Summary
该方案介绍了如何建立病毒感染在果蝇体内使用纳米注射方法和基本技术, 以分析病毒宿主相互作用。
Abstract
病毒传播是传染病的主要原因。因此, 了解病毒与宿主之间的相互作用对于扩大我们预防和治疗病毒感染的知识非常重要。果蝇被证明是最有效和最有生产力的模型生物之一, 以筛选抗病毒因子和调查病毒-宿主相互作用, 由于强大的遗传工具和高度保守的先天免疫信号通路。这里描述的程序演示了一种纳米注射方法, 以建立病毒感染, 并诱导在成年苍蝇的系统抗病毒反应。这种方法对病毒注射剂量的精确控制可实现较高的实验重现性。本研究描述的方案包括苍蝇和病毒的制备、注射方法、存活率分析、病毒负荷测量和抗病毒途径评估。本文提到了苍蝇背景对病毒感染的影响。这种感染方法易于执行, 可定量重复;它可用于筛查与病毒宿主相互作用有关的宿主病毒因子, 并对先天免疫信号与其他生物途径在病毒感染反应中的串扰进行解剖。
Introduction
新出现的病毒感染, 特别是基孔肯雅病毒 1、登革热病毒、黄热病病毒2和寨卡病毒3等弓形虫病毒, 通过引起大流行病, 对公众健康构成巨大威胁4. 因此, 更好地了解病毒与宿主的相互作用对于流行病控制和人类病毒性疾病的治疗变得越来越重要。为此, 必须建立更适当和更有效的模型, 以调查病毒感染的机制。
果蝇,果蝇 (d. 黑色素母细胞), 为研究病毒宿主相互作用5,6提供了一个强大的系统, 并已被证明是研究人类病毒性疾病的最有效的模型之一7,8,9. 高度保守的抗病毒信号通路和无与伦比的遗传工具使苍蝇成为一个很好的模型, 能够产生对人类抗病毒研究具有真正影响的显著结果。此外, 苍蝇在实验室维护起来容易, 价格低廉, 在感染期间, 很方便地大规模筛选新的调节因子6,10和宿主。
最近, 在嗜酸性粒细胞中, 研究了四种主要的高度保守的抗病毒途径 (例如 rna 干扰 (rnai) 通路11、JAK-STAT 通路12、nf-b 通路和自体吞噬通路13)年6。rnai 途径是一种广泛的抗病毒机制, 可以抑制大多数类型的病毒感染6,14。由双宁-2 (dcr-2)或 Argonaute 2 (ago2 ) 等基因突变破坏这一途径可导致病毒滴度和宿主死亡率增加 15, 16,17.jak-stat 途径与控制来自双星科和黄曲霉家族的病毒感染昆虫有关,例如, 16岁苍蝇中的果蝇 c 病毒 (dcv) 和西尼罗河病毒 (wnv)并且登革热病毒在蚊子18,19。五音龙(同源于人类的 nf-b 途径) 和免疫缺陷 (imd) 途径 (类似于人类 nf-b 和 tnf 途径) 都参与了病毒入侵20,21, 22. 自食其力是另一种在病毒感染的调节中被保护的机制, 在德罗菲拉23,24中有很好的特点。因此, 可以很容易地识别这些途径的新调控因素, 并在这些抗病毒信号转接和其他生物途径 (如代谢、衰老、神经反应等) 之间进行解剖系统。
虽然果蝇中最成熟的病毒感染模型是由 rna 病毒诱导的, 但无脊椎动物的虹彩病毒 6i (iv-6) 和 kallithea 病毒的感染表明了研究苍蝇中 dna 病毒的潜力25 26岁此外, 该病毒也可以修改, 以允许感染嗜德维塔, 如流感病毒9。这极大地扩大了食人鱼筛选平台的应用。在这个过程中, 我们使用 dcv 作为一个例子来描述如何在嗜德维拉开发病毒感染系统。dcv 是一种正感单链 rna 病毒, 约9300核苷酸, 编码 9蛋白 27。dcv 作为d. 黑色素瘤的一种天然病原体, 被认为是研究宿主在宿主-病毒相互作用和共同进化过程中生理、行为和基础免疫反应的合适病毒28。此外, 它在野生苍蝇感染后的快速死亡率使 dcv 有助于筛选宿主29中的耐药或易感基因。
然而, 在研究嗜德维拉病毒感染时, 有几个方面值得关注。例如, 共生细菌wolbachia有能力抑制不同谱的 rna 病毒在德洛菲拉和蚊子30,31,32。最近的证据表明,沃尔巴奇亚通过宿主33中甲基转移酶 mt2 表达的提高阻断了 sindbis 病毒 (sinv) 感染的一种可能机制.此外, 昆虫的遗传背景对病毒感染也至关重要。例如,松柏基因中的自然多态性决定了五合34、35 对 dcv感染的易感性, 而ubc-e2h和cg892的位点分别参与了板球麻痹病毒 (crpv) 和羊群屋病毒 (fhv) 感染 36.
建立苍蝇中病毒宿主相互作用的特殊方法, 必须根据研究目的进行选择, 例如对果蝇细胞系 37、38、口服中的宿主细胞成分进行高通量筛选感染研究肠道特异性抗病毒反应22,39,40, 针刺41,42或纳米注射通过上皮屏障, 以刺激全身免疫反应。纳米注射能精确控制病毒剂量, 诱导受控抗病毒反应和生理病变43, 从而保证高实验重现性44。在这项研究中, 我们描述了一种纳米注射方法来研究果蝇中的病毒-宿主相互作用, 强调了苍蝇的背景效应的重要性。
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Protocol
注: 在开始实验之前, 所使用的细胞系和苍蝇库存不得受到其他病原体的污染, 特别是对于 dcv、fhv、果蝇 x 病毒 (dxv) 和禽流感病毒 (anv) 等病毒。理想情况下, rna 测序或更简单的基于 pcr 的识别用于检测污染 10,45。如果发生污染, 细胞系和苍蝇库存不应再使用, 直到它们完全净化46。
1. 病毒和飞行准备
- 病毒传播和收集
注:嗜酸性粒细胞 s2 * 用于 dcv 传播和滴定。s2 * 细胞系来源于晚期黑色素瘤胚胎的原代培养。这个细胞系在前面已经描述得很好了。- 在25°c 的施耐德的德赛菲拉培养基中生长 s2 * 细胞, 而不增加 co2, 作为一个松散的, 半粘附单层在一个10厘米的细胞培养盘, 密度为 1x107 活细胞。使用完整的 s2 * 细胞培养基: 施耐德的嗜酸性粒细胞含有10% 的热灭活 fbs, 100 unitsml 青霉素和100μgml 链霉素。
注: 健康细胞应显示圆形和均匀大小。 - 在25°c 的水浴中, 从-80°c 快速解冻 dcv 库存。通过在细胞培养皿 (生长面积:55 cm 2) 中直接添加1毫升的病毒溶液, 为 s2 * 细胞注入 s2 * 细胞的 dcv = 0.01.
- 在25°c 下培养细胞3至5天。当病毒准备收集时, 细胞形态是不正常的 (细胞形态看起来模糊), 培养基中充满了黑色颗粒指示细胞碎片。
- 通过上下移液和在-80°c (长达一年) 冻结, 在15毫升管中收集整个细胞培养。
注: dcv 可在-80°c 中长时间储存, 并将感染损失降至最低, 最长可保存一年。 - 在25°c 的水浴中, 在不断晃动的情况下解冻细胞培养, 然后在 6, 000 x 克的温度下离心, 在4°c 下进行15分钟的离心。在无菌的15毫升管和涡旋中收集上清液。每个管的病毒溶液最高可达200μl。
注: 病毒等价物可在4°c 下短期存放, 最长可储存 3天, 在-80°c 下可存放1年。应避免重复的冻融循环。一次使用所有的化名总是比较好的。 - 选择5个随机含病毒管, 通过细胞病理效应 (cpe) 测定确定平均病毒组织培养感染剂量 (tcid50) (1个 tcid 50 = 0.7 斑块形成单元 [pfu]).
注: cpe 是指病毒入侵引起的宿主细胞结构变化。感染病毒会导致宿主细胞的裂解, 或者当细胞因无法繁殖而在没有裂解的情况下死亡。- 第1天, 通过移液收集准备好的 s2 * 细胞。数一数手机号码。将细胞离心 4分钟, 并丢弃上清液。如步骤1.1.1 所述, 用 s2* 细胞的完整培养基将细胞稀释到 1 x 10 6 细胞的密度。
- 种子 1 x10 5 S2*cells (100μl) 每口井到平底96孔板 (~ 30% 融合)。
- 对 s2 * 电池的 dcv 库存进行连续10倍稀释, 并提供完整的介质。在井中加入50μl 稀释剂。在分类为阴性对照的井中加入50μl 无病毒培养基。
注: 每次稀释率使用8口井。由于典型的 dcv 收率在10-10 9 9 puuml 左右, 稀释量应至少覆盖 ~ 10-5-10-10. - 第4天, 用明亮的显微镜用20x 或40x 目标观察 cpe。将细胞看起来模糊、介质充满碎片的井归类为 "正井", 将细胞形态与 "负井" 相法正分的井进行分类。
- 标记 cpe 正或负井, 分别为 + 或-。用芦苇和穆奇方法 49计算病毒 tcid 50。
- 在净化盘中处理所有受污染的材料和手套。如果病毒无法达到所需的 tcid50, 则在4°c 下, 以 68, 000 x 克的离心速度, 以1小时的速度浓缩100毫升的病毒溶液。
注: 根据实验的目的, 可用于病毒感染的剂量范围从 102到 106 tcid50 单位。通常情况下, 我们使用 3 x10 6 tcid50 单位。 - 丢弃上清液, 在1毫升的 Tris-HCl 缓冲液中重新悬浮 (10 mm, ph 7.2)。每个管的病毒溶液为 20μl, 并储存在-80°c。选择5个随机管, 以再次确定平均病毒 tcid50 。
- 在25°c 的施耐德的德赛菲拉培养基中生长 s2 * 细胞, 而不增加 co2, 作为一个松散的, 半粘附单层在一个10厘米的细胞培养盘, 密度为 1x107 活细胞。使用完整的 s2 * 细胞培养基: 施耐德的嗜酸性粒细胞含有10% 的热灭活 fbs, 100 unitsml 青霉素和100μgml 链霉素。
- 飞行准备为传染
注: 共生细菌wolbachia可以抑制昆虫中的多种 rna 病毒感染 30,31,32, 33,41.因此, 在体内研究宿主病毒感染33之前, 必须先清除苍蝇中的沃尔巴契亚。- 将含有四环素的苍蝇食品加入 400μl 50μml 四环素 (70% 乙醇) 到4克新鲜标准玉米粉飞食 (1 升含有77.7 克玉米粉, 32.19 克酵母, 10.6 克琼脂, 0.726 克cl 2), 31.62 克蔗糖, 63.3 克葡萄糖, 2 克山梨酸钾和15毫升 5% c8h8 o3).将食物充分混合, 在4°c 下过夜, 蒸发乙醇。
注: 高剂量的乙醇可能会影响苍蝇的生育能力, 所以不要省略此步骤。 - 将食物加热到室温, 并将新失去的成年苍蝇 (2 0名雌性和 1 0名雄性苍蝇) 放入小瓶中。在25°c 条件下繁殖苍蝇, 在正常的光/暗循环下, 60% 的湿度。
注: 通常情况下, 苍蝇需要3-4天才能产下足够的卵。过多的卵抑制幼虫的发育, 降低四环素的效率。 - 在二氧化碳的光流下收集新放生的成虫 (3 ~ 5天内), 并重复步骤 ~ 1.2.1-1.2.2。通常情况下, 完全消灭沃尔巴奇亚至少需要3代。
- 经过3代四环素治疗后, 在二氧化碳的光流下收集5只苍蝇进行沃尔巴奇感染试验。用250微米的双蒸馏水 (ddh2o)和几个 0.5 mm 的不育陶瓷珠在 1.5 ml 管中使用均质机进行10分钟的研磨。在样品和涡流中再加入250μl 的2倍缓冲液 a (0.2 m Tris-HCl, ph 值 9.0; 0.2 m edta; 2% sds)。
注: 由于 sds 会阻碍珠子移动, 因此不能直接使用1x 缓冲区 a 来磨碎苍蝇。如果苍蝇的眼睛发红, 在磨合前摘下头, 因为这可能会影响 dna 产品的颜色。 - 将样品冷冻在-80°c (最多保存一年)。在25°c 的水浴中快速解冻-80°c 的样品, 直到溶解。在70°c 下将样品生下30分钟。
- 加入190μl 的 5m koac, 涡旋, 在冰上孵育15分钟或更长时间。
- 在室温下以 13, 000 x g 离心样品 5分钟, 收集上清液并将其转移到新的管中。
- 重复步骤1.2.7 获得质量更好的 dna。
- 在每个样品中加入750μl 异丙醇, 然后手动轻轻反转几次。在室温下孵化5分钟。
- 在室温下以 13, 000 x g 离心样品 5分钟, 并丢弃上清液。白色基因组 dna 颗粒将停留在试管底部。
- 在颗粒中加入1毫升70% 乙醇, 以 13, 000 x g 离心 5分钟, 并丢弃上清液。空气干燥 dna, 直到它变得透明。
- 用 uv-vis吸收分光光度法将 dna 在100μl 的 ddh 2o 中溶解, 滴定 dna 浓度, 并将 dna 稀释至100ngμl。
- 使用200纳克的 dna 进行 pcr 反应 (在20μl 系统中, 请参见材料表)。通过以下程序执行 pcr: 95°c 15分钟;36°c 循环 45°c, 50°c 45秒, 72°c 1分钟;和热循环器中的最后扩展步骤 (72°c, 1分钟)。
注: 根据 wolbachia 16s rrna, 使用以下引物: 5 "tgagagatagagagagggg 3" (正向) 和 5 "cctctttttcaaca 3" (反向)。对于 wsp, 引物为 5 ' cattgtgtgtgtgtgg 3 ' (正向) 和 5 ' acgaacaggccag 3 '。 - 用1% 琼脂糖凝胶电泳分析 pcr 产物。wolbachia 16s rrna 和wsp的 pcr 产物大小分别在 200 bp 和 600 bp 左右。
- 后沃尔巴奇亚免费苍蝇库存的标准玉米粉飞食。收集3-5天新放菌的雄性苍蝇感染。
注: 四环素治疗也会影响肠道微生物群成分, 从而影响宿主的抗病毒反应。我们建议所有苍蝇都应该接受同样的四环素治疗。保持狼无菌苍蝇在标准条件下生长至少3代, 以恢复肠道微生物群。
- 将含有四环素的苍蝇食品加入 400μl 50μml 四环素 (70% 乙醇) 到4克新鲜标准玉米粉飞食 (1 升含有77.7 克玉米粉, 32.19 克酵母, 10.6 克琼脂, 0.726 克cl 2), 31.62 克蔗糖, 63.3 克葡萄糖, 2 克山梨酸钾和15毫升 5% c8h8 o3).将食物充分混合, 在4°c 下过夜, 蒸发乙醇。
- 帕斯特雷尔基因分型
注: 据报道, pst基因的 s 或 r 等位基因在遗传背景中的存在影响了 drosila 34,35中的 dcv 感染. 有必要检查pst基因型, 特别是 dcv 感染。在pst中有一些可以影响病毒感染的 snps, 主要 snp 是 512c t。温度梯度 pcr 是一种快速识别pst基因型的方法。- 如上文所述 (步骤 1.2.4-1.2.15), 提取苍蝇基因组 dna。
- 使用100纳克的 dna 作为模板, 512c 引物, 5 ' cagcatggggggatagtctc 3 ' (正) 和 5 ' acggatgagagat 3 ' (反向) 检测 r 等位基因, 512C 引物, 5 ' cagcatgggggccagtagtt 3 ' (正向) 和 5 ' acggatcatgagat 3 ' (反向)s 等位基因。
- 将 tm (熔融温度) 梯度设置如下: 54°c、54.7°c、555°c、58°c、597°c、62.2°c、63.7°c 和 64°c (每个温度 45秒)。
注: 建议 pcr 链式反应的30个周期 (20μl 系统)。 - 用2% 琼脂糖凝胶电泳可视化-bp pcr 产物。
2.嗜酸性粒细胞的病毒感染
-
通过纳米注射感染苍蝇并进行生存检测。
- 拉毛细血管准备注射针, 用油回填注射针, 并组装前面所述的注射器 50.
- 在二氧化碳的光流下, 在垫子上麻醉苍蝇。通过胸腔内注射 44 50.6 nl 的病毒溶液 (100 pfu, 用 Tris-HCl 缓冲液稀释, ph 7.2) 接种苍蝇。注射至少3瓶苍蝇 (每瓶20只苍蝇)。
注: 注射是耗时的 (一般每小时100只苍蝇) 和 dcv 复制是非常迅速的, 所以它是非常重要的是写在管上的确切时间, 一旦完成每个小瓶 (20 苍蝇)。仅缓冲区注入设置为模拟控件。通常情况下, 雄性成年苍蝇是首选, 因为结果是更稳定和可复制的比使用女性时, 因为在交配和繁殖期间的荷尔蒙变化可能会影响女性读出51。 - 在正常的光/黑暗循环下, 在25°c、60% 的湿度下生长注射的苍蝇。每天供应新鲜食物的苍蝇, 并记录死蝇的数量。
- 执行至少3个生物复制并绘制生存曲线。
- 为了对生存数据进行统计分析, 利用统计软件生成卡普兰-梅耶尔生存曲线。执行日志排名测试来计算 p 值。在生存表中, 输入每个主题的信息。然后, 该软件计算每次存活率, 并绘制卡普兰-梅耶尔的生存图。
注: 不要在小瓶中添加额外的酵母。与模拟控制相比, 感染 dcv 的苍蝇偶尔会腹水, 而且笨手笨脚, 这使得它们容易受到粘稠酵母的影响。最好在初步实验中记录更多的时间点, 找出受感染苍蝇大规模死亡的时间框架。一般来说, 被感染的苍蝇很少在头两天内死亡, 即使是dcr-2突变线也是如此。对于免费的 wwolbachia w 1118 (bloomington 5905) 苍蝇感染了 100 pfu 的 dcv, 这个时间窗口是大约3-5天后感染。注射后0.5 小时内死亡的果蝇不应被视为死亡, 因为它们可能死于针头伤害, 而不是病毒感染。
-
cpe 法测定 dcv 负荷
注: 病毒负荷的测量类似于病毒库存的滴定 (步骤 1.1.6), 但需要额外的样品制备 (步骤 2.2.1-2.2.4)。- 第1天, 感染雄蝇, 如步骤 2.1.1 2.1.2 所述。小组以20人的小组注射苍蝇, 并在所需时间 (通常为24小时或 3天) 的时间内保持它们在新鲜苍蝇食物上的生长。每天为苍蝇提供新鲜的食物。
- 第2天, 种子五合子s2 * 细胞在一个10厘米的细胞培养盘, 密度约为 5x106至 1x107 细胞/ml, 如步骤1.1.1 所述。
- 第3天, 收集5只苍蝇 (在二氧化碳的光流下), 用均质机将它们磨成一个 1.5 ml 的离心管, 用200μl 的 tris 缓冲液和陶瓷珠进行30秒的研磨。将样品存放在-80°c, 或立即进入下一步。
- 彻底旋涡的样品。使用1毫升注射器和0.22μm 过滤器将上清液过滤到新的 1.5 ml 管中。按照步骤 1.1.6.1-1.1.6.5 中所述, 继续进行滴定。
-
用 qrt-pcr 测量 dcv 负荷
- 第1天, 如上文所述, 感染苍蝇。组注射雄性苍蝇 (20 苍蝇组), 并在新鲜苍蝇食物上生长所需的时间, 通常为24小时或3天。每天为苍蝇提供新鲜的食物。
- 第3天, 在带有200μl 裂解缓冲液和 20个陶瓷珠 (直径 = 0.5 mm) 的 1.5 ml 管中, 在二氧化碳的光流下采集5只苍蝇, 用高速均匀度研磨样品 30秒. 在每个管中加入800μl 额外的裂解缓冲液, 并储存样品在-80°c 时, 或立即进行 rna 提取和 qrt-pcr。
- 制备不含 rnase 的尖端、管和去电离、二乙基碳酸酯 (depc) 处理和0.22μm 膜过滤水。加入200μl 氯仿 (≥99.5%)到样品中, 用手大力摇晃15秒。在室温下孵化5分钟或更长时间, 直到水相和有机相明显分离。
注: 氯仿是极其危险的, 必须小心处理。不要对样品进行涡旋, 这会增加 dna 污染的风险。 - 在4°c 条件下, 以 13, 000 x g 离心样品15分钟。
- 收集400μl 的上清液, 并将上清液转移到新的管中。与相同体积的异丙醇 (≥99.5%) 混合, 手工轻轻倒置样品 20次, 然后在室温下沉淀10分钟或更长时间。
注:-20°c 的降水将增加 rna 产量。 - 在4°c 条件下, 以 13, 000 x g 离心样品10分钟。在试管底部可以看到白色 rna 颗粒。
- 丢弃上清液, 加入70% 乙醇 (depc 水中的乙醇) 1 毫升, 并多次倒置清洗 rna。
- 在4°c 条件下, 以 13, 000 x g 离心样品5分钟。丢弃上清液和干 rna 5-10;rna 应该变得透明。
- 在样品中加入50μl 的 depc 水, 将移液器加入几次, 并产生涡旋。
- 取3μl 的 rna 来滴定 rna 浓度。在260纳米的地方对 rna 进行定量。通常情况下, 该协议提取的 rna 浓度约为 100-500μμμμl, 适用于 cdna 合成。
- 使用2μg 的 rna 进行 cdna 合成。用 ddh2o将样品稀释至 100μl, 并在-20°c 下保存。
- 根据制造商的说明执行 qrt-pcr, 并运行 qrt-pcr。
注: 对于 dcv 的 cdna 合成, 随机引物的效果远远好于我们手中的保利 a 引物。dcv mrna 表达归一化为内源性核糖体蛋白 49 (rp49) mrna。本部分使用的寡核苷酸引物: rp49 5 ' agatgagggcccaag 3 ' (正向) 和 5 ' cacgaggattttgg 3 ' (反向);dcv, 5 ' tcatgggcattgtct 3 ' (正向) 和 5 ' cgcatactctctctg 3 ';vago, 5 ' tgacactactggggggtagc 3 ' (正向) 和 5 ' aattcccgggggttt 3 ' (反向);病毒诱导的 rna 1 (病毒-1) 5 "gatccatttccacacca3" (正向) 和 5 ' gattagggggggggccaa 3 ' (反向)。
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Representative Results
本节的结果是在 d. 黑色素瘤dcv 感染后获得的。图 1显示了嗜德维拉病毒感染的流程图。苍蝇被注射胸腔内, 然后采集样本测量病毒 tcid 50 和基因组 rna 水平 (图 1).病毒感染可诱导细胞裂解, 感染后3天观察到 cpe (图 2a)。cpe 检测仪测量的病毒负载与 qpcr 测量的病毒负载一致 (图 2b)。如图 3所示,沃尔巴奇亚抑制德索菲拉的dcv 感染。wol-16 rrna和wsp引物用于检测wol-16s的存在 (图 3 a),无 wol-16s苍蝇在 dcv 感染后的存活率显著下降 (图 3A)。图 4显示了如何使用特定引物使用梯度 pcr 来验证pst多态性。图 5显示了野生苍蝇中 dcv 感染的剂量依赖性影响。图 5a中的存活率和感染后3天的病毒负荷如图 5A所示。图 6显示 dcv 感染可以激活宿主52中的 dcr/rnai 和 jak/stat 抗病毒信号通路。感染后 3天, dcr/rnai 通路的报告基因vago表达水平升高 (图 6a)。jak-stat 通路也在 dcv 感染时被激活, 这表现在报告基因病毒-1的表达水平上 (图 6b)。图 7显示, dcr/rnai 途径对五代菌52的抗病毒感染至关重要。dcr-2突变苍蝇在 dcv 感染后存活率下降 (图 7a), 病毒负荷增加 (图 7A)。
图 1:食子体感染和病毒负荷分析流程图。
建立多孔注射感染的亲罗斯菌。图式图显示苍蝇在胸腔内被感染, 病毒负荷是通过 cpe 检测和 qrt-pcr 检测的。请点击这里查看此图的较大版本.
图2:dcv 负载分析。
cpe 检测仪检测的病毒载量与 qpcr 检测的病毒负载一致。(a) s2 * 细胞在25°c 下培养 3天, 使用不同的病毒稀释 (50μl)。1单位 tcid50的废旧病毒为 4.29 x10 9 (相当于 3 x10 9 pu l)。第一面板,10-3稀释;第二面板,10-7稀释;第三面板,10-10稀释;第四面板, 感染。第一和第二面板中的细胞显示典型的 cpe 阳性表型 (白色箭头表示细胞碎片), 第三和第四面板中的细胞显示典型的负表型。刻度柱在数字中显示。(b) 用 qpcr 测量 dcv 负载。对 dcv 进行连续10倍稀释, 并感染 s2 * 细胞系。提取受感染细胞的总 rna, 并进行 qpcr 测量 dcv rna 水平。细胞中的梯度病毒感染负荷 (通过 cpe 测定) 与 qpcr 测量 (r2= 0.999) 呈正相关。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 有或没有沃尔巴奇亚的苍蝇的病毒感染。
沃尔巴奇亚感染有助于在嗜德维拉的dcv 耐药。(a) 狼- 16s rrna 和 wsp引物检测到沃尔巴契亚的存在。g1、g2 和 g3 分别代表矿石苍蝇 (俄勒冈州-r)(bloomington 5) 分别用四环素治疗一、二、三代。pcr 产品的大小约为 200 bp (wol-16s rrna)和 600 bp (wsp)。(b)无狼苍蝇对 dcv 感染更敏感。3-5天, 成年雄性苍蝇被注射 100 pfu 的 dcv。与dcv 感染后的狼链保护苍蝇 (虚线) 相比,狼飞蝇的生存率明显下降。两种不同的野生动植物 线, 矿石 r 和w1118, 用于生存试验, 并显示出相似的结果。所有误差线表示至少三个独立测试的标准误差 (例如);* P<0.05、* * P<0.01、* * P<0.001、* * * P<0.0001、ns, 不显著。卡普兰–meier (b)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 通过梯度 pcr对 pastrel基因分型。
用梯度 pcr 验证了pst多态性。梯度 pcr 是为了区分嗜酸性粒细胞中的pst r (512c) 和 s (512C) 等位基因。tm 梯度为: 54°c, b:54.7°c, c:555°c, d:58°c, e:597°c, f:62.2°c, g:637°c, h.64°c。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:不同 剂量 dcv 感染的矿石苍蝇的存活率和 dcv 滴度。
矿石苍蝇注射三种不同剂量的 dcv、10只 pusuyfly、50 pusuy第imt 和 100 pusuyp/fly。(a) 如果感染了较高的感染剂量, 苍蝇的存活率要低得多。(b) 在指示时间用 qrt-pcr 测量表明苍蝇全身的 dcv rna 水平, 并归一化为 10个 pusu/苍蝇接种组。所有误差线表示至少三个独立测试的标准误差 (例如);* P<0.05、* * P<0.01、* * P<0.001、* * * P<0.0001、ns, 不显著。卡普兰–梅耶尔 (a) 或单向 anova (b)。请点击这里查看此图的较大版本.
图6:dcv 感染后激活的 dcr/rnai 和 jak/stat 抗病毒信号转导途径。
苍蝇感染了 100只 dcv 的 pfu。在感染后的指示时间点, 用 qrt-pcr 测量在全身表达的 vago (a) 和 vir-1 (b) mrna。在感染前, 表达式的变化被归一化为基础水平的变化。所有误差线表示至少三个独立测试的标准误差 (例如);* P<0.05、* * P<0.01、* * P<0.001、* * * P<0.0001、ns, 不显著。单向方差分析 (a, b)。请点击这里查看此图的较大版本.
图7:dcr-2 突变体对 dcv 感染敏感。
dcr-2 突变苍蝇及其基因控制w1118 头苍蝇感染了 100只 dcv pfu。(a) dcr-2有缺陷苍蝇和野生苍蝇 (w1118) 的存活率后 dcv 感染。(b) 在感染后2天内, 用 qrt-pcr 测量表明苍蝇全身的 dcv rna 水平, 并归一化为w 1118。所有误差线表示至少三个独立测试的标准误差 (例如);* P<0.05、* * P<0.01、* * P<0.001、* * * P<0.0001、ns, 不显著。卡普兰–meier (a) 或学生的 t 考试 (b)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这篇文章中, 我们提出了一个详细的程序, 如何建立一个病毒感染系统的成人果蝇使用纳米注射。这些协议包括准备适当的飞线和病毒储备、感染技术、评估感染指标和测量抗病毒反应。虽然 dcv 被用作病毒病原体的例子, 但数十种不同的病毒已成功地应用于食人鱼系统的研究。此外, 通过对苍蝇进行大规模筛查, 还发现了数百种监管因素, 无论是病毒还是宿主。因此, 这种方法适应性强, 不限于dcv/dr神菲拉相互作用。
要成功繁殖和收获高滴度 dcv, 必须采取一些预防措施。细胞应该是健康的, 培养在适当的密度和收获的时间。减少细胞培养量不会显著影响病毒滴度。通常情况下, 107名细胞感染 dcv 在 mois千万0.01 最终将产生约 10 8-109 tcid 50 的 dcv, 这可以满足大多数的体内和体外实验的要求. 该协议描述了用于病毒负荷测量的 cpe 检测和 qrt-pcr 检测方法。cpe 检测在某种程度上是棘手的。细胞接种的适当密度和有经验的阳性/负 cpe 鉴别标准允许快速和成功的 cpe 检测。因此, 我们在掌握 cpe 检测方法之前, 提供了一种简便的 qrt-pcr 检测方法, 以帮助确定 cpe 检测中的截止稀释点。
然而, dcv 是一种非常有效的病毒, 为成人苍蝇和果蝇细胞系。只有 100个 pusu/苍蝇接种可以在5天内杀死50% 的野生苍蝇。过量的感染剂量可能会掩盖野生苍蝇和潜在易感线之间的意义。启动新屏幕时, 至少要应用两种感染剂量是很重要的。由于 dcv 的高杀伤力, 在很短的时间内可能会发生大量死亡, 因此强烈建议在初步实验中更频繁地记录死亡次数。dcv 感染后, 一些苍蝇偶尔会出现腹水综合征。值得注意的是, 感染后0.5 小时内死亡的苍蝇应排除在外, 这可能是针头注射受伤造成的。
dcv 的感染强度也受到许多寄主因素的影响, 在开始实验之前应考虑这些因素。沃尔巴奇亚是一种垂直传播的内共生体, 对苍蝇的病毒感染有很大的影响。四环素治疗是一种常用的方法, 以消除狼人感染.然而, 这种方法也改变肠道微生物群的组成, 这反过来可能会影响抗病毒反应53。一些研究强调了遗传变异对病毒感染36的重要性,如ubc-e2h、 cg8492和pst。例如, 大多数野生类型的苍蝇线都有pst s 等位基因, 对类似皮节的病毒很敏感, 而我们在布卢明顿股票中心测试的大多数突变线都有pst r 等位基因, 因此具有耐药的表型。排除pst的影响是非常重要的, 特别是在筛选出与野生类型对照相比的耐药基因时.
除了纳米注射诱导全身病毒感染外, 还有其他方法可以研究苍蝇中的病毒感染。嗜食细胞系已被证明是一种高通量的方法, 以筛选出病毒感染相关的宿主细胞成分 37,38。然而,在体内确认时,体外系统总是伴随着高假阳性率。dcv 也可用于口服感染德索菲拉, 而它只能引发受限制和温和的感染。只有20% 的幼虫在12小时内被感染, 14% 的死亡率被观察到, 在20天内, 成年苍蝇的死亡率只有25% 22。使用0.15 毫米直径的引脚给苍蝇定价是另一种设置病毒感染的方法, 但它不能确保准确的感染剂量和定量重复性。通过在苍蝇中的基因操纵过度表达病毒蛋白是研究体内分子间细胞的好方法7。然而, 它可能不会描绘感染后宿主的生理和病理现实。同时, 纳米注射法也有缺点, 因为它不是感染的自然途径, 直接刺激感染后的强大系统免疫反应, 绕过角质层, 第一抗病毒防线。总之, 具体的研究目的和可用的实验条件是决定不同方法选择的因素。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢 ips 中的整个泛实验室。Cas。我们感谢王兰峰博士 (中国科学院 ips) 的实验协助和戈纳洛·科多娃·斯泰格博士 (斯普林格自然)、杰西卡·瓦尔加斯博士 (ips, 巴黎) 和朱生博士 (ips, 巴黎) 的评论。这项工作得到了中国科学院战略优先研究方案对 l. p (xda13010500) 和 h. t (xdb29030300)、中国国家自然科学基金至 l. p (338887 和 31870887) 和 j. y (31870887) 的资助。l. p 是中科院青年创新促进会会员 (2012083)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
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