Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في Melanogaster المورفولوجية

Published: March 14, 2019 doi: 10.3791/58845
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 4, 2, 1, 1,2, 1,2,3
1The Joint Center for Infection and Immunity, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, 2CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 3CAS Key Laboratory of Infection and Immunity (CASKLII), Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء العدوى الفيروسية في فيفو في المورفولوجية ميلانوجاستير باستخدام أسلوب الحقن نانو والتقنيات الأساسية لتحليل التفاعل الفيروس--المضيف.

Abstract

انتشار الفيروس أحد أسباب رئيسية للأمراض الوبائية. ومن ثم، فهم التفاعل بين الفيروس والمضيفة مهم جداً لتوسيع معرفتنا بالوقاية والعلاج من العدوى الفيروسية. ذبابة الفاكهة المورفولوجية ميلانأوجاستير ثبت أن أحد الكائنات النموذج الأكثر كفاءة وإنتاجية الشاشة للعوامل المضادة للفيروسات، والتحقيق في التفاعل الفيروس--المضيف، بسبب أدوات قوية الوراثية والمناعة الفطرية العالية حافظ مما يشير إلى الممرات. يوضح الإجراء الموضح هنا أسلوب نانو-حقن إثبات العدوى الفيروسية، والحث على الردود المضادة للفيروسات الجهازية في الذباب الكبار. مراقبة دقيقة لجرعة حقن الفيروسية في هذا الأسلوب يتيح إمكانية تكرار نتائج تجريبية عالية. وتشمل البروتوكولات المذكورة في هذه الدراسة إعداد الذباب والفيروس وطريقة الحقن، وتحليل معدل البقاء على قيد الحياة، وقياس حمولة الفيروس وتقييم مسار المضادة للفيروسات. آثار تأثير العدوى الفيروسية بخلفية الذباب ذكرها هنا. يعد هذا الأسلوب العدوى سهلة لتنفيذ والكمية قابلة للتكرار؛ يمكن تطبيقها على الشاشة للمضيف/الفيروسية العوامل الداخلة في التفاعل الفيروس--المضيف وتشريح الحديث المتبادل بين المناعة الفطرية الإشارات والممرات البيولوجية الأخرى استجابة للعدوى الفيروسية.

Introduction

الناشئة العدوى الفيروسية، خاصة عن طريق سيتناقش، مثل فيروس الشيكونغونيا1، كان فيروس حمى الدنج، فيروس الحمى الصفراء2 والفيروساتزكى3، تهديدا كبيرا للصحة العامة التي تسبب الأوبئة 4-وهكذا، فهم أفضل للتفاعل مضيف الفيروس قد أصبح متزايد الأهمية لمكافحة الوباء والعلاج من الأمراض الفيروسية في البشر. لتحقيق هذا الهدف، يجب إنشاء نماذج أكثر ملائمة وفعالة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء الإصابة بعدوى الفيروس.

يوفر نظام قوي للتحقيق الفيروس--المضيف التفاعل5،6 ذبابة الفاكهة، دروسوفيلاميلانوجاستير (ميلانوجاستير د)، وقد ثبت أن واحدة من النماذج الأكثر كفاءة لدراسة الأمراض الفيروسية البشرية7 , 8 , 9-يحافظ جداً المضادة للفيروسات مما يشير إلى سبل وأدوات الجينية لا تضاهي تجعل الذباب نموذج عظيم تسفر عن نتائج هامة مع الآثار الحقيقية للدراسات الإنسانية المضادة للفيروسات. وباﻹضافة إلى ذلك، الذباب هي سهلة وغير مكلفة للحفاظ على في المختبر ومريحة للفرز على نطاق واسع من العوامل التنظيمية رواية6،10 في الفيروس والمضيف أثناء الإصابة.

أربعة رئيسية عالية حفظت مسارات المضادة للفيروسات (على سبيل المثال.، مسار التدخل ([رني]) الجيش الملكي النيبالي11و مسار جاك-ستات12وفي مسار NF-κB و ممر أوتوفاجي13) هي درس جيدا في المورفولوجية في الآونة الأخيرة سنة6. المسار [رني] هو إليه واسعة المضادة للفيروسات التي يمكن منع معظم أنواع الفيروسات العدوى6،14. يمكن أن يؤدي تعطيل هذا المسار بطفرة في الجينات مثل ديسير-2 (Dcr-2) أو 2 أرجوناوتي (AGO2) للفيروس زيادة عيار والمضيف وفيات15،،من1617. قد تورط في مسار جاك-STAT في السيطرة على العدوى بفيروس من أسرة ديسيستروفيريداي وأسرة فيروسات مصفرة في الحشرات، و على سبيل المثال-، الفيروس "ج المورفولوجية" (DCV) في16 من الذباب وفيروس غرب النيل (WNV) و "فيروس حمى الدنج" في البعوض18،19. حصيلة المورفولوجية (مثلى للمسار NF-κB البشرية) ونقص المناعة (IMD) مسارات (مشابه للمسار NF-κB وتنف البشرية) على حد سواء المشاركة في الدفاع عن فيروس غزو20،21، 22. أوتوفاجي هو إليه يحافظ أخرى تشارك في تنظيم العدوى الفيروسية، التي تتميز أيضا في المورفولوجية23،24. وبالتالي، تحديد العوامل التنظيمية رواية هذه الممرات وتشريح الحديث المتبادل بين هذه الإشارات المضادة للفيروسات وغيرها الممرات البيولوجية، مثل التمثيل الغذائي، والشيخوخة، وردود الفعل العصبية وهلم جرا، يمكن بسهولة إعداد في المورفولوجية النظام.

على الرغم من أن النماذج المعدية الفيروسية الأكثر الراسخة في المورفولوجية هي تسببها فيروسات الحمض النووي الريبي، الإصابة بواسطة 6I فيروس قزحي الألوان اللافقاريات (رابعا-6) وفيروسات كاليثيا أظهرت إمكانية دراسة فيروسات الحمض النووي في الذباب25، 26. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تعديل الفيروس للسماح للعدوى من المورفولوجية، مثل فيروس الإنفلونزا9. وهذا اتسع إلى حد كبير تطبيق منصة الفحص المورفولوجية . في هذا الإجراء، نستخدم DCV كمثال لوصف كيفية تطوير نظام معدية فيروسية في المورفولوجية. DCV فيروس الحمض النووي الريبي إيجابية بمعنى واحد الذين تقطعت بهم السبل من النيوكليوتيدات حوالي 9300، ترميز البروتينات 927. ممرض طبيعية من ميلانوجاستير دال، تعتبر DCV فيروس مناسبة لدراسة الاستجابة المناعية الفسيولوجية والسلوكية والقاعدية المضيف أثناء التفاعل والتطور المشترك الفيروسات المضيف-28. بالإضافة إلى ذلك، معدل وفيات السريع بعد الإصابة في الذباب نوع البرية يجعل DCV مفيدة للشاشة لجينات مقاومة أو عرضه في المضيف29.

ومع ذلك، هناك العديد من جوانب القلق عند دراسة الأمراض الفيروسية في المورفولوجية. على سبيل المثال، البكتيريا التكافلية ولبخيه لديها قدرة تمنع من أطياف واسعة من انتشار فيروسات الرنا في المورفولوجية والبعوض30،،من3132. وتبين الأدلة الأخيرة إليه محتملة في التي ولبخيه كتل سيندبيس (سينف) الإصابة بعدوى الفيروس من خلال upregulation من methyltransferase Mt2 التعبير في المضيف33. بالإضافة إلى ذلك، الخلفية الوراثية للحشرات أيضا حاسمة بالنسبة للعدوى الفيروسية. على سبيل المثال، تعدد الأشكال الطبيعية في الجينات، باستريل (pst)، يحدد قابلية للإصابة DCV في المورفولوجية34،35، بينما المكاني جامعة كولومبيا البريطانية--E2H و CG8492 تشارك في لعبة الكريكيت فيروس الشلل (كربف) وقطيع البيت الإصابة بعدوى الفيروس (فف)، على التوالي36.

يجب اختيار طرق معينة لإقامة تفاعل الفيروس--المضيف في الذباب، وفقا لأغراض البحوث مثل شاشة الفائق لاستضافة المكونات الخلوية في المورفولوجية خلية خطوط37،38، عن طريق الفم العدوى لدراسة استجابة مضادة للفيروسات الخاصة بالقناة الهضمية22،39،40، إبرة الثقب41،42 أو نانو-الحقن باجتياز الحواجز الظهارية لتحفيز النظام المناعي الردود. نانو-الحقن يمكن التحكم بدقة في الجرعة الفيروسية للحث على رد فعل على الأدوية المضادة للفيروسات التي تسيطر عليها وآفة فسيولوجية43، مما يضمن إمكانية تكرار نتائج تجريبية عالية44. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة حقن نانو لدراسة التفاعلات بين الفيروس--المضيف في المورفولوجية، تسليط الضوء على أهمية الآثار الخلفية الذباب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: قبل البدء بالتجربة، بخطوط الخلايا ويطير الأرصدة المستخدمة يجب أن لا تكون ملوثة بمسببات الأمراض الأخرى، خاصة بالنسبة للفيروسات مثل DCV، فف المورفولوجية X (دكسف)، وفيروس التهاب إنفلونزا الطيور (ANV). ومن الناحية المثالية، وتسلسل الحمض النووي الريبي أو تحديد هوية على أساس بكر أبسط تستخدم للكشف عن التلوث10،45. إذا حدث تلوث، ينبغي عدم استخدام خطوط الخلايا والأرصدة يطير أي أكثر حتى يتم تطهير تماما46.

1-الفيروس وإعداد ذبابة

  1. انتشار الفيروس وجمع
    ملاحظة: يتم استخدام المورفولوجية S2 * الخلايا لإكثار DCV والمعايرة. خط الخلية S2 * مستمدة من ثقافة أواخر الأجنة melanogaster دال- المرحلة الأولية. تم هذا خط الخلية جيدا الموصوفة سابقا47.
    1. ينمو S2 * الخلايا في "المورفولوجية المتوسطة" شنايدر عند 25 درجة مئوية دون إضافية CO2، كأحادي الطبقة فضفاضة، وشبه ملتصقة في طبق ثقافة خلية 10 سم، في كثافة 1 × 107 صالحة خلايا/مل. استخدام المتوسطة كاملة ل S2 * الخلايا: "المورفولوجية المتوسطة" شنايدر التي تحتوي على الحرارة 10% إبطال FBS، 100 وحدة/مل البنسلين و 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
      ملاحظة: ينبغي إظهار شكل دائري الخلايا السليمة ويحمل حجم متجانسة.
    2. سرعة ذوبان الجليد رصيد DCV من-80 درجة مئوية في حمام مائي 25 درجة مئوية. تصيب S2 * الخلايا مع DCV في وزارة الداخلية = 0.01 فورا بإضافة 1 مل من محلول الفيروس مباشرة إلى الأطباق ثقافة الخلية (منطقة النمو: 55 سم2) مع 10 مل متوسطة كاملة ل S2 * الخلايا.
    3. احتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 3 إلى 5 أيام. عند الاستعداد لجمع الفيروس، مورفولوجيا الخلايا غير طبيعي (يبدو الشكل الخلية بطمس) والمتوسطة الثقافة مليئة بالجزيئات السوداء يدل على الحطام خلية.
    4. جمع ثقافة كل خلية في أنبوب 15 مل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتجميد في-80 درجة مئوية (لتصل إلى سنة).
      ملاحظة: يمكن تخزين DCV لفترات طويلة من الزمن في-80 درجة مئوية مع فقدان الحد الأدنى من العدوى، لمدة تصل إلى سنة واحدة.
    5. ذوبان الجليد ثقافة الخلية في حمام مائي 25 درجة مئوية مع الرج المستمر وثم الطرد المركزي في 6,000 س ز، لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية في أنبوب عقيم 15 مل ودوامه. قاسمة ما يصل إلى 200 ميكروليتر من الفيروسات الحل كل أنبوب.
      ملاحظة: مختبرين الفيروس يمكن تخزينها لفترات قصيرة لمدة تصل إلى 3 أيام عند 4 درجة مئوية و لمدة تصل إلى سنة واحدة في-80 درجة مئوية. وينبغي تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة. دائماً أنه من الأفضل استخدام جميع قاسمة مرة واحدة.
    6. اختيار 5 أنابيب المحتوية على الفيروس عشوائي لتحديد فيروس متوسط الجرعة المعدية زراعة الأنسجة (TCID50) بتحليل تأثير سيتوباثيك (CPE) (الوحدة 1 تسيد50= 0.7 اللوحة تشكيل وحدة [بفو]).
      ملاحظة: التعليم المهني المستمر يشير إلى التغييرات الهيكلية في الخلايا المضيفة الناجمة عن غزو فيروسي. إصابة الفيروس يسبب تحلل الخلية المضيفة، أو عندما يتوفى الخلية دون تحلل بسبب عدم قدرة على استخراج48.
      1. في يوم 1، جمع استعداد S2 * الخلايا عن طريق بيبيتينج. حساب عدد الخلايا. الطرد المركزي خلايا ل 300 g x 4 دقيقة وتجاهل المادة طافية. تمييع الخلايا لكثافة 1 × 106 خلايا/مل مع المتوسطة كاملة ل S2 * الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
      2. البذور 1 × 105 S2 * الخلايا (100 ميكروليتر) الواحدة وكذلك إلى شقة-96-جيدا--لوحة أسفل (~ 30% كونفلوينسي).
      3. إجراء تخفيف إذ المسلسل من مخزون DCV مع المتوسطة كاملة ل S2 * الخلايا. إضافة 50 ميليلتر تخفيف في البئر. إضافة 50 ميليلتر من الثقافة المتوسطة دون الفيروس إلى البئر يصنف كعنصر سلبي أيضا.
        ملاحظة: لكل معدل تمييع، استخدمت 8 آبار. إضعاف على الأقل كما هو العائد DCV نموذجي حوالي 108-109 بفو/mL، ينبغي أن تغطي ~ 10-5-10-10.
      4. في يوم 4، مراقبة CPE مجهر مشرق الميدانية مع 20 س أو 40 س الهدف. تصنيف فضلا عن الخلايا التي تبدو ضبابية والمتوسطة مليئة بالشظايا كبئر "إيجابية"، وبئر فيها مورفولوجيا الخلايا أمر طبيعي ك "حسنا السلبية".
      5. الآبار CPE علامة إيجابية أو سلبية مع + أو – على التوالي. حساب الفيروس تسيد50 ب أسلوب ريد ومونش49.
    7. التخلص من جميع المواد الملوثة والقفازات في عموم إزالة التلوث. إذا تعذر الوصول إلى الفيروس تسيد المطلوب50، تركيز 100 مل من محلول الفيروسات التي سينتريفوجينج في 68,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: اعتماداً على الهدف من هذه التجربة، مجموعة من جرعات من 102 106 TCID50 وحدات يمكن استخدامها للإصابة بعدوى الفيروس. عادة، ونحن نستخدم 3 × 106 TCID50 الوحدات.
    8. تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق في 1 مل من HCl تريس المخزن المؤقت (10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2). الكوة ميكروليتر 20 من الفيروسات الحل كل أنبوب ومخزن في-80 درجة مئوية. اختيار 5 أنابيب عشوائية لتحديد الفيروس متوسط تسيد50 مرة أخرى.
  2. إعداد يطير للإصابة
    ملاحظة: يمكن منع البكتيريا التكافلية ولبخيه أنواع كثيرة من العدوى بفيروس الحمض النووي الريبي في الحشرات30،،من3132،،من3341. ولذلك، من الضروري لتطهير ولبخيه من الذباب قبل دراسة عدوى الفيروس المضيف في فيفو33.
    1. إعداد يطير الأغذية التي تحتوي على التتراسكلين بإضافة 400 ميكروليتر من 50 ميكروغرام/مل التتراسيكلين (في الإيثانول 70 في المائة) إلى 4 غرام غذاء يطير دقيق الذرة قياسية جديدة (1 لتر من المواد الغذائية تحتوي على 77.7 غ من دقيق الذرة، ز 32.19 الخميرة، ز 10.6 من أجار، ز 0.726 كاكل2 ، ز 31.62 السكروز، ز 63.3 الجلوكوز، ز 2 من سوربات البوتاسيوم و 15 مل من 5% ج8ح8س3). مزيج دقيق ووضع الغذاء في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها تتبخر الإيثانول.
      ملاحظة: قد يؤثر على جرعة عالية من الإيثانول يطير الخصوبة، حتى لا بحذف هذه الخطوة.
    2. الحارة الطعام إلى درجة حرارة الغرفة ووضعت حديثا من الذباب اكلوسيد الكبار (20 من الإناث والذكور 10) في القنينة. تكاثر الذباب عند 25 درجة مئوية، الرطوبة 60% تحت دائرة الضوء/الظلام عادي.
      ملاحظة: عادة ما يستغرق 3-4 أيام للذباب لوضع ما يكفي من البيض. عدد كبير جداً من البيض تعوق التنمية اليرقات وانخفاض كفاءة التتراسيكلين.
    3. جمع حديثا الذباب الكبار اكلوسيد (ضمن 3 ~ 5 أيام) تحت ضوء تدفق CO2، وكرر الخطوة ~ 1.2.1-1.2.2. بشكل عام، على الأقل 3 أجيال مطلوبة للقضاء تماما على من ولبخيه.
    4. بعد 3 أجيال مع العلاج التتراسيكلين، جمع الذباب 5 تحت ضوء تدفق CO2 لاختبار الإصابة ولبخيه . طحن الذباب لمدة 1 دقيقة 250 ميكروليتر من الماء المقطر مزدوجة (ddH2س) وبضعة 0.5 مم الخرز السيراميك عقيمة في أنبوب 1.5 مل استخدام الخالطون. إضافة آخر ميكروليتر 250 س 2 المخزن المؤقت A (0.2 M تريس-HCl، pH 9.0؛ يدتا 0.2 M؛ الحزب الديمقراطي الصربي 2%) للعينة ودوامه.
      ملاحظة: نظراً لمخزونات النشر الاستراتيجي سوف تعوق حركة حبة، 1 x A المخزن المؤقت لا يمكن مباشرة استخدام لطحن الذباب. إذا كان الذباب العيون الحمراء، قم بإزالة رؤساء قبل طحن، كما قد يؤثر هذا اللون من الحمض النووي المنتج.
    5. تجميد العينات في-80 درجة مئوية (الاحتفاظ لمدة تصل إلى سنة واحدة). سرعة ذوبان الجليد العينة من-80 درجة مئوية في حمام مائي 25 درجة مئوية حتى يذوب. احتضان هذه العينات في 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. إضافة ميكروليتر 190 من 5 "م كوك"، ودوامه، واحتضان في الثلج لمدة 15 دقيقة أو أكثر.
    7. الطرد المركزي العينات في س 13,000 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع المادة طافية وتحويلها إلى أنابيب جديدة.
    8. كرر الخطوة 1.2.7 للحصول على الحمض النووي مع نوعية أفضل.
    9. إضافة 750 ميكروليتر من الايزوبروبانول لكل عينة وعكس عدة مرات بلطف باليد. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    10. الطرد المركزي العينات في 13,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل المادة طافية. وسيبقي بيليه الدنا الجينومي أبيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
    11. أضف 1 مل إيثانول 70% إلى الكريات، أجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية. أيردري الحمض النووي حتى يصبح شفافاً.
    12. يحل الحمض النووي في 100 ميكروليتر من ddH O2، تيتراتي تركيز الحمض النووي التي كانت امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة وتمييع الحمض النووي إلى 100 نانوغرام/ميكروليتر.
    13. استخدام 200 نانوغرام من الحمض النووي لتفاعل PCR (في نظام 20 ميكروليتر، انظر الجدول للمواد). إجراء PCR حسب البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ دورة 36 95 درجة مئوية ل 45 ثانية، 50 درجة مئوية ل 45 s، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ وخطوة تمديد نهائي (72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة) في cycler حرارية.
      ملاحظة: تستند الرنا الريباسي ولبخيه 16S، استخدم كبسولة تفجير التالية: تجاجاجاتاتجاكج 5 '3' (إلى الأمام) و 5 'ككتكتاتككتكتتكاكك 3' (العكسية). Wsp، كانت كبسولة تفجير 5 'كاتجتجتجتجتجتج 3' (إلى الأمام) و 5 'أككجااتاكجاجكتككاج 3' (العكسية).
    14. تحليل منتجات PCR مع 1% [اغروس] هلام التفريد. حجم المنتج بكر الرنا الريباسي ولبخيه 16S و wsp هو حوالي 200 شركة بريتيش بتروليوم و 600 شركة بريتيش بتروليوم، على التوالي.
    15. الخلفية ولبخيه الحرة الأسهم يطير على معيار دقيق الذرة الغذاء يطير. جمع الذباب الذكور اكلوسيد يوم 3-5 حديثا للعدوى.
      ملاحظة: العلاج التتراسيكلين يمكن أن تؤثر أيضا على تكوين الحجمية المعوية، التي تؤثر في وقت لاحق الردود المضادة للفيروسات في البلد المضيف. نوصي بأن الذباب جميع ينبغي أن يحصل على نفس العلاج التتراسيكلين. تبقى خالية من ولبخيه الذباب تنمو تحت الظروف القياسية على الأقل 3 أجيال لاستعادة القناة الهضمية الحجمية.
  3. باستريل الوراثي
    ملاحظة: عن وجود اليل S أو R الجينات الباسيفيكي في الخلفية الوراثية تؤثر على العدوى DCV في المورفولوجية34،35. من الضروري فحص وراثي الباسيفيكي ، خاصة بالنسبة للعدوى DCV. هناك بضعة بطانات في توقيت المحيط الهادي التي يمكن أن تؤثر على الإصابة بعدوى الفيروس، SNP الرئيسية ج 512/ت. التدرج درجة الحرارة PCR طريقة سريعة لتحديد النمط الوراثي الباسيفيكي .
    1. يطير استخراج الحمض النووي كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.2.4-1.2.15).
    2. استخدام 100 نانوغرام من الحمض النووي كالقالب، التمهيدي 512 جيم، كاجكاتجتجتككاتجاجتك 5 '3' (إلى الأمام) و 5 'أكجتجاتكاتجكتجااجت 3' (العكسية) للكشف عن اليل R، التمهيدي 512T، كاجكاتجتجتككاتجاجت 5 '3' (إلى الأمام) و 5 'أكجتجاتكاتجكتجااجت 3' (العكسية) للكشف عن اليل S.
    3. تعيين التدرجات Tm (ذوبان درجة الحرارة) على النحو التالي: 54 درجة مئوية و 54.7 درجة مئوية، 55.5 درجة مئوية، 58 درجة مئوية، 59.7 درجة مئوية، 62.2 درجة مئوية، 63.7 درجة مئوية و 64 درجة مئوية (45 s في كل درجة حرارة).
      ملاحظة: ينصح 30 دورات التفاعل المتسلسل PCR (20 ميكروليتر النظام).
    4. تصور المنتج بكر 100 bp بنسبة 2% [اغروس] هلام التفريد.

2-الفيروسية العدوى في المورفولوجية

  1. إصابة الذباب بحقن نانو وإجراء فحوصات البقاء على قيد الحياة.
    1. سحب الشعيرات الدموية تحضير الحقن بالإبر، وكما سبق ذكره ملء الخلفية الحقن إبرة مع النفط وتجميع محقن50.
    2. تخدير الذباب على منصة تحت ضوء تدفق CO2. تطعيم الذباب ب الحقن داخل الصدر44 من 50.6 nL من الفيروسات الحل (بفو 100، تضعف مع المخزن المؤقت تريس-HCl، الرقم الهيدروجيني 7.2). حقن قارورة 3 على الأقل من الذباب (الذباب 20 كل قنينة).
      ملاحظة: الحقن هو مضيعة للوقت (الذباب عموما 100 ساعة) والنسخ المتماثل DCV سريع للغاية، ولذلك فمن المهم جداً كتابة في الوقت المحدد على أنبوب الانتهاء مرة واحدة كل قنينة (20 الذباب). يتم تعيين المخزن المؤقت فقط الحقن كعنصر تحكم وهمية. عادة، يتم الذباب الذكور البالغين المفضل، كما نتائج أكثر استقرارا واستنساخه من عند استخدام الإناث نظراً للتغيرات الهرمونية أثناء التزاوج والإنجاب قد تؤثر قراءات من الإناث51.
    3. تنمو الذباب المحقون عند 25 درجة مئوية، والرطوبة 60% تحت دائرة الضوء/الظلام عادي. يطير الإمداد بالأغذية الطازجة يوميا، وسجل عدد القتلى flies.
    4. أداء replicates البيولوجية على الأقل 3 وارسم منحنى البقاء على قيد الحياة.
    5. للتحليل الإحصائي للبيانات البقاء على قيد الحياة، توليد كابلان-ماير منحنيات البقاء على قيد الحياة عن طريق البرامج الإحصائية. إجراء اختبار رتبة سجل لحساب القيم ف. على الطاولة، والبقاء على قيد الحياة بإدخال المعلومات لكل موضوع. البرنامج ثم يحسب نسبة البقاء على قيد الحياة في كل وقت، ويرسم مؤامرة بقاء كابلان-ماير.
      ملاحظة: لا تقم بإضافة الخميرة إضافية إلى القنينة. بالمقارنة مع عناصر صورية، DCV إصابة الذباب أحياناً الاستسقاء والخرقاء، مما يجعلها عرضه للخميرة لزجة. فمن الأفضل لتسجيل المزيد من النقاط الزمنية في التجربة الأولية لمعرفة إطار الزمني الذي سوف يحدث موت ضخمة للذباب المصابة. عموما، نادراً ما يموت الذباب المصابة خلال اليومين الأول والثاني، حتى بالنسبة لخطوط متحولة Dcr-2 . بالنسبة ولبخيه إصابة ذبابة الحرة ث1118 (بلومينغتون 5905) مع بفو 100 من DCV، هذه النافذة الزمنية حوالي 3-5 أيام بعد الإصابة. ينبغي أن لا تحسب ذباب الفاكهة التي تموت في غضون ساعة حقن وظيفة ح 0.5 محتوماً نظراً لأنهم قد قتلوا جراء إصابة إبرة ليس بالعدوى الفيروسية.
  2. تحميل DCV التدبير بمقايسة CPE
    ملاحظة: يقاس على نحو مماثل لمعايرة مخزون فيروس (الخطوة 1.1.6) الحمولة الفيروسية لكن يتطلب إعداد عينة إضافية (الخطوة 2.2.1-2.2.4).
    1. في يوم 1، تصيب الذباب الذكور كما هو موضح في الخطوة 2.1.1-2.1.2. المجموعة الذباب المحقون في مجموعات من 20 والاحتفاظ بها والمتزايد على الأغذية الطازجة يطير للوقت المطلوب (عادة على 24 ساعة أو 3 أيام). تزويد الذباب بالأغذية الطازجة يوميا.
    2. في اليوم 2، البذور المورفولوجية S2 * الخلايا في طبق ثقافة خلية 10 سم بكثافة حوالي 5 x106 و 1 × 107 خلايا/مل كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
    3. في يوم 3، جمع الذباب 5 (تحت ضوء تدفق CO2) وطحن لهم في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل لمدة 30 ثانية مع 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت تريس وحبات السيراميك باستخدام الخالطون. تخزين العينات في-80 درجة مئوية أو فورا للانتقال إلى الخطوة التالية.
    4. دقة دوامة العينة. استخدم حقنه 1 مل و 0.22 ميكرومتر عامل التصفية لتصفية المادة طافية على أنبوب 1.5 مل جديدة. المضي قدما مع المعايرة، كما هو موضح في الخطوات 1.1.6.1-1.1.6.5.
  3. تحميل DCV تقاس قرت-بكر
    1. في يوم 1، تصيب الذباب كما هو موضح أعلاه. مجموعة حقن أنثى الذباب (20 الذباب في المجموعة) وتنمو على المواد الغذائية الطازجة يطير للوقت المطلوب، وعادة 24 ساعة أو 3 أيام. تزويد الذباب بالأغذية الطازجة يوميا.
    2. في يوم 3، جمع الذباب 5 تحت ضوء تدفق CO2 في أنبوب 1.5 مل مع 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل وحبات السيراميك 20 (قطرها = 0.5 مم) وطحن العينات التي الخالطون مع سرعة عالية ميكروليتر إضافة 800 س. 30 من المخزن المؤقت لتحلل إضافية لكل أنبوبة وتخزينها s أمبليس في-80 درجة مئوية أو على الفور إجراء استخراج الحمض النووي الريبي وبكر قرة.
    3. إعداد رناسي نصائح مجانية، وأنابيب ومنزوع، ديثيلبيروكاربوناتي (ديبك) تعامل والمياه تصفية غشاء 0.22 ميكرومتر. إضافة 200 ميكروليتر من كلوروفورم (≥99.5%) في العينة وبقوة يهز لمدة 15 ثانية باليد. احتضان لمدة 5 دقائق أو أكثر في درجة حرارة الغرفة حتى مرحلة المياه والعضوية هي يفصل بوضوح.
      ملاحظة: كلوروفورم خطرة للغاية ويجب التعامل معها بحذر. دوامة لا العينة، مما يزيد من خطر التلوث الحمض النووي.
    4. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 13,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    5. جمع 400 ميكروليتر من المادة طافية ونقل المادة طافية بأنابيب جديدة. يخلط نفس حجم الايزوبروبانول (≥ 99.5 ٪) وعكس العينات برفق لعشرين مرة باليد ثم يعجل مدة 10 دقائق أو أكثر في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: سوف زيادة هطول الأمطار في-20 درجة مئوية غلة الجيش الملكي النيبالي.
    6. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 13,000 ز س لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. الكريات "البيضاء الحمض النووي الريبي" مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    7. تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل إيثانول 70% (الإيثانول في الماء ديبك) وعكس عدة مرات لغسل الجيش الملكي النيبالي.
    8. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل الجيش الملكي النيبالي طافية والجافة لمدة 5-10 دقائق؛ الجيش الملكي النيبالي أن تصبح شفافة.
    9. إضافة 50 ميكروليتر من المياه ديبك عينة، وماصة لعدة مرات ودوامه.
    10. تأخذ 3 ميكروليتر من الحمض النووي الريبي للمعايرة تركيز الجيش الملكي النيبالي. التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي في 260 نيوتن متر. عادة، يتم تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج بموجب هذا البروتوكول حوالي 100-500 ميكروغرام/ميكروليتر، الذي مناسبة لتوليف كدنا.
    11. استخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتوليف كدنا. تمييع العينة إلى 100 ميكروليتر مع ddH2س ومخزن في-20 درجة مئوية.
    12. إجراء PCR qRT وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وتشغيل قرة-PCR.
      ملاحظة: لتوليف كدنا DCV، كبسولة تفجير عشوائي وعملت أفضل بكثير من بولي بالتمهيدي في أيدينا. هو تطبيع DCV التعبير مرناً للبروتين ريبوسومال الذاتية 49 (rp49) مرناً. كبسولة تفجير اليغنوكليوتيد المستخدمة في هذا الجزء: rp49 أجاتكجتجاجاجكجكاككاج 5 '3' (إلى الأمام) و 5 'كاككاجاكتكتجاتككج 3' (عكس)؛ DCV، تكاتكجتاتجكاكاتجكت 5 '3' (إلى الأمام) و 5 'كجكاتاككاتجكتكتكتج 3' (عكس)؛ ابعدتها، تجكاكتكتججاجاتاجك 5 '3' (إلى الأمام) و 5 'آتتجكككتجكجتكاجتت 3' (عكس)؛ الفيروسات التي يسببها الجيش الملكي النيبالي 1 (فير-1) جاتكككاتتتكككاتكا 3 '5' (إلى الأمام) و 5 'جاتاكاجكتججتجكاكا 3' (العكسية).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم الحصول على نتائج من هذا القسم بعد الإصابة DCV من ميلانوجاستير د. ويبين الشكل 1 في الرسم البياني للعدوى الفيروسية في المورفولوجية. يتم حقن الذباب داخل ثوراسيكالي ومن ثم يتم جمع العينات لقياس مستوى الحمض النووي الريبي الجينوم (الشكل 1) و تسيد الفيروسية50 . يمكن أن يؤدي إلى الإصابة بعدوى الفيروس تحلل الخلية ويلاحظ CPE في 3 أيام بعد الإصابة (الشكل 2A). تحميل الفيروس تقاس بمقايسة CPE تمشيا مع أن يقاس قبكر (الشكل 2). كما هو موضح في الشكل 3، ولبخيه يمنع الإصابة DCV في المورفولوجية. كبسولة تفجير الرنا الريباسي wol-16s و wsp تستخدم للكشف عن وجود ولبخيه (الشكل 3A) وولبخيه-الذباب مجاناً إظهار معدل البقاء على قيد الحياة إلى حد كبير انخفاض بعد الإصابة DCV (الشكل 3B). ويبين الشكل 4 كيفية التحقق من تعدد الأشكال الباسيفيكي بالتدرج [بكر] كبسولة تفجير محددة باستخدام. يبين الشكل 5 الجرعة تعتمد آثار العدوى DCV في الطاير wildtype. تحميل معدل البقاء على قيد الحياة في الشكل 5A والفيروس في 3 أيام بعد الإصابة هو مبين في الشكل 5 (ب). الشكل 6 يوضح أن الإصابة DCV يمكن تنشيط Dcr2/[رني] وجاك/STAT المضادة للفيروسات مما يشير إلى مسارات في المضيف52. هو مستوى التعبير التعبير مراسل الجينات ابعدتها عن مسار Dcr2/[رني] مرتفعة 3 أيام بعد الإصابة (الشكل 6A). يتم تنشيط مسار جاك-STAT أيضا عند الإصابة DCV، الذي تتم الإشارة إلى مستوى التعبير مراسل الجينات فير-1 (الشكل 6B). يبين الشكل 7 أن المسار Dcr2/[رني] أمر حاسم للعدوى المضادة للفيروسات في المورفولوجية52. وقد الذباب متحولة Dcr-2 معدل بقاء انخفاض (الشكل 7 أ) وفيروس زيادة تحميل (الشكل 7) بعد الإصابة DCV.

Figure 1
الشكل 1: الرسم البياني العدوى المورفولوجية وتحليل تحميل الفيروس.
إنشاء المورفولوجية العدوى عن طريق الحقن نانو. ويبين الرسم البياني المخطط أن يصاب الذباب داخل ثوراسيكالي وأن تحميل الفيروس هي يقاس بمقايسة CPE وبكر قرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: DCV تحميل التحليل.
تحميل الفيروس تقاس بمقايسة CPE تمشيا مع أن يقاس qPCR. (أ) تستزرع S2 * الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام مع إضعاف فيروسات مختلفة (50 ميكروليتر). 1 "تسيد الوحدة"50 من الفيروسات المستخدمة هي 4.29 x 109 (ما يعادل 3 × 109 بفو/mL). الفريق الأول، 10-3 إضعاف؛ الفريق الثاني، 10-7 إضعاف؛ الفريق الثالث، 10-10 إضعاف؛ لوحة المنصوص عليها، ث/س العدوى. إظهار الخلايا في فريق واحد واثنين النمط الظاهري إيجابية CPE نموذجية (تشير الأسهم البيضاء إلى الحطام خلية)، وتظهر الخلايا في الفريق ثلاثة وأربعة النمط الظاهري السلبية النمطية. ويشير شريط مقياس الأرقام. تحميل قياس DCV (ب) بواسطة qPCR. إجراء تخفيف إذ المسلسل من DCV وتصيب خط الخلية S2 *. يتم استخراج الجيش الملكي النيبالي مجموع الخلايا المصابة ويتم تنفيذ قبكر لقياس مستوى الحمض النووي الريبي DCV. التدرج المعدية الفيروسي (يحدده الفحص CPE) في الخلايا المتطابقة وإيجابية تتصل بالقياس قبكر (ص2= 0.999). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: العدوى الفيروسية من الذباب مع أو بدون ولبخيه.
وتساهم العدوى ولبخيه DCV المقاومة المورفولوجية. (أ) ولبخيه الكشف عن وجود بواسطة كبسولة تفجير الرنا الريباسي wol-16s و wsp . الذباب G1, G2 و G3 ممثلة ركازr(أوريغون-R) (بلومينغتون 5) معاملة من التتراسيكلين واحد، اثنين وثلاثة أجيال على التوالي. حجم المنتج PCR هو حوالي 200 شركة بريتيش بتروليوم (الرنا الريباسي wol-16) و 600 شركة بريتيش بتروليوم (wsp). (ب) الذباب ولبخيه الحرة أكثر حساسية للإصابة DCV. 3-5 أيام يتم حقن القديمة الذباب البالغين الذكور مع بفو 100 من DCV. ولبخيه الحرة الذباب (خطوط متصلة) تظهر انخفاض كبير في البقاء على قيد الحياة من الذباب ولبخيه المحمية (خطوط داش) عند الإصابة DCV. سطرين wildtype مختلفة، خامr و w1118، تستخدم لتحليل البقاء على قيد الحياة وتظهر نتيجة مشابهة. وتمثل كافة أشرطة الخطأ الخطأ القياسي (جنوب شرق) على الأقل ثلاثة اختبارات مستقلة؛ * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001، ns، ليس كبيرا. كابلان-ماير (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التنميط باستريل بالتدرج PCR.
يتم التحقق من تعدد الأشكال الباسيفيكي بالتدرج PCR. بكر التدرج يتم التمييز بين توقيت المحيط الهادي R (512 ج) واليل S (512T) في تعليم الكبار المورفولوجية . تدرجات Tm هي ج: 54 درجة مئوية، باء: 54.7 درجة مئوية، c: 55.5 ° C، d: 58 درجة مئوية، هاء: 59.7 درجة مئوية، واو: 62.2 درجة مئوية، وزاي: 63.7 درجة مئوية، h: 64 درجة مئوية.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: معدل البقاء على قيد الحياة وعيار DCV الذباب ركازr مصاب بجرعة مختلفة من DCV.
يتم حقن الذباب ركازrبثلاث جرعات مختلفة من DCV، بفو/الطاير 10، 50 بفو/يطير يطير و 100 بفو/. (أ) معدل البقاء على قيد الحياة الذباب أقل بكثير عند المصابين بالجرعات المعدية. الجسم (ب) مستوى الحمض النووي الريبي DCV في الجامعة من الذباب المشار إليه هو تطبيع لفريق التطعيم بفو/الطاير 10 وتقاس قرت-بكر في الوقت المشار إليه. وتمثل كافة أشرطة الخطأ الخطأ القياسي (جنوب شرق) على الأقل ثلاثة اختبارات مستقلة؛ * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001، ns، ليس كبيرا. كابلان-ماير (A) أو anova أحادي الاتجاه (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: Dcr2/[رني] وجاك/STAT المضادة للفيروسات مما يشير إلى مسار تنشيط بعد الإصابة DCV.
كانوا مصابين بالذباب ركازrبفو 100 من DCV. ابعدتها (A) ومرناً فير-1 (ب) أعربت في الجسم كله تقاس قرت-بكر في الوقت المشار إليه النقاط بعد الإصابة. هو تطبيع التغيير للتعبير عن المستوى القاعدي قبل الإصابة. وتمثل كافة أشرطة الخطأ الخطأ القياسي (جنوب شرق) على الأقل ثلاثة اختبارات مستقلة؛ * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001، ns، ليس كبيرا. أحادي الاتجاه ANOVA (أ، ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: Dcr-2 متحولة يطير حساسة للإصابة DCV.
يطير للمسخ Dcr-2 وكانوا مصابين به الذباب w1118 التحكم الوراثي بفو 100 من DCV. (أ) معدلات البقاء على قيد الحياة Dcr-2 ناقص الذباب والذباب البرية من نوع (w1118) نشر العدوى DCV. يقاس qRT-بكر 2 يوما بعد الإصابة بمستوى (ب) DCV الجيش الملكي النيبالي في الجسم كله من الذباب المشار إليها وتطبيع لأن ث1118. وتمثل كافة أشرطة الخطأ الخطأ القياسي (جنوب شرق) على الأقل ثلاثة اختبارات مستقلة؛ * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001، ns، ليس كبيرا. كابلان-ماير (A) أو الطالب اختبار T (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، نقدم إجراءات مفصلة حول كيفية إنشاء نظام فيروسية معدية في البالغين melanogaster المورفولوجية استخدام حقن نانو. وتشمل البروتوكولات إعداد خطوط الطيران المناسبة ومخزون فيروس وتقنيات العدوى، وتقييم مؤشرات المعدية وقياس الاستجابة المضادة للفيروسات. على الرغم من أن يتم استخدام DCV كمثال لمسببات الأمراض الفيروسية، عشرات أنواع مختلفة من الفيروسات قد طبقت بنجاح للدراسة في النظام المورفولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، حددت مئات عوامل التنظيمية، أما للفيروس أو للبلد المضيف، ومن خلال الفحص على نطاق واسع في الذباب. وهكذا، هذا الأسلوب هو القدرة على التكيف ولا يحد إلى DCV/التفاعلالمورفولوجية .

لنشر وحصاد عيار عالية DCV بنجاح، يجب اتخاذ الاحتياطات قليلة. ينبغي أن تكون خلايا صحية، مثقف في كثافة مناسبة وحصادها في الوقت المناسب. تقليل حجم ثقافة الخلية لا تؤثر تأثيراً كبيرا على عيار الفيروس. وبشكل نموذجي, 10 خلايا7 مصاب ب DCV في وزارة الداخلية = 0.01 سوف أخيرا العائد التقريبي 108-109 تسيد50 من DCV، التي يمكن أن تفي بمطالب معظم التجارب في الجسم الحي وفي المختبر . الفحص المستمر والتحليل qRT PCR موصوفة في هذا البروتوكول لقياس حمولة الفيروس. والرزن CPE صعبة نوعا ما. الكثافة المناسبة لتلقيح الخلية ومعيار خبرة الإيجابية/السلبية CPE التمييز السماح مقايسة CPE سريعة وناجحة. وهكذا، نحن نقدم فحص PCR qRT سهلة هنا للمساعدة في تحديد النقطة تمييع وقف إنتاج المواد الانشطارية في مقايسة CPE قبل إتقان المقايسة CPE.

ومع ذلك، DCV فيروس قوية جداً ليطير الكبار و المورفولوجية الخلية خط. يمكن أن تقتل فقط 100 بفو/يطير تلقيح 50% ذباب البرية في غضون 5 أيام. جرعة إصابة زائدة قد الظل أهمية بين نوع البرية المحتملة ويطير خطوط عرضه. من المهم أن تطبق على الأقل جرعتين العدوى عند بدء شاشة جديدة. تسجيل عدد الوفيات أكثر تواترا في التجارب الأولية منذ وفاة المورفولوجية ضخمة قد يحدث في إطار وقت قصير جداً بسبب ارتفاع قوة فتك DCV، يوصي بشدة. أحياناً يكون بعض الذباب بعد الإصابة DCV، متلازمة استسقاء. جدير بالذكر أن ينبغي أن تستبعد الذباب الذي يموت داخل ح 0.5 وظيفة العدوى، التي يمكن أن تسببها الإصابة حقن إبرة غير مناسب.

قوة DCV المعدية يتأثر أيضا باستضافة العديد من العوامل، التي ينبغي النظر فيها قبل البدء تجربة. ولبخيه هو عمودي يحيل اندوسيمبيونت الذي له تأثير كبير على الإصابة بعدوى الفيروس في الذباب32. العلاج التتراسيكلين في الغذاء يطير أسلوب المستخدمة شيوعاً للقضاء على الإصابة ولبخيه . ومع ذلك، هذا الأسلوب أيضا يغير تكوين الحجمية المعوية، التي قد تؤثر بدورها على الاستجابة المضادة للفيروسات53. عدد قليل من الدراسات أكدت أهمية التباين الوراثي على فيروس العدوى36، مثل ubc-e2h، cg8492 ، و توقيت المحيط الهادي. على سبيل المثال، وجود ذبابة نوع البرية معظم خطوط قد اليل الباسيفيكي S وتكون حساسة للفيروسات مثل بيكورنا، بينما معظم خطوط متحولة اختبرنا من مركز الأسهم بلومينغتون اليل الباسيفيكي R، وهكذا تعمل مقاومة. من المهم جداً لاستبعاد أثر الباسيفيكي، خصوصا عندما حجب مورثة مقاومة مقارنة مع نوع البرية التحكم29.

بالإضافة إلى حقن نانو للحث على الإصابة بعدوى الفيروس النظمية، تتوفر أساليب أخرى لدراسة الإصابة بعدوى الفيروس في الذباب. وقد أثبتت خطوط الخلايا المورفولوجية طريقة الفائق لحجب الإصابة بعدوى الفيروس ذات الصلة بالمضيف مكون الخلوية37،38. ومع ذلك، نظام في المختبر دائماً يترافق مع نسبة عالية من إيجابيات كاذبة، عندما يؤكد في فيفو. يمكن أيضا تطبيق DCV لتصيب المورفولوجية شفويا، في حين أنه يمكن أن تؤدي فقط إصابة أكثر اعتدالا وتقييد. فقط 20% يرقات أصيبوا داخل ح 12 ولوحظ نفوق 14%، الذباب وفيات خلال 20 يوما في تعليم الكبار بنسبة 25 في المائة فقط22. الثقب الذباب مع دبابيس 0.15-مم-القطر طريقة أخرى لتعيين العدوى الفيروسية ولكن لا يمكن التأكد من الإصابة بدقة الجرعة والكمية التكرار. أوفيريكسبريسينج البروتينات الفيروسية بالتحوير الوراثي في الذباب وسيلة جيدة لدراسة إينتيراكتوميس الجزيئية في فيفو7. ومع ذلك، قد لا تصور واقع علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في البلد المضيف عند الإصابة. وفي الوقت نفسه، طريقة حقن نانو لديه أيضا العيوب، كما أنه ليس هو الطريق الطبيعي للعدوى ويمكن أن تحفز مباشرة نظام قوي لاستجابة المناعية فقط بعد الإصابة بالفيروس، الذي تجاوز بشرة، أول خط الدفاع المضادة للفيروسات. إجمالاً، بحوث محددة الغرض وشرط التجريبية المتاحة هي العوامل الحاسمة في الاختيار بين أساليب مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نود أن نشكر مختبر عموم كامل في البرامج المتكاملة. الأكاديمية الصينية للعلوم. ونشكر الدكتور لانفينج وانغ (IPS، CAS) للمساعدة التجريبية والدكتور جونالو كوردوفا ستجر (سبرينغر الطبيعة)، والدكتورة جيسيكا فارغاس (IPS، باريس) والدكتور تشو سنغ (IPS، باريس) للتعليقات. وأيد هذا العمل منح من "برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية" للأكاديمية الصينية للعلوم L.P (XDA13010500) و H.T (XDB29030300)، و "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين" إلى L.P (31870887 و 31570897) و J.Y (31670909). L.P زميل "الأكاديمية الشباب جمعية النهوض بالابتكار" (2012083).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22um filter Millipore SLGP033RS
1.5 ml Microcentrifuge tubes Brand 352070
1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C
10 cm cell culture dish Sigma CLS430167 Cell culture
100 Replacement tubes Drummond Scientific 3-000-203-G/X
15 ml tube Corning 352096
ABI 7500 qPCR system ABI 7500 qPCR
Cell Incubator Sanyo MIR-553
Centriguge Eppendof 5810R
Centriguge Eppendof 5424R
Chloroform Sigma 151858 RNA extraction
DEPC water Sigma 95284-100ML RNA extraction
Drosophila Incubator Percival I-41NL Rearing Drosophila
FBS Invitrogen 12657-029 Cell culture
flat bottom 96-well-plate Sigma CLS3922 Cell culture
Fluorescence microscope Olympus DP73
Isopropyl alcohol Sigma I9516 RNA extraction
Lysis buffer (RNA extraction) Thermo Fisher 15596026 TRIzol Reagent
Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) Thermo Fisher 10296028 TRIzol LS Reagent
Microscope Olympus CKX41
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)
Optical Adhesive Film ABI 4360954 qPCR
Penicillin-Streptomycin, Liquid Invitrogen 15140-122 Cell culture
qPCR plate ABI A32811 qPCR
Schneider’s Insect Medium Sigma S9895 Cell culture
statistical software GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix TransScript AT301 RNA extraction
Vortex IKA VORTEX 3 RNA extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
  2. Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
  3. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
  4. Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today? One Health. 4, 1-13 (2017).
  5. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  6. Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
  7. Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
  8. Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genetics. 189, 495-506 (2011).
  9. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
  10. Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
  11. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208, 853-874 (2018).
  12. West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
  13. Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
  14. Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
  15. van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
  16. Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
  17. Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
  18. Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
  19. Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
  20. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
  21. Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
  22. Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
  23. Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
  24. Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
  25. Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
  26. Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
  27. Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
  28. Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
  29. Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
  30. Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
  31. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
  32. Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O'Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
  33. Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
  34. Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
  35. Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genetics. , 2159-2173 (2017).
  36. Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
  37. Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  38. Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
  39. Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
  40. Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
  41. Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
  42. Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
  43. Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
  44. Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
  45. Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
  46. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  47. Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
  48. Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
  49. Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  50. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
  51. Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
  52. Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
  53. Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 145، melanogaster المورفولوجية، فيروس، العدوى، والحصانة الفطرية، والاستجابة المضادة للفيروسات، نانوينجيكشن
إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في <em>Melanogaster المورفولوجية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, S., Zhao, Y., Yu, J., Fan, Z., … More

Yang, S., Zhao, Y., Yu, J., Fan, Z., Gong, S. t., Tang, H., Pan, L. Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (145), e58845, doi:10.3791/58845 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter