Summary
Denne protokollen både visuelt kommuniserer hjernestammen ryggmargen utarbeidelse og tydeliggjør utarbeidelse av hjernestammen tverrgående skiver i en omfattende trinnvis måte. Det ble designet for å øke reproduserbarhet og øke sannsynligheten for å få levedyktig, langvarig, rytmisk er aktiv skiver for opptak nevrale utdata fra regionene åndedretts av hjernestammen.
Abstract
Pattedyr Inspiratorisk rytme genereres fra et nevrale nettverk i en region av medulla kalt preBötzinger kompleks (pBC), som produserer et signal kjøring rytmisk sammentrekning av Inspiratorisk muskler. Rytmisk nevrale aktivitet generert i Playback Control og fraktet til andre neuronal bassenger å kjøre muskulatur å puste kan studeres ved hjelp av ulike tilnærminger, inkludert en bloc nerve innspillinger og tverrgående stykke opptakene. Men har tidligere publiserte metoder ikke mye beskrevet hjernestammen ryggmargen disseksjon prosessen i en gjennomsiktig og reproduserbar måte for framtidige studier. Her presenterer vi en omfattende oversikt over en metode som brukes til reproduserbar skiver rytmisk er aktiv hjernestammen inneholder nødvendig og tilstrekkelig neuronal kretskobling for generering og sending Inspiratorisk stasjon. Dette arbeidet bygger på tidligere hjernestammen ryggmargen elektrofysiologi protokoller å øke sannsynligheten for at pålitelig levedyktig og rytmisk er aktiv skiver for opptak neuronal utdata fra pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), og hypoglossal motor neurons (XII MN). Arbeidet presentert utvider på tidligere publiserte metoder ved å gi detaljert, trinnvis illustrasjoner av dissection, fra hele rotte valp, i vitro skive som inneholder XII-rootlets.
Introduction
Åndedretts nettverk av hjernestammen gir en fruktbar for å forstå de generelle egenskapene til rytmisk neural nettverk. Spesielt er interessen i utviklingen av neonatal gnager puste og forstå hvordan puste rytmen utvikler. Dette kan være gjort ved hjelp av en multi-level tilnærming, inkludert i vivo helt dyr plethysmography, i vitro en bloc nerve innspillinger, og in vitro skjær opptak som inneholder puste rytme generatoren. Reduksjonistiske i vitro en blokk og skive innspillinger er en fordelaktig metode å bruke når avhør mekanismene bak åndedretts rhythmogenesis og nevrale kretser i hjernestammen ryggmargen regionen utvikle gnagere. Utvikle luftveiene inneholder omtrent 40 celletyper, preget av skyte mønster, inkludert de av sentrale åndedretts1,2. Sentrale åndedretts nettverket inneholder en gruppe rytmisk aktive nerveceller i den rostral ventrolateral medulla1,3. Pattedyr åndedretts rhythmogenesis genereres fra en autorhythmic lokalisert interneuron nettverk kalt preBötzinger kompleks (pBC), som har vært eksperimentelt via både skive og en blokk preparater av neonatal pattedyr hjernestammen-spinal strømledninger3,,4,,5,,6,,7,,8. Denne regionen serverer en lignende funksjon til noden sinoatrial (SA) i hjertet og genererer en Inspiratorisk timingen systemet å kjøre åndedrett. Fra pBC utføres Inspiratorisk rytmen til andre regioner av hjernestammen (inkludert hypoglossal motor kjernen) og spinal motor bassenger (for eksempel phrenic motor neurons som driver membranen)9.
Rytmisk aktivitet kan oppnås ved hjelp av hjernestammen ryggmargen no blokken forberedelser eller stykker fra ulike celle populasjoner, inkludert C3-C5 nerve rootlets, XII nerve rootlets, hypoglossal motor kjernen (XII MN), hypoglossal premotor neurons (XII pMN), og de pBC3,10,11,12. Mens disse metoder for innsamling av data har vært vellykket over en håndfull laboratorier, er mange av protokoller ikke presentert på en måte som er fullt reproduserbar for nye forskere inn i feltet. Få levedyktig og rytmisk aktiv en blokk og skive forberedelser krever en akutt oppmerksomhet på detaljer gjennom alle trinnene i disseksjon og skive kutte protokollen. Tidligere protokoller mye beskriver ulike opptak prosedyrer og elektrofysiologi, men mangel detalj i den viktigste delen av å få en levedyktig vev forberedelse: utfører hjernestammen ryggmargen disseksjon og skive prosedyren.
Effektivt å skaffe en rytmisk er aktiv og levedyktig en blokk eller skive forberedelse hjernestammen ryggmargen elektrofysiologi opptak krever at alle trinnene utføres riktig, nøye og raskt (vanligvis hele prosedyren relatert her kan være utført i ca 30 min). Kritiske punkter av hjernestammen ryggmargen elektrofysiologi protokollen som ikke er tidligere godt beskrevet inkluderer Disseksjon av nerve rootlets og slicing prosedyren på vibratome. Denne protokollen er først til å gradvis kommunisere visuelt hjernestammen ryggmargen dissection for både nye forskere og eksperter på feltet. Denne protokollen forklarer også grundig kirurgiske teknikker, landemerker og andre prosedyrer å hjelpe fremtidige forskere standardisere skiver og en bloc preparater inneholder nøyaktig kretsene ønsket i hvert eksperiment. Prosedyrene presenteres her kan brukes i både rotte og mus neonatal pups.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokollen er godtatt og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) i Loma Linda University. NIH retningslinjer for etisk behandling av dyr er fulgt i alle dyreforsøk i laboratoriet. Alle etiske standarder ble opprettholdt av enkeltpersoner utfører denne protokollen.
1. løsninger
-
Forberede kunstig hjerne spinalvæske (aCSF).
- Forberede frisk aCSF kvelden før et eksperiment 1 L satsvise følgende Oppskrift: 7.250 g NaCl (124 mM), 0.224 g KCl (3 mM), 2.100 g NaHCO3 (25 mM), 0.069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 mM), 0.247 g MgSO4 • 7 H2 O (1.0 mM), og 5.410 g D-glukose (30 mM), 0.221 g CaCl2 • 2t2O (1,5 mM). Legge til CaCl2 • 2t2O sist.
- Oppløses komponentene i 1 L deionisert vann. Rør i 20-30 min.
- Måle pH i aCSF og Juster 7,40 ± 0,02 bruker små mengder (vanligvis < 0,5 mL) av fortynnet NaOH, KOH eller HCl.
Merk: Forberedt aCSF kan lagres i kjøleskapet (4 ° C, pH 7.40 ± 0,02) til tre dager før bakterievekst påvirker levedyktighet av vev under et eksperiment. Bruke 0,2 µm filtre for å redusere forurensning av sopp og bakterier i laboratoriet siden eksperimenter kan vare opptil 36 h. For effektivitet, aCSF oppskriften beskrevet kan skaleres til 4 L grupper etter for samme protokoll og dette volumet vil vare i opptil tre dager eksperimenter.
2. forberedelse av disseksjon og Vibratome rigg
-
Konfigurere blade.
- Bruk en frisk tveegget barberblader for skjæring vev på en vibratome. Vask bladet med 100% etanol og skyll med deionisert vann før skjæring eller snapping bladet i to og innsetting av bladet til montering klemme på vibratome.
- Endre bladet hver gang en ny vev forberedelse er montert på vibratome til kutting eller hvis det skjærer inn i parafin slab mens kutting. Noen parafin rester vil gjøre det nesten umulig å kutte rent gjennom neonatal nevrale vev.
-
Definere du parafinvoks skive.
- Bruk alle innebygging stil parafin voks. Plasser 10 g innebygging medier i et varme-tolerant glass beaker og bruke lav varme til å smelte parafinvoks perler til væske.
- Legg ca 0,5 g grafitt-pulver og bland løsning grundig og jevnt i den flytende parafinen.
- Bruk en liten plast plate som underlaget for parafinen. Skjær et små (0,5 - 1 cm tykk og ca 2 x 2 cm2 bredt) stykke plast (polykarbonat eller aluminium kan også brukes). Bruke en maskinist filen til scratch riller i plast asthis sikrer at parafinen overholder plast.
Merk: Alternativt bruke en oppvarmet 18 G sprøyte nål plassere vinklet hull i å sikre at parafin-grafitt blandingen overholder plast. - Bruke baksiden av en bomull tips applikator for å dryppe parafin-grafitt blandingen på plasten av gjentatte ganger dipping applikatoren i flytende parafin-grafitt blandingen, dryppende gjødsel på plast blokken og bygge den parafin-grafitt til ca 1,5 cm tykkelse på plast.
- Når et tilstrekkelig tykke lag av parafin-grafitt miksen er avsatt på blokken, kan du angi blokken side avkjøles og deretter form for å imøtekomme hjernestammen-ryggmargen.
3. disseksjon og isolering av Neuraxis
- Utføre innledende disseksjon og anesthetization.
Merk: dyr som brukes i denne studien kan variere i størrelse fra embryonale dag 18 (E18) postnatal dag 10-20 i mus eller rotter spenner fra E18 til postnatal dag 5/6. Rotter eller mus av belastning, behandling eller kjønn kan brukes, avhengig av eksperimentell design. Utføre anestesi og foreløpige disseksjon under avtrekksvifte siden isoflurane brukes (0,25 mL i en 25 mL kammer).- Veie pup og deretter plassere den i en bedøvelse kammer som inneholder 0,25 mL isoflurane plassert på en 2 x 2 tommers2 stykke gasbind. Etter dyret når et kirurgisk fly bedøvelse (bekreftet av tå knipe med ingen tilbaketrekning refleks), pin dyr på en Petriskål fylt med parafin eller silikon-elastomer.
Merk: Neonatal gnagere kan også være anesthetized via cryoanesthesia13,14, isoflurane fordamping15, eller injeksjon16 balansert med oksygen. - Plasser den dyr ventral siden ned og gjøre en midtlinjen snitt fra like bak øynene til regionen midt lumbale virvelsøylen med 10 eller 11 skalpell bladet eller kirurgisk saks. Reflektere huden og decerebrate dyret på nivå med det parietal/tilpassing suture (se figur 1) og fjerne hud transecting dyret under membranen. Deretter fjerne armene ved å kutte i skulderleddet med saks eller skalpell.
- Når huden er fjernet, kan du overføre dyret til en perfusjonsmåling kammer med silikon elastomerin bunnen for ytterligere disseksjon og utarbeidelse av hjernestammen-ryggmargen.
- Boble en aCSF reservoaret (500 mL-porten flaske) kontinuerlig med kjølt (4 ° C, pH 7.40 ± 0,02) aCSF og oxygenate med en blanding av 95% O2 og 5% CO2 (også kalt "carbogen"). Under dissection, bruke kjølt aCSF å med jevne mellomrom tømme kammeret, gir frisk oksygenrikt aCSF i isolasjon av hjernestammen-ryggmargen.
Merk: Røde blod celler kan sees i gjenværende arteriene og venene og, når tilstrekkelig oksygenert, disse er røde. - Bruke gravitasjon-flow perfusjon via rør og en stopcock, for å midlertidig eller kontinuerlig perfuse vev med oksygenrikt aCSF (bolus volum eller via langsom drypp bruker en stopcock, ca 0,5 - 1,0 mL/min). Dette oxygenates vevet og opprettholder en tydelig kirurgiske feltet.
- Fjern overflødig væske som trengs av vakuum inntaks filtreringssystem.
- Utføre dissection bruker dissecting mikroskop. En kontinuerlig zoom modell er foretrakk å tillate finjustering av forstørrelse og tillate optimal visualisering av regionen rundt på hvert trinn i dissection.
Merk: Mikrokirurgi verktøy anbefales omfatter en rekke toothed tissue tang, sløv tang, #5 tang, vinklet tissue tang, en rekke mikro-dissekere saks (våren saks), og vanlig insekt og mikro-dissekere pinner. - Utsette hjernen via midtlinje delen av skallen langs det sagittal suture så pin ned reflektert flaps med mikro-dissekere pinner og feste ryggraden på caudal slutten silikon-dekket nederst i disseksjon kammeret ved hjelp av en 27 G nål.
Merk: Resten av dissection krever disseksjon mikroskop å gi klareste visningen av vev og landemerker brukes til å sikre maksimal sannsynligheten for å få rytmisk får ut på de kraniale rootlets av hjernestammen og spinal rootlets. Utfør disse trinnene av dissection bruker middels våren saks eller iris saks og fine tang.
- Veie pup og deretter plassere den i en bedøvelse kammer som inneholder 0,25 mL isoflurane plassert på en 2 x 2 tommers2 stykke gasbind. Etter dyret når et kirurgisk fly bedøvelse (bekreftet av tå knipe med ingen tilbaketrekning refleks), pin dyr på en Petriskål fylt med parafin eller silikon-elastomer.
- Raskt overføre isolert stammen av dyret til en karbonisert disseksjon kammer. Plass vev dorsal side opp med rostral slutten (hjernen) mot fronten av kammeret. Feste vev på skuldrene og mest caudal slutten av ryggmargen.
- Gjør et mid-sagittal snitt gjennom skallen etter det parietal suture å unngå å skade cortex og hjernestammen underliggende skallen.
Merk: Neonatal benvev er ikke fullt forkalket og er svært skjøre. Benvev vil være fleksibel til en viss grad, men tøffere enn omkringliggende forbinde og muskelvev. - Bruk middels våren eller iris saks for å bekkasin occipital bildet av skallen, begynner på sagittal suture og arbeider sidelengs. Dette vil opprette "flaps" av skallen som kan bli reflektert og låste å forankre den rostral delen av skallen og gi noen stabilitet til vev (se figur 2A).
- Etter reflekterer skallen flaps, kuttet av resten av hjernebarken, slik at den caudal delen av lillehjernen (vermis) relativt intakt (figur 2B).
- Gjør et mid-sagittal snitt gjennom skallen etter det parietal suture å unngå å skade cortex og hjernestammen underliggende skallen.
- Utføre dorsal laminectomy.
- Fjerne muskulatur rundt skallen og virvelsøylen mikro våren saks og tang. Fjerne vev langs dorsal ribbe buret, røres ribbe buret, som dette vil være festet senere for å forankre vevet under det ventrale laminectomy, minimere sjansen for skade på ryggmargen.
- Nøye klipp bort lateral prosessene av ryggvirvel laminae middels våren saks eller fin iris saks. Klippe bort alle vev overliggende pons og forlengede. Den vermis, lillehjernen, pons, og begynnelsen av ryggmargen vil nå bli synlig (figur 2C).
- Utføre ventrale laminectomy.
- Senker vev dorsal side og feste i ribbeinet buret og mest caudal slutten av ryggraden. Feste den rostral siden av vev ved hjelp av skallen flaps (Figur 3A).
- Fjerne det ventrale halvparten av ribbe buret, inkludert sternum og alle abdominal organer med samme saks og tang. Dissekere bort bløtvev knyttet til brystkasse utsette ribbeina og ryggmarg (Figur 3B).
- Fjerne tungen, spiserøret, luftrør, strupehode, og alle andre bløtvev og muskulaturen overliggende bunnen av skallen og ryggraden (som sett i Figur 3C).
- Dissekere vev overliggende vanskelig pallen. Identifisere den harde ganen ved å finne en rektangulær plate av bein i bunnen av skallen med en V-form innrykk på det (Figur 3C). Skjær langs midtlinjen til ganen, forsiktig løfte den oppover og utføre en tverrgående kuttet for å fjerne den (Figur 4A).
- Starte en ventrale laminectomy ved å fjerne laminae utsette ventrale overflaten av hjernestammen og ryggmargen fra første cervical vertebra til ca thorax vertebra 7 (T7) som vist i Figur 4B.
- På dette stadiet vises de ventrale rootlets. Bruker små mikro-disseksjon eller våren saks, ta vare for å gjøre kutt så nær laminae og så langt unna røtter opprinnelse i ryggmargen som mulig; unngå å strekke røttene.
- Klipp 5-10 mm langs begge sider av ryggraden på laminae. Ikke klipp for nær i ryggmargen eller ryggvirvlene. Dette trinnet gir fjerning av cervical ryggsøylen å avsløre ryggmargen. Unngå klipping rootlets.
- Bekkasin rootlets ca 20-25 mm (bilateralt) langs ryggraden (ca T7). Gjennom hele prosedyren unngå kutte i ryggmargen og manipulere kantene av ryggsøylen som vist i Figur 4C.
- Fjerne C1 og C2, C3 ved forsiktig løfte rostral kanten av hver av ryggsøylen og snipping tett under benet. Jo nærmere benet at kuttet er laget, jo lenger rootlet. Bruk hekta eller bøyd tang å hjelpe oppnå et fast grep om hver cervical vertebra samtidig som kutt (Figur 4C).
- Når ønsket lengden på ryggmargen er isolert og dissekert fra virvelsøylen, gjøre en tverrgående kutt fjerne ryggmargen (figur 5A og figur 5B).
- Fjerne dura mater.
Merk: isolert hjernestammen-ryggmargen kan brukes for en bloc i vitro opptak som har vært beskrevet tidligere3,7. Med hjernestammen-ryggmargen fjernet fra virvelsøylen, må dura fjernes for å gi optimal tilgjengelighet for sugekraft elektroder utføre opptak på klipp skallen og spinal rootles. I tillegg, gjør fjerning av dura det mulig å rent skjær hjernestammen og få rytmisk aktive tynne skiver for i vitro opptak.- Nøye rootles pin-isolert hjernestammen-spinal cord tissue dorsal side opp til dura rundt den kraniale (figur 5B). Pinnene skal brukes gjennom den laterale delen av hjernestammen, rostral til XII-rootlets.
- Fjerne dura fra dorsal overflaten av hjernestammen ved å løfte dura med fine tang (#5) på dorsal margin dura og kuttet fra lateral til mediale over lengden på hjernestammen med fine våren saks. Være forsiktig for å unngå kutte i hjernestammen selv. Forsiktig løfte blodkar fra hjernestammen overflaten og kuttet for å unngå hinder på vibratome bladet ved snitting hjernestammen.
- Nøye analysere dura fra mediale og laterale aspekter av hjernestammen, cranial nerve rootlets passerer gjennom dura og lett dratt bort når dura er løftet. Minimere sannsynligheten for rootlets blir dratt ved å forsiktig kutte rundt dem med små våren saks.
- Vend hjernestammen-ryggmargen slik at ventrale overflaten vender og de kraniale rootlets er synlig. Dissekere dura fra dorsal side av hjernestammen ved å løfte forsiktig dura direkte over området postrema, kutte fra rostral til caudal. Postrema området vises litt rosa på grunn av det store antallet microcapillaries perfusing denne regionen.
- Bruk en fin insekt pin å erte bort eventuelle gjenværende dura og fjerne gjenværende blodårer i nærheten skallen og cervical rootlets.
4. Skjær protokollen
- Etter fjerner dura, plassere hjernestammen i midten av parafin plattformen på plast blokk (heretter kalt "cutting blokk"). Feste caudal slutten av hjernestammen gjennom distale ryggmargen med fine insekt pinner som har blitt beskåret til mer enn 1 cm i lengde som vist i figur 5C.
- Justere parafin-dekket kutte blokken med festede hjernestammen i vibratome blokk holderen slik at bladet skjærer vinkelrett mot rostral hjernestammen.
- Foreta et første stykke fjerne ujevne, overflødig vev på rostral mest slutten. Denne første kutt kan være 200-300 µm vanligvis men nøye unngå fjerning av IX og X XII skallen rootlets. Dette trinnet vises vanligvis caudal omfanget av ansikts kjernen (VII) og glossopharyngeus rootlets og gjør det mulig å justere hjernestammen slik at dens ansikt er par-plan å vibratome bladet. Foreta små justeringer som er nødvendig for å sikre PARI-planarity og små kutt fjerne vev som er ujevn.
Merk: Glossopharyngeus (IX) rootlets vises på den laterale kanten av hjernestammen, som man kutter hver påfølgende skive, og dette gir et landemerke for rostro-caudal avstanden til hjernestammen nerve kretssystem nødvendig for rytme generasjon. På ventral side av hjernestammen, de hypoglossal rootlets (XII) skal også vises litt caudal til kutt ansiktet viser IX-rootlets. Et siste landemerke blir obex (punktet i den menneskelige hjernen som fjerde ventrikkel begrenser for å bli det sentrale kanalen i ryggmargen) i dorsal ansiktet av hjernestammen. Med disse tre poeng referanseramme synlig, riktig skjæringsplanet er etablert (se figur 6A) og pålitelig oppnås en rytmisk er aktiv skive. - Fortsett kutte rostral til caudal til IX rootlets er nær overflaten av kuttet hjernestammen.
- Se figur 6 for landemerker og riktig retning. Justere parafin-skive i vibratome klemmen slik at neste vinkelen på transection oppretter en veldig liten "kile" figur kuttet sektoren og skiver ca 100-200 µm til landemerkene beskrevet kan være tydelig (figur 6en).
Merk: Kutte denne liten kile øker antallet XII motor neurons i sektoren og maksimerer sannsynligheten for å få rytmisk aktivitet under opptak. Bruker landemerkene beskrevet (rostral rootlets fra glossopharyngeus nerve bunten, rootlets fra hypoglossus bunten, obex) sikrer at stykket reproduserbar inneholder minst en stor del av pBC (figur 6B). - Kuttet en 300-500 µm skive hjernestammen fra disse rostral nevroanatomi markørene å fange Playback Control og tilhørende overføring krets.
Merk: Et "ideelle" stykke inneholder de mest rostral rootlet av hypoglossal rootlet bunt pålitelig hente Inspiratorisk aktivitet uten å ty til overflaten opptak ved hjelp av et inntaks elektrode over rytme-generering/overføring loci i den hjernestammen.
5. registrering prosedyrer
- Plasser sektoren i et opptak kammer, perfuse kontinuerlig med aCSF (0,5 - 1,0 mL/min) og bruker suge eller ekstracellulær elektroder til posten befolkningen aktivitet fra XII-rootlets eller fra pBC, XII PMNs eller XII motoneurons. For detaljert registrering prosedyrer, se tidligere publikasjoner på hjernestammen ryggmargen electrophysiology og patch klem10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden som presenteres her kan forsker interessert i å få rytmisk aktive skiver av hjernestammen reproduserbar og pålitelig kutte en levedyktig, robust skive som gjør opptak av fiktiv motoren i mange timer. Alle minimal nødvendig nevrale Kretselementer for generering og sending Inspiratorisk rytme kan hentes i en tynn skive med denne metoden. Disse elementene omfatter: preBötzinger komplekset, premotor neurons prosjektering til hypoglossal motor neurons (pXII MNs) og hypoglossal motor neurons (XII MNs) og hypoglossus rootlets. Den pBC, XIIn og C4 nerve rootlets brukes vanligvis for Inspiratorisk rytme innspillinger, som vist i figur 7.
Denne fremgangsmåten brukes vil produsere en levedyktig og rytmisk aktiv en blokk forberedelse i 10-15 minutter, eller en rytmisk er aktiv sektor i < 30 min. Etter isolasjon av en bloc hjernestammen-ryggmargen eller en tynn skive er 15 min av balanse i innspillingen kammeret tilstrekkelig for produksjon av fiktiv motoren. I stykket, vil øke den ekstracellulære [K +] ca 8-9 mm produsere robust nevrale stasjon som kan vare i 24 til 36 h i dette laboratoriet erfaring. Preparatet bør være kontinuerlig superfused med carbogenated (95% O2/5% CO2) og oppvarmet aCSF (~ 27 ° C). Vellykket disseksjoner utføres raskt og unngå klemme, strekke eller ødeleggende nerve rootlets brukes for opptak. For optimale resultater, alle trinn i prosedyren utføres raskt og vevet badet eller kontinuerlig parfyme med carbogenated aCSF når du utfører disseksjon og vev isolasjon (som beskrevet ovenfor). Omfattende informasjon om nevroanatomi og presis Atlas av hjernestammen, se arbeidet til Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 og kolleger. Protokollen presenteres her er en metode som har vist seg pålitelig i senior forfatteren laboratorium og denne rapporten gir en grafisk, trinnvise metoden for å generere disse sektorene stole bare på overflaten landemerker synlig på hjernestammen eller i den hjernestammen som finnesher.
Figur 1 : Første disseksjon for hjernestammen ryggmargen utvinning. (A) Anesthetized pup festet for disseksjon. Stiplede linjer viser snitt retningslinjer for sagittal snitt i huden og transverse skjærer caudal øynene og under membranen. (B) Guide for å fjerne hud og forelimbs fra dyr. (C) Dorsal aspekt av flådd gnager. Stiplede linjer viser snitt retningslinjer for skallen-klaff "clamshell" eksponering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Stadier av det dorsal laminectomy. (A) stiplede linjer angir snitt retningslinjer for å fjerne cerebrum. (B) resultatet etter fjerning av vev. Stiplede linjer viser snitt retningslinjer for dorsal laminectomy. (C) Exposed hjernestammen-rotere ledningen etter dorsal laminectomy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Stadier av første ventrale disseksjon. (A) Ventral side av en flådd gnager kuttet forebrain og magen. Stiplede linjer viser snitt retningslinjer for fjerne xyphoid prosessen og åpne ribbe buret for å senere fjerne mage og thoracic hulrom organer. (B) mage og thoracic hulrom organer fjernet. (C) orofaryngeal strukturer fjernet. Stiplede linjer viser snitt retningslinjer for harde ganen fjerning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Av det ventrale laminectomy. (A) harde ganen og gjenværende skallen deler er fjernet. Snitt retningslinjene tilsier hvor å fjerne resterende vevet rundt hjernestammen-ryggmargen. (B) første cervical vertebra (C1) utsatt. (C) demonstrasjon på løfte C1 og gjør en tverrgående kutt å ryggvirvel kroppen å fjerne den. Nervene er nøye kuttet flush til dorsal side av ryggvirvel kroppen før du fjerner den. Dette er det viktigste trinnet i dissection. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Utarbeidelse av hjernestammen ryggmargen til kutting. (A) C1-C3 fjernet fra ryggmargen. Snitt retningslinjer viser hvor bryte hjernestammen-ryggmargen fra caudal ryggmargen. (B) Ventral side av hjernestammen ryggmargen med merket nerve rootlets. Snitt retningslinjene tilsier anbefalte transection eller gjenstående rostral strukturer på ponto-medullær før innspillingen fra regionen hjernestammen ryggmargen. (C) parafin skive oppsett for kutting på vibratome. Kutting regionen inkluderer vevet mellom Hjernenerve IX og XII. Ikke plass mikro-pins i regionen kutting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Landemerker brukt for å oppnå skiver med intakt hypoglossal motor kjernen og PreBötzinger komplekset. (A) tverrgående visning av hjernestammen ryggmargen etter første kuttet er gjort rostral til glossopharyngeus (IX) rootlets. Snitt retningslinje angir transection nivå bare caudal til hypoglossal (XII) rootlets. (B) retning av parafin blokk til bladet før klippe et stykke som inneholder Playback Control og hypoglossal motor kjernen. Opprette en trapesformet "kile" figur kutt maksimerer sannsynligheten for fanger nok Inspiratorisk nerveceller i sektoren å få rytmisk aktivitet under opptak. Kilen inkluderer Playback Control, hypoglossal premotor neurons og hypoglossal motor neurons, som samlet gir det nødvendige kretsløpet å overføre rytmisk driv, som er en indeks på luftveiene rhythmogenesis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Representant opptak fra en blokk eller skive forberedelser. (A) integrert spor fra XII rootlet. (B) integrert spor fra Playback Control. Opptak fra Playback Control krever bruker en en blokk forberedelse en blind oppdateringen klemme. (C) integrert spor fra C4 nerve rootlet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilpasse protokollen presenteres her i en en blokk eller skive arbeidsflyt er fordelaktig for laboratorier og studier som ønsker å benytte enten en bloc hjernestammen-ryggmargen og/eller tynn skive forberedelser for elektrofysiologi innspillinger. Metoden disseksjon og skive presentert, kombinert med metoder som tidligere rapportert av andre17,18,19, vil tillate reproduserbar utarbeidelse av robust og levedyktig vev som mye tilpasses en rekke Eksperimenter med gnager hindbrain eller ryggmargen. Dissection presentert er svært detaljert og inkluderer rygg- og ventrale laminectomy samt omfattende detaljer om retning av hjernestammen-ryggmargen når forbereder skiver. Detaljert disseksjon og skive protokollen presentert lar forskeren inkludere alle kretser nødvendig for generasjon og overføring av Inspiratorisk rytme. De viktigste nevrale bestander/strukturene som kan hentes ved hjelp av denne metoden inkluderer: hypoglossal premotor neurons, hypoglossal motor kjernen og preBötzinger komplekse. Merk at områder av hjernestammen som inneholder sentrale CO2 sensorer eller ekspiratorisk rytme-generering kretser (RTN/pFRG) ikke er inkludert i utarbeidelse finnesher20,21. Når en blokk forberedelse eller skive er oppnådd, kan rytmisk aktivitet oppnås ved hjelp av suge elektroder, overflate elektrodene eller encellede opptak metoder som ekstracellulære enhet eller patch-klemanordning metoder3,10 ,11.
Målet med denne protokollen er en klar, lett-å-følge metode for å generere en hjernestammen ryggmargen forberedelse eller en tynn, rytmisk er aktiv skive. Denne protokollen bør være verdifulle for både erfarne og nye forskere interessert i å innlemme rytmisk hjernestammen/skive forberedelser i deres armamentarium, som det er flere viktige trinn detaljerte i prosedyrene som lette fange av robust, reproduserbare og langvarig rytmisk aktive skiver.
Når forskeren har blitt komfortabel med identifikasjon av anatomiske landemerkene og ferdigheter nødvendig for disseksjon, vil øke hastigheten på dissection og prosedyrene kan optimaliseres for hver individuelle etterforsker. Protokollen finnesher lærte senior forfatteren (CGW) under hans post-doc arbeid med Jeffrey Smith, opphavsmannen til rytmisk hjernestammen skive forberedelse3. For å sikre rytmisk aktivitet og levedyktighet både i skiver og en blokk forberedelser, skal alle prosedyrer for å generere en skive være ferdig innen ca 30 min fra begynnelsen av prosedyren til et stykke i innspillingen kammeret. Kontinuerlig perfusjon, det er svært liten innvirkning på vev levedyktighet men minimere tiden for disseksjon tillater lengre opptak og datainnsamling. For åndedretts studier, et stykke som så tynne som ca 280 µm tykk3 vil ha rytmisk, robust Inspiratorisk aktivitet, men skiver kan variere opp til 550 µm17,18,19,22. Forsiktig praksis er nødvendig for å utvikle de nødvendige ferdighetene for å utføre denne prosedyren og minimere variasjon i tykkelse og rostral-caudal plasseringen av hver skive. Inkludere eller ekskludere visse celle populasjoner vil påvirke kvalitet og robusthet av rytmisk aktivitet innhentet i senere inn som både eksitatoriske og inhibitory atomkjerner i hjernestammen kan påvirke "kvalitet" av rytmen innspilt fra sektoren 3.
Til slutt, det er også viktig at aCSF er forberedt helt etter protokollen, og er på et standardisert pH20, temperatur og oksygenering nivå. Anoksisk preparater kan ikke rytmisk aktive og vil påvirke dataene samling21.
Det er flere viktige trinn i prosedyren som forenkler en etterforsker fange levedyktig og rytmisk aktive forberedelser. Under det ventrale laminectomy, beholder dorsal ribbe buret tillater ekstra utnytter og gir mer vev for å sikre forberedelse ved utføring relativt delikat isolering av hjernestammen-ryggmargen fra virvelsøylen. Dissection trinnene finnesher tillate etterforskeren enkelt produsere en blokk forberedelser eller tynne skiver slik av nødvendighet, ekstra trinnene er detaljert som utelates for å hente bare en tynn skive. Andre nyttige tips inkluderer, mens du utfører det ventrale laminectomy, er det viktig å få et fast grep på ryggvirvel kroppen å løfte den oppover mens kuttet av nerve rootlets. Når hjernestammen-ryggmargen er dissekert og utdraget, må dura mater og gjenværende blodkar være dissekert av overflaten av nevrale vev. Blodkar og dura er tøff og kan hindre kutte en ren del av bladet vibratome. Disseksjon av dura er ikke viktig for en blokk forberedelse, men anbefales å optimalisere nerve-sug elektrode kopling. Til slutt, forsiktig og metodisk praksis i bruk av vibratome er nødvendig for kutte en ren, reproduserbare skive. Denne protokollen gir en svært omfattende liste med detaljerte trinn for disseksjon og kutte prosedyrer. Vekt her er å gi en trinnvis detaljert liste for en etterforsker å bruke som en pålitelig foundation og treningsverktøy som de kan endre deres laboratorium prosedyrer etter behov.
Som helhet representerer denne metodikken en tredve års utvikling av i vitro elektrofysiologi. Omfanget av denne artikkelen fokuserer på standardisering av en bloc og skjær hjernestammen ryggmargen innspillinger som vanligvis brukes for å studere Inspiratorisk aktivitet i P0-P5 rotter og mus22. Imidlertid kan disseksjon prosessen benyttes på tvers av en rekke dyr størrelser og aldre Art for en rekke studier, inkludert E18 rotter/mus, neonatal rotter og mus (postnatal dager 0 til 6) og voksne mus. Fremtidige studier kan bruke metodene presentert for å effektivisere protokoller over arter og aldre, slik at studier avhøre mekanismer i rytme generasjon eller annen fysiologisk prosess over både arter og aldre. Til slutt, endre retning, tykkelse eller plasseringen av skive eller en bloc forberedelse vil påvirke rytmisk aktivitet23. Omfattende litteratur er publisert tidligere angående nevrale befolkningen fanget av stykket prosedyrer og stereotaxic rat og mus Atlas tilgjengelig for å gi flere detaljer om nerve kretssystem diskutert her24, 25,26. Prosedyrene presenteres her gi omfattende detaljer med klart illustrasjoner som tillater en ny etterforsker å lære å kutte rytmisk skiver fra landemerker synlig under et laboratorium dissekere omfang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
S.B.P er en mottaker av en Loma Linda University sommer Undergraduate Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).
