Summary
Этот протокол как визуально общается спинного мозга подготовки и разъясняет подготовку ствола мозга поперечных срезов всеобъемлющим образом шаг за шагом. Он был разработан для увеличения воспроизводимость и повысить вероятность получения жизнеспособных, длительное, ритмично активные фрагменты для записи нейронной вывода из дыхательных регионов мозга.
Abstract
У млекопитающих вдоха ритм генерируется из нейронной сети в регионе мозга называется preBötzinger комплекс (КПБ), которая производит сигнал вождения Ритмичное сокращение мышц вдоха. Ритмические нейронной активности в КПБ и в других нейронов бассейны диск мускулатура дыхания могут быть изучены с использованием различных подходов, включая комплектно нерва и поперечный срез записей. Однако опубликованных ранее методы не описал подробно процесс вскрытия спинного мозга на основе прозрачной и воспроизводимость для будущих исследований. Здесь мы представляем всеобъемлющий обзор метод, используемый для герметизации нарезать ломтиками ритмично активные ствола мозга, содержащий необходимые и достаточные нейрональных схемотехника для генерации и передачи вдоха диск. Эта работа опирается на предыдущие протоколы электрофизиологии спинного мозга для повышения вероятности надежно получения жизнеспособных и ритмично активные фрагменты записи нейронов выходного от КПБ, подъязычного премоторной нейронов (XII ПМН), и подъязычный двигательных нейронов (XII MN). Работы, представленные расширяет предыдущий опубликованные методы, предоставляя подробный, шаг за шагом иллюстрации рассечения, от всего крыса щенка, в пробирке фрагмент, содержащий XII корешков.
Introduction
Респираторные нейронной сети мозга обеспечивает плодородные домен для понимания общие характеристики художественной нейронных сетей. В частности интерес является в развитие новорожденных грызунов дыхание и понять, как развивается ритм дыхания. Это может быть сделано с использованием многоуровневого подхода, в том числе в vivo весь животных плетизмографии экстракорпорального комплектно нерва записи и in vitro фрагмент записи, которые содержат генератор ритм дыхания. Редукционистской в vitro en блока и фрагмент записи являются выгодным методом для использования при опрашивания механизмы за дыхательной ритмогенеза и нейронные цепи в регионе спинного мозга развивающихся грызунов. Развивающихся дыхательная система включает в себя около 40 типов клеток, характеризуется стрельбы шаблон, в том числе из Центральной дыхательных1,2. Центральный дыхательных сеть включает в себя группу ритмично активных нейронов, расположенный в ростральной вентролатеральные продолговатого1,3. Млекопитающих дыхательных ритмогенеза генерируется из autorhythmic межнейронного сети называли preBötzinger комплекс (КПБ), которая была экспериментально локализован через срез и en блока подготовки новорожденных млекопитающих спинного мозга шнуры3,4,5,6,,78. Этот регион служит аналогичную функцию в синоатриальном узле (SA) в самом сердце и создает систему вдоха сроков для привода дыхания. От КПБ вдоха ритм осуществляется в других регионах мозга (включая ядро подъязычного двигатель) и позвоночника мотор бассейнов (например, диафрагмальный двигательных нейронов, которые привод диафрагмы)9.
Ритмической активности может быть получен с помощью спинного мозга en блока препаратов или фрагментов из различных клеточных популяций, в том числе С3-С5 нервных корешков, XII нервных корешков, ядро подъязычного двигатель (XII MN), подъязычного премоторной нейронов (XII ПМН), и КПБ3,10,,1112. Хотя эти методы сбора данных успешно через несколько лабораторий, многие из протоколов не представлены таким образом, чтобы полностью воспроизводимый для новых исследователей, входящие в область. Получения жизнеспособных и ритмично активных en блока и ломтик препаратов требует острого внимания к деталям через все шаги диссекции и ломтик резки протокола. Предыдущих протоколов подробно описывают различные процедуры записи и электрофизиологии, но не хватает деталей в наиболее важной частью получения подготовки жизнеспособных ткани: выполнение процедуры вскрытия и ломтик спинного мозга.
Эффективно получение ритмично активных и жизнеспособной en блока или ломтик подготовка спинного мозга электрофизиологии записей требует все действия правильно, тщательно и быстро (как правило, вся процедура связанных здесь может быть выступал в приблизительно 30 мин.) Критические точки протокола электрофизиологии спинного мозга, которые не были ранее хорошо описаны относятся рассечение нервных корешков и нарезки процедуры на vibratome. Этот протокол является первым поэтапного визуально общаться рассечение спинного мозга для новых исследователей и экспертов в области. Этот протокол также тщательно объясняет хирургические методы, достопримечательности и другие процедуры для оказания помощи будущих исследователей в стандартизации ломтиками и комплектно препараты содержат точные схемы, желательно в каждом эксперименте. Процедуры, представленные здесь могут использоваться в крысы и мыши новорожденных щенков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол принят и утвержден институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Лома Линда университета. NIH руководящие принципы этического обращения животных идут в всех животных эксперименты, проведенные в лаборатории. Все этические стандарты были поддержаны лицами, выполняя этот протокол.
1. решения
-
Подготовка искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО).
- Подготовьте свежие фаго вечером перед эксперимент в 1 Л пакетов с помощью следующих рецепт: 7.250 г NaCl (124 мм), 0.224 г KCl (3 мм), 2.100 g NaHCO3 (25 мм), 0.069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 мм), 0,247 g MgSO4 • 7 H2 O (1,0 мм) и 5.410 g D-глюкоза (30 мм), 0,221 g CaCl2 • 2 H2O (1,5 мм). Всегда последние добавьте CaCl2 • 2 H2O.
- Растворите в 1 Л деионизированной воды компоненты. Мешайте в течение 20-30 мин.
- Измерение pH фаго и приспособиться к 7.40 ± 0,02 с использованием малых объемов (обычно < 0,5 мл) разбавляют NaOH, KOH, или HCl.
Примечание: Подготовленные фаго может храниться в холодильнике (4 ° C, pH 7.40 ± 0,02) до трех дней, прежде чем рост бактерий влияет на жизнеспособность тканей во время эксперимента. Используйте фильтры 0,2 мкм для уменьшения загрязнения, грибков и бактерий, присутствующих в лаборатории после экспериментов может длиться до 36 ч. Для повышения эффективности фаго рецепт описал может быть расширены до 4 Л пакетов после тот же протокол и этот объем будет длиться до трех дней экспериментов.
2. Подготовка диссекции и Vibratome Рог
-
Установите лезвие.
- Используйте свежие обоюдоострый лезвия для резки ткани на vibratome. Промойте лезвие с 100% этанола и ополосните деионизированной водой до резки или щелкая лезвие пополам и вставка лезвие в держатель зажима на vibratome.
- Измените лезвие, каждый раз, когда новый препарат ткани монтируется на vibratome для нарезки или если она врезается в парафин плиты во время нарезки. Остатки парафина сделает практически невозможным аккуратно прорезать неонатальной нервной ткани.
-
Установите плиту парафина.
- Используйте любое встраивание стиль парафина. 10 g вложения средств массовой информации в тепло терпимо стекла стакан и использовать низкий тепла для плавления парафина бусы для жидкости.
- Добавить примерно 0,5 г порошка графита и смешать раствор тщательно и равномерно в жидкий парафин.
- Используйте небольшие пластиковые плиты как субстрат для парафина. Вырежьте небольшой (0,5 - 1 см толщиной и приблизительно 2 x 2 см2 широкий) кусок пластика (поликарбоната или алюминия могут также использоваться). Используйте файл машинист к царапинам канавки в пластмассу, asthis будет гарантировать, что парафин придерживается пластик.
Примечание: Кроме того используйте подогревом 18 G подкожных игл поместить угловых отверстий в лист, чтобы обеспечить, что смесь парафина графит придерживается пластик. - Использование задней аппликатор отзыв хлопок закапать смесь парафина графит на пластик, неоднократно погружением в расплавленный парафин графит смесь аппликатор, капает навозной жижи на пластиковый блок и строительство парафин Графит для приблизительно 1,5 см толщины на вершине пластик.
- После того, как достаточно толстый слой парафина графит смесь наносится на блок, установите блок сторону остыть и затем форма для размещения спинного мозга.
3. Вскрытие и изоляции Neuraxis
- Выполнение первоначального вскрытия и анестезии.
Примечание: животных, используемых в этом исследовании может варьируются в размерах от эмбриональных день 18 (E18) послеродового день 10-20 в мышей или крыс, начиная от E18 до послеродового день 5/6. Крыс или мышей любой деформации, лечения или пола может использоваться, в зависимости от экспериментальный дизайн. Выполните анестезии и предварительной диссекции под зонт с изофлюрановая используется (0,25 мл в камере 25 мл).- Вес щенка, а затем поместите его в камеру анестезии, содержащие 0,25 мл изофлюрановая, размещены на 2 x 2 дюйма2 кусок Марли. После того, как животное достигает хирургические плоскости анестезии (Проверено на мыс пинча с без вывода рефлекс), контактный животное на чашку Петри заполнены с парафином или силиконовые эластомера.
Примечание: Новорожденных грызуны также может быть под наркозом через cryoanesthesia13,14, изофлюрановая испарения15, или инъекции16 сбалансированы с кислородом. - Место животных вентральной стороне вниз и сделать срединной разрез от позади глаз в регион среднего поясничного отдела позвоночника с числом 10 или 11 скальпель лезвие или Ножницы хирургические. Отражать кожи и decerebrate животное на уровне теменной/затылочной шва (см. Рисунок 1) и снять кожу, transecting животное ниже диафрагмы. Затем удалите оружие, резка на плечевом суставе с ножницами или скальпелем.
- После удаления кожи, передачи животное перфузии палату с силиконовой elastomerin дно для дальнейшего вскрытие и подготовка спинного мозга.
- Пузырь фаго водохранилище (сторона порт бутылка 500 мл) непрерывно с охлажденным (4 ° C, pH 7.40 ± 0,02) фаго и кислородом с смесь 95% O2 и 5% CO2 (также называемые «Карбоген»). Во время вскрытия используйте охлажденные фаго периодически очищать камеру, обеспечивая свежего кислородом фаго всей изоляции спинного мозга.
Примечание: Красные кровяные клетки можно увидеть в оставшихся артерий и вен, и, когда достаточно кислородом, это ярко-красный. - Использовать перфузии самотечный поток через НКТ и краном, чтобы периодически или постоянно perfuse ткани с кислородом Фаго (болюс тома или через капельно медленно с помощью краном, примерно 0,5 - 1,0 мл/мин). Это насыщает кислородом тканей и поддерживает ясно операционного поля.
- Удалите избыток жидкости, при необходимости системой вакуумного всасывания фильтрации.
- Выполните рассечение, с использованием рассечения микроскопа. Модель непрерывного масштабирования предпочитают позволяют тонкая настройка увеличения и позволяют оптимальной визуализации региона интерес во время каждого шага рассечение.
Примечание: Микрохирургия инструменты рекомендуется включают в себя широкий спектр зубчатый ткани щипцы, тупой щипцы, #5 щипцы, угловой ткани щипцы, широкий спектр микро Рассекающий ножницы (Весна ножницы) и регулярные насекомых и микро Рассекающий булавки. - Подвергнуть мозг через середину линии часть черепа вдоль Сагиттальный шов затем придавить отраженного клапанами с микро Рассекающий булавками и закрепление позвоночника в хвостовой конец покрытые силиконовые нижней палаты рассечение, используя 27 G иглы.
Примечание: Остальная часть рассечение требует рассечение Микроскоп, чтобы обеспечить ясное представление о ткани и ориентиров для обеспечения максимальной вероятности получения художественной фиктивных вывода на краниальной корешками ствола мозга и корешков спинного мозга. Выполните эти шаги рассечение, с использованием средних весной ножницы или Ирис ножницы и тонкой щипцами.
- Вес щенка, а затем поместите его в камеру анестезии, содержащие 0,25 мл изофлюрановая, размещены на 2 x 2 дюйма2 кусок Марли. После того, как животное достигает хирургические плоскости анестезии (Проверено на мыс пинча с без вывода рефлекс), контактный животное на чашку Петри заполнены с парафином или силиконовые эластомера.
- Оперативно передать ствол изолированных животного газированных диссекцию камеры. Место на спинной стороне ткани вверх с ростральной конца (мозга) с видом на передней камеры. PIN-код ткани на плечи и наиболее хвостовой конец спинного мозга.
- Сделайте середине Сагиттальный разрез через череп после париетальной шовный материал, чтобы избежать повреждения коры головного мозга и ствола мозга, лежащие в основе черепа.
Примечание: Новорожденных костной ткани полностью не кальцинированная и является очень хрупким. Кости/ткани будет гибкой в степени, но жестче, чем окружающие соединительной и мышечной ткани. - Используйте средний весной или Ирис ножницы для СНиП затылочной швы черепа, начиная в Сагиттальный шов и боков. Это создаст «закрылки» черепа, что может быть отражено и возлагали на якорь в ростральной части черепа и обеспечить некоторую стабильность в ткани (см. Рисунок 2).
- После отражающие череп закрылки, отрезаны от остальной части коры головного мозга, оставляя хвостовой части мозжечка (червя) относительно нетронутыми (рис. 2B).
- Сделайте середине Сагиттальный разрез через череп после париетальной шовный материал, чтобы избежать повреждения коры головного мозга и ствола мозга, лежащие в основе черепа.
- Выполняйте спинного Ламинэктомия.
- Удаление мышц, окружающих черепа и позвоночного столба, с помощью микро весной ножницы, щипцы. Удаление ткани вдоль спинной стороне грудной клетки, оставляя нетронутыми, грудная клетка, как это будет закреплен позже якорь ткани во время вентральной ламинэктомии, свести к минимуму вероятность повреждения спинного мозга.
- Тщательно СНиП прочь боковой процессов позвоночной пластинки с использованием средних весной ножницы или ножницы штраф Ирис. Отрежьте любые ткани вышележащих моста и продолговатого мозга. Червя мозжечка, Понс и начале спинного теперь будет отчетливо видна (рис. 2C).
- Выполните брюшной Ламинэктомия.
- Поверните на спинной стороне ткани и закрепить в грудной клетке и наиболее хвостового конце позвоночника. Придавить ростральной части ткани с помощью заслонки черепа (рисA).
- Удаление вентральной половине грудной клетки, включая грудины и все органы брюшной полости, используя же ножницы и пинцет. Вскрыть прочь мягких тканей придает грудную клетку, подвергая ребер и спинного мозга (рис. 3B).
- Удалите язык, пищевода, трахеи, гортани и всех других мягких тканей и мускулатура вышележащих основания черепа и позвоночника (как показано на рис. 3C).
- Вскрыть ткани вышележащих жесткий поддон. Определение твердого неба, найдя прямоугольной пластины кости в основании черепа с V-образной отступ на него (рис. 3C). Разрезать вдоль средней линии неба, тщательно поднять его вверх и выполнить поперечный, вырезать, чтобы удалить его (рис. 4A).
- Начните вентральной ламинэктомии, удалив пластинки, подвергая вентральной поверхности ствола мозга и спинного мозга от первого шейного позвонка до приблизительно грудного позвонка 7 (Т7), как показано на рисунке 4B.
- На этой стадии вентральных корешков будет видимым. Использование малых микро рассечение или весной ножницы, позаботьтесь, чтобы сделать отрезоки как можно ближе к пластинки и как далеко от корни происхождения на спинной мозг как можно скорее; Избегайте растяжения корни.
- СНиП 5-10 мм по обе стороны позвоночника на пластинки. Не режьте слишком близко к спинного мозга или в позвонков. Этот шаг позволяет удаление шейных позвонков подвергать спинного мозга. Избегайте резки корешков.
- СНиП корешков примерно 20-25 мм (на двусторонней основе) вдоль позвоночника (примерно, T7). Во время этой процедуры Избегайте резки в спинной мозг и манипулировать края позвонков, как показано на рисунке 4C.
- Удаление C1, C2 и C3 осторожно подняв ростральной краю каждого из позвонков и тесно ножниц под кость. Чем ближе к кости, что производится разрез, чем дольше корешок. Используйте крючок или изогнутые щипцы для помощи достижение крепко на каждом шейного позвонка делая сокращений (рис. 4C).
- После желаемой длины спинного изолирована и расчлененный от позвоночного столба, сделать поперечного раскроя для удаления спинного мозга (рис. 5A и 5 рисунокB).
- Удаления твердой мозговой оболочки.
Примечание: изолированные ствола мозга-спинного может использоваться для комплектно в пробирке записи, как было ранее описано3,7. С мозга-спинного мозга удалены от позвоночного столба чтобы обеспечить оптимальный доступ для всасывания электродов для выполнения записи от отрезока черепа и позвоночника rootles должны быть удалены Дура. Кроме того удаление Дура делает возможным чисто срез ствола мозга и получить ритмично активных тонкими ломтиками для записи в пробирке.- Тщательно ПИН, изолированные спинного мозга шнур ткани спинной стороне вверх чтобы разрешить доступ к Дура, окружающих черепной rootles (рис. 5B). Штифты должен применяться через боковые поля ствола мозга, Ростральные XII корешков.
- Снимите дура от дорсальной поверхности ствола мозга, подняв дура с тонкой щипцами (#5) на спинной маржа Дура и отрезать от бокового к медиальному по всей длине ствола мозга с тонкой весной ножницами. Будьте осторожны избежать резки в ствол головного мозга, сам. Аккуратно поднимите кровеносных сосудов от поверхности ствола мозга и вырезать избежать препятствий vibratome лезвие при резании ствола мозга.
- Тщательно анализировать дура от медиальной и латеральной аспектов ствола мозга, как корешков черепных нервов проходят через Дура и легко разорвал прочь когда поднял Дура. Свести к минимуму вероятность корешков снял резанием осторожно вокруг них с небольшой весной ножницами.
- Флип спинного мозга, так что вентральной поверхности обращена вверх и черепной корешков, четко видны. Вскрыть дура от спинной стороне ствола мозга, осторожно подняв Дура непосредственно через район postrema, резка с ростральной хвостовой. Postrema области появится слегка розовый из-за большого количества microcapillaries, perfusing этот регион.
- Используйте штраф насекомых ПИН для дразнить прочь любые оставшиеся Дура и удалить оставшиеся кровеносных сосудов в непосредственной близости от головы и шейки матки корешков.
4. slice протокол
- После удаления Дура, место ствола мозга в центре платформы парафина на пластиковый блок (в дальнейшем именуемый «режущий блок»). Штифт хвостовой конец ствола мозга через дистальной спинной мозг с помощью тонкой насекомых контакты, которые были сокращены до не более чем 1 см в длину, как показано на рис. 5C.
- Выровняйте парафин охватывает резки блок с закрепленного ствола мозга в держатель блока vibratome так, что лезвие отрубы перпендикулярно на Ростральных лицо ствола мозга.
- Сделайте первоначальный срез удалить неравномерным, посторонние ткани на конце ростральной большинство. Этот первоначальный разрез может быть, 200-300 мкм обычно, но тщательно избегать удаления IX, X и XII черепной корешков. Этот шаг обычно покажет хвостового степени лица ядра (VII) и Языкоглоточного корешков и делает возможным согласовать ствола мозга, таким образом, чтобы его лицо пар плоские vibratome лезвие. Сделать небольшие изменения при необходимости обеспечить пар плоскостность и сделать небольшие разрезы для удаления тканей, что является неравномерным.
Примечание: Корешков Языкоглоточного (IX) будет отображаться на краю бокового ствола мозга, как одно режет каждый последовательных фрагментов, и они обеспечивают ориентир для rostro хвостового расстояние до ствола мозга нейронной схемы, необходимые для ритм поколения. На вентральной стороне ствола мозга, подъязычного Корешков (XII) также должны быть видны слегка хвостового вырезать лицо, показаны IX корешков. Окончательный ориентир будет obex (точка в на котором четвертого желудочка сужает стать Центральный канал спинного мозга человека) на спинной стороне ствола мозга. С этими тремя точками отсчета видно, правильный секущей плоскости создан (см. Рисунок 6A) и ритмично активный срез будет надежно получено. - Продолжайте резки ростральной в хвостовой до IX корешков находятся вблизи поверхности вырезать лица ствола мозга.
- Обратитесь к рис для памятников и правильной ориентации. Отрегулируйте парафин плиты в зажим vibratome, так что следующий угол перерезка создаст фигуру весьма незначительные «клина» на вырезать фрагмент и нарезать ломтиками примерно 100-200 мкм до тех пор, пока достопримечательности описаны может быть хорошо видно(рис. 6).
Примечание: Этот небольшой клин увеличивает количество XII двигательных нейронов, захвачен в срез и максимизирует вероятность получения ритмической активности во время записи. С помощью ориентиров описано (Ростральные корешков от Языкоглоточного нерва расслоение, корешков от подъязычный нерв расслоение, obex) будет гарантировать, что срез можно воспроизвести содержит по крайней мере большая часть КПБ (Рисунок 6B). - Вырезать 300-500 мкм срез ствола мозга от этих ростральной нейроанатомический маркеров для захвата КПБ и связанные цепи передачи.
Примечание: «Идеальный» фрагмент будет содержать наиболее ростральной корешок подъязычный корешок расслоение надежно получить вдоха деятельность не прибегая к поверхности записи с помощью всасывания электрод через ритм генерации/передачи локусов в пределах ствола мозга.
5. запись процедуры
- Место среза в камере запись, постоянно perfuse с Фаго (0,5 - 1,0 мл/мин) и использовать всасывания или внеклеточная электродов для активности записи населения от XII корешков или от КПБ, XII ПНЛ или XII мотонейронов. Для процедур подробные записи смотрите предыдущие публикации по электрофизиологии спинного мозга и патч зажима10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленные здесь метод позволяет исследователь заинтересован в получении ритмично активные срезы мозга можно воспроизвести и надежно отрезать кусочек жизнеспособной, надежный, которые позволят запись фиктивных мощность двигателя для многих часов. Все элементов минимально необходимые нейронных цепей для генерации и передачи вдоха ритма могут быть захвачены в тонкий ломтик с помощью этого метода. Эти элементы включают в себя: preBötzinger комплекс, премоторной нейронов, проектирование подъязычный двигательных нейронов (pXII MNs) и подъязычного моторных нейронов (XII MNs) и подъязычный нерв корешков. КПБ, XIIn и C4 нервных корешков обычно используются для вдоха ритм записей, как показано на рисунке 7.
Успешное использование этой процедуры будет производить блока подготовки жизнеспособных и ритмично активных en в 10-15 мин, или ритмично активный срез в < 30 мин. После изоляции комплектно ствола мозга-спинного мозга или тонкий ломтик 15 минут уравновешивания в зале записи достаточно для производства фиктивных мощность двигателя. В случае срез увеличение внеклеточного [K +] до приблизительно 8-9 мм будет производить надежные нейронных диск, который может длиться от 24 до 36 h в этой лаборатории опыт. Подготовка должна быть постоянно superfused с carbogenated (95% O2/5% CO2) и подогревом Фаго (~ 27 ° C). Успешное Анатомирование выполняются быстро и избежать щипать, растяжения или повреждения нервных корешков, используемый для записи. Для получения оптимальных результатов все шаги процедуры выполняются быстро и ткани должны быть купались или непрерывно увлажненную с carbogenated фаго при выполнении диссекции и изоляции тканей (как описано выше). Обширные сведения о нейроанатомия и точные атласы мозга смотрите работу Ruangkittisakul et al.13,14, Ballanyi15 и коллег. Протокол, представленные здесь является одним из методов, который оказался надежным в лаборатории старший автор и этот отчет предоставляет графический, шаг за шагом метод для генерации этих фрагментов, полагаясь только на поверхности ориентиры видны ствола мозга или в пределах ствола мозга как подробно здесь.
Рисунок 1 : Начальная диссекции для извлечения спинного мозга. (A) щенка Anesthetized удержал для рассечения. Пунктирные линии показывают разрез руководящие принципы для Сагиттальный разрез в коже и поперечные отрубы хвостового глаза и ниже диафрагмы. (B) руководство для удаления кожи и передние конечности животного. (C) спинной кожурой грызунов. Пунктирные линии показывают разрез руководящие принципы для черепа щиток «раскладушка» экспозиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Этапы спинного Ламинэктомия. (A) пунктирные линии указывают разрез руководящие принципы для удаления головного мозга. (B) результат после удаления ткани. Пунктирные линии показывают разрез руководящие принципы для спинного Ламинэктомия. (C) Exposed спинного мозга шнур, следуя спинного Ламинэктомия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Этапы начальной вентральной рассечение. (A) вентральной стороне кожурой грызунов с отрубленной переднего мозга и живота. Пунктирные линии показывают разрез руководящие принципы для удаления процесса xyphoid и открыв грудную клетку впоследствии удалить органов брюшной и грудной полости. Органы брюшной и грудной полости (B) удалены. (C) орофарингеальной области структуры удалены. Пунктирные линии показывают разрез руководящие принципы для удаления твердого неба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Этапы вентральной Ламинэктомия. (A) твердого неба и оставшиеся части черепа удалены. Разрез руководящие принципы указывают как удалить оставшиеся тканей, окружающих спинного мозга. (B) первого шейного позвонка (C1) подвергаются. (C) демонстрация на отмену C1 и поперечного раскроя для тела позвонка удалить его. Нервы аккуратно вырежьте заподлицо на спинной стороне тела позвонка перед ее удалением. Это наиболее важным этапом в рассечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Подготовка спинного мозга для нарезки. (A) C1-C3 удалены от спинного мозга. Разрез руководящие принципы указывают где разорвать ствола мозга-спинного мозга от хвостового спинного. (B) вентральной стороне спинного мозга с метками нервных корешков. Разрез руководящие принципы указывают Рекомендуемые перерезка или оставшиеся ростральной структур в Понто Медуллярная перед записью из этого региона спинного мозга. (C) парафин плиты установки для нарезки на vibratome. Нарезки регион включает в себя ткани между черепных нервов IX и XII. Не размещайте микро Пен в область срезов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Достопримечательности, используемый для получения фрагментов с нетронутыми ядро подъязычного двигатель и комплекс PreBötzinger. (A) поперечной вид спинного мозга после того, как первоначальный разрез был сделан ростральной корешков Языкоглоточного (IX). Разрез руководящего указывает уровень перерезка просто каудально к подъязычной Корешков (XII). (B) ориентация блока парафина лезвие перед вырезанием фрагмента, содержащий КПБ и ядро подъязычного двигатель. Создание вырезать фигуру трапециевидной «клина» увеличивает вероятность захвата достаточно вдоха нейронов в срез для получения ритмической активности во время записи. Клин будет включать в себя КПБ, подъязычного премоторной нейронов и подъязычного двигательных нейронов, которые совместно обеспечивают необходимые цепи для передачи ритмических диск, который является индекс дыхательных ритмогенеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Представитель записи из en блока или ломтик препаратов. (A) интегрированный след от XII корешок. (B) интегрированный след от КПБ. Запись от КПБ с помощью подготовки блока en потребует слепой фиксации. (C) интегрированный след от корешок нерва C4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Адаптация протокола представлены здесь в en блока или ломтик рабочего процесса является выгодным для лабораторий и исследования, которые хотели бы использовать либо комплектно ствола мозга-спинного мозга и/или тонкий ломтик подготовка к записи электрофизиологии. Метод вскрытия и ломтик представил, в сочетании с методами сообщалось ранее другими17,18,19, позволит воспроизводимые подготовки надежной и жизнеспособной ткани, которая широко адаптируемым к ряду эксперименты с использованием грызунов задний мозг или спинного мозга. Рассечение представил весьма подробные и включает в себя дорсальной и вентральной ламинэктомии, а также обширные детали относительно ориентации спинного мозга при подготовке к нарезать ломтиками. Представил подробные диссекции и ломтик протокол позволяет исследователю включают все схемы, необходимые для генерации и передачи вдоха ритма. Основные нейронных популяций/структуры, которые могут быть захвачены с использованием этого метода включают: Подъязычный премоторной нейронов, ядро подъязычного двигатель и preBötzinger комплекса. Обратите внимание, что области мозга, которые содержат Центральной CO2 датчиков или выдоха ритм генерации цепей (RTN/мнения) не включены в подготовке подробно здесь20,21. После того, как был получен en блока подготовки или срез, ритмической активности может быть получен с помощью всасывания электродов, поверхности электродов или одноклеточных записи методов, таких как внеклеточного единица или патч зажима методы3,10 ,11.
Цель настоящего Протокола заключается в том, предоставить четкие, easy-to последующие метод для генерации спинного мозга подготовки или тонкий, ритмично активный срез. Этот протокол должен быть ценным, как опытных, так и новых исследователей, заинтересованных в деле включения художественной ствола мозга/ломтик препаратов в их арсенале, как есть несколько критических шагов, подробно в рамках процедур, которые облегчают захват надежные, воспроизводимые и long-lasting ритмично активных фрагментов.
Как только исследователь стало комфортно с идентификации анатомические ориентиры и навыков, необходимых для вскрытия, увеличит скорость рассечение, и процедуры могут быть оптимизированы для каждого индивидуального следователя. Протокол, подробно здесь преподавали старший автор (CGW) во время его докторской работы с Джеффри Смита, составитель художественной мозга фрагмент подготовки3. Для обеспечения художественной деятельности и жизнеспособности в фрагменты и en блока подготовки, все процедуры для создания фрагмента должна быть завершена в течение примерно 30 мин от начала процедуры на фрагмент записи камеры. С непрерывной перфузии существует весьма незначительное воздействие на жизнеспособность тканей, но свести к минимуму время диссекция позволяет дольше записи и сбора данных. Для дыхания исследования ломтик, тонкие, как приблизительно 280 мкм толщиной3 будет иметь художественной, надежные вдоха активность, но фрагменты могут варьироваться до 550 мкм17,18,19,22. Для приобретения необходимых навыков для выполнения этой процедуры и минимизировать изменчивость в толщину и Ростральные хвостовой позиции каждого ломтика требуется тщательная практика. Включая или исключая определенных клеточных популяций будут влиять на качество и надежность художественной деятельности, полученные в позднее запись как возбуждающим и тормозящий ядер в стволе головного мозга может влиять «качество» ритм, записанные с ломтик 3.
Наконец важно также и то, что фаго готовится точно в соответствии с протоколом и находится на уровне20, температуры и оксигенации стандартизированных рН. Аноксии препараты не будет ритмично активной и будет влиять на данных коллекции21.
Есть несколько ключевых шагов в процедуре, которые облегчают захват следователь жизнеспособных и ритмично активных препаратов. В вентральной ламинэктомии сохранении спинной грудной клетки позволяет дополнительные рычаги и предоставляет больше ткани для обеспечения подготовки во время выполнения относительно тонкий изоляции спинного мозга от позвоночного столба. Рассечение, описанные здесь шаги позволяют что следователь легко производить en блока подготовки или тонкими ломтиками так, при необходимости, дополнительные шаги подробно, что может быть опущен для получения только тонкий ломтик. Другие полезные советы включают в себя, выполняя вентральной ламинэктомии, важно получить крепко на тела позвонка, чтобы поднять его вверх при разрыве нервных корешков. После того, как ствол головного мозга-спинного расчлененные и извлечены, твердой мозговой оболочки и оставшиеся сосудистую должны расчлененный офф поверхности нервной ткани. Кровеносные сосуды и дура жесткой и может предотвратить vibratome лезвие от резки чистый срез. Рассечение Дура не имеет жизненно важное значение для подготовки блока en, но рекомендуется для оптимизации электрода нерва Всасывающие муфты. Наконец тщательного и методические практика использования vibratome необходимых для резки чистой, воспроизводимых фрагментов. Этот протокол обеспечивает весьма всеобъемлющий список шагов для резки процедур и dissection. Акцент здесь-обеспечить поэтапный подробный список для следователя для использования в качестве надежной основой и средство обучения, из которых они могут изменять свои лабораторные процедуры при необходимости.
В целом эта методология представляет тридцать лет эволюция методов экстракорпорального электрофизиологии. Сфера охвата этого документа целиком посвящен стандартизации и фрагмент записи спинного мозга, которые обычно используются для изучения вдоха деятельности в P0-P5 крыс и мышей22. Однако этот рассечение процесс может использоваться в различных животных размеров, возрастов и видов для широкого спектра исследований, в том числе E18 крысы/мыши, новорожденных крыс и мышей (послеродовых дней от 0 до 6) и взрослых мышей. Будущие исследования могут использовать методы, представлены для упорядочения протоколы разных видов и возрастов, позволяя исследования допросить механизмов в поколение ритм или другие физиологические процессы разных видов и возрастов. В конечном счете изменение ориентации, толщина или расположение фрагмента или комплектно подготовка будет влиять художественной деятельности23. В прошлом была опубликована обширная литература о нейронных популяций Захваченный фрагмент процедур и есть стереотаксического крысы и мыши атласы для предоставления более подробно о нейронной схемы обсуждали здесь24, 25,26. Процедуры, представленные здесь предоставляют обширные детали с четких иллюстраций, которые позволяют новый следователь научиться вырезать художественной ломтика от достопримечательностей легко видны под лабораторию, пройдя через область.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
S.B.P является получателем Лома Линда университета летом Бакалавриат стипендии для проведения исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).
