Summary
Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.
Abstract
T hücreleri farklı metabolik programlarının farklılaşma ve yayılması sırasında fonksiyonel kendi ihtiyaçlarına uygun kullanmaktadır. Mitokondri çok önemli hücresel bileşenleri hücre enerji sağlamak için sorumlu vardır; Ancak, aşırı mitokondri Ayrıca reaktif oksijen türleri (ROS) hücre ölümüne neden olabilir üretmek. Bu nedenle, mitokondri sayısı sürekli hücreleri ihtiyaçlarınıza uygun şekilde ayarlanması gerekir. Bu dinamik yönetmelik kısmen artı/hasarlı organelleri ve oluştururlar kaldırmak organellerin işlevi elde edilir. Bu nedenle, hücresel mitokondrial ve lizozomal içeriği hücre metabolik ayarlama değerlendirmek için anahtar göstergeler vardır. Probları organelleri için gelişmesiyle birlikte, iyi karakterize lysosome veya mitokondri özel boyalar hücresel organellerin ve mitokondri etiketlemek için çeşitli biçimlerde kullanılabilir hale gelmiştir. Çok renkli akış sitometresi profil hücre fenotipleri için ortak bir araç ve diğer deneyleri ile entegre olmak için yeteneği vardır. Burada, bir akış sitometresi organellerin ve mitokondri farklı T hücre Nüfus miktarını ölçmek için boyama yüzey imleçli organel özel boyalar birleştirmek nasıl ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut.
Introduction
Harekete geçirmek ve T hücrelerin çoğalması başarılı bağışıklık yanıtı montaj için önemli adımlardır. Son gelişmeler hücresel metabolizma sıkıca geliştirme ve T hücrelerinin işlevleri ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Örneğin, saf T hücreleri büyük ölçüde Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ikincil lenfoid organlar arasında devridaim sırasında enerji talebi karşılamak için güveniyor. Harekete geçirmek, saf T hücreleri ciddi metabolik, aerobik glikoliz ATP üretimi artırmak için ve hücre farklılaşma ve yayılması sırasında muazzam metabolik talepleri yerine getirmek için indüksiyon dahil olmak üzere yeniden programlama tabi. Metabolik ihtiyaçları ile takip etmek başarısız hücreleri ölmek apoptosis1,2. Metabolik yeniden sırasında programlama mitokondri önemli roller organelleri ATP hücrenin enerji sağlamak için üretim büyük ölçüde sorumlu olduklarını ve metabolik anahtarları sırasında hücresel mitokondri içeriği değişir bu yana oynamak T hücre gelişimi ve harekete geçirmek3. Ancak, gereksiz ya da zarar mitokondri birikimi yağlar, proteinler ve DNA zarar ve sonunda ölüm4 hücre için yol açabilir aşırı ROS üretebilir
Metabolik değişiklikler sonucu aşırı ya da zarar mitokondri autophagy5mitophagy bilinen, özel bir tür tarafından kaldırılır. Mitokondri autophagosomes tarafından sarılmış ve bozulması için organellerin ile erimiş. Bu mitokondri arasındaki iletişimi kapatın ve organellerin büyük ilgi6,7oluşturmuş. Örneğin, oksidatif stres mitokondri organellerin fosfataz ve tensin homolog (PTEN) bozulması için hedeflenen mitokondri kaynaklı veziküller (MDVs) oluşturmak için uyarır-sözde kinaz 1 (PINK1) indüklenen ve parkin (bir E3 Ubikuitin ligaz) bağımlı bir şekilde8. Bu da o mitophagy bej beyaz adipocyte geçiş9,10için gerekli bulundu. Daha da önemlisi, organellerin sadece bir bozulma bölme değildir, ancak aynı zamanda hücresel sinyal bir regülatör. Enzim eksiklikleri nedeniyle aşırı substrat birikimi lizozomal disfonksiyonu lizozomal membran geçirgenliği kesintiye tarafından sonuçlar ve Ca2 + homeostazı11etkiler. T hücre fonksiyonel kusurları lizozomal asit lipaz (LAL)12 veya lizozomal metaboliti ışınlama nakavt fare modeli13 daha fazla T hücre homeostazı korumada organellerin önemini gösterdi. Mitokondri ve organellerin hücresel metabolik regülasyon ayrılmaz parçalarıdır. Bu yüzden, ölçüm-in hücresel mitokondrial içerik T hücre metabolik ve fonksiyonel durumu değerlendirmek için çok önemli bir göstergesi olmuştur.
Hücresel mitokondrial veya lizozomal içeriği ölçmek için yaygın olarak kullanılan deneyleri dahil immunoblot, elektron mikroskobu, immünfloresan (Eğer) boyama ve PCR analizleri mitokondrial DNA kopya sayıları14,15, 16. immunoblot kantitatif protein düzeyleri farklı örnekleri ve elektron veya mikroskobu bu organelleri17morfolojik işaretlerinden görselleştirebilirsiniz arasında mukayese edebilirsiniz iken, bu deneyleri teknik bazı dezavantajları ayı. Örneğin, zaman alıcı yeterli sayıda hücre imge ile yüksek büyütme ve çözünürlük elde etmek için veya bir protein ifade seviyede iş hızı düşük yöntemleri olarak kabul bu deneyleri yapma örnekleri, onlarca arasında karşılaştırmak için bu. Ayrıca, bu deneyleri homojen hücre nüfus, hücre hatları gibi ama değil karışık nüfus oluşan doku örnekleri yalnızca uygulanabilir.
Nadir nüfus için en az hücresi şartı numaraları 10'dan, bu deneyleri uygulamak zordur6 -108 karşılamak imkansız. Son olarak, hücreleri genellikle lysed veya onları daha fazla bilgi almak için diğer yöntemleri ile uyumlu yapma işlemi sırasında sabit. Geleneksel yöntemlere göre floresan tabanlı akış sitometresi nispeten yüksek üretilen iş sahip - analiz ve aynı anda toplanan tüm hücrelerin bir örnek içinde oluşan karma hücre nüfus bilgileri. Buna ek olarak, bir aynı hücre üzerinde 10'dan fazla parametre algılayabilir ve daha fazla deneyleri için istenen fenotipleri dayalı hücreleri sıralamak. Reaktif floresan problar organellerin ve canlı hücrelerde mitokondri etiketlemek için kullanılan ve akış sitometresi18,19tarafından algılanabilir. Bu organel özgü sonda hücre geçirgen vardır ve belirli hücre altı konumları veya organelleri konsantre oldum kurmalarına izin fiziko-kimyasal özelliklere sahip. Elverişli bir konuma sahip, bu probları böylece onların uygulama çok renkli analiz için etkinleştirme çeşitli biçimlerde floresan, uygundur.
Bu iletişim kuralı ayrıntılı olarak anlatılmaktadır nasıl lysosome veya mitokondri özel boyalar için etiket organellerin ile boyama yüzey marker birleştirmek veya hücreleri mitokondri içinde yaşamak. Bu birincil doku ve organlar, kez türdeş olmayan hücre popülasyonlarının oluşan üretilen örnekler için özellikle yararlıdır. Araştırmacılar hücre popülasyonlarının ilgi onların yüzey marker ifade tarafından tanımlayabilir ve özellikle bu hücrelerde organel özel boyalar ile lizozomal veya mitokondrial içeriği ölçmek. Burada, biz büyük dalak T hücre altgrupları lizozomal veya mitokondrial Große değerlendirir akış sitometrik analizin ayrıntılı yordam göstermek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan fare doku hasat yordam kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Ulusal Yang Ming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. lenfosit süspansiyon lenfoid organlar üzerinden hazırlanması
- CO2 inhalasyon servikal çıkığı tarafından ölüm emin olmak için takip bir şeffaf akrilik odasında gibi onaylı bir yöntem tarafından fare ötenazi.
Not: CO2 dakikada bir % 20 deplasman odası ve Hayır 5 psi (inç kare başına pound) daha yüksek akış hızı tutmak. Bilincini kaybedecek bir fare için 2-3 dakika sürer. Hayvan (5-7 dk genel) nefes durduktan sonra CO2 akışını en az 1 dakika korumak. - Sırtında (Örneğin polistirol plastik Yönetim Kurulu) temiz bir tahta üzerinde fareyi getirin ve bacaklarda bant ile düzeltin. % 70 etanol ile yıkayın.
- Dalak hasat, kesim ve karın boşluğu 11 cm diseksiyon makası (dalak mide altındaki ve üstündeki sol böbrek değil) ile açmak için. Forseps ile dalak çıkarın ve bağ dokusu (gerekirse makas kullanın) temizleyin.
- Timus hasat için diyafram ve göğüs kafesi makas diseksiyon ile her iki taraftan kesti. Forseps tüm göğüs boşluğuna ortaya çıkarmak için göğüs kemiği kaldırmak için kullanın. Timus dikkatle makasla dokuları çevreleyen ayırın ve herhangi bir kalıntı bağ dokusu PBS ile ıslak kağıt havlu üzerine çıkarın.
- Mekanik enjektör pompası 5 mL buz gibi FACS arabellek (PBS ile % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 mM EDTA) içeren 6 cm tabak içinde ile belgili tanımlık doku ayırmak. Tek hücreli süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü transfer; Ek 2 mL FACS arabellek ile 6 cm çanak yıkama ve yıkama de hücre süspansiyon ile birleştirmek.
- Hücre süspansiyon (300 x g, 4 ° C'de 5 min için) santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Pelet 2 mL, amonyum klorür potasyum (ACK) (kırmızı kan hücreleri parçalayıcı RT) Oda sıcaklığında 1 dk. için arabellek (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 ve 0,1 mM Na2EDTA) lysing ile yeniden askıya alma. ACK arabellek hücre süspansiyon 10 mL FACS arabelleği ekleyerek etkisiz hale getirin.
- Hücre süspansiyon (300 x g, 4 ° C'de 5 min için) santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 5 mL tam RPMI orta de hücrelerde yeniden askıya alma (takıma RPMI 1640 orta, 44 mM NaHCO3, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, %1 MEM esansiyel olmayan amino asitler ve % 10 FBS).
- Filtre hücre süspansiyon hücre kümeleri kaldırmak için bir hücre süzgeç (gözenek boyutu 70 µm) aracılığıyla. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri hesaplama.
2. mitokondri ve organellerin miktar
Not: çünkü en iyi boyama koşulu bu boyalar için kuluçka 37 ° C'de ilk boyama organel özel boya gerçekleştirmek Yüzey marker boyama önemli ölçüde antikor kapatma ve içselleştirilmesi o sıcaklıkta nedeniyle azalır.
- 1 x 106 hücreler yuvarlak-FACS borular alt, hücreleri (300 x g, 4 ° C'de 5 min için) santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak için ekleyin.
- Sonda hisse senedi çözümleri son çalışma konsantrasyonu seyreltik (100 nM MitoTracker yeşil veya LysoTracker yeşil; bundan böyle mitokondri veya lysosome özel boya sırasıyla) önceden ısıtılmış 37 ° C serum serbest kültür ortamında. Lysosome veya mitokondri özel boya için çalışma çözüm bu.
Not: birden fazla konsantrasyonları (mitokondri özel boya için 20-200 nM) ve 50-75 nM burada kullanılan lysosome özel boya için üretici tarafından önerilen çalışma konsantrasyonları aralığı da dahil olmak üzere Test verimliliği boyama en iyi elde etmek için. Hedef (Örneğin organellerin) pozitif kontrol olarak boyama iyi ifade sahip olduğu bilinmektedir bir hücre nüfus seçin (Örneğin insan CD14+ monosit). Negatif ve pozitif boyama, hem de iyi hücre canlılığı arasında iyi bir ayrım dayalı çalışma konsantrasyonu seçin. - 100 µL, lysosome veya mitokondri özel hücrelerde boya çalışma çözüm ve 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka kuluçkaya resuspend için 15 dk ya da 30 dk, anılan sıraya göre.
- Buz gibi FACS arabellek reaksiyonu durdurmak için 1 mL ekleyin. Santrifüjü (300 x g, 4 ° C'de 5 min için) tarafından hücreleri cips ve süpernatant atın. Hücre yüzey marker boyama için artık hazırsınız.
3. yüzey Marker boyama
- Blok Fc reseptörleri ile önceden titre 2.4G2 Hibridoma süpernatant 10 dk. yıkama hücreler için buz üzerinde 100 µL FACS arabellek ve santrifüj (300 x g, 5 dk 4 ° C'de) 1 mL ile. Süpernatant atmak.
- 50 µL floresans Birleşik antikor titre önceden birlikte FACS arabellek 20 dk. kaçının ışık buzda hücrelerle kuluçkaya.
Not: tüm mevcut floresan antikor antikor içeren tek renk lekeli hücreleri hazırlamak kombinasyonu ve hücreleri tedavi sadece organel özel boya akışı gerilim her floresans dedektörü ve tazminat düzeltmesi ayarlama sitometresi. Aynı şekilde, eksi bir (FMO) Floresan antikor içeren, ancak organel özel boyalar ile boyama vitray hücreler kullanarak arka plan denetimleri hazır olun. - Hücreleri tarafından Santrifüjü (300 x g, 5 dk 4 ° C'de) 1 mL FACS arabellek ve Pelet ekleyerek yıkayın. Süpernatant atmak.
- 300 µL FACS arabelleği 1 µg/mL propidium iyodür (PI) içeren hücrelerde resuspend ve hemen akış sitometresi örneği çözümleyebilirsiniz.
4. örnek koleksiyon üzerinde akış sitometresi
- Bilgisayar, akış sitometresi, FACS edinme yazılım ve diğer aksesuar aygıtlar makine platformuna bağlı olarak açın. PBS için yaklaşık 1 dk akışı satır sağlamak için PBS ve kılıf arabelleği ile doldurulur çalıştırın. Akım akışı sorunsuz çalışır emin olun.
- Yeni bir deneme açın ve üreticisinin yönerge göre sitometresi parametre (floresan dedektörleri) seçin. 70 µm hücre süzgeç ve girdap kümeleri ve tamamen oluşumunu önlemek için her örnek alım öncesinde ile hücreleri filtre.
- Hücre boyutu ve taneciklik, sırasıyla temsil nokta araziler ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC), olun. Voltaj FSC ve SSC araziler içinde faiz hücrelerinin göründüğünden emin olmak için en iyi duruma getirme. FSC-A vs FSC-W (veya FSC-H) ve nokta araziler olun ve tek hücreler için bir kapı çizin.
- Nokta araziler, floresan her parametrenin olun. Günahı hücre arka plan sinyal belirlemek tek renk lekeli denetimlerini ve gerilimleri, floresan her parametrenin, pozitif ve negatif hücre popülasyonlarının açıkça ayırt olması ve edinme dinamik aralığı içinde ayarlamak için kullanmak için kullanın.
- Bütün gerilim ayarladıktan sonra otomatik-tazminat varsa kullanın veya spektral yayılma düzeltmek için günahı ve tek renk lekeli denetimleri ile değerini el ile ayarlayın. Tazminat örnekleri için geçerlidir.
- Her parametrenin bir nokta çizim yapmak ve gates deneysel kümeniz göre çizin. Örneğin, FSC-A vs FSC-H (veya FSC-W) birini, dışlamak için takip FSC-A vs tarafından SSC-A için lenfosit geçişi; SSC-A vs PI (canlı hücreleri) ve CD4 ve CD8 (Şekil 1).
- Anlamlı karşılaştırma için yeterli olayları (Toplam hücresini sayı) nüfus arasında toplamak. Genellikle, en az 1000 olayları nüfus ilgi20elde gerek.
- Sonra tüm örneklerini iktisap, akış veri akış sitometresi Analizi Yazılım tarafından analiz edilecek verin. Deneme benzer deneyler için gelecekte uygulamak için parametreleri ve sitometresi ayarı korumak için şablon olarak kaydedin.
5. veri analizi
Not: Akış sitometrik veri, hem ticari hem de ücretsiz yazılım analiz etmek için birçok araç vardır. Akış cytometers edinme yazılım ayrıca veri analizi için çalışabilirsiniz. Burada örnek olarak FlowJo kullanılmıştır.
- Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı başlatmak ve FCS dosyaları çalışma alanına sürükleyin. Bir örneğe bağlı olarak bir grafik penceresini açmak için tıklatın. Üzerinde sunulmak üzere parametreleri seçin X ve Y eksenleri üzerinde tıklayarak X ve Y ekseni. Gates differentially ifade işaretleri veya hücre popülasyonlarının tanımlanmış fenotipleri göre çizmek için araç çubuğunu kullanın.
- Gates, her parametrenin Şekil 1' de gösterildiği gibi ekleyin. Gates için sürükleyin çalışma alanındaki tüm örneklerini böylece onlar aynı olsun geçişi.
- Araziler düzeni editörü için grafik raporlar oluşturmak için sürükleyin.
- Ortalama floresans yoğunluğu (MFI) faiz her nüfus için bir grafik penceresinde İstatistikler düğmesini (Σ) tıklatıp "Demek" ve uygun parametre, örneğin, organel özel boya algılamak için kullanılan kanal seçerek görüntüleyin. Sonra "Ekle".
- Tablo Düzenleyici simgesini tıklatın ve MFI tablo editörü istatistiksel raporlar oluşturmak için sürükleyin. Delta MFI (ΔMFI) MFI (organel özel boyalar) - MFI (FMO) hesaplamak için Excel, metin veya CSV dosyası olarak kaydedin.
Not: Farklı sitometresi ile alınan örnekler arasındaki MFI hesaplanır değil ayarları (voltaj, floresan kanalları veya tazminat). Farklı ayarlar ile deneyler türetilen değerleri karşılaştırmaları anlamsız ve önyargılı. - Tüm değerleri çalışma alanı ve araziler düzeni editörü tablo ve şekiller yapmak için verilecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Büyük T hücre alt kümeleri dalak ve timus tanımlaması
Kısaca, tek hücre süspansiyonlar dalak ve timus kırmızı kan hücreleri lysed, 2.4G2 süpernatant ile inkübe, organel özel boya ve ile antikor (Tablo 1) Floresan Birleşik boyama yüzey marker izledi. Timositleri gelişimsel ilerleme antikorlar Co reseptörleri kullanarak tanımlanabilir CD4 ve CD8. En olgun timositleri CD4 veya CD8 ifade edemediği ve çift negatif (DN) adı verilir. Sonra CD4 ve CD8 yukarı düzenleyen ve Çift Kişilik pozitif (DP) olmak. Son olarak, onlar aşağı düzenleyen-CD4 veya CD8 ve ORGA hazır olgun tek olumlu (SP) hücreleri haline. T hücre gelişimi, hücreleri Co reseptörleri ifade edemediği zaman erken aşamalarında CD4 ve CD8, daha da sınıflandırılabilir temelinde CD44 ve CD25 ifade. CD44 ilk ataları olan+ CD25- (DN1), ve sonra da CD25 ifade başlatın ve CD44 haline+CD25+ (DN2) hücreleri. Bundan sonra hücreleri aşağı CD44 düzenleyen ve CD44 haline-CD25+ (DN3) hücreleri ve son olarak, onlar aşağı-düzenleyen CD25 de CD44 olmak için-CD25- (DN4) hücreleri CD4 ve CD8 ifade etmek ve olmak üzereler Çift-pozitif (DP) hücreleri.
Dalak CD8 sitotoksik T hücreleri ayrılabilir+ ve yardımcı CD4+ T hücreleri. Bu nüfusun her ikisi de daha fazla CD62L ve CD44 dayalı naif, efektör ve bellek alt kümeleri ayrılabilir boyama. Detaylı gating strateji Şekil 1' de gösterilen.
Miktar farklı T hücre alt kümeleri mitokondri kütlesinin
Mitokondri özel boyalar mitokondri T hücre nüfus miktarlarını ölçmek için kullanılmıştır. Mitokondrial içeriği DN1 en düşük olduğunu, DN2-DN3 ve o zaman biraz DN4 ve DP timositleri azalmıştır ve doruğa CD4 ve CD8 SP timositleri (Şekil 2A) daha düşük olduğunu bulduk. Ancak, CD4 veya CD8 SP timositleri daha yüksek mitokondri MFI dalak CD4 veya CD8 T hücreleri (Şekil 2B) boyama vardı. Mitokondrial içeriği daha olgun karşılıkları yapmak ve daha düşük oksijen açısından zengin kan recirculate saf T hücreleri var daha fazla mitokondri içeren olgun timositleri ile T hücre gelişimi sırasında değişiklik gösterir bu gözlemler öneririm Mitokondrial kitle. İlginçtir, bu azaltma mitokondrial İçindekiler CD4 T lineage (Şekil 2B) CD8 içinde daha belirgin ve T Hücre aktivasyonu daha da azaldı. T hücreleri CD4 arasında aktif+ bellek T hücreleri vardı biraz daha fazla mitokondri karşılaştırıldığında effectors için; Ancak, CD8 için durum tam tersiydi+ T hücreleri: CD8+ bellek T hücreleri tüm T hücre alt kümeleri (Şekil 2B) arasında en düşük mitokondrial kitle vardı.
T hücreleri çeşitli altgrupları lizozomal içerik ölçüm
Lysosome özel boya kullanarak, biz nispeten düşük, ama algılanabilir, lizozomal İçindekiler tüm T hücre popülasyonlarının içinde organellerin DN1 timositleri (Şekil 3A) içinde daha belirgin varlığı ile gözlenen. Anlamlı bir fark thymocyte alt kümeleri arasında DN1 itibaren bulundu. Çevre içinde bellek ve efektör CD8 organellerin nispeten yüksek sayıda bulundu+ T hücreleri. CD8 aktif gösterilen önceki çalışmalar doğrultusunda bu olgudur+ T hücreleri artmış kendi ifade (lamba-1) ilişkili lizozomal membran protein 1 onların sahibi yansıtan2221,, sitotoksik lizozomal granül (Şekil 3B)
Resim 1 : Strateji dalak lenfositler ve timositleri geçişi. Hücreleri canlı gömlek almak için FSC/SSC ve PI- üzerinde ön kapı. (A) fareler gelen toplam timositleri CD4, CD8, CD44 ve CD25 ile lekeli. CD4 ve CD8 ifadeleri CD4 ayırt etmek için kullanılan+CD8- SP, CD4-CD8+ SP, CD4+CD8+ DP ve CD4-CD8- DN alt kümeleri. CD4-CD8- DN alt daha fazla CD44 bölünmüş+CD25- DN1, CD44+CD25+ DN2, CD44-CD25+ DN3 ve CD44-CD25- DN4 altgrupları. (B) fareler üzerinden toplam splenocytes TCRβ, CD4, CD8, CD44 ve CD62L ile lekeli. TCRβ+ hücreleri CD4 ayrı kaldık+ ve CD8+ T hücreleri, daha da saf ayrıldı (CD44-CD62L+), bellek (CD44+CD62L+) ve efektör (CD44+CD62L -) nüfus. N ile üç bağımsız deneyler temsilcisi sonuçlarıdır = 3-4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Her hücre nüfus boyama mitokondri gösterilen temsilcisi histogramlar. Hücreleri mitokondri özel boya için 15 dk 37 ˚C yüzey marker boyama tarafından takip, az lekeli. Lekeli hücre floresan sinyal akış sitometresi tarafından alınan ve üzerinde analiz. (A) mitokondri DN ve DP timositleri boyama. (B) CD4SP ve CD8SP timositleri ve dalak T hücre popülasyonlarının mitokondri boyama. ΔMFI MFI (mitokondri) boyama - MFI (FMO) =. Düz kırmızı çizgiyi boyama, FMO denetimini, kesintisiz mavi çizgi gösterir mitokondri ve kesikli kırmızı çizgi her nüfus boyama mitokondri yoğunluğunu ortalama floresans temsil eder. N ile üç bağımsız deneyler temsilcisi sonuçlarıdır = 3-4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: dalak lenfositler ve timositleri boyama lysosome gösterilen temsilcisi histogramlar. Hücreleri lysosome özel boya için 30 dk 37 ˚C yüzey marker boyama tarafından takip, az lekeli. Lekeli hücre floresan sinyal akış sitometresi tarafından edinilen ve analiz edilebilir. (A) Lysosome DN ve DP timositleri boyama. (B) Lysosome CD4SP ve CD8SP timositleri ve dalak T hücre popülasyonlarının boyama. ΔMFI (Lysosome boyama) - MFI = MFI (FMO). Düz yeşil çizgi lysosome boyama, FMO, kesintisiz mavi çizgi gösterir ve her nüfus boyama lysosome yoğunluğunu ortalama floresans kesikli kırmızı çizgi temsil eder. N ile bir deneme temsilcisi sonuçlarıdır = 5. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: çok renkli akış sitometresi masası tasarımları. Fluorochrome ve antikorlar/organel boya boyama karışımları içinde konsantrasyon burada listelenir. Titre ve ne zaman yeni paneller boyama ayarlama her antikor test için önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı organel özel boyalar ve yüzey marker mitokondri veya organellerin farklı T hücre Nüfus miktarını ölçmek için boyama birleştirir. Bu yöntem elektron mikroskobu ve immunoblot analiz gibi geleneksel yöntemleri için hücre sayısı ve homojenliği gereksinimleri sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Nadir hücre popülasyonlarının analiz ve aynı anda birden çok hücre tipleri aynı zamanda incelenmesi özellikle yararlıdır.
İşlem süresi ve kuluçka sıcaklığını bu protokolü en kritik faktör vardır. Uygun organel etiketleme organel özel boyalar doğru titrasyon gerektirir. Hücreleri de kesinlikle canlılığı arttırmak ve antikor kapatma ve içselleştirilmesi önlemek için buz üstünde tutulmalıdır. Buna ek olarak, bu organel özel boyalar floresan ışık pozlama ve sıcaklık değişikliklerine karşı savunmasızdır. Böylece, hemen analiz boyama yordamı tamamladıktan sonra örnekleri çok önemlidir. Biz sürekli olarak 2 saat içinde bütün deneyin tamamlamak mümkün olmuştur.
Hücre içi bileşenleri değerlendirmek çok renkli floresan akış sitometresi tarafından hafiye yeteneklilik üstünde bu protokolü kullanır beri satın alma ayarlarını (Örneğin Devresel_ödeme gerilimleri) ve spectra tazminat (yayılma, örtüşme floresans kanalları komşu içine) ağır sinyalin yoğunluğunu etkileyebilir. Bu özellikle ilgili olduğunda ilgili hücre tipleri tanımlamak için gereken yüzey işaretleyicileri altı artırmak. Bu durumda, çok renkli akış sitometresi deney tasarımı deneyimi yüksek kalitede veri toplama için çok önemli hale gelir.
Patojen hakaret ve enfeksiyonlar vücut bağışıklık sistemini korur ve T Hücre aktivasyonu diğer bağışıklık hücreleri temel sinyalleri sağlanmasında çok önemli rolü vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda farklı T hücre popülasyonlarının özel metabolik programlar var ve içeriğini mitokondrial ve lizozomal metabolik değişiklikler önemli göstergeleridir öneririz. Ancak, bu olgu T hücreleri için benzersiz değildir. Farklılaşma ve makrofaj ve dendritik hücreler gibi doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu için onların metabolik durum23,24de yakından bağlantılı. Bu protokol lineage özgü işaretleri karşı antikor kullanarak herhangi bir hücre popülasyonlarının ilgi incelemek için adapte edilebilir avantajdır. Ayrıca, diğer organel özel boya, gibi ER - veya Cyto-ID, birlikte bu farklı organelleri ya da çeşitli hücre hücresel kompartmanlarda değerlendirme potansiyeline sahiptir.
Kuruluş Bu mitokondri veya lysosome miktar yöntemi sadece T hücre metabolizmasında çalışmaya enstrümantal değil ama aynı zamanda hastalık ayarlarında, kanser gibi metabolik değişiklikler üzerinde duruluyor araştırma yararına büyük bir potansiyele sahiptir veya otoimmün hastalıklar25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çakışma çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Bu iletişim kuralı geliştirilmesi hibe Tayvan Bakanlığı Bilim ve teknoloji (en) NSC103-2320-B-010-002-MY2 ve MOST104-2628-B-010-002-MY4 CL Hsu tarafından desteklenmiştir. CW Wei mükemmel Tez Ödülü, Enstitüsü Mikrobiyoloji ve İmmünoloji, Ulusal Yang Ming Üniversitesi bir alıcı var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
