Summary
Amphiphilic guld nanopartikler kan bruges i mange biologiske applikationer. En protokol til syntetisere guld nanopartikler belagt med en binær blanding af ligander og en detaljeret karakterisering af disse partikler er præsenteret.
Abstract
Guld nanopartikler belagt med en blanding af 1-octanethiol (OT) og 11-mercapto-1-undecane sulfonsyre (MUS) er blevet grundigt undersøgt på grund af deres interaktioner med cellemembraner, lipid bilayers, og vira. De hydrofile ligander gør disse partikler kolloid stabile i vandige opløsninger og kombinationen med hydrofobiske ligander skaber en amfifile partikel, der kan læsses med hydrofobe stoffer, fusionere med lipid membraner, og modstå uspecifikke protein adsorption. Mange af disse egenskaber afhænger af nanopartikler størrelse og sammensætningen af ligand skallen. Det er derfor afgørende at have en reproducerbar syntetisk metode og pålidelige karakterisering teknikker, der gør det muligt at bestemme nanopartikel egenskaber og ligand Shell sammensætning. Her præsenteres en en-faset kemisk reduktion, efterfulgt af en grundig rensning for at syntetisere disse nanopartikler med diametre under 5 nm. Forholdet mellem de to ligander på overfladen af nanopartiklen kan justeres gennem deres støkiometriske forhold, der anvendes under syntesen. Vi demonstrerer, hvordan forskellige rutinemæssige teknikker, såsom transmission elektronmikroskopi (TEM), nuklear magnetisk resonans (NMR), termo gravimetrisk analyse (TGA), og ultraviolet-synlige (UV-Vis) SPEKTROMETRI, er kombineret til omfattende karakterisere nanopartiklenes fysisk-kemiske parametre.
Introduction
Ligand skallen af guld nanopartikler kan være konstrueret til at udstille flere forskellige egenskaber, der kan anvendes til at løse udfordringer i biomedicin1,2,3,4. En sådan alsidighed gør det muligt at kontrollere de intermolekylære interaktioner mellem nanopartikler og biomolekyler5,6,7. Hydrophobicity og opladning spiller en afgørende rolle, samt andre overflade parametre, der påvirker, hvordan nanopartikler interagerer med biomolekyler5,8,9. For at finjustere nanopartiklernes overfladeegenskaber tilbyder valget af de thiolatmolekyler, der udgør ligand skallen, et utal af muligheder i henhold til de ønskede egenskaber. For eksempel bruges en blanding af ligand-molekyler med hydrofobe-og hydrofile (f. eks.ladede) grupper ofte til at frembringe amphifilic nanopartikler10,11.
Et fremtrædende eksempel på denne type nanopartikler er beskyttet af en blanding af OT og mus (i det følgende benævnt mus: OT nanopartikler), som har vist sig at besidde mange relevante egenskaber12,13,14. For det første, med en ligand Shell sammensætning af 66% MUS (herefter 66:34 MUS: OT), er den kolloid stabilitet af nanopartiklerne høj, nå op til 33% i vægt i deioniseret vand, samt i fosfat-bufferet saltvandsopløsning (1x, 4 mM fosfat, 150 mM NaCl)15. Desuden udfældes disse partikler ikke ved relativt lave pH-værdier: for eksempel ved pH 2,3 og med saltkoncentrationer på 1 M NaCl15forbliver disse nanopartikler koldally stabile i månedsvis. Det støkiometriske forhold mellem de to molekyler på ligand skallen er vigtigt, fordi det dikterer kolloid stabilitet i opløsninger med en høj ionstyrke16.
Disse partikler har vist sig at krydse cellemembranen uden at porere det, via en energi-uafhængig pathway1,12. Den spontane fusion mellem disse partikler og lipid bilag ligger til grund for deres difsivitet gennem cellemembraner17. Mekanismen bag denne interaktion er minimering af kontakten mellem et Hydrofobisk opløsningsmiddel tilgængeligt overfladeareal og vandmolekyler ved fusion med lipid-bilag18. Sammenlignet med All-MUS nanopartikler (nanopartikler, der kun har MUS ligand på deres shell), den højere hydrofobicitet på blandede MUS: OT nanopartikler (for eksempel ved en 66:34 MUS: OT sammensætning) øger span af kernen diameter, der kan fusionere med lipid bilag18. Forskellige selvsamlings organisationer af ligand Shell korrelerer til særskilte bindings tilstande på 66:34 MUS: OT nanopartikler med forskellige proteiner, såsom albumin og ubiquitin, sammenlignet med All-MUS partikler19. For nylig er det blevet rapporteret, at 66:34 mus: OT nanopartikler kan anvendes som en bredspektret antiviral middel, der uigenkaldeligt ødelægger virus på grund af multivalente elektrostatiske bindinger af mus ligander og ikke-lokale koblinger af OT ligander til kapsid proteiner14. I alle disse tilfælde er det blevet konstateret, at det hydrofobe indhold, samt kerne størrelsen af nanopartiklerne, afgør, hvordan disse bio-Nano interaktioner finder sted. Disse forskellige egenskaber af MUS: OT nanopartikler har foranlediget mange computersimulation undersøgelser, der har til formål at afklare de mekanismer, der understøtter samspillet mellem MUS: OT partikler og forskellige biologiske strukturer såsom lipid bilag20.
Forberedelsen af MUS: OT-beskyttede AU nanopartikler udgør nogle få udfordringer. For det første er det opladede ligand (MUS) og det hydrofobiske ligand (OT) ublandbar. Således, opløseligheden af nanopartikler og ligander skal tages i betragtning i hele syntesen, samt under karakterisering. Desuden, renheden af MUS ligand molekyler-især indholdet af uorganiske salte i udgangsmaterialet-påvirker kvaliteten, reproducerbarhed, samt den kort-og langsigtede kolloid stabilitet af nanopartikler.
Her er en detaljeret syntese og karakterisering af denne klasse af amphifilic guld nanopartikler beskyttet af en blanding af MUS og OT er skitseret. En protokol til syntesen af den negativt ladede MUS ligand er rapporteret at sikre renhed og dermed reproducerbarhed af forskellige nanopartikler synteser. Derefter er proceduren for at generere disse nanopartikler, baseret på en fælles en-faset syntese, efterfulgt af grundig rensning, rapporteres i detaljer. Forskellige nødvendige karakteriserings teknikker21, såsom tem, UV-Vis, TGA, og NMR, er blevet kombineret for at opnå alle de nødvendige parametre for eventuelle yderligere biologiske eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntese af 11-mercapto-1-undecanesulfonat (MUS)
Bemærk: denne protokol kan anvendes i enhver skala, der ønskes. Her beskrives en 10 g skala-of-produkt.
- Natriumundec-10-enesulfonat
- Tilsæt 11-Bromo-1-undecene (25 mL, 111,975 mmol), natriumsulfit (28,75 g, 227,92 mmol) og benzyltriethylammoniumbromid (10 mg) til en blanding af 200 mL methanol (MeOH) og 450 mL deioniseret (DI) vand (4:9 v/v MeOH: H2O ratio) i en 1 L rund-bund kolbe .
- Reaktionsblandingen reflux ved 102 °C i 48 h. cap systemet med en Tryk relief mekanisme-for eksempel en ballon med en nål, eller blot en nål. Denne reaktion er ikke følsom over for atmosfæriske gasser.
Bemærk: opløsningen bliver farveløs, når reaktionen er færdig. - Reaktionsblandingen tilsluttes en rotationsfordamper for at fordampe MeOH og reducere volumen til ca. 300 mL.
- Overfør den resterende opløsning til en 1 L-addition tragt.
- Udpak den resterende vandige opløsning 5x med diethylether med tilsætning af tragten. Ureagerede 11-Bromo-1-undecene forbliver i diethylether fasen og det sulfonerede produkt i H2O.
Forsigtig: frigør tryk ophobning hyppigt under ekstraktionen, og se den korrekte brug af addition tragte. - Den endelige udvundne Vandopløsning opsamles i en 1 L rund kolbe med enkelt hals.
- Reaktionskolben tilsluttes en rotationsfordamper ved at sætte en smule fedt (eller Teflon ring strimler eller anden fugemasse) mellem kolben og fælden.
- Sænk vakuum langsomt for at fordampe den vandige fase i en rotationsfordamper. Da produktet er et overfladeaktivt stof, vil skumdannelse forekomme under fordampningen. Du kan omgå dette problem ved at følge instruktionen i næste trin.
- Tilsæt ethanol til blandingen for at accelerere fordampningen af H2O og undgå skumdannelse. Når skumdannelse genstarter på grund af nedgangen i ethanolindholdet, skal fordampningen standses, kolben fjernes fra rotationsfordamper, tilsættes mere ethanol (ca. en tredjedel af den samlede mængde), og kolben tilsluttes til rotationsfordamper. Gentag denne proces, indtil opløsningens blanding falder betydeligt og ikke danner bobler.
- Tør det hvide pulver direkte ved at slutte kolben til et højt vakuum. Den tørretumbler pulveret, de mindre uorganiske salte vil krybe ind i de efterfølgende trin.
Bemærk: varme kan bruges til at tørre produktet — for eksempel ved at holde kolben under vakuum i et 60 °C bad og til venstre natten over. - Det hvide pulver suspenderes i 400 mL methanol i en kolbe. Sonicate for at opløse den maksimale mængde af produktet.
Bemærk: målet med dette trin er at opløse produktet, men ikke de uorganiske biprodukter, såsom overskydende natriumsulfit og natrium bromid, der har begrænset Opløselighed i methanol. Brug methanol med det lavest mulige vandindhold, da vand i methanol vil øge opløseligheden af de uorganiske biprodukter i solvensen. - For at øge opløseligheden af produktet, methanol kan opvarmes forsigtigt tæt på sit kogepunkt (~ 64 °C).
Forsigtig: Sørg for at arbejde under en stinkhætte under opvarmningen af kolben. Dampene af den fordampede methanol er farlige. - Filtrer opløsningen for at fjerne methanol uopløselige uorganiske biprodukter. Brug en filter kolbe, der er sluttet til en vakuumpumpe, og en filtrerings tragt med kvantitativ filtrerpapir eller et borosilicat. Både produktet og de uorganiske salte er hvide pulvere, når det er tørt: produktet er opløseligt i methanol, mens salte ikke er.
- Den filtrerede opløsning fra filter kolben overføres til en 1 L rund bund kolbe.
- Kolben sluttes til en rotationsfordamper, og methanolopløsningen inddamperes ved 45 °C, det hvide pulver opløses i methanol, og opløsningen filtreres (protokol trin 1.1.7, 1.1.8 og 1.1.9). Gentag denne proces mindst 2x, at reducere mængden af uorganisk salt.
- Saml det hvide methanol opløselige pulver (ca. 30 g, i denne skala).
- Der opløses ca. 10 mg produkt i 500 μL D2O, og opløsningen overføres til et NMR-rør.
- Udfør 1H NMR massespektrometri på produktet i D2O ved 400 MHz med 32 scanninger.
Bemærk: spids opgaverne for 1h NMR (D2O) er 5,97 (m, 1h), 5,09 (m, 2h), 2,95 (t, 2h), 2,10 (m, 2h), 1,77 (q, 2h), 1,44 (br s, 12h).
- Natrium 11-acetylthio-undecanesulfonat
- Den omtrentlige 30 g natrium undec-10-enesulfonat (reaktionsproduktet i punkt 1,1) opløses i 500 mL methanol inde i en 1 L rund-bund kolbe. Tilsæt et 2,6 x overskydende thioeddikesyre til opløsningen, og rør det foran en UV-lampe (250 W) i natten (~ 12 h). Hvis der ikke findes en UV-lampe, kan reaktionen udføres ved hjælp af en radikal igangsætter, såsom azobisisobutyronitril (AIBN); Det anbefales dog kraftigt at anvende en UV-lampe.
Forsigtig: Sørg for at arbejde under stinkhætten hele tiden. Hvis kolben skal transporteres til et andet sted, hvor UV-lampen er anbragt, forsegles kolben for at undgå at sprede den kraftige lugt af thioeddikesyre. Der skal udvises forsigtighed ved betjening af en UV-lampe: helt blokere det rum, hvor lampen er placeret, og se institutionens sikkerhedsretningslinjer for, hvordan en UV-lampe betjenes. - Overvåge reaktionen ved at tage ~ 2 ml aliquoter fra reaktionen, fordampe opløsningsmiddel, og tilsæt deuterede vand til at tjekke med 1H NMR. Når toppene, der svarer til dobbelt obligationen, forsvinder, skal reaktionen stoppes.
Bemærk: efter 12 timer foran UV-lampen er reaktionen som regel fuldført. Hvis reaktionsblandingen bliver uklar, tilsættes flere MeOH og fortsætte eksponeringen for UV-lys i seks ekstra timer. - Alle MeOH inddamperes i en rotationsfordamper, indtil den faste rest bliver orange-rød. Hvis produktet er efterladt længe nok, bliver det brunt til sort.
Forsigtig: Arbejd mindsomt på grund af de kraftige lugte fra thioeddikesyre. Den kraftige lugt af alle thiolatudslip kan neutraliseres ved hjælp af en vandig opløsning af blegemiddel (natriumhypochlorit). - Ved hjælp af en filtrerings kolbe vaskes produktet med diethylether for at fjerne overskydende thioeddikesyre, indtil der ikke forekommer mere farvede (orange-gule) stoffer i diethylether supernatanten. Tør fast under højt vakuum og derefter opløse det i methanol, giver en gul til orange opløsning.
Bemærk: Tilsæt nok methanol til at opløse produktet.
Bemærk: farven kan variere på dette trin. - Tilsæt 3 g Carbon Black til opløsningen, bland kraftigt, og Filtrer blandingen gennem filtreringsmediet (Se tabel over materialer), der dækker to tredjedele af et skyllede filterpapir.
Bemærk: den porøse struktur af Carbon Black fanger det farvede side-produkt materiale (og nogle af produktet). Den filtrerede opløsning skal være klar. Hvis den filtrerede opløsning stadig er farvet (gul), skal du gentage denne proces. - Opløsningsmidlet inddamps fuldstændigt i en rotationsfordamper, og der opsamles ca. 35 g hvidt pulver.
- ~ 10 mg af produktet opløses i ~ 500 μL D2O, og opløsningen overføres til NMR-rør.
- Udfør 1H NMR på produktet i D2O på 400 MHz med 32 scanninger.
Bemærk: spids opgaverne for H NMR (D2O) er 2,93 (t, 4h), 2,40 (s, 3h), 1,77 (m, 2H), 1,62 (m, 2H), 1,45 (br s, 14H).
- Den omtrentlige 30 g natrium undec-10-enesulfonat (reaktionsproduktet i punkt 1,1) opløses i 500 mL methanol inde i en 1 L rund-bund kolbe. Tilsæt et 2,6 x overskydende thioeddikesyre til opløsningen, og rør det foran en UV-lampe (250 W) i natten (~ 12 h). Hvis der ikke findes en UV-lampe, kan reaktionen udføres ved hjælp af en radikal igangsætter, såsom azobisisobutyronitril (AIBN); Det anbefales dog kraftigt at anvende en UV-lampe.
- 11-mercapto-1-undecanesulfonat (mus)
- Refluks natrium 11-acetylthio-undecanesulfonat ved 102 °C i 400 mL af 1 M HCl i 12 h for at kløve thioacetat gruppen og opnå en thiol.
- Produktet overføres til en 1,5 L eller 2 L rund bund kolbe. Der tilsættes 200 mL 1 M NaOH til den endelige opløsning, og den øverste del af den med 400 mL DI vand for at få et endeligt volumen på 1 L. Dette vil holde opløsningen sure og forhindre krystalliseringen af uorganiske salte som biprodukt.
Bemærk: en fuldstændig neutralisering af opløsningen til pH 7 vil resultere i krystalliseringen af et produkt, der er uopløseligt i methanol. - Opbevar den klare opløsning ved 4 °C, og den vil krystalatisere natten over. Produktet krystalliserer som fine krystaller, der er viskøse, når de er våde.
Bemærk: for at fremskynde krystalliseringen tilsættes presynthesized MUS til opløsningen, hvis den er tilgængelig. - Den tydelige supernatanten centrifugeres, og det viskøse hvide produkt nedbrydes i 50 mL-centrifugeglas i 5 minutter ved 4.000 x g.
- Supernatanten hældes i en anden kolbe, og de hvide pellets tørres under højt vakuum – afhængigt af den tilgængelige centrifuge kan dette være 2-16 rør eller mere.
Bemærk: filtrering tilrådes ikke på grund af produktets overfladeaktive karakter; der vil forekomme overdreven skumdannelse, og det meste af produktet vil gå tabt. - Der opsamles ca. 12 g (ca. 30% udbytte) af methanol-opløselig MUS fra dette rensningstrin.
Bemærk: Vær opmærksom på, at pulveret er fint og elektrostatisk-det har tendens til at holde sig til spatler og overfladerne af containere. Desuden kan mere materiale ekstraheres fra supernatanten af Centrifugerings trinnet ved at reducere volumenet (til ca. en tredjedel af dets oprindelige værdi) og holde det ved 4 °C. Reducer lydstyrken endnu mere (med 75%) at øge udbyttet på dette trin. - ~ 10 mg af produktet opløses i ~ 500 μL D2O, og opløsningen overføres til NMR-rør.
- Udfør 1H NMR på produktet i D2O på 400 MHz med 32 scanninger.
Bemærk: de maksimale tildelinger af H NMR (D2O) er 2,93 (t, 4h), 2,59 (t, 3h), 1,78 (m, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,44 (br s, 14H). Den beregnede molmasse (inklusive natriumcounterion) af produktet er 290,42 g/mol.
2. nanopartikel syntese: forberedelse af reagenser
- Rengør alle glasvarer (1 250 mL og 1 500 mL rund bund kolbe med enkelt hals, en 100 mL-tragt og en lille tragt) med frisk Aqua Regia (tre dele saltsyre til en del salpetersyre). Skyl glasset med en overskydende mængde vand inde i en stinkhætte og fjern alle dampe. Skyl derefter glasset med ethanol, og tør det i et laboratorieglas ovn (40-60 °C anbefales).
- Der afvejes 177,2 mg (0,45 mmol) guld (III) chloridtrihydrat (HAuCl4∙ 3h2O) i et lille hætteglas (10 eller 20 ml rene hætteglas eller på veje papir).
- Der afvejes 87 mg (0,3 mmol) MUS i et hætteglas med 20 mL.
- Der tilsættes 10 mL methanol for at opløse MUS. Sonicate det i et ultralydbad indtil ingen solid materiale er synlig, for at sikre fuldstændig opløsning.
Bemærk: alternativt opvarmes opløsningen forsigtigt ved hjælp af en varmepistol eller et varmt bad (~ 60 °C). Når det opvarmes, skal der køres koldt vand gennem kolbens ydersiden for at bringe det tilbage til stuetemperatur. - Der tilsættes 26 μL (0,15 mmol) OT til methanolopløsningen, og det omrystes for at blande ligander.
- Der afvejes 500 mg (13 mmol) natrium borohydrid (NaBH4), og der tilsættes 100 ml ethanol i den 250 ml rund kolbe. Rør kraftigt med magnetisk omrøring (600-800 rpm). (NaBH4 tager 10 til 20 min, afhængigt af karakteren, for at danne en klar opløsning i ethanol.)
3. syntese af guld nanopartikler
- Guld saltet opløses i 100 mL ethanol i den 500 mL rund kolbe, og der begynder omrøring ved 800 rpm med en magnetisk bjælke på en omrørings plade. Sørg for, at guldet salt opløses fuldstændigt.
- Der anbringes en 100 mL-tragt over den runde bund kolbe. Sæt en tragt på toppen af addition tragten med et kvantitativt papir filter indeni. Når NaBH4 opløses i ethanol, skal man begynde at filtrere opløsningen ind i tilsætning tragten gennem filter papiret i tragten.
- Tilsæt ligand-opløsningen til reaktionsblandingen. Vent 15 min for dannelsen af guld-thiolate kompleks. Farveændringen af reaktionsblandingen fra gennemskinnelig gul til uklar gul indikerer dannelsen af guld-thiolat kompleks.
- Begynd at tilføje den filtrerede NaBH4 -løsning fra tilsætningen af tragten. Juster intervaltiden for dråberne, så tilføjelsen af NaBH4 tager ca. 1 time.
- Efter den komplette tilsætning af NaBH4, Fjern tragten. Hold omrøring reaktionen i en anden time. I slutningen af reaktionen fjernes den magnetiske omrørings stang ved hjælp af en magnet, der anbringes på ydersiden af kolben.
- Brug et septum til at lukke kolben og gennembore en nål i septum for at frigøre H2 -gassen, der vil udvikle sig efter reaktionen.
- Reaktionsblandingen opbevares i et laboratorie køleskab (4 °C) for at fremskynde nanopartiklerne natten over.
4. tilkobling af syntese
- Den supernatanten ethanol decant for at reducere lydstyrken.
- Det resterende bundfald overføres til 50 mL centrifugeglas og centrifugeres i 3 minutter ved 4.000 x g.
- Supernatanten, dispergerings nanopartiklerne igen med ethanol ved vortexing, og centrifuger dem igen. Gentag denne vaskeproces 4X.
- Tør nanopartiklerne under vakuum for at fjerne den resterende ethanol.
- For at rense nanopartiklerne fra frie, hydrofile ligander/molekyler opløses bundfaldet i 15 mL DI-vand og overføres til centrifuge rørene med en filtrerings membran på 30 kDa-cutoff-molekylvægt. Dialyse er også underholdende for denne procedure.
- Disse rør centrifugeres i 5 min ved 4.000 x g for at koncentrere nanopartikel opløsningen.
- Der tilsættes 15 mL DI vand til denne opløsning, og der centrifugeres til koncentratet igen. Gentag denne rengøringsproces mindst 10x.
Bemærk: en indikation af, at de vandopløselige urenheder er fjernet, er fravær af skumdannelse, når det vandige affald omrystes; efter alt, de fleste af urenheder er disulfider af mus med sig selv eller med OT (dette kan bestemmes ved at indsamle materialet og udfører 1H NMR). - Efter centrifugeringen overføres de koncentrerede nanopartikler til et 15 mL centrifugeglas. For at omdanne nanopartiklerne til et håndterbart pulver skal de enten udfælde dem i et opløsningsmiddel som acetone eller fryse-tørre den resterende vandige opløsning. Når frysetørret, nanopartikler tendens til at danne en løs pulver, der klæber til overflader og kan være vanskeligt at manipulere.
5. karakterisering af nanopartiklerne
-
Renhed
- For at kontrollere om nanopartiklerne er fri for ubundne ligander, opløses 5 mg tørre nanopartikler i 600 μL D2O og Udfør en 1H NMR-måling af partiklerne. Hvis der ikke er nogen skarpe toppe af ligander, betyder det, at nanopartiklerne er fri for små organiske molekyler.
-
Ligand-forhold
- Forbered en 20 mg/mL methanol-d4 opløsning af jod. Der tilsættes 600 μL af denne opløsning til ~ 5 mg nanopartikler i et hætteglas til ætsning af nanopartiklerne.
- Wrap hætten af hætteglasset med paraffin film og sonikerer det i et ultralydbad i 20 min. Overfør opløsningen til en NMR tube og erhverve en 1H NMR (400 MHz) spektrum med 32 scanninger.
-
Ligand tæthed
- Overfør 2 til 8 mg nanopartikler til en TGA-smeltedigel. Vælg et temperaturområde fra 30 °C til 900 °C og en hastighed på 5 °C pr. minut under N2 -gas.
-
Størrelsesfordeling
-
Tem
- Forbered 0,1 mg/mL nanopartikel opløsning i DI-vand. Drop 5 μL af den tilberedte opløsning på det 400-mesh Carbon-støttede kobber gitter. Vent, til den tørrer.
- Overfør gitteret i en TEM-holder, og sæt det i mikroskop. Erhverve 5-10 billeder med en forstørrelse på mindst 64, 000X, der betjenes ved 200 kV.
Bemærk: for at øge kontrasten kan der indsættes en objektiv blænde på 20 Nm.
-
UV-Vis-spektre
- Forbered en 0,2 mg/mL nanopartikel opløsning i DI vand.
- Sæt den nødvendige mængde af denne opløsning i kvarts kuvette og scanne fra 200 Nm til 700 nm.
-
Tem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reaktions trinnene til syntetisere MUS er vist i figur 1. Den 1H NMR spektre af produktet af hvert trin er repræsenteret i figur 2. Den syntese workflow af den binære MUS: OT amphifilic guld nanopartikler er beskrevet i figur 3. Efter syntesen bestod nanopartiklerne i at vaske partiklerne flere gange med ethanol og DI vand. Før enhver karakterisering af nanopartikler blev renholdelse af nanopartiklerne fra ubundne frie ligander overvåget af 1H NMR i D2O, som vist i figur 4. Størrelsesfordelingen af nanopartiklerne var karakteriseret ved TEM (figur 5a, b). Lokaliseret overflade Plasmon resonans absorption blev målt ved at erhverve UV-Vis spektre (figur 5c).
Forholdet mellem de to ligander blev bestemt ved ætsning af guld kernen ved hjælp af jod, erhverve 1H NMR, og beregning af de relative mængder af hver ligand ved hjælp af de integrerede værdier. Figur 6 viser de repræsentative spektre, samt proceduren for NMR peak opgaver. For at finde ligand forholdet mellem MUS og OT, beregnede vi integralerne af toppene mellem 0,8-1 (I1), 1,12-1,55 (i2), 1,6-1,9 (I3) og 2,6-3 (i4) ppm. I1 peak indeholder signal fra tre OT genet, i2 peak fra en kombination af 14 mus hydro gener og 10 OT hydro gener, og i3 og jeg4 toppe fra fire mus hydro gener og to OT genet (for hver peak). Derfor er det nødvendigt at normalisere I1 til 3 og anvende følgende udtryk for at finde OT-procenten.
For jeg2,
For jeg3 og jeg4,
Disse beregninger angiver forholdet mellem OT og MUS, forudsat at der er en vilkårlig enhed af OT i systemet. For figur 6bgav de tre integraler tilsvarende værdier for OT-procenten (dvs.15,3, 15,9 og 15,9 fra i2, i3og i4).
Nanopartiklens overfladedækning undersøges af TGA som vist i figur 7. TGA, NMR, og TEM data (figur 3) kombineres for at beregne ligand tæthed, som er antallet af ligander på en enhed af overfladearealet, tilnærme partiklerne til en kugle. (Denne beregning antager, at na koges som NaHSO3.) TEM data viser, at den gennemsnitlige diameter af nanopartiklerne er 2,4 nm, der peger på ca 18,08 nm2 (enpar= 4pr2) af overfladearealet (apar) og 7,23 nm3 (Vpar= 4pr 3/3) af volumen pr. partikel (V-par). Tætheden af guld er 19,9 g/cm3 og massen af en partikel er 1,3969 x 10-16 mg (massepartikel = Vpar x tætheden af guld = 7,23 nm3 x 19,9 g/cm3 x 10-18 mm3/nm3). Den resterende masse omkring 800 °c svarer til guld kernen, og der er ca. 3,7 x 1016 partikler (npar), som anslås ved hjælp af Npar = (masseguld/masse partikel) = 5,17 mg/1,3969 x 10-16 mg. Det totale overfladeareal (aTOT) af partiklerne er 6,69 x 1017 nm2 (aTOT = Nparx Apar= 3,69 x 1016 x 18,08 nm2). NMR af jod-ætsede nanopartikler viste, at MUS: OT ratio er 85:15 og mængden af organisk indhold i TGA er 0,00146 g. Derfor er der 3,26 x 1018 ligander (nligand) efter formlen for Nligand= [masseorganisk /((rOT x MwOT) + (rmus x Mwmus))/(rmus + rOT)] x NAvogadro= [0,00146 g/((15 x 146 g/mol) + (85 x 267,42 g/mol))/(85 + 15] x (6,02 x 1023) = 3,26 x 1018 . Endelig er ligand tætheden 4,8 ligands/nm2, beregnet ved at dividere Nligand med enTOT(4,8 = 3,26 x 1018/6,69 x 1017 nm2). De støkiometriske forhold i forhold til NMR-forholdet i OT, som er et resultat af forskellige synteser, sammenlignes i figur 8.
Figur 1: skematisk mus syntese. MUS syntese er det vigtigste punkt for reproducerbarhed af amphifilic nanopartikel syntese. Hvis MUS har et højt saltindhold, kan det støkiometriske forhold mellem liganderne afvige. X = 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: NMR-spektre af molekylerne efter hvert trin i mus-syntesen (400 MHz). (A) dette panel viser 1h NMR-spektret af natrium undec-10-enesulfonat i d2o. (B) dette panel viser 1h NMR-spektret af natrium 11-acetylthio-undecanesulfonat i d2o. (C) dette panel viser 1H NMR-spektret af 11-mercapto-1-undecanesulfonat i D2O. I alle spektre indikerer * opløsningsmiddel toppene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk af den amphifiske nanopartikel syntese. (A) dette panel viser forberedelsen af en-faset kemisk reduktions reaktion med ethanol som opløsningsmiddel. (B) guld-thiolat-komplekset må dannes før tilsætning af et reduktionsmiddel. På dette tidspunkt blev opløsningen af guld salt uklar. C) under dråbevis-tilføjelsen af reduktionsmidlet dannes der guld nanopartikler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: rengøring af nanopartiklerne fra ureagerede frie ligander. (A) dette panel viser de 1H NMR spektrum af nanopartiklerne lige efter syntese og vakuum-tørring. D2O anvendes som opløsningsmiddel til 1H NMR-analysen. Skarpe toppe vist med røde pile indikerer eksistensen af frie ubundne ligander. B) dette panel viser de 1H NMR-spektrum af nanopartiklerne efter en grundig rensning (dvs.skylning og centrifugering med ethanol og di-vand). Den røde pil peger på den forstørrede del af spektret, hvor toppene er brede, ikke skarpe som før indikerer fraværet af frie ligander. I begge spektre indikerer * opløsningsmiddel toppene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: størrelsesfordeling af nanopartikler. A) dette panel viser et repræsentativt tem-billede af mus: OT-nanopartikler. Skala bjælken er 20 Nm. (B) dette panel viser et histogram af kerne størrelsen af nanopartikler baseret på flere tem-billeder. (C) UV-Vis spektre af nanopartiklerne viste den karakteristiske overflade Plasmon resonans top af nanopartiklerne ved omkring 520 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: ligand ratio beregning. (A) dette panel viser repræsentative NMR-spektre af kombinationer af disulfider (som referencer for ligander efter kerne ætsning) og spids opgaver for forskellige protoner i meod-d4. (B) dette panel viser 1H NMR spektre af ætsede nanopartikler i meod-d4. I alle spektre indikerer * opløsningsmiddel toppene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: ligand density analyse. En TGA måling af nanopartiklerne blev gjort for at bestemme forholdet og tætheden af organisk materiale (ligander). Grafen for målingerne er afbildet som vægtprocenten vs. temperaturen. OT desorbs først, mellem 176 °C og 233 °C (lodrette linjer). MUS nedbrydes til mindre molekyler og er totalt brændt ved omkring 800 °C. Den resterende vægtprocent svarer til nanopartiklerne guld kerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: sammenligning af stokiometriske og NMR-ratioer af OT på partiklerne. Det er muligt at tune den amfifile af nanopartiklerne ved at ændre startende Støkiometrisk forhold mellem MUS og OT i reaktionen. Fejllinjerne viser den øvre og nedre grænse for OT-indhold, der er erhvervet ved hjælp af de indikerede støkiometriske nøgletal. Støkiometriske nøgletal på 10%, 20% osv., op til 90% OT, blev syntetiseret for at observere grænserne for OT-indhold på nanopartikler overflader. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver først syntesen af mus ligand og, derefter, syntese og karakterisering af amfifile mus: OT guld nanopartikler. Syntetisere MUS med minimal saltindhold giver en bedre pålidelighed af det støkiometriske forhold mellem ligander under nanopartiklen syntese, som er en nøglefaktor for den reproducerbare syntese af MUS: OT nanopartikler med en Target hydrofobe indhold (figur 8). Brugen af methanol som et fælles opløsningsmiddel for MUS og OT, sammen med syntesen af partiklerne i ethanol, giver mulighed for en pålidelig syntese af MUS: OT guld nanopartikler. De metoder til karakterisering, der præsenteres her, udgør en minimal liste over eksperimenter, der er nødvendige for at få tilstrækkelige oplysninger om nanopartiklerne til at verificere resultatet af deres syntese.
Der er fire kritiske trin i denne protokol: (i) syntesen af MUS med et lavt saltindhold sammen med fjernelsen af farvede urenheder i andet trin og en krystallisering af ren MUS i sidste ende; II) tuning og bestemmelse af det støkiometriske forhold mellem MUS og OT (III) at nanopartiklerne er blevet arbejds narmere; og (IV) karakteriseringen af nanopartiklerne.
Under dannelsen af nanopartikler binder MUS fortrinsvis til nanopartiklernes overflader, som kan være relateret til opløseligheden af de resulterende nanopartikler. For eksempel resulterer et 2:1 støkiometrisk foder forhold mellem MUS og OT i 15% af OT på overfladen, når det beregnes ved hjælp af data fra 1H NMR af ætsede guld nanopartikler. Derfor skal et højere indhold af OT anvendes under syntesen af partiklerne (figur 8) for at opnå en nanopartikel med en lavere mus til OT-ratio; med andre ord en mere Hydrofobisk partikel. For at vurdere det støkiometriske forhold mellem liganderne på nanopartiklens overflade er det nødvendigt at sikre, at der ikke er nogen ubundne ligander i opløsningen. Tilstedeværelsen af ubundne ligander påvirker bestemmelsen af ligand forholdet på nanopartiklerne og tætheden, sammen med efterfølgende tests og eksperimenter, der kan føre til ukorrekte fortolkninger. Gentagne rengøringscyklusser med forskellige opløsningsmidler (f. eks. ethanol og DI-vand) er nødvendige for at eliminere alle ubundne ligander og andre urenheder (biprodukter af natriumborohydrid, guld ioner osv.). 1 af H NMR er vigtigt at bekræfte renheden af nanopartiklerne. Den linje-udvidelse effekt af ligander på grund af det komplekse kemiske miljø på nanopartiklerne udvide toppe svarende til ligander, mens enhver skarp signal kommer fra ubundne molekyler22. På grund af begrænset mobilitet kan de NMR-toppe, der svarer til methylenset ved siden af thiol-grupperne, heller ikke påvises, hvilket er en anden underskrift af nanopartiklen, når den inspiceres ved hjælp af 1H NMR. Når nanopartiklerne er rene, er metal kernen ætset med jod. Jod ætsning er en veletableret metode til at kvantificere ligand ratio på nanopartikler. For eksempel, for to årtier siden, Murray et al. rapporterede bestemmelse af enkeltlags sammensætning på guld nanopartikler efter jod ætsning, hvor jod nedbrydes guld kerne og frigiver de thiolate ligander som disulfider23. Pålideligheden af jod ætsning metode er blevet fastlagt ved hjælp af andre metoder; f. eks. rapporterede hardet et al. , at ligand-forholdet opnået fra NMR er inden for 1% afvigelse fra målinger af massespektroskopi24.
TGA er en enkel metode til at beregne organisk indhold på nanopartiklerne. Skønnet over overflade tæthed forudsætter, at alle thiolatligander binder sig til overfladen guld atomer og alle frie ligander er blevet fjernet under rensningen. For at bestemme ligand tæthed, er flere antagelser lavet, primært at partiklerne er kugleformede, som bruges til at beregne overfladearealet, samt pakning tæthed, af guld kerne. TEM giver en størrelsesfordeling af nanopartiklen guld kerner, der kan bruges til at beregne den omtrentlige overfladeareal af en nanopartikel. Den beskrevne nanopartikel syntese frembringer en polydispergerpopulation af partikler med en gennemsnitlig diameter på 2-3 nm og en størrelses afvigelse på op til 30%. Også den gennemsnitlige radius, der anvendes til at beregne den gennemsnitlige volumen af en partikel (tilnærme partiklerne til kugler), kombineret med tætheden af guld, muliggør beregningen af massen af en nanopartikel. Derefter gør massen målt ved TGA over 800 °C det muligt at beregne det antal partikler, der oprindeligt var til stede. Ved at bruge denne værdi og den gennemsnitlige kerne størrelse kan det samlede overfladeareal af guld nanopartiklerne estimeres. Ligand forholdet beregnet ud fra de data, der erhverves med 1H NMR spectroskopi, giver mulighed for beregning af antallet af mol af ligander på overfladen af nanopartiklerne. Molarforholdet mellem liganderne over overfladearealet af guld nanopartikler giver ligand tæthed (figur 7). Rene nanopartikler har ca. 4 ligander pr. nm2. TGA data kan også bruges til at estimere ligand ratio, hvis det temperaturinterval, som de desorptionsopløsning fra guld overfladen er kendt for hver ligand, og desorption forekommer ved separate temperaturintervaller.
Sammenfattende, denne protokol giver en ligetil måde at syntetisere MUS ligand med et lavt saltindhold og MUS: OT amphifilic guld nanopartikler. En af de vigtigste faktorer for reproducerbarheden af disse nanopartikler er det lave uorganiske saltindhold i MUS, der anvendes. Disse nanopartikler er stabile både som pulver og i opløsning (f. eks.H2O og fysiologisk relevante), hvilket bør fremhæves som en forudsætning for mange anvendelser. Grundig karakterisering af størrelse og overfladeegenskaber af amphifilic nanopartikler er afgørende for fremtidige applikationer, hvor graden af amphifilicity kan spille en central rolle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Z.P.G. og F.S. takker Swiss National Science Foundation og specielt NCCR ' Molecular Systems Engineering '. Z.L. og F.S. takker støtte fra den schweiziske National Science Foundation Division II tilskud. Alle forfattere takker Quy Ong for frugtbare diskussioner og for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11-bromo-1-undecene | Sigma Aldrich | 467642-25 ml | |
| Sodium Sulfite | Sigma Aldrich | S0505-250 g | |
| Benzyltriethyl-ammonium bromide | Sigma Aldrich | 147125-25 g | |
| Methanol | VWR | BDH1135-2.5 LP | |
| DI water | Millipore | ZRXQ003WW | Deionized water |
| 1 L round bottom flask | DURAN | 24 170 56 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 1.00930 EMD Millipore | |
| Stirring bar | Sigma Aldrich | Z329207, | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | Sigma Aldrich | Z273554 ALDRICH | |
| Filtering flask | DURAN | 20 201 63 | |
| Filtering Buchner Funnel | FisherSci | 11707335 | |
| Ethanol >99.8%, ACS, Reagent | VWR | 2081.321DP | |
| Deuterium dioxide | Sigma Aldrich | 151882 ALDRICH | |
| Thioacetic acid 96% | Sigma Aldrich | T30805 ALDRICH | |
| Carbon black | Sigma Aldrich | 05105-1KG | |
| Celite | Sigma Aldrich | D3877 SIGMA-ALDRICH | Filtration medium |
| Condenser | Sigma Aldrich | Z531154 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent 37% | Sigma Aldrich | 320331 SIGMA-ALDRICH | |
| Sodium Hydroxide, BioXtra, pellets (anhydrous) | Sigma Aldrich | S8045 SIGMA-ALDRICH | |
| Centrifuge tubes | VWR | 525-0155P | |
| 250 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 37 | |
| 500 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 46 | |
| Nitric acid, fACS reagent 70% | Sigma Aldrich | 438073 SIGMA-ALDRICH | |
| Gold(III) chloride trihydrate >99.9% trace metal basis | Sigma Aldrich | 520918 ALDRICH | |
| 1-octanethiol >98.5% | Sigma Aldrich | 471836 ALDRICH | |
| Sodium Borohydride purum p.a.>96% | Sigma Aldrich | 71320 ALDRICH | |
| addition funnel | SIgma Aldrich | Z330655 SIGMA | |
| Funnel | DURAN | 21 351 46 | |
| 2V folded filtering papers | Whatman | 1202-150 | |
| Amicon filters | Merck | UFC903024 | |
| Iodine, ACS reagent, >99.8%, solid | Sigma Aldrich | 207772 SIGMA-ALDRICH | |
| 5 mm NMR-Tubes, Type 5HP (high precision) | Armar | 32210.503 | Length 178 mm |
| Methanol-d4 99.8 atom%D | Armar | 16400.2035 | |
| TGA crucible | Thepro | 9095-9270.45 | |
| 400 mesh carbon supported copper grid | Electron Microscopy Science | CF400-Cu | |
| quartz cuvette | Hellma Analytics | 100-1-40 |
References
- Verma, A., et al. Effect of surface properties on nanoparticle-cell interactions. Small. 6 (1), 12-21 (2010).
- Yeh, Y. -C., et al. Gold nanoparticles: preparation, properties, and applications in bionanotechnology. Nanoscale. 4 (6), 1871-1880 (2012).
- Mirza, A. Z. A novel drug delivery system of gold nanorods with doxorubicin and study of drug release by single molecule spectroscopy. Journal of Drug Targeting. 23 (1), 52-58 (2015).
- Mirza, A. Z., et al. Fabrication and characterization of doxorubicin functionalized PSS coated gold nanorod. Arabian Journal of Chemistry. , In Press (2014).
- Nel, A. E., et al. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8 (7), 543-557 (2009).
- Yeo, E. L. L., et al. Protein Corona around Gold Nanorods as a Drug Carrier for Multimodal Cancer Therapy. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (6), 1039-1050 (2017).
- Lin, J., et al. Cell membranes open "doors" for cationic nanoparticles/ biomolecules: Insights into uptake kinetics. ACS Nano. 7 (12), 10799-10808 (2013).
- Saha, K., et al. Regulation of Macrophage Recognition through the Interplay of Nanoparticle Surface Functionality and Protein Corona. ACS Nano. 10 (4), 4421-4430 (2016).
- Moyano, D. F., et al. Fabrication of corona-free nanoparticles with tunable hydrophobicity. ACS Nano. 8 (7), 6748-6755 (2014).
- Pengo, P., et al. Gold nanoparticles with patterned surface monolayers for nanomedicine: current perspectives. European Biophysics Journal. 46 (8), 749-771 (2017).
- Kuna, J. J., et al. The effect of nanometre-scale structure on interfacial energy. Nature Materials. 8 (10), 837-842 (2009).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nature Materials. 7 (7), 588-595 (2008).
- Van Lehn, R. C., et al. Lipid tail protrusions mediate the insertion of nanoparticles into model cell membranes. Nature Communications. 5, 4482-4493 (2014).
- Cagno, V., et al. Broad-spectrum non-toxic antiviral nanoparticles with a virucidal inhibition mechanism. Nature Materials. 17 (2), 195-203 (2018).
- Uzun, O., et al. Water-soluble amphiphilic gold nanoparticles with structured ligand shells. Chemical Communications. 2 (2), 196-198 (2008).
- Huang, R., et al. Colloidal stability of self-assembled monolayer-coated gold nanoparticles: The effects of surface compositional and structural heterogeneity. Langmuir. 29 (37), 11560-11566 (2013).
- Carney, R. P., et al. Electrical method to quantify nanoparticle interaction with lipid bilayers. ACS Nano. 7 (2), 932-942 (2013).
- Van Lehn, R. C., et al. Effect of particle diameter and surface composition on the spontaneous fusion of monolayer-protected gold nanoparticles with lipid bilayers. Nano Letters. 13 (9), 4060-4067 (2013).
- Huang, R., et al. Effects of surface compositional and structural heterogeneity on nanoparticle-protein interactions: Different protein configurations. ACS Nano. 8 (6), 5402-5412 (2014).
- Van Lehn, R. C., et al. Free energy change for insertion of charged, monolayer-protected nanoparticles into lipid bilayers. Soft Matter. 10 (4), 648-658 (2014).
- Ong, Q., et al. Characterization of Ligand Shell for Mixed-Ligand Coated Gold Nanoparticles. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1911-1919 (2017).
- Marbella, L. E., et al. NMR techniques for noble metal nanoparticles. Chemistry of Materials. 27 (8), 2721-2739 (2015).
- Templeton, A. C., et al. Reactivity of Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules Steric Effects. Journal of American Chemical Society. 120 (8), 1906-1911 (1998).
- Harkness, K. M., et al. A structural mass spectrometry strategy for the relative quantitation of ligands on mixed monolayer-protected gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 82 (22), 9268-9274 (2010).
