Summary
Denne protokol både visuelt kommunikerer hjernestammen rygmarven forberedelse og præciserer forberedelse af hjernestammen tværgående skiver på en omfattende måde, trin for trin. Det var designet til at øge reproducerbarhed og øge sandsynligheden for at få levedygtigt, langtidsholdbare, rytmisk-aktive skiver til optagelse af neurale output fra regionerne respiratorisk af hjernestammen.
Abstract
Pattedyr inspiratory rytme er genereret fra en neuronal netværk i et område af medulla kaldt preBötzinger komplekse (pBC), som producerer et signal kørsel den rytmiske sammentrækning af inspiratory muskler. Rytmisk neurale aktivitet genereret i pBC og transporteres til andre neuronal puljer til drev muskulatur af vejrtrækning kan studeres ved hjælp af forskellige metoder, herunder blokoverførslen nerve optagelser og tværgående skive optagelser. Imidlertid har tidligere udgivne metoder ikke udførligt beskrevet hjernestammen rygmarven dissektion proces i en gennemsigtig og reproducerbar måde for fremtidige undersøgelser. Her præsenterer vi et samlet overblik over en metode til reproducerbar skåret rytmisk-aktive hjernestammen skiver indeholdende de nødvendige og tilstrækkelige neuronal kredsløb til at skabe og overføre inspiratory drev. Dette arbejde bygger på tidligere hjernestammen rygmarven Elektrofysiologi protokoller til at øge sandsynligheden for at pålideligt opnå rentable og rytmisk-aktive skiver til optagelse af neuronal output fra pBC, hypoglossal premotor neuroner (XII pMN), og hypoglossal motor neuroner (XII MN). Arbejde præsenteret udvider på tidligere offentliggjorte metoder ved at give detaljerede, trin for trin illustrationer af dissektion, fra hele rotte pup, at in vitro-skive indeholdende XII finrødder.
Introduction
Den respiratoriske neurale netværk af hjernestammen giver en frugtbar domæne for at forstå de generelle Karakteristik af rytmiske neurale netværk. Især er af interesse i udviklingen af neonatal gnaver vejrtrækning og forstå, hvordan vejrtrækning rytme udvikler. Dette kan være sker ved hjælp af en multi-niveau fremgangsmåde, herunder blokoverførslen nerve optagelser, vivo hele dyr plethysmography, in vitro- og in vitro-skive optagelser, der indeholder vejrtrækning rytme generator. Reduktionistiske i vitro en bloc og skive optagelser er en fordelagtig metode at bruge når spørgekriterierne mekanismerne bag respiratoriske rhythmogenesis og neurale kredsløb i hjernestammen-rygmarven regionen udvikle gnavere. Udvikle åndedrætssystemet indeholder ca 40 celletyper, karakteriseret ved at affyre mønster, herunder de centrale luftveje1,2. De centrale luftveje netværk omfatter en gruppe af rytmisk aktive neuroner beliggende i rostralt ventrolaterale medulla1,3. Pattedyr respiratorisk rhythmogenesis er genereret fra en autorhythmic interneuron netværk døbt preBötzinger complex (pBC), som er blevet lokaliseret eksperimentelt via både skive og en bloc præparater af neonatal pattedyr hjernestammen-spinal snore3,4,5,6,7,8. Denne region serverer en lignende funktion til noden sinoatrialt (SA) i hjertet og genererer en inspiratory timing system at drive respiration. Fra pBC udføres den inspiratory rytme til andre regioner i hjernestammen (herunder hypoglossal motoren kernen) og spinal motor pools (såsom de phrenic motoriske neuroner, der drive mellemgulvet)9.
Rytmisk aktivitet kan opnås ved hjælp af hjernestammen rygmarven en bloc præparater eller skiver fra en række forskellige cellepopulationer, herunder C3-C5 nerve finrødder, XII nerve finrødder, hypoglossal motoriske kerne (XII MN), hypoglossal premotor neuroner (XII pMN), og pBC3,10,11,12. Mens disse metoder til dataindsamling har haft succes på tværs af en håndfuld af laboratorier, er mange af protokollerne ikke præsenteret på en måde, der er fuldt reproducerbare for nye forskere ind i feltet. At få levedygtigt og rytmisk aktive en blok og skive præparater kræver en akut opmærksomhed for detaljer gennem alle trin i dissektion og skive skæring protokol. Tidligere protokoller udførligt beskrive de forskellige optagelse procedurer og Elektrofysiologi, men mangler detaljer i den mest kritiske del for at opnå en levedygtig væv forberedelse: udfører hjernestammen rygmarven dissektion og skive procedure.
Effektivt at opnå en rytmisk-aktiv og levedygtig en blok eller skive forberedelse hjernestammen rygmarven Elektrofysiologi optagelser kræver, at alle trin udføres korrekt, omhyggeligt og hurtigt (typisk, hele proceduren relateret her kan være udført i ca 30 min). Kritiske punkter i hjernestammen-rygmarven Elektrofysiologi protokol der ikke har været tidligere godt beskrevet omfatter dissektion af nerve finrødder og udskæring proceduren på vibratome. Denne protokol er først til trinvis visuelt kommunikere hjernestammen rygmarven dissektion for både nye forskere og eksperter på området. Denne protokol forklarer også grundigt kirurgiske teknikker, landemærker og andre procedurer at hjælpe fremtidige forskere med at standardisere skiver og blokoverførslen forberedelser til at indeholde den nøjagtige kredsløb ønskes i hvert forsøg. De procedurer, der er præsenteret her kan bruges i både rotten og musen neonatal unger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er blevet accepteret og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) i Loma Linda University. NIH retningslinjer for den etiske behandling af dyr, der er fulgt i alle dyreforsøg udføres i laboratoriet. Alle etiske standarder blev stadfæstet af personer udfører denne protokol.
1. løsninger
-
Forberede kunstige cerebral-spinalvæske (aCSF).
- Forberede friske aCSF om aftenen før et eksperiment i 1 L partier ved hjælp af følgende opskrift: 7.250 g NaCl (124 mM), 0.224 g KCl (3 mM), 2.100 g NaHCO3 (25 mM), 0.069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), 0.247 g MgSO4 • 7 H2 O (1.0 mM), og 5.410 g D-glucose (30 mM), 0.221 g CaCl2 • 2 H2O (1,5 mM). Altid tilføje CaCl2 • 2 H2O sidst.
- Opløses komponenterne i 1 L deioniseret vand. Omrøres i 20-30 min.
- Måle pH-værdien af aCSF og justere til 7.40 ± 0,02 ved hjælp af små mængder (typisk < 0.5 mL) fortyndet NaOH, KOH eller HCl.
Bemærk: Rede aCSF kan opbevares i køleskab (4 ° C, pH 7.40 ± 0,02) til tre dage før bakteriel vækst påvirker levedygtigheden af vævet under et eksperiment. Bruge 0,2 µm filtre til reduktion af kontaminering af svamp eller bakterier til stede i laboratoriet da eksperimenter kan vare op til 36 h. ACSF opskrift beskrevet kan skaleres til 4 L partier efter samme protokol for effektivitet, og dette volumen vil vare i op til tre dage af eksperimenter.
2. forberedelse af dissektion og Vibratome Rig
-
Oprette blade.
- Bruge en frisk tveægget barberblade til skære væv på en vibratome. Vask klinge med 100% ethanol og skyl med deioniseret vand før opskæring eller snapper kniven i halvdelen og indsætte vingen til montering klemme på vibratome.
- Ændre bladet, hver gang en ny væv forberedelse er monteret på vibratome til udskæring, eller hvis det skærer i paraffin slab mens udskæring. Enhver paraffin rester vil gøre det næsten umuligt at skære proper gennem neonatal neurale væv.
-
Oprette paraffinvoks slab.
- Bruge nogen embedding-stil paraffinvoks. Anbringes 10 g af indlejring medier i en varme-tolerant glas bægerglas og bruge svag varme til at smelte paraffin voks perler til væske.
- Tilføje ca. 0,5 g grafit pulver og blande løsning grundigt og ensartet i flydende paraffin.
- Bruge en lille plastik plade som substrat for paraffin. Skære en lille (0,5 - 1 cm tyk og ca. 2 x 2 cm2 bred) stykke plastik (polycarbonat eller aluminium kan også bruges). Bruge en maskinarbejder fil til scratch riller i plast asthis vil sikre, at paraffinen overholder plast.
Bemærk: Alternativt bruge en opvarmet 18 G kanyle til at placere vinklet huller i ark for at sikre, at paraffin-grafit blandingen overholder plast. - Bruge bagsiden af en bomuld spids applikator til at dryppe paraffin-grafit blandingen på plast ved gentagne gange at dyppe applikator i smeltet paraffin-grafit blanding, dryp gylle på plast blokken og bygning paraffin-grafit til ca. 1,5 cm i tykkelsen på toppen af plast.
- Når en tilstrækkelig tykke lag af paraffin-grafit mix er deponeret på blokken, indstille blok til side til at afkøle og derefter forme til at rumme hjernestammen-rygmarv.
3. dissektion og isolering af Neuraxis
- Udføre indledende dissektion og anesthetization.
Bemærk: dyr, der anvendes i denne undersøgelse kan variere i størrelse fra embryonale dag 18 (E18) til postnatal dag 10-20 i mus eller rotter spænder fra E18 til postnatal dag 5/6. Rotter eller mus for enhver stamme, behandling eller køn kan bruges, afhængigt af forsøgets udformning. Udføre anæstesi og foreløbige dissektion under et stinkskab, da isofluran anvendes (0,25 mL i et 25 mL kammer).- Vejer pup og derefter placere den i en anæstesi salen indeholdende 0,25 mL isofluran placeret på en 2 x 2 tommer2 stykke gaze. Når dyret når en kirurgisk flyet af anæstesi (kontrolleret af tå knivspids med ingen tilbagetrækning refleks), pin dyret på en petriskål fyldt med paraffin eller silikone elastomer.
Bemærk: Neonatal gnavere kan også blive bedøvede via cryoanesthesia13,14, isofluran fordampningsvarme15, eller indsprøjtning16 afbalanceret med ilt. - Placer den animalske ventrale side ned og gøre en midterlinjen indsnit fra lige bag øjnene i midten lænde regionen i rygsøjlen med nummer 10 eller 11 skalpel blade eller kirurgisk saks. Afspejler huden og decerebrate dyr på niveau med den parietale/occipital sutur (Se figur 1) og fjern skindet transecting dyret under mellemgulvet. Fjern derefter armene af skæring på skulderleddet med en saks eller en skalpel.
- Når huden er fjernet, skal du overføre dyret til en perfusion kammer med silikone elastomerin bunden for yderligere dissektion og forberedelse af hjernestammen-rygmarven.
- Boble en aCSF reservoir (500 mL side-port flaske) kontinuerligt med kølet (4 ° C, pH 7.40 ± 0,02) aCSF og oxygenat med en blanding af 95% O2 og 5% CO2 (også kaldet "carbogen"). Bruge kølet aCSF under dissektion, at periodisk flush kammer, leverer frisk iltet aCSF hele isolation af hjernestammen-rygmarven.
Bemærk: Røde blodlegemer kan ses i de resterende arterier og vener, og når tilstrækkeligt iltet, disse er lyse rødt. - Bruge grovhed-flow perfusion via rør og en stophane til periodisk eller konstant perfuse væv med iltet aCSF (bolus volumen eller via langsom drop ved hjælp af en stophane, ca 0,5 - 1,0 mL/min). Dette oxygenatorer væv og fastholder et klart kirurgiske felt.
- Fjern overskydende væske, som kræves af vakuum sug filtreringssystem.
- Udføre dissektion ved hjælp af en dissekere mikroskop. En kontinuerlig zoom model er foretrukket at tillade finjustering af forstørrelse og giver mulighed for optimal visualisering af det pågældende område under hvert trin af dissektion.
Bemærk: Mikrokirurgi værktøjer anbefales omfatter en række tandede væv pincet, stump pincet, #5 pincet, vinklet væv pincet, en række mikro-dissekere saks (foråret saks), og regelmæssig insekt og mikro-dissekere pins. - Udsætte hjernen via midterlinje del af kraniet langs den sagittal sutur derefter pin ned de reflekterede klap med mikro-dissekere pins og pin rygsøjlen enden caudale i silikone-dækket bunden af dissektion kammeret ved hjælp af en 27 G nål.
Bemærk: Resten af dissektion kræver en dissektion mikroskop til at give den klareste opfattelse af væv og vartegn bruges til at sikre maksimal sandsynligheden for at opnå rytmiske fiktive output på de kranielle finrødder af hjernestammen og spinal finrødder. Udfør disse trin af dissektion ved hjælp af medium foråret saks eller iris saks og fine pincet.
- Vejer pup og derefter placere den i en anæstesi salen indeholdende 0,25 mL isofluran placeret på en 2 x 2 tommer2 stykke gaze. Når dyret når en kirurgisk flyet af anæstesi (kontrolleret af tå knivspids med ingen tilbagetrækning refleks), pin dyret på en petriskål fyldt med paraffin eller silikone elastomer.
- Straks overføre isolerede stammen af dyret til en beluftet dissektion kammer. Læg den dorsale side, væv op med den rostralt ende (hjernen) vender mod forsiden af salen. PIN væv i skuldre og mest caudale slutningen af rygmarven.
- Gøre en midten af sagittal snit gennem kraniet efter den parietale sutur at undgå at beskadige cortex og hjernestammen underliggende kraniet.
Bemærk: Neonatal knoglevæv er ikke fuldt forkalket og er meget skrøbelig. Knoglevævet bliver fleksibelt til en vis grad, men hårdere end de omkringliggende bindevæv og muskelvæv. - Bruge medium foråret eller iris saks til snip occipital suturer af kraniet, begynder ved den sagittal sutur og arbejder sideværts. Dette vil skabe "flapperne" af kraniet, der kan reflekteres og fastgjort til at forankre den rostralt del af kraniet og give nogle stabilitet til væv (Se figur 2A).
- Efter afspejler kraniet flaps, afbrød resten af hjernebarken, forlader den caudale del af lillehjernen (vermis) relativt intakt (figur 2B).
- Gøre en midten af sagittal snit gennem kraniet efter den parietale sutur at undgå at beskadige cortex og hjernestammen underliggende kraniet.
- Udføre dorsale laminectomy.
- Fjerne muskulaturen omkring kraniet og rygsøjlen ved hjælp af mikro foråret saks og pincet. Fjern væv langs den dorsale side af brystkassen, forlader brystkassen intakt, da dette vil være fastgjort senere for at forankre vævet under den ventrale laminektomi, minimere chancen for beskadigelse af rygmarven.
- Omhyggeligt snip væk de laterale processer af vertebrale bladplader ved hjælp af medium foråret saks eller fine iris saks. Skåret væk væv overliggende pons og medulla. Vermis, lillehjernen, pons og begyndelsen af rygmarven bliver nu klart synlige (fig. 2C).
- Udføre ventrale laminectomy.
- Drej væv dorsale side og pin i brystkassen og mest caudale slutningen af rygsøjlen. PIN den rostralt side af væv ned ved hjælp af kraniet flapper (fig. 3A).
- Fjerne den ventrale halvdel af brystkassen, sternum og alle abdominale organer ved hjælp af samme saks og pincet. Dissekere lager bløde væv tilsluttet brystkassen udsætte ribben og rygmarven (fig. 3B).
- Fjerne tungen, spiserøret, luftrør, strubehovedet, og alle bløde væv og muskulatur overliggende bunden af kraniet og rygsøjlen (som det ses i figur 3C).
- Dissekere vævet overliggende den hårde Palle. Identificere den hårde gane ved at placere en rektangulær plade af knoglen i bunden af kraniet med en V-form indrykning på det (figur 3C). Skær langs midterlinjen af ganen, forsigtigt løfte det opad, og udføre et tværsnit for at fjerne den (figur 4A).
- Begynde en ventrale laminektomi ved at fjerne bladplader udsætter den ventrale overflade af hjernestammen og rygmarven fra den første halshvirvel ca thorax ryghvirvel 7 (T7) som det ses i figur 4B.
- På dette stadium bliver de ventrale finrødder synlige. Ved hjælp af små micro-dissektion eller foråret saks, sørge for at nedskæringer så tæt på bladplader og så langt fra rødderne oprindelse på rygmarven som muligt; undgå at strække rødderne.
- Snip 5-10 mm langs begge sider af rygsøjlen på bladplader. Kan ikke skære alt for tæt på rygmarven eller i ryghvirvler. Dette trin giver mulighed for fjernelse af halshvirvler at eksponere rygmarven. Undgå at skære finrødder.
- Snip finrødder ca 20-25 mm (bilateralt) langs hvirvelsøjlen (ca T7). I hele denne procedure undgå opskæring i rygmarven og manipulere kanterne af ryghvirvler som det ses i figur 4C.
- Fjern C1, C2 og C3 ved forsigtigt løfte den rostralt kant af hver af hvirvlerne og snipping tæt nedenunder knoglen. Jo tættere knoglen at snittet er lavet, jo længere rootlet. Brug hooked eller bøjet pincet til hjælp for at opnå et fast greb på hver halshvirvel mens nedskæringer (fig. 4C).
- Når den ønskede længde af rygmarven er isoleret og dissekeret fra rygsøjlen, foretage en tværgående snit til at fjerne rygmarv (figur 5A og figur 5B).
- Fjerne dura mater.
Bemærk: isoleret hjernestammen-rygmarven kan anvendes til blokoverførslen in vitro-optagelse, som det har været tidligere beskrevet3,7. Med hjernestammen-rygmarven fjernet fra rygsøjlen, skal dura fjernes for at give optimal adgang til suge elektroder til at udføre optagelser fra cut kraniel og spinal rootles. Derudover gør fjernelse af dura det muligt at rent skær hjernestammen og opnå rytmisk aktive tynde skiver til in vitro-optagelse.- Omhyggeligt rootles pin den isolerede hjernestammen-spinal ledning væv dorsale side op for at give adgang til dura omkring den craniale (figur 5B). Pins bør anvendes gennem den laterale margin af hjernestammen, rostralt for XII finrødder.
- Fjern dura fra den dorsale overflade af hjernestammen ved at løfte dura fine pincet (#5) på den dorsale margin af dura og skære fra lateral til mediale i hele længden af hjernestammen med fine foråret saks. Vær omhyggelig med at undgå at skære ind i hjernestammen, selv. Forsigtigt løfte blodkar fra hjernestammen overflade og skåret til at undgå hindring af vibratome bladet ved skæring i hjernestammen.
- Omhyggeligt dissekere dura fra de mediale og laterale aspekter af hjernestammen, som kranienerver finrødder passerer gennem dura og er nemt revet væk når dura er ophævet. Minimere sandsynligheden for finrødder bliver trukket ved at forsigtigt skære omkring dem med små foråret saks.
- Flip hjernestammen-rygmarven, således at den ventrale overflade vender opad og de kranielle finrødder er klart synlige. Dissekere dura fra den dorsale side af hjernestammen ved forsigtigt at løfte dura direkte over det område postrema, skære fra rostralt til caudale. Det område postrema vises lidt lyserøde på grund af det store antal microcapillaries perfusing denne region.
- Brug en fin insekt pin til at tirre væk enhver resterende dura og fjerne resterende blodkar i umiddelbar nærhed af kraniel og cervikal finrødder.
4. skive protokol
- Efter fjernelse af dura, skal du placere hjernestammen i midten af paraffin platform på plastik blok (i det følgende benævnt "skære blokken"). PIN den caudale slutningen af hjernestammen gennem distale rygmarven ved hjælp af fine insekt pins, der er blevet trimmet til ikke mere end 1 cm i længden, som vist i figur 5C.
- Justere paraffin-dækket skære blokken med fastgjorte hjernestammen i vibratome blok indehaveren, så klingen skærer vinkelret på rostralt ansigtet af hjernestammen.
- Gøre en indledende udsnit til at fjerne den ujævn, fremmed væv i den rostralt-mest ende. Denne første klip kan være 200-300 µm typisk men omhyggeligt undgå fjernelse af IX, X og XII kraniel finrødder. Dette trin vil typisk afsløre det caudale omfanget af facial kernen (VII) og glossopharyngeal finrødder og gør det muligt at justere hjernestammen, så dens ansigt er par-planar til vibratome blade. Foretage små justeringer som nødvendigt for at sikre PARI-stjernebilleder og laver små stykker til at fjerne væv, der er ujævn.
Bemærk: Glossopharyngeal (IX) finrødder vil være synlig på den laterale kant af hjernestammen, som man skærer hver successive skive, og disse giver et vartegn for rostro-caudale afstanden til hjernestammen neurale kredsløb nødvendige for rytme-generation. Den ventrale side af hjernestammen, de hypoglossal finrødder (XII) bør også være synlig lidt caudale til cut ansigt viser IX finrødder. En sidste milepæl bliver obex (punkt i den menneskelige hjerne, hvor den fjerde ventrikel indsnævres til at blive den centrale kanal af rygmarven) på den dorsale ansigt af hjernestammen. Med disse tre holdepunkter synlige, det korrekte beskæringsplanet er etableret (Se fig. 6A) og en rytmisk-aktive skive opnås pålideligt. - Fortsætte skæring rostralt til caudale IX finrødder er nær overfladen af den afskårne ansigt af hjernestammen.
- Se figur 6 for vartegn og korrekte orientering. Justere paraffin-plade i vibratome klemmen, så den næste vinkel af transection vil skabe en meget lille "kile" form til at skære skive og skære skiver af ca 100-200 µm indtil vartegn beskrevet kan være tydeligt ses (fig. 6A).
Bemærk: Skære denne lille kile øger antallet af XII motoriske neuroner fanget i Skive og maksimerer sandsynligheden for at opnå rytmisk aktivitet under optagelsen. Ved hjælp af vartegn beskrevet (rostralt finrødder fra glossopharyngeal nerve bundt, finrødder fra hypoglossal nerve bundt, obex) vil sikre, at udsnittet reproducerbar indeholder mindst en stor del af pBC (fig. 6B). - Skåret en 300-500 µm udsnit af hjernestammen fra disse rostralt neuroanatomical markører til at fange pBC og tilhørende transmission kredsløb.
Bemærk: En "ideel" slice vil indeholde de mest rostralt rootlet af hypoglossal rootlet bundle til pålideligt opnå inspiratory aktivitet uden at ty til overflade optagelser ved hjælp af en suge elektrode over de rytme-genererer/fremsendende loci inden for den hjernestammen.
5. optage procedurer
- Placer udsnittet i en optagelse kammer, perfuse løbende med aCSF (0,5 - 1,0 mL/min.) og bruge suge eller ekstracellulære elektroder til at optage befolkning aktivitet fra XII finrødder eller pBC, XII PMNs eller XII motoneurons. For detaljeret optagelse procedurer, se tidligere publikationer på hjernestammen rygmarven Elektrofysiologi og lappe fastspænding10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden præsenteres her tillader en forsker interesseret i at opnå rytmisk aktive skiver af hjernestammen til reproducerbar og pålideligt skære en levedygtig, robust skive, der giver mulighed for optagelse af fiktive motor output i mange timer. Alle de minimalt nødvendige neurale kredsløbselementer til at skabe og videregive inspiratory rytme kan blive fanget i en tynd skive ved hjælp af denne metode. Disse elementer omfatter: preBötzinger kompleks, premotor neuroner projektering til hypoglossal motoriske neuroner (pXII MNs) og hypoglossal motor neuroner (XII MNs) og hypoglossal nerve finrødder. PBC, XIIn og C4 nerve finrødder er almindeligt anvendt til inspiratory rytme optagelser, som illustreret i figur 7.
Vellykket anvendelse af denne procedure vil producere en levedygtig og rytmisk aktive en bloc forberedelse i 10-15 min, eller en rytmisk-aktive skive i < 30 min. Efter isolering af blokoverførslen hjernestammen-rygmarven eller en tynd skive er 15 min af ækvilibrering i optagelse kammer tilstrækkelig til produktion af fiktive motor output. For Skive, vil øge den ekstracellulære [K +] til ca 8-9 mM producere robust neurale drive, der kan vare i 24 til 36 timer i dette laboratorium erfaring. Præparatet bør løbende superfused med carbogenated (95% O2/5% CO2) og opvarmet aCSF (~ 27 ° C). Vellykket dissektioner udføres hurtigt og undgå klemning, strække eller beskadige nerve finrødder bruges for optagelser. For optimale resultater, alle trin i proceduren udføres hurtigt og vævet skal badet eller løbende perfunderet med carbogenated aCSF, når du udfører dissektion og væv isolation (som beskrevet ovenfor). Omfattende oplysninger om Neuroanatomi og præcise Atlas af hjernestammen, se venligst Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 og kolleger arbejde. Protokollen præsenteres her er en metode, der har vist sig pålidelige i den ledende forfatter laboratorium og denne rapport indeholder en grafisk, trinvis metode til at generere disse skiver kun paaberaabe sig overflade seværdigheder synlige på hjernestammen eller inden for den hjernestammen som beskrevet her.
Figur 1 : Indledende dissektion til hjernestammen rygmarven udvinding. (A) Anesthetized pup fastgjort til dissektion. Stiplede linjer angiver indsnit retningslinjer for sagittal snit i huden og tværgående skærer caudale til øjne og under mellemgulvet. (B) Guide til at fjerne hud og forbens fra dyr. (C) dorsale aspekt af flået gnaver. Stiplede linjer angiver indsnit retningslinjer for kraniet-flap "clamshell" eksponering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Faser af den dorsale laminectomy. (A) stiplede linjer angiver indsnit retningslinjer for fjernelse af cerebrum. (B) resultat efter fjernelse af væv. Stiplede linjer angiver indsnit retningslinjer for dorsale laminectomy. (C) Exposed hjernestammen-spinal ledning følge dorsale laminectomy. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Faser af indledende ventrale dissektion. (A) ventrale side af en flået gnaver med afhuggede forhjernen og maven. Stiplede linjer angiver indsnit retningslinjer for at fjerne xyphoid processen og åbne brystkassen for at efterfølgende fjerne abdominal og thorax hulrum organer. (B) Abdominal og thorax hulrum organer fjernet. (C) oropharyngeale strukturer fjernes. Stiplede linjer angiver indsnit retningslinjer for hårde gane fjernelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Faser af den ventrale laminectomy. (A) hårde gane og resterende kraniet dele fjernet. Indsnit retningslinjer angive, hvordan du fjerner resterende væv omkring hjernestammen-rygmarven. (B) første halshvirvel (C1) udsat. (C) Demonstration på løft C1 og gøre et tværgående snit til den vertebrale kroppen til at fjerne den. Nerver er omhyggeligt skæres flush til den dorsale side af vertebrale kroppen før du fjerner den. Dette er den mest afgørende skridt i dissektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Forberedelse af hjernestammen rygmarven til udskæring. (A) C1-C3 fjernet fra rygmarven. Snit retningslinjerne angiver, hvor at bryde hjernestammen til rygmarven fra caudale rygmarven. (B) ventrale side af hjernestammen rygmarven med mærket nerve finrødder. Snit retningslinjer viser anbefalede transection eller resterende rostralt strukturer på ponto-medullær før optagelse fra regionen hjernestammen rygmarven. (C) Paraffin slab setup for udskæring på vibratome. Udskæring regionen omfatter væv mellem hjernenerver IX og XII. Placer ikke mikro-pins i regionen udskæring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Vartegn anvendes for at opnå skiver med en intakt hypoglossal motoren kernen og PreBötzinger kompleks. (A) tværgående visning af hjernestammen-rygmarven efter første cut er blevet gjort rostralt for glossopharyngeal (IX) finrødder. Snit retningslinje angiver transection niveau bare caudale til de hypoglossal (XII) finrødder. (B) orientering af paraffin blok til at klinge, før du skære en skive med pBC og hypoglossal motoren kerne. Oprettelse af en trapezformet "kile" shape cut maksimerer sandsynligheden for fanger nok inspiratory neuroner i Skive at opnå rytmisk aktivitet under optagelsen. Kilen vil omfatte pBC, de hypoglossal premotor neuroner og hypoglossal motoriske neuroner, som tilsammen giver den nødvendige kredsløb for at overføre rytmiske drive, hvilke er et indeks af respiratoriske rhythmogenesis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Repræsentant optagelser fra en blok eller skive præparater. (A) integreret spor fra XII rootlet. (B) integreret spor fra en pBC. Optagelse fra en pBC vil ved hjælp af en en bloc forberedelse kræve en blind patch klemme. (C) integreret spor fra C4 nerve rootlet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilpasning af protokollen præsenteres her i en en bloc eller skive arbejdsgang er fordelagtige for laboratorier og undersøgelser, der gerne vil udnytte enten blokoverførslen hjernestammen-rygmarven og/eller tynd skive forberedelserne til Elektrofysiologi optagelser. Metoden dissektion og skive præsenteret, kombineret med metoder tidligere rapporteret af andre17,18,19, vil tillade reproducerbare forberedelse af robust og holdbar væv, der er meget tilpasningsdygtige til en række eksperimenter ved hjælp af gnaver baghjernen eller rygmarven. Dissektion præsenteret er meget detaljerede og indeholder dorsal og ventral laminektomi samt omfattende detaljer om orientering af hjernestammen-rygmarven ved udarbejdelsen af til at skåret skiver. Detaljerede dissektion og skive protokollen præsenteret tillader forsker til at omfatte alle kredsløb nødvendigt til produktion og transmission af inspiratory rytme. De vigtigste neurale populationer/strukturer, der kan opfanges ved hjælp af denne metode omfatter: de hypoglossal premotor neuroner, hypoglossal motoren kernen og den komplekse preBötzinger. Bemærk, at regioner i hjernestammen, der indeholder centrale CO2 sensorer eller ekspiratorisk rytme-genererende kredsløb (RTN/pFRG) ikke er inkluderet i forberedelsen detaljeret her20,21. Når en blok forberedelse eller skive har opnået, kan rytmisk aktivitet opnås ved hjælp af suge elektroder, overflade elektroder eller encellede optagelse metoder såsom ekstracellulære enhed eller patch-fastspænding metoder3,10 ,11.
Målet med denne protokol er at give en klar, let at følge metode til generering af enten en hjernestammen rygmarven forberedelse eller en tynd, rytmisk-aktive skive. Denne protokol skal være værdifulde for både erfarne og nye forskere interesseret i at indarbejde rytmiske hjernestammen/skive præparater i deres angrebsformål, da der er flere kritiske trin detaljeret inden for de procedurer, som letter hentning af robust, reproducerbare og langvarig rytmisk aktive skiver.
Når forskeren er blevet fortrolig med identifikation af de anatomiske landemærker og de færdigheder, der er nødvendige for dissektion, hastighed af dissektion vil stige, og procedurerne, der kan optimeres til hver enkelte investigator. Protokollen detaljeret her blev undervist til den ledende forfatter (CGW) under hans post-ph.d.-arbejde med Jeffrey Smith, ophavsmand til rytmiske hjernestammen skive forberedelse3. For at sikre rytmisk aktivitet og levedygtighed både i skiver og en bloc præparater, skal alle procedurer til at generere en skive være færdig inden for ca 30 min. fra begyndelsen af proceduren til en skive i salen, optagelse. Med kontinuerlig perfusion, der er meget lidt indflydelse på væv levedygtighed men minimerer tid for dissektion mulighed for længere optagelse og dataopsamling. For respiratorisk undersøgelser, en skive, der er lige så tynd som ca 280 µm tykt3 vil have rytmiske, robust inspiratory aktivitet, men skiver kan variere op til 550 µm17,18,19,22. Forsigtig praksis er forpligtet til at udvikle de nødvendige færdigheder til at udføre denne procedure og minimere variansen i tykkelse og rostralt-caudale placeringen af hver skive. Medtage eller udelade visse cellepopulationer vil påvirke kvalitet og robusthed af rytmisk aktivitet fremstillet i senere optagelse som excitatoriske og hæmmende kerner i hjernestammen kan påvirke "kvaliteten" af rytmen optaget fra Skive 3.
Endelig er det også kritisk at aCSF tilberedes præcis efter protokol, og er på et standardiseret pH20, temperatur og iltning. Anoxiske præparater vil ikke være rytmisk aktiv og vil påvirke data indsamling21.
Der er flere vigtige trin i proceduren, at lette en investigator erobringen af levedygtige og rytmisk aktive præparater. Under den ventrale laminektomi, holde den dorsale brystkassen intakt giver ekstra gearing og leverer mere væv til sikring af forberedelse mens du udfører forholdsvis fine isolering af hjernestammen-rygmarven fra rygsøjlen. Dissektion trin detaljeret her tillade investigator let producere en bloc præparater eller tynde skiver så af nødvendighed, ekstra trin er listet det kan undlades at opnå bare en tynd skive. Andre nyttige tips omfatter, mens de udfører den ventrale laminektomi, det er vigtigt at få et fast greb på det vertebrale krop til at løfte det opad, mens severing nerve finrødder. Når hjernestammen-rygmarven er dissekeret og udvundet, skal dura mater og resterende Vaskulaturen blive dissekeret ud af overfladen af det neurale væv. Blodkar og dura er hård og kan forhindre vibratome bladet, skære en ren skive. Dissektion af dura er ikke afgørende for en bloc forberedelse, men anbefales at optimere nerve-suge elektrode kobling. Endelig, omhyggelig og metodisk praksis i brug af vibratome er nødvendige til at skære en ren, reproducerbare skive. Denne protokol giver en meget omfattende liste over detaljerede trin for dissektion og skære procedurer. Fokus her er at give en trin for trin detaljeret liste for en investigator skal bruges som et pålideligt fundament og træningsredskab, hvorfra de kan ændre deres laboratorieprocedurer efter behov.
Som helhed udgør denne metode en tredive års udvikling af metoder til in vitro-Elektrofysiologi. For denne hvidbogs anvendelsesområde fokuserer på standardisering af blokoverførslen og skær hjernestammen rygmarven optagelser, der typisk bruges til at studere inspiratory aktivitet i P0-P5 rotter og mus,22. Men denne dissektion proces kan udnyttes på tværs af en række animalske størrelser, aldre og arter for en bred vifte af undersøgelser, herunder E18 rotter/mus, neonatal rotter og mus (postnatal dage 0 til 6) og voksne mus. Fremtidige studier kan bruge metoderne præsenteret for at strømline protokoller på tværs af arter og aldre, så undersøgelser at afhøre mekanismer i rytme generation eller andre fysiologiske processer på tværs af både arter og aldre. I sidste ende vil ændre orientering, tykkelse eller placering af skive eller blokoverførslen forberedelse påvirke rytmisk aktivitet23. Omfattende litteratur har været offentliggjort tidligere vedrørende de neurale befolkninger fanget af skive procedurer og der er stereotaxisk rotten og musen atlasser rådighed til flere detaljer vedrørende de neurale kredsløb drøftet her24, 25,26. De procedurer, der er præsenteret her giver omfattende detaljer med klare illustrationer, der giver mulighed for en ny efterforsker til at lære at skære rytmiske skiver fra seværdigheder let synlig under et laboratorium dissekere anvendelsesområde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
S.B.P er en modtager af en Loma Linda University sommer Undergraduate Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).
