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Neuroscience

Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

doi: 10.3791/58870 Published: March 23, 2019

Summary

Dieses Protokoll sowohl visuell kommuniziert die Hirnstamm Rückenmark Vorbereitung und klärt die Vorbereitung der Hirnstamm quer Scheiben in umfassender Weise Schritt für Schritt. Es wurde entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erlangung lebensfähiger, lang anhaltender, rhythmisch aktiv Scheiben für die Aufzeichnung von neuronalen Ausgang aus der Atemwege Regionen der Hirnstamm.

Abstract

Säugetier-inspiratorische Rhythmus entsteht aus einem neuronalen Netzwerk in einer Region der Medulla namens der PreBötzinger Komplex (pBC), erzeugt ein Signal fahren die rhythmische Kontraktion der inspiratorischen Muskeln. Rhythmische neuronaler Aktivität in der pBC generiert und trug zu anderen neuronalen Pools zu fahren, die die Muskulatur der Atmung mit verschiedenen Ansätzen, einschließlich en bloc Nerv und quer Scheibe Aufnahmen untersucht werden kann. Jedoch haben bisher veröffentlichte Methoden nicht ausgiebig den Hirnstamm Rückenmark Dissektion Prozess transparent und nachvollziehbar für zukünftige Studien beschrieben. Hier präsentieren wir Ihnen einen umfassenden Überblick über eine Methode verwendet, um reproduzierbar rhythmisch-aktive Hirnstamm Scheiben, enthält die notwendige und hinreichenden neuronale Schaltkreise zur Erzeugung und Übertragung von inspiratorischen Laufwerk geschnitten. Diese Arbeit baut auf früheren Hirnstamm Rückenmark Elektrophysiologie Protokolle, die Wahrscheinlichkeit der Erlangung zuverlässig tragfähiger und rhythmisch-Active Scheiben für die Aufzeichnung von neuronalen Ausgang aus der pBC hypoglossal prämotorischen Neuronen (XII pMN), zu verbessern und Hypoglossal Motoneuronen (XII MN). Die vorliegende Arbeit baut auf früheren veröffentlichten Methoden durch den ausführliche, schrittweise Illustrationen der Dissektion, aus ganze Ratte Pup, in-vitro-Slice XII Würzelchen enthalten.

Introduction

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Die Atemwege neuronale Netz der Hirnstamm bietet eine fruchtbare Domain für das Verständnis der allgemeinen Eigenschaften von rhythmischen neuronalen Netzen. Insbesondere ist das Interesse an der Entwicklung des Neugeborenen Nagetier atmen und das Verständnis, wie der Atemrhythmus entwickelt. Dies ist möglicherweise mit einem mehrstufigen Ansatz, darunter in Vivo ganze Tier Plethysmographie, in-vitro-en bloc Nerv Aufnahmen gemacht und in-vitro-schneiden Sie Aufnahmen, die den Atem-Rhythmus-Generator enthalten. Reduktionistische in Vitro En Bloc und Scheibe Aufzeichnungen sind eine vorteilhafte Methode zu verwenden, wenn die Mechanismen hinter Atemwege Rhythmogenesis und neuralen Schaltkreis im Großraum Hirnstamm Rückenmark entwickeln Nagetiere zu verhören. Die Entwicklung Atemwege umfasst ca. 40 Zelltypen, gekennzeichnet durch Brennen Muster, einschließlich derjenigen der zentralen Atemwege1,2. Der zentrale Atemwege Netzwerk umfasst eine Gruppe von rhythmisch aktiven Neuronen befindet sich in der rostral ventrolateralen Medulla1,3. Säugetier-Atemwege Rhythmogenesis entsteht aus einer Autorhythmic lokalisiert Interneuron Netzwerk synchronisiert die komplexe PreBötzinger (pBC) wurde experimentell über Slice und En Bloc-Vorbereitungen des Neugeborenen Säugetieren Hirnstamm-spinalen Schnüre3,4,5,6,7,8. Die Region dient eine ähnliche Funktion wie der Sinusknoten (SA) im Herzen und erzeugt eine inspiratorische Timing-System auf Laufwerk Atmung. Aus der pBC erfolgt die inspiratorische Rhythmus in andere Regionen der Hirnstamm (einschließlich des hypoglossal motor Kerns) und spinale Motor-Pools (z. B. der Phrenicus Motoneuronen, die das Zwerchfell fahren)9.

Rhythmische Aktivität erhalten Sie mit Hirnstamm Rückenmark En Bloc Vorbereitungen oder Scheiben aus einer Vielzahl von Zell-Populationen, einschließlich C3-C5 Nerven Würzelchen, XII Nerven Würzelchen, hypoglossal motor Kern (XII-MN), hypoglossal prämotorischen Neuronen (XII pMN), und die pBC3,10,11,12. Während diese Methoden der Datenerhebung über eine Handvoll Laboratorien erfolgreich waren, sind viele der Protokolle nicht in einer Weise präsentiert, die für neue Forscher betreten des Feldes vollständig reproduzierbar ist. Lebensfähig und rhythmisch aktive En Bloc und Scheibe Vorbereitungen zu erhalten erfordert eine akute Liebe zum Detail durch alle Schritte der Präparation und Scheibe schneiden Protokoll. Frühere Protokolle ausführlich beschreiben die verschiedenen Aufnahme-Verfahren und Elektrophysiologie, doch fehlen Details in der wichtigste Teil der Erlangung einer lebensfähigen Gewebe Zubereitung: Durchführung des Hirnstamm Rückenmark Dissektion und Slice-Verfahrens.

Effizient erhalten eine rhythmisch-aktiv und tragfähige En Bloc oder Slice Vorbereitung Hirnstamm Rückenmark Elektrophysiologie Aufnahmen erfordert, dass alle Schritte korrekt, sorgfältig und zügig durchgeführt werden (in der Regel die ganze Prozedur zusammenhängen hier können in ca. 30 min durchgeführt). Kritische Punkte des Protokolls Hirnstamm Rückenmark Elektrophysiologie, die zuvor nicht gut beschrieben wurde sind die Zerlegung des Nerven Würzelchen und das slicing Verfahren auf der Vibratome. Dieses Protokoll ist die erste, der schrittweise visuelle Kommunikation der Hirnstamm Rückenmark Dissektion für neue Forscher und Experten auf dem Gebiet. Dieses Protokoll erklärt auch gründlich Operationstechniken, Sehenswürdigkeiten und andere Verfahren, künftige Forscher bei der Standardisierung von Scheiben und en bloc Vorbereitungen, um die exakte Schaltung in jedem Experiment gewünscht enthalten. Die hier vorgestellten Verfahren können in Ratte und Maus neugeborenen Welpen verwendet werden.

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Protocol

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Das folgende Protokoll wurde akzeptiert und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Loma Linda Universität. NIH-Leitlinien für die ethische Behandlung der Tiere folgen in alle Tierversuche im Labor durchgeführt. Alle ethischen Standards wurden von Personen, die Aufgaben dieses Protokolls bestätigt.

(1) Lösungen

  1. Bereiten Sie künstliche Liquor (ACFS).
    1. Bereiten Sie frische ACFS am Vorabend ein Experiment in 1 L Chargen unter Verwendung der folgenden Rezept: 7,250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g Nahco33 (25 mM), 0,069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), 0,247 g MgSO4 • 7 H2 O (1,0 mM), und 5,410 g D-Glucose (30 mM), 0,221 g CaCl2 • 2 H2O (1,5 mM). Immer fügen Sie zuletzt das CaCl2 • 2 H2O.
    2. Die Komponenten in 1 L entionisiertem Wasser auflösen. 20-30 min köcheln.
    3. Messen Sie den pH-Wert der ACFS und 7,40 ± 0,02 anpassen mit Kleinmengen (in der Regel < 0,5 mL) verdünnte NaOH, KOH oder HCl.
      Hinweis: Vorbereitete ACFS kann im Kühlschrank (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) gespeichert werden, drei Tage vor Bakterienwachstum Lebensfähigkeit des Gewebes während eines Experiments beeinflusst. Verwenden Sie 0,2 µm Filter, um Kontamination durch Pilze oder Bakterien im Labor zu reduzieren, da Experimente bis zu 36 Stunden anhalten können. Für Effizienz das ACFS Rezept beschrieben kann bis zu 4 L Chargen nach dem gleichen Protokoll skaliert werden und dieses Bandes dauert bis zu drei Tage von Experimenten.

2. Vorbereitung der Dissektion und Vibratome Rig

  1. Richten Sie Klinge.
    1. Verwenden Sie ein frisches zweischneidiges Rasierklingen für Schneiden von Gewebe auf ein Vibratome. Waschen Sie die Klinge mit 100 % Ethanol und mit entionisiertem Wasser spülen Sie, bevor schneiden oder fangen die Klinge in der Mitte und die Klinge in die Halterung einlegen auf der Vibratome festzuklemmen.
    2. Ändern Sie die Klinge, jedes Mal, wenn eine neue Gewebe-Vorbereitung auf die Vibratome zum Schneiden montiert ist oder wenn sie beim Schneiden in die Paraffin-Platte schneidet. Paraffin Rückstände machen es fast unmöglich, neonatale Nervengewebe sauber durchtrennt.
  2. Paraffin Wachsbad Platte eingerichtet.
    1. Verwenden Sie Einbettung Stil Paraffinwachs. 10 g der Einbettung von Medien in eine Hitze-toleranten Becherglas und mit schwacher Hitze die Paraffin-Wachs-Perlen Flüssigkeit schmelzen.
    2. Ca. 0,5 g Graphitpuder und mischen Sie Lösung gründlich und gleichmäßig in das flüssige Paraffin.
    3. Verwenden Sie eine kleine Kunststoff-Platte als Substrat für das Paraffin. Schneiden Sie ein Stück kleiner (0,5 - 1 cm dick und ca. 2 x 2 cm2 Breite) aus Kunststoff (Polycarbonat oder Aluminium kann auch verwendet werden). Verwenden des Maschinisten Datei zu kratzen Rillen in den Kunststoff Asthis sorgen dafür, dass das Paraffin an den Kunststoff hält.
      Hinweis: Alternativ können Sie eine beheizte 18 G Injektionsnadel legen abgewinkelten Löcher in das Blatt, um sicherzustellen, dass die Paraffin-Graphit-Mischung hält sich an den Kunststoff.
    4. Verwenden Sie die Rückseite von einem Baumwolle Spitze Applikator die Paraffin-Graphit-Mischung auf den Kunststoff Tropfen durch wiederholtes Eintauchen des Applikators in die geschmolzenen Paraffin-Graphit-Mischung, tropft die Gülle auf dem Kunststoffblock und Aufbau des Paraffin-Graphits ca. 1,5 cm Dicke auf den Kunststoff.
    5. Sobald eine ausreichend dicke Schicht von Paraffin-Graphit-Mischung auf den Block eingezahlt ist, setzen Sie den Block beiseite abkühlen lassen und dann zu gestalten, um den Hirnstamm Rückenmark unterzubringen.

(3) Dissektion und Isolierung von der Neuraxis

  1. Durchführen Sie anfängliche Präparation und Anesthetization.
    Hinweis:
    in dieser Studie verwendeten Tiere reichen in der Größe von embryonalen 18.Tag (E18) postnatale Tag 10-20 bei Mäusen oder Ratten von E18 bis hin zu postnatalen Tag 5/6. Ratten oder Mäusen von jeder Sorte, die Behandlung oder die Geschlecht können verwendet werden, abhängig von den experimentellen Design. Durchführen Sie Anästhesie und vorläufige Dissektion unter einem Abzug, da Isofluran (0,25 mL in einer 25 mL Kammer) verwendet wird.
    1. Wiegen Sie die Welpen und dann legen Sie es in einer Narkose-Kammer mit 0,25 mL Isofluran auf einem 2 x 2 Zoll2 Stück Gaze gelegt. Nachdem das Tier erreicht eine chirurgische Ebene der Anästhesie (verifiziert durch Zehe Prise mit keinen Rückzug-Reflex), Pin das Tier auf eine Petrischale mit Paraffin oder Silikon Elastomer gefüllt.
      Hinweis: Neonatale Nagetiere können auch über Cryoanesthesia13,14, Isofluran Verdampfung15, betäubt oder Injektion16 ausgewogen mit Sauerstoff.
    2. Legen Sie das Tier Bauchseite nach unten und machen Sie einen Mittellinie Einschnitt von direkt hinter den Augen in der Mitte des lumbalen Region der Wirbelsäule mit einer Skalpellklinge Nr. 10 oder 11 oder chirurgische Schere. Reflektieren die Haut und das Tier auf der Ebene der parietalen/okzipitalen Naht decerebrate (siehe Abbildung 1) und entfernen Sie die Haut vor dem Tier unterhalb des Zwerchfells. Dann entfernen Sie die Arme durch Schneiden am Schultergelenk mit einer Schere oder einem Skalpell.
    3. Sobald die Haut entfernt wird, übertragen Sie das Tier auf eine Perfusion Kammer mit Silikon Elastomerin den Boden für weitere Dissektion und Vorbereitung der Hirnstamm Rückenmark.
    4. Blase eine ACFS Reservoir (Seitenanschluss 500 mL-Flasche) kontinuierlich gekühlt (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) ACFS und Sauerstoff mit einer Mischung aus 95 % O2 und 5 % CO2 (auch genannt "Carbogen"). Die Dissektion Nutzungszeit gekühlte ACFS die Kammer bietet frisches sauerstoffreiches ACFS in Isolation von der Hirnstamm Rückenmark in regelmäßigen Abständen geleert.
      Hinweis: Roten Blutkörperchen in der restlichen Arterien und Venen zu sehen und, wenn ausreichend Sauerstoff sind leuchtend rot.
    5. Verwenden Sie Schwerkraft-Flow Perfusion über Schläuche und ein Absperrhahn, um zeitweise oder ständig Durchspülen Sie des Gewebes mit Sauerstoff angereichertes ACFS (Bolus Volumen oder über langsamen Tropf mit einem Absperrhahn, etwa 0,5 - 1,0 mL/min). Das sauerstoffhaltigen organischen Verbindungen des Gewebes und unterhält eine klare OP-Feld.
    6. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeiten, wie von Vakuum-Saug-Filtersystem benötigt.
    7. Führen Sie die Dissektion mit einem sezierenden Mikroskop. Feinjustierung der Vergrößerung ermöglichen und optimale Visualisierung der Region von Interesse bei jedem Schritt die Zerlegung ist ein stufenloser Zoom Modell bevorzugt.
      Hinweis: Mikrochirurgie Werkzeuge empfohlen beinhalten eine Reihe von verzahnten Gewebe Zange, stumpfe Pinzette, #5 Zangen, Zange abgewinkelt Gewebe, eine Reihe von Mikro-sezieren Schere (Frühjahr Schere) und regelmäßige Insekt und Mikro-sezieren Pins.
    8. Setzen den Gehirn über Mittellinie Abschnitt des Schädels entlang die sagittale Naht dann festnageln der reflektierten Klappen mit Mikro-sezieren Pins und pin der Wirbelsäule am kaudalen Ende der Silikon bedeckten Boden der Dissektion Kammer mit einem 27 G Nadel.
      Hinweis: Der Rest der Dissektion erfordert eine Dissektion Mikroskop zu den klarsten Blick auf des Gewebes und zur Sicherstellung der maximale Wahrscheinlichkeit der Erlangung rhythmische fiktiven Ausgabe auf der kranialen Würzelchen der Hirnstamm und Rückenmark Würzelchen Sehenswürdigkeiten zu bieten. Führen Sie diese Schritte für die Dissektion mit mittleren Frühling Schere oder Iris-Schere und feine Pinzette.
  2. Übertragen Sie umgehend den isolierten Stamm des Tieres auf eine belüftete Dissektion Kammer. Legen Sie die dorsalen Gewebeseite oben mit dem rostral Ende (Gehirn) auf der Vorderseite der Kammer. Heften Sie das Gewebe an den Schultern und am kaudalen Ende des Rückenmarks.
    1. Machen Sie einen Mitte-sagittalen Schnitt durch den Schädel nach der parietalen Naht zur Vermeidung von Schäden der Kortex und Hirnstamm zugrunde liegt des Schädels.
      Hinweis: Neonatale Knochengewebe ist nicht vollständig verkalkt und ist sehr spröde. Das Knochengewebe werden flexibel zu einem gewissen Grad, aber härter als das umgebende Binde- und Muskelgewebe.
    2. Verwenden Sie mittlere Feder oder Iris Schere, um die okzipitalen Nähte des Schädels, beginnend an der sagittale Naht und seitlich arbeiten zu schnippeln. Dadurch entsteht "Flaps" des Schädels, die reflektiert und fixiert um die rostral Teil des Schädels zu verankern und bieten einige Stabilität des Gewebes werden kann (siehe Abbildung 2A).
    3. Verlassen nach reflektieren die Schädel Klappen, schneiden Sie den Rest der Großhirnrinde, des kaudalen Teils des Kleinhirns (Vermis) relativ intakt (Abbildung 2B).
  3. Durchführen Sie dorsale Laminektomie.
    1. Die Muskulatur rund um die Schädel und Wirbelsäule mit Mikro Feder Schere und Zange zu entfernen. Entfernen von Gewebe an der dorsalen Seite des Brustkorbs, der Brustkorb intakt, wie dies später fixiert werden, um das Gewebe während der ventralen Laminektomie, wodurch das Risiko von Schäden des Rückenmarks zu verankern.
    2. Sorgfältig Schnipp entfernt die seitlichen Prozesse der Wirbelkörper Schichten mit einer Schere mittlere Feder oder feine Iris-Schere. Schneiden Sie jedes Gewebe über den Pons und Medulla. Die Vermis, Kleinhirn, Pons und Beginn des Rückenmarks werden nun deutlich sichtbar (Abbildung 2C).
  4. Durchführen Sie ventralen Laminektomie.
    1. Drehen Sie die Gewebe dorsalen Seite nach unten und pin am Brustkorb und am kaudalen Ende der Wirbelsäule. Fassen Sie die rostral Seite des Gewebes mit dem Schädel Klappen(Abbildung 3)aus.
    2. Die ventrale Hälfte des Brustkorbes, einschließlich des Brustbeins und alle Bauchorgane mit gleichen Schere und Zange zu entfernen. Sezieren Sie Weg Weichgewebe an den Brustkorb, die Freilegung der Rippen und des Rückenmarks (Abbildung 3B) angeschlossen.
    3. Entfernen Sie die Zunge, Speiseröhre, Luftröhre, Kehlkopf, und alle anderen weichen Gewebe und Muskulatur über der Basis des Schädels und der Wirbelsäule (wie in Abbildung 3C).
    4. Gewebe über die harte Palette zu sezieren. Identifizieren des harten Gaumens durch die Lokalisierung einer rechteckigen Platte Knochen an der Basis des Schädels mit einer V-Form Einzug auf (Abb. 3C). Schneiden Sie entlang der Mittellinie des Gaumens, sorgfältig nach oben heben und führen ein quer geschnitten, um es (Abb. 4A) zu entfernen.
    5. Zunächst eine ventrale Laminektomie entfernen Schichten aussetzen der ventralen Oberfläche der Hirnstamm und das Rückenmark aus der erste Halswirbel etwa Brustwirbel 7 (T7), wie in Abbildung 4Bdargestellt.
    6. In diesem Stadium werden die ventralen Würzelchen sichtbar sein. Mit kleinen Mikro-Dissektion oder Feder Schere, achten Sie darauf, möglichst nahe an die Schichten und so weit von Wurzeln Ursprung am Rückenmark wie möglich kürzen; Dehnung der Wurzeln zu vermeiden.
    7. Snip 5-10 mm beiderseits der Wirbelsäule bei der Schichten. Schneiden Sie nicht zu dicht an das Rückenmark oder in den Wirbeln. Dieser Schritt ermöglicht das Lösen der Halswirbel, das Rückenmark verfügbar zu machen. Vermeiden Sie, schneiden die Würzelchen.
    8. Schnipp Würzelchen ca. 20-25 mm (bilateral) entlang der Wirbelsäule (ca. T7). Während dieses Verfahrens zu vermeiden Sie schneiden ins Rückenmark und manipulieren Sie die Kanten der Wirbel wie in Abbildung 4Cdargestellt.
    9. C1, C2 und C3 durch sorgfältige heben die rostral Rand der einzelnen Wirbel und schnippeln eng unter den Knochen zu entfernen. Je näher die Knochen, dass der Schnitt gemacht wird, je länger die Darre. Verwenden Sie süchtig oder gebogen Pinzette zu Hilfe, erzielen einen festen Halt auf jedem Halswirbel und Kürzungen (Abb. 4C).
    10. Sobald die gewünschte Länge des Rückenmarks ist isoliert und von der Wirbelsäule seziert, machen Sie einen queren Schnitt des Rückenmarks (Abb. 5A und Abbildung 5B) entfernen.
  5. Dura Mater zu entfernen.
    Hinweis:
    der isolierte Hirnstamm Rückenmark kann für en bloc in-vitro-Aufnahme verwendet werden, wie zuvor beschrieben3,7wurde. Mit dem Hirnstamm-Rückenmark von der Wirbelsäule entfernt muss die Dura sorgen für optimaler Zugang für Saugelektroden auszuführenden Aufnahmen aus dem Schnitt kranialen und spinalen rootles entfernt werden. Entfernung der Dura ermöglicht darüber hinaus, sauber schneiden den Hirnstamm und rhythmisch aktive dünne Scheiben für in-vitro-Aufnahme zu erhalten.
    1. Sorgfältig rootles Pin der isolierten Hirnstamm-Rückenmark dorsal Gewebeseite bis Zugriff auf die Dura, rund um die kranialen (Abb. 5B). Stifte sollten über den Seitenrand der Hirnstamm, rostral zu XII Würzelchen angewendet werden.
    2. Entfernen Sie die Dura von der dorsalen Oberfläche der Hirnstamm durch Anheben der Dura mit feinen Pinzette (#5) am dorsalen Rand der Dura und von Lateral, Medial über die gesamte Länge der Hirnstamm mit feinen Feder Schere geschnitten. Achten Sie darauf, in den Hirnstamm selbst schneiden zu vermeiden. Heben Sie Blutgefäße aus dem Hirnstamm Oberfläche und geschnitten Sie, um die Behinderung der Vibratome Klinge zu vermeiden, wenn der Hirnstamm-Schnitt.
    3. Sezieren Sie Dura von den medialen und lateralen Aspekten der Hirnstamm, sorgfältig wie die Hirnnerven Würzelchen die Dura durchlaufen und sind einfach weggerissen, wenn die Dura angehoben wird. Minimieren Sie die Wahrscheinlichkeit, dass die Würzelchen wird durch sanft um sie herum mit einer kleinen Feder Schere schneiden abgezogen.
    4. Drehen Sie das Hirnstamm Rückenmark, so dass die ventrale Oberfläche nach oben zeigt und der kranialen Würzelchen deutlich sichtbar sind. Sezieren Sie die Dura von der dorsalen Seite der Hirnstamm durch leichtes Anheben der Dura direkt über der Area Postrema, Ablängen von rostral kaudalen. Die Area Postrema erscheint aufgrund der großen Anzahl von Mikrokapillaren Vorrichtung dieser Region leicht rosa.
    5. Verwenden Sie eine feine Insekt Pin zu necken entfernt alle verbleibenden Dura und restlichen Blutgefäße in unmittelbarer Nähe zum kranialen und zervikalen Würzelchen entfernen.

4. Scheibe Protokoll

  1. Nach dem Entfernen der Dura, legen Sie den Hirnstamm in der Mitte der Paraffin-Plattform auf dem Kunststoffblock (nachfolgend der "Schneidblock"). PIN-kaudalen Ende der Hirnstamm durch das distale Rückenmark mit feinen Insekt Pins, die auf nicht mehr als 1 cm in der Länge getrimmt wurde, wie in Abbildung 5Cgezeigt.
  2. Richten Sie das Paraffin bedeckten Schneidblock mit angehefteten Hirnstamm im Vibratome Block Halter so aus, dass die Klinge senkrecht auf die rostral Fläche der Hirnstamm schneidet.
  3. Machen Sie eine erste Scheibe, unebene, überflüssige Gewebe am Ende rostral-die meisten zu entfernen. Diesen ersten Schnitt kann 200-300 µm in der Regel jedoch sorgfältig vermeiden, Entfernung von IX, X und XII kranialen Würzelchen. Dieser Schritt wird in der Regel zeigen die Caudale Ausdehnung der Nucleus Gesichts (VII) und glossopharyngeus Würzelchen und macht es möglich, den Hirnstamm so ausrichten, dass sein Gesicht auf das Vibratome Messer Par-planar ist. Anpassungen Sie kleine Bedarf Par-Planität und sorgst kleine Kürzungen um Gewebe zu entfernen, die uneben ist.
    Hinweis: Glossopharyngeus (IX) Würzelchen werden sichtbar am seitlichen Rand der Hirnstamm, wie man jede aufeinanderfolgende Scheibe schneidet und diese bieten ein Wahrzeichen für den Rostro-kaudalen Abstand zu den Hirnstamm neuralen Schaltkreis notwendig für Rhythmus-Generation. Auf der ventralen Seite der Hirnstamm hypoglossal Würzelchen (XII) sollte auch sichtbar an der Schnittfläche zeigt IX Würzelchen leicht kaudalen. Eine endgültige Wahrzeichen werden die Obex (der Punkt im menschlichen Gehirn bei dem vierten Ventrikels verengt, um den Zentralkanal des Rückenmarks werden) auf der dorsalen Fläche der Hirnstamm. Mit diesen drei Punkten des Verweises sichtbar, die richtige Schnittebene wird gegründet (siehe Abb. 6A) und eine rhythmisch-Active-Scheibe wird zuverlässig erreicht.
  4. Weiter rostral-kaudalen schneiden bis IX Würzelchen nahe der Oberfläche von der Schnittfläche der Hirnstamm.
  5. Wahrzeichen und korrekte Ausrichtung finden Sie in Abbildung 6 . Paraffin-Platte in die Klemme Vibratome so einstellen, dass der nächste Winkel der Durchtrennung wird eine sehr geringe "Keilform" den geschnittenen Slice zu erstellen und Scheiben von ca. 100-200 µm geschnitten, bis die Sehenswürdigkeiten beschrieben werden können(Abbildung 6)deutlich zu erkennen.
    Hinweis: Dieser leichten Keil schneiden erhöht die Anzahl der XII Motoneuronen im Segment erfasst und maximiert die Wahrscheinlichkeit der Erlangung rhythmische Aktivität während der Aufnahme. Mit den Sehenswürdigkeiten beschrieben (rostral Würzelchen aus dem Glossopharyngeal Nervenbündel, Würzelchen aus dem Hypoglossal Nervenbündel, die Obex) wird sichergestellt, dass die Scheibe reproduzierbar mindestens einen Großteil der pBC (Abb. 6B) enthält.
  6. Schneiden einer 300-500 µm Scheibe Hirnstamm aus dieser rostral neuroanatomischen Marker, die pBC zu erfassen und die damit verbundenen Getriebe Schaltung.
    Hinweis: Ein "idealer" Slice enthält die meisten rostral Darre des Bündels hypoglossal Darre zuverlässig inspiratorische Aktivität zu erhalten, ohne Rückgriff auf Oberfläche Aufnahmen mit einer Saug-Elektrode über den Rhythmus-Generierung/Übertragung Loci innerhalb der Hirnstamm.

5. Aufnahme-Verfahren

  1. Legen Sie die Scheibe in einer Aufnahme Kammer, perfundieren Sie kontinuierlich mit ACFS (0,5 - 1,0 mL/min) und Saug oder extrazelluläre Elektroden Rekord Bevölkerung Tätigkeit aus dem XII Würzelchen oder vom pBC, XII PMNs oder XII Motoneurone. Detaillierte Erfassung Verfahren finden Sie unter vorherigen Veröffentlichungen am Hirnstamm Rückenmark Elektrophysiologie und patch-Klemmen10,11.

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Representative Results

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Die hier vorgestellte Methode ermöglicht einen Forscher interessiert, rhythmisch aktive Scheiben von Hirnstamm, zuverlässig und reproduzierbar eine tragfähige und robuste Scheibe abschneiden, die Aufnahme des fiktiven Motorleistung für viele Stunden ermöglichen. Alle die minimal erforderlichen neuronalen Schaltelemente zur Erzeugung und Übertragung von inspiratorischen Rhythmus kann in eine dünne Scheibe, die mit dieser Methode erfasst werden. Zu diesen Elementen gehören: der PreBötzinger Komplex, prämotorischen Neuronen projizieren die hypoglossal Motoneuronen (pXII MNs) und die hypoglossal motorischen Neuronen (XII MNs) und Hypoglossal Nerven Würzelchen. Die pBC, XIIn und C4 Nerven Würzelchen werden häufig für inspiratorische Rhythmus Aufnahmen verwendet, wie in Abbildung 7dargestellt.

Erfolgreichen Einsatz dieses Verfahrens erzeugt eine tragfähige und rhythmisch aktive En Bloc Vorbereitung in 10-15 min oder einer rhythmisch-Active-Scheibe in < 30 min. Nach Isolierung von der en bloc Hirnstamm Rückenmark oder eine dünne Scheibe ist 15 min von Gleichgewichtherstellung in der Aufnahme-Kammer für die Produktion von fiktiven Motorleistung ausreichend. Im Falle der Scheibe erzeugt erhöht die extrazelluläre [K +] ca. 8-9 mM robusten neuralen Antrieb, der für 24 bis 36 Stunden in das Labor Erfahrung dauern kann. Die Vorbereitung sollte kontinuierlich unterkühlte mit Carbogenated (95 % O25 % CO2) und beheizten ACFS (~ 27 ° C). Erfolgreiche Sezierungen erfolgen schnell und vermeiden Sie kneifen, Dehnung oder Beschädigung der Nerven Würzelchen für Aufnahmen verwendet. Für ein optimales Ergebnis alle Schritte des Verfahrens werden schnell ausgeführt und das Gewebe muss gebadet oder kontinuierlich mit Carbogenated ACFS durchblutet, bei der die Dissektion und Gewebe isoliert (wie oben beschrieben). Eine ausführliche Erläuterung bezüglich der Neuroanatomie und präzise Atlanten der Hirnstamm finden Sie in der Arbeit von Ruangkittisakul Et Al.13,14, Ballanyi15 und Kollegen. Die hier vorgestellten Protokoll ist eine Methode, die in der senior-Autor Labor bewährt hat und dieser Bericht enthält eine grafische, Schritt für Schritt Methode zur Erzeugung von diesen Scheiben bauend nur auf Oberflächen Wahrzeichen sichtbar auf dem Hirnstamm oder innerhalb der Hirnstamm als hier besprochen.

Figure 1
Abbildung 1 : Erste Präparation für die Extraktion der Hirnstamm Rückenmark. (A) Anesthetized Pup fixiert für Dissektion. Gestrichelte Linien zeigen Einschnitt Richtlinien für sagittale Inzision in Haut und quer schneidet kaudalen Augen und unterhalb des Zwerchfells. (B) Anleitung zum Entfernen von Haut und Vorderbeine aus Tier. (C) dorsalen Aspekt des dunkelhäutigen Nagetier. Gestrichelte Linien zeigen Einschnitt Richtlinien für Schädel-Klappe "Clamshell" Exposition. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Stadien der dorsalen Laminektomie. (A) gestrichelte Linien zeigen Einschnitt Leitlinien für das Entfernen des Cerebrums. (B) Ergebnis nach dem Entfernen von Gewebe. Gestrichelte Linien zeigen Einschnitt Leitlinien für die dorsale Laminektomie. (C) Exposed Hirnstamm-Spinal cord folgenden dorsalen Laminektomie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Phasen der ursprünglichen ventralen Dissektion. (A) Bauchseite einen dunkelhäutigen Nagetier mit abgetrennten Vorderhirn und Bauch. Gestrichelte Linien zeigen Einschnitt Leitlinien für das Entfernen des Xyphoid Prozesses und Eröffnung des Brustkorbs um anschließend Abdominal- und Thoraxchirurgie Hohlraum Organe zu entfernen. (B) Abdominal- und Thoraxchirurgie Hohlraum Organe entfernt. (C) oropharyngealen Strukturen entfernt. Gestrichelte Linien zeigen Einschnitt Leitlinien für die Entfernung des harten Gaumens. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Stadien der ventralen Laminektomie. (A) harten Gaumens und erhaltene Schädel Teile entfernt. Einschnitt Leitlinien anzugeben, wie verbleibenden Hirnstamm Rückenmark umgebende Gewebe zu entfernen. (B) erste Halswirbel (C1) ausgesetzt. (C) Demonstration auf Aufhebung C1 und einen queren Schnitt zu der Wirbelkörper zu entfernen. Nerven sind sorgfältig bündig an der dorsalen Seite des Wirbelkörpers abschneiden bevor Sie ihn entfernen. Dies ist der wichtigste Schritt in der Dissektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 5
Abbildung 5 : Vorbereitung der Hirnstamm Rückenmark zum Schneiden von. (A) C1-C3 aus Rückenmark entfernt. Einschnitt Leitlinien zeigen wo der Hirnstamm Rückenmark aus dem kaudalen Rückenmark zu durchtrennen. (B) Bauchseite der Hirnstamm Rückenmark mit beschrifteten Nerven Würzelchen. Einschnitt Leitlinien zeigen empfohlene Durchtrennung oder verbleibenden rostral Strukturen auf die Ponto-medullären vor der Aufnahme aus dem Hirnstamm Rückenmark-Region. (C) Paraffin Tafel Setup für das Schneiden auf der Vibratome. Die Slice Region umfasst Gewebe zwischen Hirnnerven IX und XII. Stellen Sie Mikro-Nadeln nicht in die slicing-Region. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 6
Abbildung 6 : Sehenswürdigkeiten für den Erhalt der Scheiben mit einem intakten hypoglossal motor Kern und PreBötzinger Komplex. (A) quer Ansicht der Hirnstamm Rückenmark nach ersten Schnitt rostral, glossopharyngeus (IX) Würzelchen gemacht wurde. Schnitt-Leitlinie gibt Durchtrennung nur kaudalen, hypoglossal (XII) Würzelchen. (B) Ausrichtung der Paraffinblock Klinge vor dem Schneiden ein Stück mit der pBC und Nucleus hypoglossal motor. Erstellen einen trapezförmigen "Keil" Form Schnitt maximiert die Wahrscheinlichkeit für den Fang von genügend inspiratorischen Neurone in dem Segment, rhythmische Aktivität während der Aufnahme zu erhalten. Der Keil wird gehören die pBC, die hypoglossal prämotorischen Neuronen und die hypoglossal Motoneuronen, die gemeinsam bieten die notwendige Schaltung zur rhythmischen Drive zu übermitteln, die ein Index der Atemwege Rhythmogenesis ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Repräsentative Aufnahmen von En Bloc oder Slice Vorbereitungen. (A) integrierte Spur von XII Darre. (B) integrierte Spur aus der pBC. Aufnahme von der pBC benötigen mit eine En-Bloc-Vorbereitung eine blinde Patch-Clamp. (C) integrierte Spur von C4 Nerven Darre. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Anpassung des Protokolls in einer En-Bloc hier vorgestellten oder Slice Workflow ist vorteilhaft für Labore und Studien, die möchten, nutzen Sie entweder en bloc Hirnstamm Rückenmark und/oder dünn schneiden Vorbereitungen für Elektrophysiologie Aufnahmen. Die Dissektion und Slice Methode vorgestellt, zusammen mit Methoden, die bereits von anderen berichtet17,18,19, ermöglicht reproduzierbare Vorbereitung der robusten und tragfähigen Gewebe, das ist allgemein anpassungsfähig an eine Reihe von Experimente mit dem Nagetier Hinterhirn oder Rückenmark. Die Dissektion präsentiert ist sehr detailliert und enthält dorsalen und ventralen Laminektomie sowie umfangreiche Details zur Ausrichtung der Hirnstamm Rückenmark bei der Vorbereitung auf Scheiben geschnitten. Das detaillierte Dissektion und Scheibe Protokoll präsentiert ermöglicht den Forscher, alle Schaltungen für die Erzeugung und Übertragung von inspiratorischen Rhythmus aufzunehmen. Die wichtigsten neuronalen Populationen/Strukturen, die mit dieser Methode erfasst werden können gehören: die hypoglossal prämotorischen Neuronen, Nucleus hypoglossal motor und komplexen PreBötzinger. Beachten Sie, dass Regionen der Hirnstamm, die zentrale CO2 -Sensoren oder exspiratorischen Rhythmus generierenden Schaltungen (RTN/pFRG) enthalten in der Vorbereitung nicht enthalten sind detailliert hier20,21. Sobald die En-Bloc-Vorbereitung oder Scheibe erreicht wurde, rhythmische Aktivität erhalten Sie mit Saugelektroden, Oberflächenelektroden oder einzellige Aufnahmemethoden wie extrazelluläre Einheit oder Patch-Klemmung Methoden3,10 ,11.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine klare, leicht verständliche Methode zur Erzeugung von entweder einer Hirnstamm Rückenmark Zubereitung oder eine dünne, rhythmisch-aktive Scheibe. Dieses Protokoll sollte wertvoll, um sowohl erfahrene als auch neue Forscher bei der Einbeziehung von rhythmischen Hirnstamm/Slice Vorbereitungen in ihrem Arsenal interessiert sein, da gibt es mehrere wichtige Schritte im Rahmen der Verfahren, die Einnahme zu erleichtern robust, reproduzierbare und lang anhaltende rhythmisch aktive Scheiben.

Wenn der Forscher bei der Identifizierung von der anatomischen Landmarken und die notwendigen Fähigkeiten für Dissektion vertraut hat, erhöht sich die Geschwindigkeit der Dissektion und die Verfahren können für jedes einzelnen Ermittler optimiert werden. Das Protokoll, hier wurde der senior-Autor (CGW) während seiner postdoktorale Arbeit mit Jeffrey Smith, der Begründer des rhythmischen Hirnstamm Slice Vorbereitung3unterrichtet. Um rhythmische Aktivität und Rentabilität in den Scheiben und En Bloc Vorbereitungen zu gewährleisten, sollten alle Verfahren um ein Stück zu generieren innerhalb von ca. 30 min von Beginn des Verfahrens ein Slice in der Aufnahme Kammer abgeschlossen sein. Mit kontinuierlicher Perfusion gibt es sehr wenig Wirkung auf Gewebe überleben aber minimiert die Zeit für die Dissektion ermöglicht eine längere Aufnahme und Datenerfassung. Für Atemwege Studien ein Stück, das so dünn wie etwa 280 µm dicken3 haben rhythmisch, robuste inspiratorische Aktivität, aber Scheiben reichen bis zu 550 µm17,18,19,22. Sorgfältige Praxis ist erforderlich, um die notwendigen Fähigkeiten führen Sie diese Schritte und minimieren die Variabilität in Dicke und rostral-kaudalen Position der einzelnen Segmente zu entwickeln. Mit oder ohne bestimmten Zellpopulationen beeinflusst die Qualität und Robustheit der rhythmischen Aktivität erwarb später Aufnahme wie erregenden und hemmenden Kerne im Hirnstamm die "Qualität" des Rhythmus aufgenommen von der Scheibe auswirken können 3.

Schließlich ist es auch entscheidend, dass ACFS ist genau nach Protokoll zubereitet und ist bei einem standardisierten pH-Wert20, Temperatur und Sauerstoffzufuhr. Anoxische Vorbereitungen werden nicht rhythmisch aktiv und wirken sich Daten Sammlung21.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in der Prozedur, die eine Ermittler-Erfassung von lebensfähigen und rhythmisch aktive Vorbereitungen zu erleichtern. Während der ventralen Laminektomie dorsal Brustkorb intakt zu halten erlaubt zusätzliche Hebelwirkung und bietet mehr Gewebe zur Sicherung der Vorbereitung während der Durchführung der relativ empfindlichen Isolierung der Hirnstamm Rückenmark von der Wirbelsäule. Die Dissektion, die hier beschriebenen Schritte, dass der Prüfer leicht produzieren En Bloc Vorbereitungen oder dünne Scheiben ermöglichen, so dass durch die Notwendigkeit, zusätzliche Schritte sind, die detaillierte kann weggelassen werden, um nur eine dünne Scheibe zu erhalten. Weitere nützliche Tipps enthalten, während der Durchführung der ventralen Laminektomie, es ist wichtig, einen festen Griff auf die Wirbelkörper, es nach oben zu heben, während die Durchtrennung des Nerven Würzelchen zu gewinnen. Sobald der Hirnstamm Rückenmark seziert und extrahiert wurde, müssen der Dura Mater und restlichen Gefäßsystem von der Oberfläche des neuronalen Gewebes indiziert. Blutgefäße und Dura sind hart und können verhindern, dass die Vibratome Klinge schneiden eine saubere Scheibe. Dissektion der Dura ist nicht entscheidend für die En-Bloc-Vorbereitung, aber wird empfohlen, die Nerv-Saug-Elektroden-Kupplung zu optimieren. Schließlich ist Sie vorsichtig und methodische Praxis im Umgang mit der Vibratome notwendig für eine saubere, reproduzierbare Scheibe schneiden. Dieses Protokoll bietet eine sehr umfangreiche Liste von detaillierten Schritte für die Dissektion und Zerspanungstechnik. Die Betonung liegt hier ist eine Schritt für Schritt detaillierte Liste für ein Ermittler, als ein zuverlässiges Fundament und Trainingsgerät, aus denen sie ihre Laborverfahren ändern können, je nach Bedarf, zu verwenden.

Als Ganzes stellt diese Methode eine dreißig Jahre der Entwicklung der Methoden der in-vitro-Elektrophysiologie. Der Anwendungsbereich dieses konzentriert sich auf die Standardisierung von en bloc und Hirnstamm Rückenmark Aufnahmen, die in der Regel verwendet werden, für das Studium inspiratorische Aktivität in P0-P5 Ratten und Mäuse22schneiden. Allerdings kann dabei Dissektion in einem Spektrum von tierischen Größen, Altersklassen und Arten für eine Vielzahl von Studien, darunter E18 Ratten/Mäuse, Neugeborenen Ratten und Mäuse (postnatale Tage 0 bis 6) und Erwachsenen Mäusen genutzt werden. Zukünftige Studien können die Methoden vorgestellt, um Protokolle über Arten und Altersklassen, straffen ermöglicht Untersuchungen zu Mechanismen in anderen physiologischen Prozess oder Rhythmus Generation über Arten und Altersklassen zu verhören verwenden. Letztlich, Änderung der Ausrichtung, Dicke oder Standort des Segments oder en bloc Vorbereitung rhythmische Aktivität23beeinflusst. Umfangreiche Literatur veröffentlicht wurden, in der Vergangenheit hinsichtlich der neuronalen Populationen von Slice-Verfahren erfasst und es gibt stereotaktischen Ratte und Maus Atlanten zur Verfügung, um mehr Details über die neuronalen Schaltkreise diskutiert hier24, 25,26. Die hier vorgestellten Verfahren bieten umfangreiche Details mit klaren Abbildungen, mit denen eine neue Ermittler zu lernen, rhythmische Scheiben von Sehenswürdigkeiten gut sichtbar unter einem Labor sezieren Rahmen geschnitten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

S.B.P ist ein Empfänger von einem Loma Linda University Summer Undergraduate Research Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-500
KCl Sigma Aldrich P5405-1KG
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1
NaH2PO4 •H2O Sigma Aldrch S9638-25G
CaCl2•2H2O Sigma Aldrich C7902-500G
MgSO4•7H2O Sigma Aldrich M7774-500G
D-Glucose Sigma Aldrich G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W AmScope H2L50-AY
Dissection Microscope Leica M-60
Vibratome 1000 Plus Vibratome W3 69-0353
Magnetic Base Kanetic MB-B-DG6C
Isoflurane, USP Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades Wilkinson 97573
Histoclear Sigma-Aldrich H2779
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Dumont #5/45 Forcep Fine Science Tools 11251-35
Scalpel Blades #10 Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Handel #3 Fine Science Tools 10003-12
Spring Scissors Straight  Fine Science Tools 15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight Fine Science Tools 11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight Roboz RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved Roboz RS-5621
Insect pins, 0 Fine Science Tools/8840604 26000-35 
Insect pins, 0, SS Fine Science Tools 26001-35
Insect pins, 00 Fine Science Tools 26000-30
Insect pins, 00, SS Fine Science Tools 26001-30
Insect pins, 000 Fine Science Tools 26000-25
Insect pins, 000, SS Fine Science Tools 26001-25
Minutien pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10
Minutien pins, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Minutien pins, 0.2 mm Fine Science Tools 26002-20
Fisher Tissue prep Parafin  fisher T56-5
Graphite  fisher  G67-500
Delrin Plastic  Grainger 3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle BD 305195

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References

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Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe
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Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).More

Palahnuk, S. B., Abdala, J. A., Gospodarev, V. V., Wilson, C. G. Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice. J. Vis. Exp. (145), e58870, doi:10.3791/58870 (2019).

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