한 얼음에 FACS 버퍼에서 50 µ L 형광 활용 된 항 체를 미리 적정 한 조합으로 세포를 품 어.
    참고: 준비는 항 체에 형광 항 체 존재 모두를 포함 하는 단일 색상 스테인드 셀 조합과 셀 흐름에 각 형광 검출기와 보상 조정의 전압을 설정 하기 위한 세포 기관이 특정 염료로만 치료 cytometer입니다. 마찬가지로, 모든 항 체와 함께 하지 않고 세포 기관이 특정 염료 얼룩이 묻은 셀을 사용 하 여 배경 컨트롤에서 1 (FMO)을 뺀 형광 준비.
  3. 원심 (300 x g, 4 ° C에서 5 분)에 의해 FACS 버퍼 및 펠 릿의 1 mL을 추가 하 여 셀을 씻어. 상쾌한을 삭제 합니다.
  4. FACS 버퍼 1 µ g/mL propidium 요오드 화물 (PI) 포함의 300 µ L 셀 resuspend 및 즉시 교류 cytometer에 샘플을 분석.

4. 샘플 컬렉션 교류 Cytometer에

  1. 컴퓨터, 교류 cytometer, FACS 수집 소프트웨어 및 컴퓨터 플랫폼에 따라 다른 액세서리 장치를 켭니다. 실행 흐름 라인 되도록 약 1 분 동안 PBS PBS와 칼 집 버퍼 채워집니다. 흐름 스트림 원활 하 게 실행 다는 것을 확인 하십시오.
  2. 새로운 실험을 열고 하 고 제조업체의 지시에 따라 cytometer 매개 변수 (형광 검출기)를 선택 합니다. 70 µ m 셀 스 트레이너 및 덩어리와 남자 용 상의 형성을 피하기 위해 각 샘플의 인수 전에 소용돌이 통해 셀 필터링.
  3. 셀 크기와 단위, 각각 대표 하는 앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC)의 점 음모를 확인 합니다. 관심사의 세포는 플롯에 표시 되도록 FSC 그리고 SSC의 전압을 최적화 합니다. FSC- FSC W (또는 FSC-H)의 점 음모를 확인 하 고 단일 셀에 대 한 게이트를 그립니다.
  4. 점 작 각 형광 매개 변수를 확인 합니다. 흠 없는 세포를 사용 하 여 배경 신호를 확인 하 고 단일 색상 스테인드 컨트롤을 사용 하 여 긍정적이 고 부정적인 세포 인구는 명확 하 게 구별할 수 있도록 하 고 취득의 동적 범위 내에서 각 형광 매개 변수의 전압 조정.
  5. 모든 전압 설정 후 사용 가능한 경우 자동 보정을 사용 하거나 수동으로 컨트롤과 흠 없는 및 단일 색상 스테인드 스펙트럼 일 좀 해결 하기 위해 보상을 조정 합니다. 보정 샘플에 적용 됩니다.
  6. 각 매개 변수의 도트 줄거리를 만들고 실험 설정에 따르면 게이츠를 세우. 예를 들어, FSC- FSC-H (또는 FSC-W) 남자를 제외 하 뒤 FSC-A 림프 구 게이팅; 대 한 SSC-A SSC A PI (라이브 셀)와 CD4 CD8 (그림 1).
  7. 인구 사이 의미 있는 비교를 위해 충분 한 이벤트 (총 휴대폰 번호)를 수집 합니다. 일반적으로, 관심사의 인구에서 적어도 1000 이벤트20얻어질 필요가 있다.
  8. 모든 샘플, 인수 후 교류 cytometry 분석 소프트웨어에 의해 분석 흐름 데이터를 내보냅니다. 실험 cytometer 설정 및 미래에 비슷한 실험에 적용에 대 한 매개 변수를 유지 하려면 서식 파일로 저장 합니다.

5. 데이터 분석

참고: 흐름 cytometric 데이터, 둘 다 상업 및 무료 소프트웨어를 분석 하는 많은 도구가 있습니다. 교류 cytometers의 수집 소프트웨어 또한 데이터 분석에 사용할 수 있습니다. 여기 우리는 예를 들어 FlowJo를 사용합니다.

  1. 소프트웨어를 시작 하 고 FCS 파일 작업 영역으로 끕니다. 샘플 그래픽 창을 열려면 클릭 하십시오. 선택에 수 여 하는 매개 변수 X 및 Y 축을 클릭 하 여 X 및 Y 축. 도구 모음을 사용 하 여 차동 표현된 마커 또는 세포 인구의 정의 고기 게이츠 그릴.
  2. 그림 1에 표시 된 대로 각 매개 변수를 추가 합니다. 그들이 얻을 동일한 작업 영역에서 모든 샘플에 게이트를 끕니다 게이팅.
  3. 그래픽 보고서를 만들 레이아웃 편집기를 음모를 끕니다.
  4. 그래픽 창에서 통계 단추 (Σ)를 클릭 하 고 "의미"와 적절 한 매개 변수, 예를 들어 세포 기관이 특정 염료를 감지 하는 데 사용 하는 채널 선택의 각 인구를 위한 평균 형광 강도 (MFI)를 표시 합니다. 다음 "추가"를 클릭 합니다.
  5. 테이블 편집기 아이콘을 클릭 하 고 통계 보고서를 만들 테이블 편집기 MFI 드래그 합니다. MFI (세포 기관이 특정 염료)-MFI (FMO)로 델타 MFI (ΔMFI)를 계산 하기 위해 Excel, 텍스트 또는 CSV 파일로 저장 합니다.
    참고: 샘플 다른 cytometer 취득 사이 MFI를 계산 하지 않습니다 (전압, 형광 채널 설정 또는 설정 보상). 다른 설정으로 실험에서 파생 된 값의 비교는 무의미 하 고 편 파.
  6. 테이블 및 그림을 만들기 위한 레이아웃 편집기에서 플롯 하 고 작업 영역에서 모든 값을 내보냅니다.

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Representative Results

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비장 및 흉 선 주요 T 세포 부분 집합의 식별

간단히, 비장, thymus에서 단일 셀 정지 적혈구의 lysed, 2.4G2 상쾌한와 인 큐베이 팅, 세포 기관이 특정 염료 및 표면 마커 형광 활용 된 항 체 (표 1)와 얼룩. Thymocytes의 개발 진행 공동 수용 체에 항 체를 사용 하 여 기술 될 수 있다 CD4, CD8. 가장 미 숙 thymocytes CD4 또는 CD8 표현 하지 않는 그리고 이중 부정 (DN) 불린다. 다음, 그들은 c d 4와 CD8 최대 조절 하 고 이중 긍정 (DP) 될. 마지막으로, 그들은 CD4 또는 CD8 다운 조절 하 고 성숙한 단일 긍정적인 (SP) 세포 기관 떠날 준비가 되. 셀 공동 수용 체를 표현 하지 않는 때, T 세포 발달의 초기 단계 c d 4와 CD8, 더 CD44와 CD25 식 기준으로 분류 될 수 있다. 가장 이른 창시자는 CD44+ CD25- (DN1), 그리고 그들은 CD25 표현 시작 될 CD44+CD25+ (DN2) 세포. 그 후, 셀 CD44 다운 조절 되 고 CD44-CD25+ (DN3) 세포 및, 마지막으로, 그들은 다운 규제 뿐만 CD44 되려면 CD25-CD25- (DN4) 셀 고 c d 4와 CD8 표현 하는 방법에 더블-양성 (DP) 세포입니다.

비장에 T 세포 CD8 세포 독성으로 나눌 수 있습니다+ 와 CD4+ T 세포. 모두 이러한 인구 CD62L CD44에 기반 하는 순진한, 이펙터 및 메모리 하위 집합으로 더 분할 될 수 있다 얼룩. 자세한 제어 전략은 그림 1에 표시 됩니다.

다른 T 세포 부분 집합에서 미토 콘 드리 아의 정량화

미토 콘 드리 아-특정 염료는 T 세포 인구에서 미토 콘 드리 아의 양을 측정 하기 위해 사용 되었다. 우리는 미토 콘 드 리아 내용을 d n 1에 가장 낮은, DN2-DN3 정점 다음 약간 DN4 및 DP thymocytes 감소 그리고 심지어 낮은 c d 4와 CD8 SP thymocytes (그림 2A)에서 발견. 그러나, CD4 또는 CD8 SP thymocytes 높은 미토 콘 드리 아 비장 CD4 또는 CD8 T 세포 (그림 2B) 보다 MFI를 착 색 했다. 이러한 관측 제안 미토 콘 드 리아 콘텐츠 미 숙 thymocytes 포함 하는 보다 성숙한 대응, 그리고 산소 풍부한 혈액에 recirculate naïve T 세포는 더 낮은 더 많은 미토 콘 드리 아와 T 셀 개발 중 변동 미토 콘 드 리아 질량입니다. 흥미롭게도, 미토 콘 드 리아 내용의이 감소 CD4 T 계보 (그림 2B), 보다는 CD8에 더 저명한 그리고 T 세포 활성화는 더 이상 그것을 감소. 중 CD4 T 세포 활성화+ 메모리 T 세포 했다 이펙터;에 비해 약간 더 미토 콘 드리 아 그러나, 반대는 CD8 경우+ T 세포: CD8+ 메모리 T 세포 모든 T 세포 부분 집합 (그림 2B) 중 가장 낮은 미토 콘 드 리아 질량 했다.

T 세포의 다양 한 부분 모집단에 lysosomal 콘텐츠 측정

리소좀-특정 염료를 사용 하 여, 관찰 상대적으로 낮고, 감지, 하지만 모든 T 세포 인구에 lysosomal 내용을 리소좀 DN1 thymocytes(그림 3)에서 더 두드러진 존재 합니다. 큰 차이 thymocyte 하위 집합 중에서 발견 DN1 이후. 주변에서 리소좀의 상대적으로 높은 숫자를 메모리에 effector CD8 발견+ T 세포. 이 현상은 CD8 활성화 보여주는 이전 학문 이다+ T 세포 증가 그들의 표현의 lysosomal 관련 막 단백질 1 (램프-1)21,22, 반영의 그들의 소유 물 세포 독성 lysosomal 립 (그림 3B)

Figure 1
그림 1 : 전략의 비장 세포, thymocytes 게이팅. 셀 전 금감위/SSC 하 고 PI- 라이브 singlets에 문이 있었다. (A) 마우스에서 총 thymocytes CD4, CD8, CD44와 CD25 얼룩이 있었다. C d 4와 CD8 식 CD4를 구별 하는 데 사용 했다+CD8- SP, CD4-CD8+ SP, CD4+CD8+ DP, 그리고 CD4-CD8- DN 하위 집합. CD4-CD8- DN 하위 집합 CD44로 더 분할 되었다+CD25- DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44-CD25+ DN3와 CD44-CD25- DN4 부분 모집단. (B) 마우스에서 총 splenocytes와 TCRβ, CD4, CD8, CD44, CD62L 얼룩이 있었다. TCRβ+ 세포 CD4로 분리 되었다+ 와 CD8+ T 순으로 더 분할 되었다 셀 (CD44-CD62L+), 메모리 (CD44+CD62L+), 그리고 이펙터 (CD44+CD62L -) 인구입니다. N 3 개의 독립적인 실험의 결과 3-4 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 각 세포 인구에 얼룩 미토 콘 드리 아를 보여주는 대표적인 히스토그램. 세포 표면 마커 얼룩 뒤 37 ˚C에 15 분에 대 한 미토 콘 드리 아-특정 염료와 스테인드 했다. 얼룩진된 셀의 형광 신호 교류 cytometer에 의해 인수 되었고에 분석. (A) 미토 콘 드리 아의 DN과 DP thymocytes 얼룩. (B) 미토 콘 드리 아 CD4SP 및 CD8SP thymocytes과 비장 T 세포 인구의 얼룩. ΔMFI = MFI (Mitochondria 얼룩)-MFI (FMO). 빨간색 실선 얼룩, 파란색 실선 표시 FMO 제어, 미토 콘 드리 아 나타내고 빨간색 파선 미토 콘 드리 아 각 인구에 얼룩의 뜻 형광 강도 나타냅니다. N 3 개의 독립적인 실험의 결과 3-4 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 리소좀 비장 세포, thymocytes에 얼룩을 보여주는 대표적인 히스토그램. 세포 표면 마커 얼룩 뒤 37 ˚C에서 30 분 동안 리소좀 특정 염료와 스테인드 했다. 얼룩진된 셀의 형광 신호 교류 cytometer에 의해 인수 되었고 분석. (A) 리소좀 DN과 DP thymocytes의 얼룩. (B) 리소좀의 CD4SP 및 CD8SP thymocytes과 비장 T 세포 인구 얼룩. ΔMFI = (리소좀 얼룩)-MFI MFI (FMO). 녹색 실선 리소좀 얼룩, 파란색 실선 표시 FMO, 나타내고 빨간색 파선 리소좀 각 인구에 얼룩의 뜻 형광 강도 나타냅니다. N 1 개의 실험의 결과 = 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Table 1
표 1: 다 색 흐름 cytometry 패널 디자인. 형광 색소와 착 혼합물에서 항 체/세포 기관이 염료의 농도 여기 나열 됩니다. 그것은 적정 하 고 새로운 패널 얼룩을 설정할 때 각 항 체 테스트에 좋습니다.

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Discussion

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이 프로토콜은 세포 기관이 특정 염료와 표면 마커 얼룩 미토 콘 드리 아 또는 다른 T 세포 인구에서 리소좀의 양을 계량 하. 이 방법은 전통적인 방법, 전자 현미경 등 immunoblot 분석에 대 한 셀 번호와 동질성 요구의 한계를 극복 하기 위해 개발 되었다. 희귀 세포 인구를 분석 하 고 동시에 동시에 여러 셀 형식 검사에 특히 유용 합니다.

절차의 기간 및 외피의 온도이 프로토콜의 가장 중요 한 요소. 적절 한 세포 기관이 라벨 세포 기관이 특정 염료의 정확한 적정을 필요합니다. 세포 생존 능력을 강화 하 고 항 체 상한 및 국제화에 얼음에 엄격 하 게 유지 한다 또한. 또한, 이러한 세포 기관이 특정 염료의 형광은 빛 노출 및 온도 변화에 취약 합니다. 따라서, 샘플 착 절차 완료 되 면 즉시 분석은 매우 중요. 우리가 지속적으로 2 시간 이내에 모든 실험을 완료 하는 데 수 있다.

인수 설정 (예: PMT 전압) 및 스펙트럼의 보상 (다른 일의 오버랩 때문에이 프로토콜 세포내 구성 요소를 평가 하기 위해 교류 cytometer 다 색 형광 탐지의 기능에 의존, 인접 채널에 형광) 무 겁 게의 신호 강도 좌우할 수 있다. 이것은 특히 관련 관련 셀 형식을 식별 하는 데 필요한 표면 마커 6 위에 증가 합니다. 이 상황에서 다 색 흐름 cytometry 실험 설계에 경험 고품질 데이터 수집에 대 한 매우 중요 한 된다.

병원 체 모욕과 감염 으로부터 신체를 보호 하는 면역 체계 그리고 T 세포 활성화는 다른 면역 세포에 필수적인 신호를 제공 하는 중추적인 역할. 최근 연구 제안 다른 T 세포 인구는 독특한 대사 프로그램, 그리고 미토 콘 드리 아와 lysosomal 내용이 대사 변화의 중요 한 지표. 그러나,이 현상 T 세포에 고유 하지 않습니다. 차별화 및 타고 난 면역 세포, 수지상 세포, 대 식 세포 등의 활성화도 밀접 하 게 그들의 대사 상태23,24에 연결 됩니다. 이 프로토콜의 장점은 그것 계보 특정 표식에 대 한 항 체를 사용 하 여 관심의 어떤 세포 인구를 검사에 적용할 수 있습니다. 또한, 다른 세포 기관이 특정 염료와 같은 ER 또는 Cyto-ID와 함께에서 그것은 다른 세포 또는 다양 한 종류의 세포에서 세포질 구획을 평가할 가능성이 있다.

설립이 미토 콘 드리 아 또는 리소좀의 정량화 방법 뿐만 아니라 T 세포의 신진 대사를 연구 하는 수단이 아니라도 암 등 질병 설정에서 신진 대사 변화에 초점을 맞춘 연구 혜택에 큰 잠재력이 있다 또는 자가 면역 질환25,26.

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Disclosures

저자 관심 없음 충돌 선언합니다.

Acknowledgments

이 프로토콜의 개발은 카스 티 야 수의에 대만 사역의 과학 및 기술 (대부분) NSC103-2320-B-010-002-MY2 및 MOST104-2628-B-010-002-MY4에서 교부 금에 의해 지원 되었다. C.W. 웨이 우수 논문 수상의 연구소의 미생물학 및 면역학, 국립 양 밍 대학의 받는 사람입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated) Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) Dimeda
15 mL centrifuge tube Thermo Fisher Scientific 339650
5 mL syringe TERUMO 
6 cm Petri dish α-plus
70 µm nylon cell strainer SPL Lifesciences 93070
Ammonium chloride (NH4Cl)    Sigma A9434
Anti-mouse CD25 Biolegend 102007 Clone:PC61
Anti-mouse CD4 Biolegend 100453 Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44 Biolegend 103029 Clone:IM7
Anti-mouse CD62L Biolegend 104407 Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8 Biolegend 100713 Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ Biolegend 109233 Clone:H57-579
BD LSRFortessa BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio basic 6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) BD Biosciences 352052
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone ATD161145
Flowjo, LLC BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma H4034
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
LysoTracker Green DND26 Thermo Fisher Scientific L7526
MEM Non-essential amino acids (100X) Gibco 11140050
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3) J.T.baker 298-14-6
Propidium iodide solution Sigma 25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder) Gibco 31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070

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References

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미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화
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Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).More

Wei, C. W., Zhou, T. A., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. L. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

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