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Neuroscience

Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche

doi: 10.3791/58870 Published: March 23, 2019

Summary

Ce protocole tant visuellement communique la préparation du tronc cérébral-moelle épinière et clarifie la préparation des tranches transversale du tronc cérébral d’une façon complète étape par étape. Il a été conçu pour accroître la reproductibilité et la probabilité d’obtenir des tranches viables, durables et rythmiquement actifs pour l’enregistrement de sortie neuronale des régions respiratoires du tronc cérébral.

Abstract

Mammifères rythme inspiratoire est généré à partir un réseau de neurones dans une région du bulbe rachidien appelé la preBötzinger complexe (pBC), produisant un signal conduisant à la contraction rythmique des muscles inspiratoires. Activité neuronale rythmique générée en pBC et transportés aux autres piscines neuronales au lecteur que la musculature de la respiration peut être étudiée en utilisant diverses approches, y compris en bloc nerf enregistrements et tranche transversale. Cependant, méthodes publiées antérieurement n’ont pas largement décrit le processus de dissection du tronc cérébral-moelle épinière de manière transparente et reproductible pour de futures études. Nous présentons ici une vue d’ensemble d’une méthode permettant de façon reproductible couper en tranches de tronc cérébral rythmiquement actifs contenant le circuit neuronal nécessaire et suffisant pour la production et de transmission entraînement inspiratoire. Ce travail s’appuie sur les précédents protocoles d’électrophysiologie de tronc cérébral-moelle épinière pour accroître la probabilité d’obtention fiable des tranches viables et rythmiquement actifs pour l’enregistrement de la sortie neuronale de la pBC, neurones prémoteur hypoglosse (XII pMN), et motoneurones hypoglosse (XII MN). Le travail présenté élargit les précédentes méthodes publiées en fournissant des illustrations détaillées, étape par étapes de la dissection, de chiot tout rat, à in vitro de tranches contenant les radicelles XII.

Introduction

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Le réseau de neurones respiratoire du tronc cérébral fournit un domaine fertile pour comprendre les caractéristiques générales des réseaux de neurones rythmiques. En particulier, l’intérêt est dans le développement de rongeurs nouveau-nés respirer et comprendre comment le rythme de la respiration se développe. Cela peut être fait en utilisant une approche à plusieurs niveaux, y compris en pléthysmographie animaux vivo, in vitro en bloc les enregistrements de nerf et in vitro couper les enregistrements qui contiennent le générateur de rythme de respiration. Réductionniste in vitro en bloc et tranche enregistrements constituent une méthode avantageuse à utiliser pour interroger les mécanismes derrière rythmogenèse respiratoire et des circuits neuronaux dans la région du tronc cérébral-moelle épinière, de développer des rongeurs. Le développement du système respiratoire comprend environ 40 types de cellules, caractérisés par le modèle, y compris ceux du centre respiratoire1,2de tir. Le réseau respiratoire central comprend un groupe de neurones rythmiquement actives située dans la medulla ventrolatérale rostrale1,3. Rythmogenèse respiratoire chez les mammifères est généré depuis une autorhythmic interneurone réseau baptisé le preBötzinger complexe (pBC), qui a été localisée expérimentalement par tranche tant en préparations de bloc de mammifères néonatale tronc cérébral-moelle cordons3,4,5,6,7,8. Cette région joue un rôle semblable au nœud sino-auriculaire (SA) dans le coeur et génère un système de chronométrage inspiratoire à la respiration en voiture. De la pBC, le rythme inspiratoire se fait dans d’autres régions du tronc cérébral (y compris le noyau moteur Hypoglosse) et spinal bassins de moteur (tels que les motoneurones phréniques qui animent le diaphragme)9.

L’activité rythmique peut-être être obtenue à l’aide de préparations de tronc cérébral la moelle épinière en bloc ou tranches de différentes populations de cellules, y compris les radicelles nerveuses de C3-C5, radicelles de nerf XII, noyau moteur hypoglosse (XII MN), les neurones prémoteur hypoglosse (XII pMN), et le pBC3,10,11,12. Bien que ces méthodes de collecte de données ont réussi, à travers une poignée de laboratoires, bon nombre des protocoles ne sont pas présentés d’une manière qui est parfaitement reproductible pour les nouveaux chercheurs entrant dans le champ. Obtention viable et rythmiquement actif en bloc et tranche préparations nécessite une attention aiguë aux détails à travers toutes les étapes de la dissection et la tranche coupe protocole. Précédents protocoles largement décrivent les diverses procédures d’enregistrement et électrophysiologie, mais manque de détail dans la partie la plus critique de l’obtention d’une préparation de tissu viable : effectuez la procédure de dissection et de la tranche du tronc cérébral-moelle épinière.

Efficacement obtention d’une préparation de bloc ou tranche rythmiquement active et viable en enregistrements d’électrophysiologie du tronc cérébral-moelle épinière exige que toutes les étapes correctement, soigneusement et rapidement (en général, l’ensemble de la procédure liée ici peut être effectué en environ 30 min). Des points critiques du protocole électrophysiologie du tronc cérébral-moelle épinière qui n’ont pas été préalablement bien décrites comprennent la dissection des radicelles nerveuses et la procédure de découpage en tranches sur le vibratome. Ce protocole est le premier à stepwise communiquer visuellement la dissection du tronc cérébral-moelle épinière pour les nouveaux chercheurs et experts en la matière. Ce protocole explique aussi bien les techniques chirurgicales, monuments et autres procédures afin d’aider les futurs chercheurs en normalisant les tranches et en bloc les préparations pour contenir les circuits exact désiré dans chaque expérience. Les procédures présentées ici peuvent être utilisés chez les chiots nouveau-nés rat et souris.

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Protocol

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Le protocole suivant a été accepté et approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Loma Linda. Lignes directrices des NIH pour le traitement éthique des animaux sont respectées dans toutes les expériences animales réalisées au laboratoire. Toutes les normes éthiques ont été accueillis par des individus effectuant ce protocole.

1. les solutions

  1. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF).
    1. Préparer le FSCA fraîche le soir avant une expérience en lots de 1 L à l’aide de ce qui suit recette : 7,250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g NaHCO3 (25 mM), 0,069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), g 0,247 MgSO4 • 7 H2 O (1,0 mM) et 5,410 g de D-glucose (30 mM), g 0,221 CaCl2 • 2 H2O (1,5 mM). Toujours ajouter en dernier le CaCl2 • 2 H2O.
    2. Dissoudre les composants dans 1 L d’eau déionisée. Remuer pendant 20-30 min.
    3. Mesurer le pH de l’aCSF et ajuster à 7,40 ± 0,02 à l’aide de petits volumes (typiquement < 0,5 mL) de NaOH, KOH ou HCl dilué.
      Remarque : FSCA préparé peut être conservé au réfrigérateur (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) jusqu'à trois jours avant que la croissance bactérienne affecte la viabilité du tissu pendant une expérience. 0,2 µm filtres permet de réduire la contamination par les champignons ou les bactéries présentes dans le laboratoire puisque les expériences peuvent durer jusqu'à 36 h. Pour l’efficacité, la recette FSCA décrite peut être transposée à des lots de 4 L suivant le même protocole et ce volume va durer jusqu'à trois jours d’expériences.

2. préparation de la Dissection et Vibratome Rig

  1. Mettre en place la lame.
    1. Utilisez une nouvelle à double tranchant des lames de rasoir pour couper des tissus sur un vibratome. Laver la lame avec 100 % d’éthanol et rincer à l’eau désionisée avant découpe ou claquer la lame dans la moitié et introduisez la lame dans la fixation pince sur le vibratome.
    2. Changer la lame chaque fois qu’une nouvelle préparation de tissu est montée sur le vibratome pour émincer ou si il s’enfonce dans la dalle de paraffine pendant le tranchage. Tout résidu de paraffine rendra presque impossible percer proprement le tissu neural néonatal.
  2. Mis en place la plaque de cire de paraffine.
    1. Utilisez n’importe quel style incorporation de paraffine. Posez 10 g d’incorporation des médias dans un bécher en verre tolérantes à la chaleur et feu doux pour faire fondre les perles de cire de paraffine liquide.
    2. Ajouter environ 0,5 g de poudre de graphite et de mélanger la solution complètement et uniformément dans la paraffine liquide.
    3. Utilisez une petite dalle en plastique comme substrat pour la paraffine. Couper un morceau de petit (0,5 - 1 cm d’épaisseur et environ 2 x 2 cm2 de large) en plastique (polycarbonate ou aluminium peut également être utilisé). Utiliser fichier de machiniste à gratter des rainures dans le plastique asthis veillera à ce que la paraffine adhère au plastique.
      Remarque : Également utiliser une seringue hypodermique chauffée 18 G pour réaliser des trous de l’angles dans la feuille afin de veiller à ce que le mélange de paraffine-graphite adhère au plastique.
    4. Utilisez le dos d’un coton-tige pour égoutter le mélange de paraffine-graphite sur le plastique en plongeant l’applicateur dans le mélange fondu de paraffine-graphite à plusieurs reprises, ruisselant de la boue sur le bloc en plastique et en créant la paraffine-graphite à environ 1,5 cm d’épaisseur sur le dessus de la matière plastique.
    5. Une fois qu’une couche suffisamment épaisse de la mélange de paraffine-graphite est déposée sur le bloc, la valeur du bloc côté cool et puis façonner pour accueillir la tronc cérébral-moelle épinière.

3. dissection et l’isolement de la Neuraxis

  1. Exécuter anesthetization et dissection initiale.
    Remarque :
    animaux utilisés dans cette étude peut varier en taille d’embryonnaire jour 18 (E18) à jour après la naissance de 10-20 et chez des souris ou des rats allant de E18 à jour après la naissance 5/6. Des rats ou des souris de souche, traitement ou entre les sexes peuvent être utilisés, selon le protocole expérimental. Effectuer les préliminaire dissection sous une hotte de laboratoire et anesthésie comme l’isoflurane est utilisé (0,25 mL dans une chambre de 25 mL).
    1. Peser le chiot et puis placez-le dans une chambre d’anesthésie contenant 0,25 mL d’isoflurane, placé sur une 2 x 2 pouces2 morceau de gaze. Après que l’animal atteint un plan chirurgical de l’anesthésie (vérifié par orteil pincée avec aucun réflexe de retrait), épingle l’animal sur une boîte de pétri remplie de paraffine ou silicone élastomère.
      Remarque : Rongeurs nouveau-nés peuvent également être anesthésiés via cryoanesthesia13,14, isoflurane vaporisation15, ou injection16 équilibré avec l’oxygène.
    2. Placez l’animale face ventrale vers le bas et faire une incision médiane de, juste derrière les yeux vers la région lombaire médian de la colonne vertébrale avec une lame de bistouri Swann-Morton n° 10 ou 11 ou ciseaux chirurgicaux. Tenir compte de la peau et la décérébration l’animal au niveau de la suture pariétale/occipital (voir Figure 1) et enlever la peau ensuite l’animal sous le diaphragme. Puis enlever le bras de coupe à l’articulation de l’épaule avec des ciseaux ou un scalpel.
    3. Une fois que la peau est enlevée, transférer l’animal dans une chambre de perfusion avec silicone elastomerin bas pour davantage de dissection et la préparation de la moelle épinière-tronc cérébral.
    4. Un réservoir aCSF (flacon de 500 mL-port latéral) de bulle en permanence avec frais (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) FSCA et oxygéner avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2 (également appelé « carbogen »). Au cours de la dissection, utilisez FSCA réfrigéré pour rincer périodiquement la chambre, fournissant frais oxygéné FSCA tout au long de l’isolement de la moelle épinière-tronc cérébral.
      Remarque : Globules rouges peut être vu dans les artères et les veines restantes et, lorsque suffisamment oxygénée, ce sont rouge vif.
    5. Permet d’écoulement par gravité perfusion par tube et un robinet, par intermittence ou en continu perfuse le tissu avec le FSCA oxygéné (bolus volume ou via lent goutte à goutte à l’aide d’un robinet, environ 0,5 - 1,0 mL/min). Il oxygène les tissus et tient à jour un champ clair chirurgical.
    6. Retirer les liquides excédentaires au besoin par le système de filtration d’aspiration sous vide.
    7. Effectuer la dissection à l’aide d’un microscope à dissection. Un modèle zoom continu est préférable pour permettre un réglage précis de grossissement et de permettre une visualisation optimale de la région d’intérêt au cours de chacune des étapes de la dissection.
      Remarque : Outils de microchirurgie recommandés comprennent un éventail de forceps tissue dentées, pince émoussée, #5 pinces forceps tissue inclinée, une gamme de ciseaux micro-dissection (printemps ciseaux) et insecte ordinaire et broches micro-dissection.
    8. Exposer la section cerveau via le ligne médiane du crâne le long de la suture sagittale puis fixer les volets réfléchies avec broches micro-dissection et épingler la colonne vertébrale à l’extrémité caudale au fond recouvert de silicone de la chambre de dissection à l’aide d’un G 27 aiguille.
      Remarque : Le reste de la dissection nécessite un microscope à dissection pour fournir la vue plus claire du tissu et des points de repère utilisés pour assurer le maximum de vraisemblance d’obtenir rythmique sortie fictive sur les radicelles crâniennes du tronc cérébral et les radicelles de la colonne vertébrale. Effectuez ces étapes de la dissection à l’aide de ciseaux de printemps moyenne ou ciseaux iris et pinces fines.
  2. Transférer rapidement le coffre isolé de l’animal à une chambre aérée de dissection. Placer la face dorsale du tissu vers le haut avec l’extrémité rostrale (cerveau) face à l’avant de la chambre. Épinglez le tissu aux épaules et une extrémité plus caudale de la moelle épinière.
    1. Faire une incision longitudinal à travers le crâne après la suture pariétale pour éviter d’endommager le cortex et tronc cérébral qui sous-tendent le crâne.
      Remarque : Tissu osseux néonatale n’est pas entièrement calcifié et est très fragile. Le tissu osseux/sera flexible dans une certaine mesure, mais plus résistant que le tissu musculaire et conjonctif environnant.
    2. Utilisez des ciseaux printemps ou iris moyens pour découper les sutures occipitales du crâne, commençant à la suture sagittale et latéralement. Cela va créer des « volets » du crâne qui peut être traduit et épinglé pour ancrer la partie rostrale du crâne et offrent une certaine stabilité au tissu (voir la Figure 2A).
    3. Après avoir réfléchi les rabats de crâne, coupées du reste du cortex cérébral, laissant la portion caudale du cervelet (vermis) relativement intacte (Figure 2B).
  3. Effectuer une laminectomie dorsale.
    1. Retirez la musculature entourant le crâne et la colonne vertébrale à l’aide de pinces et ciseaux micro printemps. Retirez le tissu le long de la face dorsale de la cage thoracique, laissant la cage thoracique intact, comme cela sera plus tard être épinglé pour ancrer le tissu pendant la laminectomie ventrale, minimisant les risques de dommages à la moelle épinière.
    2. Soigneusement snip loin les processus latérales des limbes vertébrales à l’aide de ciseaux de printemps moyenne ou ciseaux iris fine. Découper n’importe quel tissu recouvrant la pons et le bulbe rachidien. Le vermis, cervelet, pons et début de la moelle épinière sera désormais clairement visible (Figure 2C).
  4. Effectuer une laminectomie ventrale.
    1. Baissez la face dorsale du tissu et épingler sur la cage thoracique et l’extrémité plus caudale de la colonne vertébrale. Fixer la partie rostrale du tissu en utilisant les rabats du crâne (Figure 3A).
    2. Enlever la moitié ventrale de la cage thoracique, y compris le sternum et tous les organes abdominaux en utilisant les mêmes ciseaux et pinces. Disséquer les tissus mous à l’extérieur attaché à la cage thoracique, exposant les côtes et la moelle épinière (Figure 3B).
    3. Retirez la languette, oesophage, trachée, larynx et tous les d’autres tissus mous et musculature recouvrant la base du crâne et la colonne vertébrale (comme on le voit à la Figure 3C).
    4. Disséquer le tissu recouvrant la palette dure. Identifier la voûte palatine en plaçant une plaque rectangulaire d’os à la base du crâne avec une échancrure en forme de V là-dessus (Figure 3C). Découper le long de la ligne médiane du palais, soigneusement la soulever vers le haut et effectuer une transversale coupée pour l’enlever (Figure 4A).
    5. Commencer une laminectomie ventrale en enlevant les limbes exposant la surface ventrale du tronc cérébral et la moelle épinière de la première vertèbre cervicale à environ vertèbre thoracique 7 (T7) comme illustré à la Figure 4B.
    6. À ce stade, les radicelles ventrales sera visibles. À l’aide de petite micro-dissection ou des ciseaux de printemps, prenez soin de faire des coupes au plus près les limbes et aussi loin l’origine des racines à la moelle épinière que possible ; Évitez d’étirer les racines.
    7. Snip 5-10 mm sur les deux côtés de la colonne vertébrale dans les limbes. Ne pas couper trop près de la moelle épinière ou dans les vertèbres. Cette étape permet d’enlever la vertèbre cervicale et exposer la moelle épinière. Éviter de couper les radicelles.
    8. Snip radicelles environ 20-25 mm (bilatéralement) le long de la colonne vertébrale (environ T7). Tout au long de cette procédure, évitez la coupe dans la moelle épinière et manipuler les bords des vertèbres comme illustré à la Figure 4C.
    9. Supprimer les C1, C2 et C3 par soigneusement le bord rostral de chacune des vertèbres de levage et capture étroitement sous l’os. Le plus près de l’os que la coupe est faite, plus les radicelles. Utilisation accroché ou courbés pinces pour aider à atteindre une prise ferme sur chaque vertèbre cervicale tout en procédant à des réductions (Figure 4C).
    10. Une fois que la longueur désirée de la moelle épinière est isolée et dissection de la colonne vertébrale, faites une coupe transversale pour enlever la moelle épinière (Figure 5A etBde la Figure 5).
  5. Retirez la dure-mère.
    Remarque :
    l’isolée du tronc cérébral-moelle épinière peut être utilisée pour l’enregistrement en bloc in vitro, comme cela a été précédemment décrit3,7. Avec la tronc cérébral-moelle épinière retirée de la colonne vertébrale, la dure-mère doit être enlevée pour fournir un accès optimal pour électrodes d’aspiration effectuer des enregistrements de la coupe crânienne et la colonne vertébrale rootles. En outre, la suppression de la dure-mère rend possible proprement couper le tronc cérébral et obtenir rythmiquement actives fines tranches pour l’enregistrement in vitro.
    1. Soigneusement la goupille du tronc cérébral-moelle isolée cordon face dorsale tissu vers le haut pour permettre l’accès à la dure-mère qui entourent le crâne rootles (Figure 5B). Broches doivent être appliqués par le biais de la marge latérale du tronc cérébral, rostral pour les radicelles XII.
    2. Supprimer la dure-mère de la surface dorsale du tronc cérébral en soulevant le dura avec une pince fine (#5) à la marge dorsale de la dure-mère et taillés dans latérale-à-medial sur toute la longueur du tronc cérébral avec des ciseaux de printemps parfait. Veillez à éviter la coupe dans le tronc cérébral lui-même. Soulever les vaisseaux sanguins de la surface du tronc cérébral délicatement et couper pour éviter l’obstacle de la lame vibratome lorsque la section du tronc cérébral.
    3. Soigneusement disséquer dura des aspects médiales et latérales du tronc cérébral, car les radicelles de nerf crânien passent par la dure-mère et sont facilement arrachés loin quand la dure-mère est levée. Réduire au minimum la probabilité des radicelles étant retiré en coupant délicatement autour d’eux avec des ciseaux de petite source.
    4. Mettez la tronc cérébral-moelle épinière afin que la surface ventrale orientée vers le haut et les radicelles crâniennes sont clairement visibles. Disséquer la dure-mère de la face dorsale du tronc cérébral en soulevant doucement la dure-mère directement au-dessus de l’area postrema, coupe de rostral caudal. L’area postrema apparaîtra légèrement rosée en raison du grand nombre de microcapillaries perfusant cette région.
    5. Utiliser une fine broche insecte pour taquiner loin tout dura restant et de supprimer les vaisseaux sanguins restants à proximité de radicelles crâniens et cervicales.

4. protocole de la tranche

  1. Après avoir enlevé la dure-mère, placez le tronc cérébral dans le centre de la plate-forme de paraffine sur le bloc en plastique (ci-après dénommé le « bloc de coupe »). Épingler l’extrémité caudale du tronc cérébral par l’intermédiaire de la moelle épinière distal à l’aide de fines broches insectes qui ont été allégés et pas plus de 1 cm de longueur, comme illustré à la Figure 5C.
  2. Aligner le bloc de coupe recouverts de paraffine avec tronc cérébral épinglé dans le porte-bloc vibratome afin que la lame coupe perpendiculaire à la face rostrale du tronc cérébral.
  3. Faire une première tranche pour enlever les tissus étrangers, accidenté sur l’extrémité la plus rostrale. Cette découpe initiale peut être de 200-300 µm en général mais soigneusement éviter retrait de radicelles crâniens IX, X et XII. Cette étape vous révélera généralement la mesure caudale du noyau facial (VII) et les radicelles de nerf glossopharyngien et permet d’aligner le tronc cérébral, afin que son visage est nominale plane à la lame vibratome. Faire de petits ajustements nécessaires pour s’assurer par-planéité et faire de petites coupures pour enlever les tissus qui sont inégale.
    Remarque : Radicelles glosso-pharyngien (IX) sera visibles sur le bord latéral du tronc cérébral comme on coupe chaque tranche successive, et ceux-ci fournissent un point de repère pour la distance rostro-caudal et le nécessaire pour les activités génératrices de rythme des circuits neuronaux du tronc cérébral. Sur la face ventrale du tronc cérébral, les radicelles hypoglosse (XII) doivent aussi être visibles légèrement caudal à la face de coupe montrant les radicelles IX. Un point de repère final sera l’obex (le point dans le cerveau humain au cours de laquelle le quatrième ventricule se rétrécit pour devenir le canal central de la moelle épinière) sur la face dorsale du tronc cérébral. Avec ces trois points de repère visible, que le plan de coupe correct est établi (voir Figure 6A) et une tranche de rythmiquement actifs sera sûrement obtenue.
  4. Continuer la coupe rostral-à-caudale jusqu'à ce que les radicelles IX sont près de la surface de la face de coupe du tronc cérébral.
  5. Reportez-vous à la Figure 6 pour une orientation correcte et des monuments. Ajuster la paraffine-dalle dans la pince vibratome afin que l’angle suivant de transection créera une forme très légère « cale » à la tranche coupée et couper en tranches d’environ 100 à 200 µm jusqu'à ce que les repères décrits peuvent être clairement vus (Figure 6A).
    Remarque : Cette cale légère de coupe augmente le nombre de motoneurones XII capturé dans l’écaille et maximise la probabilité d’obtenir une activité rythmique pendant l’enregistrement. En utilisant les repères décrits (radicelles rostrales de la botte de nerf glosso-pharyngien, radicelles de la botte du nerf hypoglosse, l’obex) veillera à ce que la tranche contienne reproductible au moins une grande partie de la pBC (Figure 6B).
  6. Coupez une tranche de µm de 300-500 du tronc cérébral de ces marqueurs neuroanatomiques rostrales pour capturer le pBC et associés à des circuits de transmission.
    Remarque : Une tranche de « idéal » contiendra les radicelles plus rostrale du faisceau hypoglosse radicelle d’obtenir sûrement l’activité inspiratoire sans avoir recours aux enregistrements de surface en utilisant une électrode d’aspiration sur les locus transmettant/générant le rythme dans la tronc cérébral.

5. procédures d’enregistrement

  1. Placer la tranche dans une chambre d’enregistrement, perfuse en permanence avec le FSCA (0,5 à 1,0 mL/min) et utiliser des électrodes d’aspiration ou extracellulaires à l’activité de la population record des radicelles XII ou de la pBC, XII APF ou motoneurones XII. Pour les procédures d’enregistrement détaillé, voir les publications précédentes sur l’électrophysiologie du tronc cérébral-moelle épinière et le patch de serrage10,11.

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Representative Results

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La méthode présentée ici permet un chercheur intéressé à obtenir des tranches rythmiquement actives du tronc cérébral de façon reproductible et fiable couper une tranche viable et solide qui permettra d’enregistrer la production automobile fictive pendant plusieurs heures. Tous les éléments de circuits neuronaux au minimum nécessaire pour la production et de transmission rythme inspiratoire peuvent être capturées dans une fine tranche à l’aide de cette méthode. Ces éléments incluent : la preBötzinger complexe, prémoteur neurones projetant de neurones moteurs hypoglosse (pXII MNs) et les neurones moteurs hypoglosse (XII MNs) et nerf hypoglosse radicelles. Le pBC, Jacques et C4 radicelles nerveuses sont couramment utilisés pour les enregistrements de rythme inspiratoire, tel qu’illustré à la Figure 7.

Utilisation réussie de cette procédure va produire une préparation de bloc fr viable et rythmiquement active dans 10-15 min, ou une tranche active rythmiquement en < 30 min. Après l’isolement de la moelle du tronc cérébral en bloc ou une fine tranche, 15 min de l’équilibration dans la chambre d’enregistrement est suffisante pour la production de puissance moteur fictive. Dans le cas de la tranche, augmentant l’extracellulaire [K +] à environ 8-9 mM produira robuste commande neuromotrice qui peut durer pendant 24 à 36 h dans l’expérience de ce laboratoire. La préparation doit être continuellement superfusée avec carbogenated (95 % O25 % CO2) et chauffée aCSF (~ 27 ° C). Dissections réussies sont effectuées rapidement et éviter de pincer, étirement ou endommager les radicelles nerveuses utilisés pour les enregistrements. Pour des résultats optimaux, toutes les étapes de la procédure sont effectuées rapidement et le tissu doit être baigné ou continuellement perfusé avec carbogenated FSCA lors de l’exécution de la dissection et l’isolement de tissu (comme décrit ci-dessus). Pour plus de détails concernant la neuroanatomie et Atlas précis du tronc cérébral, s’il vous plaît voir les travaux de Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 et ses collègues. Le protocole présenté ici est une méthode qui s’est révélée fiable en laboratoire de l’auteur principal et ce rapport fournit une méthode graphique, étape par étape pour générer ces tranches en se fondant uniquement sur surfaces monuments visibles sur le tronc cérébral ou au sein de la tronc cérébral comme détaillé ici.

Figure 1
Figure 1 : Initiales de dissection pour l’extraction du tronc cérébral-moelle épinière. (A) chiot Anesthetized épinglé pour la dissection. Pointillés indiquent les lignes directrices incision sagittale incision dans la peau et transverse coupe caudale pour les yeux et en dessous du diaphragme. (B) Guide pour enlever la peau et des membres antérieurs d’un animal. (C) Dorsal aspect peau rongeur. Les lignes pointillées indiquent incision directives relatives à l’exposition « coquille » crâne-rabat. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les étapes de la laminectomie dorsale. (A) lignes pointillées indiquent les directives d’incision pour enlever le cerveau. (B) résultat après avoir enlevé les tissus. Lignes pointillées indiquent les directives d’incision pour laminectomie dorsale. Exposed (C) du tronc cérébral-spinal cord après laminectomie dorsale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Étapes de la dissection initiale ventrale. (A) la face ventrale d’un rongeur dépouillée avec dissociée du cerveau antérieur et de l’abdomen. Lignes pointillées indiquent les directives d’incision pour retirer le processus de xyphoid et l’ouverture de la cage thoracique pour enlever ensuite les organes de la cavité abdominale et thoracique. Organes de cavité abdominale et thoracique (B) enlevés. (C) les structures oropharyngée supprimés. Les lignes pointillées indiquent directives d’incision pour l’enlèvement de la voûte palatine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Étapes de la laminectomie ventrale. Palais dur (A) et autres pièces de crâne retirées. Incision directives indiquent comment faire pour supprimer les autres tissus entourant la tronc cérébral-moelle épinière. (B) première vertèbre cervicale (C1) exposé. (C) manifestation le levage C1 et faire une coupe transversale du corps vertébral de l’enlever. Nerfs sont soigneusement coupés ras de la face dorsale du corps vertébral avant de le retirer. C’est l’étape la plus critique dans la dissection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 5
Figure 5 : Préparation de tronc cérébral-moelle épinière pour émincer. C1-C3 (A) retiré de la moelle épinière. Lignes directrices incision indiquent où couper la tronc cérébral-moelle épinière de la moelle épinière caudale. (B) la face ventrale du tronc cérébral-moelle épinière avec radicelles nerveuses étiquetées. Incision directives indiquent transection recommandée ou autres structures rostrales à la ponto-médullaire avant l’enregistrement de la région du tronc cérébral-moelle épinière. Paraffine (C) le programme d’installation pour trancher sur le vibratome de dalle. La région de tranchage comprend le tissu entre les nerfs crâniens IX et XII. Ne placez pas de micro-pins dans la région de tranchage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 6
Figure 6 : Points de repère utilisés pour obtenir des tranches avec un noyau moteur hypoglosse intact et le complexe PreBötzinger. (A) vue transversale du tronc cérébral-moelle épinière après que coupe initiale a été déposée rostral pour les radicelles glosso-pharyngien (IX). Orientation de l’incision indique le niveau de transection juste caudale à l’hypoglosse radicelles (XII). (B) l’Orientation du bloc de paraffine lame avant de couper une tranche contenant la cirrhose biliaire primitive et le noyau hypoglosse moteur. Création d’une coupe de forme trapézoïdale « wedge » maximise la probabilité de capturer assez neurones inspiratoires dans la tranche d’obtenir l’activité rythmique pendant l’enregistrement. La cale comprendra le pBC, les neurones prémoteur hypoglosse et les motoneurones hypoglosse, qui fournissent collectivement les circuits nécessaires pour transmettre la rythmique drive, qui représente l’index de la rythmogenèse respiratoire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Enregistrements représentatifs des préparations de bloc ou tranche fr. (A) intégrée trace de radicelles XII. (B) trace intégrée de la pBC. Enregistrement de la pBC en utilisant une préparation de bloc en exigera un aveugle patch clamp de. (C) trace intégrée de la racine nerveuse de C4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Adapter le protocole présenté ici dans un bloc fr ou tranche workflow est avantageuse pour les laboratoires et études qui tient à utiliser soit en bloc du tronc cérébral-moelle épinière et/ou mince tranche de préparations pour des enregistrements de l’électrophysiologie. La méthode de dissection et tranche présenté, combinée à méthodes précédemment signalées par d’autres17,18,19, permettra la préparation reproductible de tissu robuste et viable qui est largement adaptable à un éventail de expériences à l’aide de la moelle épinière ou le cerveau postérieur rongeur. La dissection présentée est hautement détaillée et comprend la laminectomie dorsale et ventrale, mais aussi une vaste détail au sujet de l’orientation de la tronc cérébral-moelle épinière lors de la préparation à couper en tranches. Le protocole de dissection et tranche détaillé présenté permet au chercheur d’inclure tous les circuits nécessaires pour la production et la transmission du rythme inspiratoire. Les principales populations/structures neurales qui peuvent être capturées à l’aide de cette méthode incluent : les neurones prémoteur hypoglosse, le noyau hypoglosse moteur et la preBötzinger complexe. Remarque que les régions du tronc cérébral qui contiennent centrale CO2 capteurs ou les circuits de génératrices de rythme expiratoires (RTN/pFRG) ne sont pas incluses dans la préparation détaillée ici20,21. Une fois que la préparation de bloc fr ou tranche a été obtenue, l’activité rythmique peut-être être obtenue à l’aide d’électrodes d’aspiration, électrodes de surface ou méthodes d’enregistrement unicellulaire comme unité extracellulaire ou serrage patch méthodes3,10 ,11.

Le but du présent protocole est de fournir une méthode claire et facile à suivre pour générer une préparation tronc cérébral-moelle épinière ou une tranche mince, rythmiquement actifs. Ce protocole devrait être précieux pour les expérimentés et les nouveaux chercheurs qui s’intéressent à incorporer des préparations de la rythmique du tronc cérébral/tranches dans leur arsenal, qu’il sont a plusieurs étapes critiques détaillées dans les procédures qui facilitent la prise de robustes, reproductibles et durables tranches rythmiquement actives.

Une fois que le chercheur est devenu à l’aise avec d’identifier les repères anatomiques et les compétences nécessaires pour la dissection, augmentera la vitesse de la dissection et les procédures peuvent être optimisées pour chaque chercheur individuel. Le protocole détaillé ici a été enseigné à l’auteur principal (CGW) au cours de ses études postdoctorales avec Jeffrey Smith, l’auteur du tronc cérébral rythmique tranche préparation3. Afin d’assurer l’activité rythmique et la viabilité dans les tranches et en préparation de bloc, toutes les méthodes pour générer une tranche devraient être terminés dans environ 30 min du début de la procédure pour une tranche dans la chambre d’enregistrement. Avec perfusion continue, il y a très peu d’impact sur la viabilité des tissus mais minimisant le temps de dissection permet de plus longs enregistrements et d’acquisition de données. Pour les études respiratoires, une tranche qui est aussi mince qu’environ 280 µm épaisseur3 aura activité inspiratoire rythmique, robuste, mais tranches peuvent aller jusqu'à 550 µm17,18,19,22. Pratique attentive est nécessaire pour développer les compétences nécessaires pour effectuer cette procédure et de réduire la variabilité dans l’épaisseur et la position rostrale-caudale de chaque tranche. Inclure ou exclure certaines populations cellulaires influeront sur la qualité et la robustesse de l’activité rythmique obtenue en enregistrant plus tard comme noyaux excitatrices et inhibitrices dans le tronc cérébral peuvent influer sur la « qualité » du rythme enregistrée de la tranche 3.

Enfin, il est également essentiel que FSCA prépare exactement selon le protocole et est à un pH normalisé20, température et l’oxygénation. Anoxiques préparations ne sera pas actives rythmiquement et affecteront de collecte de données21.

Il y a plusieurs étapes clés dans la procédure qui facilitent une capture de l’enquêteur des préparations rythmiquement actives et viables. Au cours de la laminectomie ventrale, conservant la cage thoracique dorsale permet l’effet de levier supplémentaire et fournit plus de tissu pour sécuriser la préparation tout en effectuant l’isolement relativement délicat de la tronc cérébral-moelle épinière de la colonne vertébrale. La dissection étapes détaillées ici permettent au chercheur de facilement produire en bloc préparations ou fines tranches afin, par nécessité, des mesures supplémentaires sont détaillées qui peut être omise pour obtenir juste une fine tranche. Incluent d’autres conseils utiles, tout en effectuant la laminectomie ventrale, il est important d’avoir une prise ferme sur le corps vertébral pour la soulever vers le haut tout en coupant les radicelles nerveuses. Une fois que la tronc cérébral-moelle épinière a été disséquée et extraite, la dure-mère et la vascularisation restante doivent être disséqués hors de la surface du tissu neural. Les vaisseaux sanguins et dura sont difficiles et peuvent empêcher la lame de vibratome de couper une tranche propre. Dissection de la dure-mère n’est pas indispensable pour la préparation de bloc fr, mais est recommandée pour optimiser le couplage de l’électrode de nerf-aspiration. Enfin, la pratique méthodique et prudente dans l’utilisation de la vibratome est nécessaire pour couper une tranche propre et reproductible. Ce protocole prévoit une liste très complète de la procédure détaillée pour la dissection et la procédure de coupe. L’accent ici est de fournir une liste détaillée étape par étape pour un enquêteur à utiliser comme une base fiable et outil de formation d'où ils peuvent modifier les procédures de leur laboratoire selon les besoins.

Dans l’ensemble, cette méthodologie constitue une évolution de trente ans des méthodes d’électrophysiologie in vitro. La portée du présent document met l’accent sur la normalisation en bloc et émincer les enregistrements du tronc cérébral-moelle épinière qui sont généralement utilisés pour l’étude de l’activité inspiratoire en P0-P5 rats et les souris22. Toutefois, ce processus de dissection peut être utilisé dans un éventail de tailles animales, les âges et espèces pour une grande variété d’études, y compris la E18 rats/souris, rats néonatals et souris (0 à 6 jours) et chez la souris adulte. Les études à venir peuvent utiliser les méthodes présentées afin de rationaliser les protocoles à travers les espèces et l’âge, ce qui permet d’interroger les mécanismes dans la génération de rythme ou d’autres processus physiologiques à travers les espèces et l’âge des études. En fin de compte, changer l’orientation, l’épaisseur ou la localisation de la tranche ou en bloc préparation influera sur l’activité rythmique23. Abondante littérature a été publiée dans le passé concernant les populations neuronales capturé par des procédures de tranche et il y a un rat et souris atlas disponibles pour fournir plus de détails concernant les circuits neuronaux discuté ici24, 25,26. Les procédures présentées ici fournissent des détails vastes avec des illustrations claires qui permettent à un nouveau chercheur d’apprendre à couper les tranches de rythmiques de points de repère facilement visibles dans un laboratoire de dissection étendue.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

S.B.P est récipiendaire d’une bourse de recherche de Loma Linda University Summer Undergraduate.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche
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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).More

Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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