Summary
Amphiphilic Guldnanopartiklar kan användas i många biologiska tillämpningar. Ett protokoll för att syntetisera Guldnanopartiklar belagda med en binär blandning av ligander och en detaljerad karakterisering av dessa partiklar presenteras.
Abstract
Guldnanopartiklar täckta med en blandning av 1-okanethiol (OT) och 11-mercapto-1-undecane etylbenztiazolinsvavelsyra Acid (mus) har studerats utförligt på grund av deras interaktioner med cell membran, lipidbilayers, och virus. De hydrofila liganderna gör dessa partiklar kolloidalt stabila i vatten lösningar och kombinationen med hydrofoba ligander skapar en amfifila molekylers partikel som kan laddas med hydrofoba droger, säkring med lipidmembranen, och motstå ospecifik proteinadsorption. Många av dessa egenskaper beror på Nanopartikel storlek och sammansättningen av ligand Shell. Det är därför avgörande att ha en reproducerbar syntetisk metod och pålitliga karakteriseringstekniker som möjliggör bestämning av nanopartikelegenskaper och ligand-skalsammansättningen. Här, en enfas kemisk reduktion, följt av en grundlig rening för att syntetisera dessa nanopartiklar med dia metrar under 5 nm, presenteras. Förhållandet mellan de två liganderna på ytan av nanopartikeln kan trimmas genom deras stökiometriska förhållandet används under syntesen. Vi visar hur olika rutin tekniker, såsom transmission elektronmikroskopi (TEM), nukleär magnetisk resonans (NMR), termogravimetrisk analys (TGA), och ultraviolett-synlig (UV-VIS) spektrometri, kombineras till omfattande karakterisera nanopartiklarnas fysikalisk-kemiska parametrar.
Introduction
Den ligand skal av guld nanopartiklar kan vara konstruerad för att uppvisa flera olika egenskaper som kan tillämpas för att hantera utmaningarna i bio medicin1,2,3,4. Sådan mångsidighet möjliggör kontroll av Intermolekylär interaktion mellan nanopartiklar och biomoleculer5,6,7. Hydrofobicitet och laddning spelar en avgörande roll, liksom andra ytparametrar som påverkar hur nanopartiklar interagerar med biomoleculer5,8,9. För att ställa in nanopartiklarnas ytegenskaper, erbjuder valet av tiolat molekyler som utgör ligand-skalet en myriad av möjligheter, enligt de egenskaper som eftersträvas. Till exempel, en blandning av ligand molekyler med hydrofoba och hydrofila (t. ex.laddade) grupper används ofta för att generera amfifila molekylers nanopartiklar10,11.
Ett framträdande exempel på denna typ av nanopartiklar skyddas av en blandning av OT och mus (hädanefter kallade mus: OT nanopartiklar) som har visat sig ha många relevanta egenskaper12,13,14. Först, med en ligand skal sammansättning av 66% MUS (hädanefter 66:34 MUS: OT), den kolloidal stabiliteten hos nanopartiklarna är hög, når upp till 33% i vikt i avjoniserat vatten, samt i fosfatbuffrad saltlösning (1x, 4 mM fosfat, 150 mM NaCl)15. Dessutom, dessa partiklar inte fälls ut vid relativt låga pH-värden: till exempel vid pH 2,3 och med saltkoncentrationer på 1 M NaCl15, dessa nanopartiklar förblir kolloidalt stabilt i månader. Den stökiometriska förhållandet mellan de två molekylerna på ligand skalet är viktigt eftersom det dikterar kolloidal stabilitet i lösningar med en hög jonisk styrka16.
Dessa partiklar har visats passera cell membranet utan att porera den, via en energi oberoende väg1,12. Den spontana fusionen mellan dessa partiklar och lipidbilayers ligger till grund för deras diffusivitet genom cell membran17. Mekanismen bakom denna interaktion är minimering av kontakten mellan en hydrofoba lösningsmedelsanpassad yta och vatten molekyler vid fusion med lipidbilayers18. Jämfört med all-MUS nanopartiklar (nanopartiklar med endast MUS ligand på deras skal), den högre hydrofobicity på blandade MUS: OT nanopartiklar (till exempel, vid en 66:34 MUS: OT sammansättning) ökar spännvidden av kärn diametern som kan smälta samman med lipid lipidmonolager18. Olika själv monterings organisationer av ligand Shell korrelerar till distinkta bindnings lägen av 66:34 MUS: OT nanopartiklar med olika proteiner, såsom albumin och ubiquitin, jämfört med all-MUS partiklar19. Nyligen har det rapporter ATS att 66:34 mus: OT nanopartiklar kan användas som ett brett spektrum antivirala medel som oåterkalleligt förstör virus på grund av multivalenta elektro statiska bindningar av mus ligander och ickelokala kopplingar av OT ligander att kapsid proteiner14. I alla dessa fall har det visat sig att det hydrofoba innehållet, liksom kärn storleken på nanopartiklarna, bestämmer hur dessa bio-nano interaktioner sker. Dessa olika egenskaper hos MUS: OT nanopartiklar har föranlett många data simulering studier som syftade till att klargöra de mekanismer som ligger till grund för samspelet mellan MUS: OT partiklar och olika biologiska strukturer såsom lipidbilayers20.
Förberedelserna av MUS: OT-skyddade au nanopartiklar utgör några utmaningar. För det första är den laddade ligand (MUS) och hydrofoba ligand (OT) oblandbar. Således måste lösligheten hos nanopartiklarna och liganderna tas med i beräkningen under hela syntesen, liksom under karakteriseringen. Dessutom, renhet av MUS ligand molekyler-specifikt, halten av oorganiska salter i utgångs materialet-påverkar kvaliteten, reproducerbarhet, liksom kort och lång sikt kolloidal stabilitet nanopartiklar.
Här beskrivs en detaljerad syntes och karakterisering av denna klass av amfifila molekylers guld nanopartiklar skyddas av en blandning av mus och OT. Ett protokoll för syntesen av negativt laddade MUS ligand rapporteras för att säkerställa renheten och därmed reproducerbarheten av olika nanopartikelsynteser. Sedan, förfarandet för att generera dessa nanopartiklar, baserat på en gemensam enfas syntes, följt av grundlig rening, rapporteras i detalj. Olika nödvändiga karakteriseringstekniker21, såsom tem, UV-VIS, TGA, och NMR, har kombinerats för att få alla nödvändiga parametrar för ytterligare biologiska experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntes av 11-mercapto-1-undecanesulfonate (MUS)
Obs: detta protokoll kan användas i valfri skala önskas. Här beskrivs en produkt skala på 10 g.
- Natrium Undec-10-enesulfonat
- Tillsätt 11-Bromo-1-undecene (25 mL, 111,975 mmol), natriumsulfit (28,75 g, 227,92 mmol) och bensyltrietylammoniumbromid (10 mg) till en blandning av 200 mL metanol (MeOH) och 450 mL avjoniserat (DI) vatten (4:9 v/v MeOH: H2O-förhållande) i en 1 L rund botten kolv .
- Reflux reaktions blandningen vid 102 ° c för 48 h. Cap systemet med en mekanism för tryck avlastning-till exempel en ballong med en nål, eller helt enkelt en nål. Denna reaktion är inte känslig för atmosfäriska gaser.
Obs: lösningen blir färglös när reaktionen är klar. - Anslut reaktions blandningen till en rotationsindunstare för att avdunsta MeOH och reducera volymen till cirka 300 mL.
- Överför resterande lösning till en 1 L tilläggstratten.
- Extrahera resterande vatten lösning 5x med dietyleter, med hjälp av additionstratten. Oreagerade 11-Bromo-1-undecene stannar i dietyleter fasen och den sulfonerade produkten i H2O.
Varning: Släpp alla tryck uppbyggd ofta under utvinning, och konsultera rätt användning av addition trattar. - Samla den slutliga extraherade vatten lösningen i en 1 L enkel hals rundkolv.
- Anslut reaktions kol ven till en rotationsindunstare genom att sätta lite fett (eller Teflonringstrippar eller något annat tätnings medel) mellan kolven och fällan.
- Sänk dammsugaren långsamt för att avdunsta vatten fasen i en roterande för ångare. Eftersom produkten är en ytaktivt ämne, skum bildning kommer att ske under avdunstning. Följ instruktionerna i nästa steg för att kringgå problemet.
- Tillsätt etanol till blandningen för att påskynda avdunstning av H2O och förhindra skum bildning. När skummande omstarter på grund av minskningen av etanol halt, stoppa avdunstning, ta bort kolven från den roterande för ångaren, tillsätt mer etanol (ungefär en tredjedel av den totala volymen), och återanslut kolven till den roterande för ångaren. Upprepa denna process tills lösningen blandningen minskar avsevärt och inte bildar bubblor.
- Torka det vita pulvret direkt genom att ansluta kolven till ett högt vakuum. Den torrare pulvret, de mindre oorganiska salter kommer att krypa in i efterföljande steg.
Obs: värme kan användas för att torka produkten, till exempel genom att hålla kolven under vakuum i ett 60 ° c bad och lämnas över natten. - Suspendera det vita pulvret i 400 mL metanol i en kolv. Sonikera att lösa upp den maximala mängden av produkten.
Anmärkning: målet med detta steg är att lösa upp produkten, men inte de oorganiska biprodukter, såsom överskott natriumsulfit och natriumbromid, som har begränsad löslighet i metanol. Använd metanol med den lägsta vattenhalten möjligt, eftersom vatten i metanol kommer att öka lösligheten av de oorganiska biprodukter i lösnings medlet. - För att öka lösligheten i produkten kan metanol värmas försiktigt nära Kok punkten (~ 64 ° c).
Varning: se till att arbeta under en draghuv under uppvärmningen av kolven. Ångorna i den avdunsta metanol är farliga. - Filtrera lösningen för att ta bort metanol olösliga oorganiska biprodukter. Använd en filtrerkolv kopplad till en vakuum pump och en filtrertratt med kvantitativt filtrerpapper eller ett borosilikatfilter. Både produkten och de oorganiska salterna är vita pulver när de är torra: produkten är löslig i metanol, medan salter inte.
- Överför den filtrerade lösningen från filtreringskolven till en 1 L Rundkolv med rund botten.
- Anslut kolven till en rotationsindunstare och avdunsta metanollösningen vid 45 ° c, gör om det vita pulvret i metanol och filtrera lösningen (protokoll steg 1.1.7, 1.1.8 och 1.1.9). Upprepa denna process minst 2x, för att minska mängden oorganiskt salt.
- Samla in det vita, metanol lösliga pulvret (ca 30 g, på denna skala).
- Lös upp cirka 10 mg produkt i 500 μL av D2O och överför lösningen till ett NMR-rör.
- Utför 1H NMR-spektrometri på produkten i D2O vid 400 MHz med 32 skanningar.
Anmärkning: topp uppdragen för 1H NMR (D2O) är 5,97 (m, 1H), 5,09 (m, 2H), 2,95 (t, 2H), 2,10 (m, 2H), 1,77 (q, 2H), 1,44 (br s, 12h).
- Natrium 11-acetylthio-undecanesulfonate
- Lös upp den ungefärliga 30 g natrium Undec-10-enesulfonat (reaktions produkten i avsnitt 1,1) i 500 mL metanol inuti en 1 L rund botten kolv. Tillsätt en 2,6 x överskott av tioättiksyra till lösningen och rör om den framför en UV-lampa (250 W) över natten (~ 12 h). Om en UV-lampa inte är tillgänglig, kan reaktionen utföras genom återflöde med hjälp av en radikal initiativtagare, såsom azobisisobutyronitril (aibn); emellertid, användning av en UV-lampa rekommenderas starkt.
Var försiktig: se till att du arbetar under dragkåpan hela tiden. Om kolven måste transporteras till ett annat utrymme där UV-lampan är placerad, försegla kolven för att undvika att den starka lukten av tioättiksyra sprids. Var försiktig när du använder en UV-lampa: helt blockera utrymmet där lampan är placerad och konsultera institutionens säkerhets anvisningar om hur man använder en UV-lampa. - Övervaka reaktionen genom att ta ~ 2 mL Ali kvoter från reaktionen, avdunsta lösnings medel, och tillsätt deutat vatten för att kontrol lera med 1H NMR. När topparna som motsvarar den dubbla bindningen försvinner, stoppa reaktionen.
Obs: vanligt vis, efter 12 h framför UV-lampan, reaktionen är klar. Om reaktions blandningen blir grumlig, tillsätt mer MeOH och fortsätta exponeringen för UV-ljus i sex ytterligare timmar. - Avdunsta alla MeOH i en roterande för ångare tills den fasta återstoden blir orange-röd. Om den lämnas tillräckligt länge blir produkten brun till svart.
Varning: arbeta mindfully på grund av den starka lukter från tioättiksyra. Den starka lukter av alla tiolat spill kan neutraliseras med hjälp av en vatten lösning av blek medel (natriumhypoklorit). - Tvätta produkten med dietyleter med hjälp av en filtrerande kolv för att avlägsna överflödig tioättiksyra tills inga mer färgade (orange-gula) substanser förekommer i dietyleter-supernatanten. Torka fast under högt vakuum och lös sedan upp det i metanol, vilket ger en gul till orange lösning.
Notera: tillsätt tillräckligt med metanol för att lösa upp produkten.
Obs: färgen kan variera i det här steget. - Tillsätt 3 g kimrök till lösningen, blanda kraftigt och filtrera blandningen genom filtrerings medium (se material tabell) som täcker två tredjedelar av ett veckat filtrerpapper.
Obs: den porösa strukturen av kimrök fångar den färgade sidan-produkt material (och en del av produkten). Den filtrerade lösningen ska vara klar. Om den filtrerade lösningen fortfarande är färgad (gul) upprepar du den här processen. - Indunsta spädnings vätskan helt i en roterande för ångare och samla cirka 35 g vitt pulver.
- Lös upp ~ 10 mg av produkten i ~ 500 μL av D2O och överför lösningen till NMR-rör.
- Utför 1H NMR på produkten i D2O vid 400 MHz med 32 skanningar.
Anmärkning: topp uppdragen för H NMR (D2O) är 2,93 (t, 4h), 2,40 (s, 3H), 1,77 (m, 2H), 1,62 (m, 2H), 1,45 (br s, 14h).
- Lös upp den ungefärliga 30 g natrium Undec-10-enesulfonat (reaktions produkten i avsnitt 1,1) i 500 mL metanol inuti en 1 L rund botten kolv. Tillsätt en 2,6 x överskott av tioättiksyra till lösningen och rör om den framför en UV-lampa (250 W) över natten (~ 12 h). Om en UV-lampa inte är tillgänglig, kan reaktionen utföras genom återflöde med hjälp av en radikal initiativtagare, såsom azobisisobutyronitril (aibn); emellertid, användning av en UV-lampa rekommenderas starkt.
- 11-mercapto-1-undecanesulfonate (mus)
- Reflux natrium 11-acetylthio-undecanesulfonate på 102 ° c i 400 mL 1 M HCl för 12 h att klyva thioacetat gruppen och få en thiol.
- Överför produkten till en 1,5 L eller 2 L rundkolv. Tillsätt 200 mL 1 M NaOH till den slutliga lösningen och överdel den med 400 mL DI-vatten för att ha en slutlig volym på 1 L. Detta kommer att hålla lösningen sura och förhindra kristallisation av oorganiska salter som biprodukt.
Anmärkning: en fullständig neutralisering av lösningen till pH 7 kommer att resultera i kristallisering av en produkt olöslig i metanol. - Förvara den klara lösningen vid 4 ° c och den kommer att kristallisera över natten. Produkten kristalliserar som fina kristaller som är trög flytande när de är våta.
Anmärkning: för att påskynda kristallisation, tillsätt presyntetiserade MUS till lösningen, om det finns. - Häll av den genomskinliga supernatanten och centrifugera ner den viskösa vita produkten i 50 mL centrifugrör i 5 min vid 4 000 x g.
- Häll av supernatanten i en annan kolv och torka den vita pellets under hög vakuum-beroende på centrifugen tillgänglig, kan detta vara 2-16 rör eller mer.
Anmärkning: filtrering rekommenderas inte på grund av produktens ytaktiva karaktär; överdriven skum bildning kommer att inträffa och de flesta av produkten kommer att förloras. - Samla ca 12 g (ca 30% avkastning) av metanol-lösliga MUS från detta renings steg.
Obs: var uppmärksam på att pulvret är bra och elektro statiskt-det tenderar att hålla sig till spatlar och ytorna på behållarna. Dessutom kan mer material extraheras från supernatanten av centrifugeringssteget genom att minska volymen (till ungefär en tredjedel av dess ursprungliga värde) och hålla den vid 4 ° c. Sänk volymen ännu mer (med 75%) att öka avkastningen i detta steg. - Lös upp ~ 10 mg av produkten i ~ 500 μL av D2O och överför lösningen till NMR-rör.
- Utför 1H NMR på produkten i D2O vid 400 MHz med 32 skanningar.
Anmärkning: topp uppdragen för H NMR (D2O) är 2,93 (t, 4h), 2,59 (t, 3H), 1,78 (m, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,44 (br s, 14h). Den beräknade molar massan (inklusive natriumcounterion) av produkten är 290,42 g/mol.
2. nanopartikelsyntes: beredning av reagenserna
- Rengör alla glas (1 250 mL och 1 500 mL enkel hals rundkolv, en 100 mL tillsats tratt, och en liten tratt) med färska Aqua Regia (tre delar saltsyra till en del sal Peter syra). Skölj glas varor med en överskotts mängd vatten i en draghuv och ta bort alla ångor. Skölj sedan glassen med etanol och torka den i en laboratorie ugn med glas fiber (40-60 ° c rekommenderas).
- Väg upp 177,2 mg (0,45 mmol) guld (III) kloridtrihydrat (HAuCl4∙ 3H2O) i en liten injektions flaska av glas (10 eller 20 ml injektions flaskor av rent glas eller på vägnings papper).
- Väg upp 87 mg (0,3 mmol) MUS i en injektions flaska med 20 mL glas.
- Tillsätt 10 mL metanol för att lösa upp MUS. Sonikera det i ett ultraljudsbad tills inget fast material är synligt, för att säkerställa fullständig upplösning.
Obs: Alternativt, med hjälp av en värme pistol eller ett varmt bad (~ 60 ° c), Värm lösningen försiktigt. Vid upphettning, kör kallt vatten genom utsidan av kolven för att föra den tillbaka till rums temperatur. - Tillsätt 26 μL (0,15 mmol) OT till metanollösningen och skaka det för att blanda liganderna.
- Väg upp 500 mg (13 mmol) natriumborohydrid (NaBH4) och tillsätt det till 100 ml etanol i den 250 ml runda botten kolven. Rör kraftigt med hjälp av magnetisk omrörning (600-800 RPM). (NaBH4 tar 10 till 20 min, beroende på sorten, för att bilda en klar lösning i etanol.)
3. syntes av Guldnanopartiklar
- Lös guldsalt i 100 mL etanol i 500 mL rundkolv och börja omrörning vid 800 RPM med en magnet stång på en Omrörnings platta. Se till att guld saltet löses upp helt.
- Lägg en tratten på 100 mL ovanför den runda botten kolven. Placera en tratt ovanpå additionstratten med ett kvantitativt pappers filter inuti. När NaBH4 löses i etanol, börja filtrera lösningen i additionstratten genom filter papperet i tratten.
- Tillsätt ligand lösningen till reaktions blandningen. Vänta 15 min för bildandet av guld-tiolat komplex. Färgen förändring av reaktionen blandningen från genomskinlig gul till grumlig gult indikerar bildandet av guld-tiolat komplex.
- Börja lägga till den filtrerade NaBH4 -lösningen från additionstratten dropwise. Justera intervall tiden för dropparna så att tillsatsen av NaBH4 tar ca 1 h.
- Efter det kompletta tillskottet av NaBH4, ta bort tratten. Fortsätt att röra reaktionen i ytterligare en timme. I slutet av reaktionen tar du bort den magnetiska Omrörnings listen med en magnet placerad på utsidan av kolven.
- Använd en septum för att stänga kolven och Pierce en nål i septum att frigöra H2 gas som kommer att utvecklas efter reaktionen.
- Förvara reaktions blandningen i ett laboratorie kyl skåp (4 ° c) för att fälla ut nanopartiklarna över natten.
4. arbetet med syntesen
- Häll av supernatanten etanol för att minska volymen.
- Överför återstående precipitanten till 50 mL centrifugrör och Centrifugera i 3 min vid 4 000 x g.
- Häll av supernatanten, skingra nanopartiklarna igen med etanol genom att vortexsera och centrifugera dem igen. Upprepa denna tvätt process 4x.
- Torka nanopartiklarna under vakuum för att avlägsna resterande etanol.
- För att rengöra nanopartiklarna från fria hydrofila ligander/molekyler, upplösa fällningen i 15 mL DI-vatten och överför dem till centrifugrör med ett filtrerings membran av 30 kDa cutoff molekyl vikt. Dialys är också mottagligt för detta förfarande.
- Centrifugera dessa tuber i 5 min vid 4 000 x g för att koncentrera nanopartikellösningen.
- Tillsätt 15 mL DI-vatten till denna lösning och centrifugera för att koncentrera sig igen. Upprepa denna renings process minst 10x.
Anmärkning: en indikation på att de vattenlösliga föroreningarna har avlägsnats är frånvaron av skum bildning vid omrörande av vattenhaltigt avfall. Trots allt, de flesta av föroreningarna är disulfider av MUS med sig själv eller med OT (detta kan bestämmas genom att samla in materialet och utför 1H NMR). - Efter centrifugering överför de koncentrerade nanopartiklarna till ett 15 mL centrifugeringsrör. För att förvandla nanopartiklarna till ett hanterbart pulver, fäller antingen dem i ett lösnings medel som aceton eller frys-torka den resterande vatten lösningen. När frystorkad, nanopartiklarna tenderar att bilda ett löst pulver som fastnar på ytor och kan vara svårt att manipulera.
5. karakterisering av nanopartiklarna
-
Renhet
- För att kontrol lera om nanopartiklarna är fria från obundna ligander, lös 5 mg torra nanopartiklar i 600 μL av D2O och utför en 1H NMR mätning av partiklarna. Om det inte finns några skarpa toppar i liganderna, betyder det att nanopartiklarna är fria från små organiska molekyler.
-
Ligand-förhållande
- Förbered en 20 mg/mL metanol-d4 lösning av jod. Tillsätt 600 μL av denna lösning till ~ 5 mg nanopartiklar i en injektions flaska av glas, för att etch nanopartiklarna.
- Linda locket på injektions flaskan med paraffin film och sonikera det i ett ultraljudsbad för 20 min. överför lösningen till en NMR röret och förvärva en 1H NMR (400 MHz) spektrum med 32 skannar.
-
Ligand densitet
- Överför 2 till 8 mg nanopartiklar till en TGA-degeln. Välj ett temperatur område från 30 ° c till 900 ° c och en hastighet på 5 ° c per minut under N2 gas.
-
Storleks fördelning
-
Tem
- Bered 0,1 mg/mL nanopartikellösning i DI-vatten. Tappa 5 μL av den beredda lösningen på det 400-mesh Carbon-stödda koppar nätet. Vänta tills den torkar.
- Överför rutnätet i en TEM-hållare och sätt in det i Mikroskop. Förvärva 5-10 bilder med en förstoring på minst 64, 000X, som drivs på 200 kV.
Anm: för att öka kontrasten kan en objektiv bländare på 20 nm infogas.
-
UV-VIS Spectra
- Bered en 0,2 mg/mL nanopartikellösning i DI-vatten.
- Sätt den erforderliga mängden av denna lösning i kvarts kyvetten och skanna från 200 nm till 700 nm.
-
Tem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reaktions stegen för att syntetisera MUS visas i figur 1. Den 1H NMR spektra av produkten av varje steg representeras i figur 2. Den syntes arbets flödet av den binära mus: OT amfifila molekylers Guldnanopartiklar beskrivs i figur 3. Efter syntesen bestod workup av nanopartiklarna av att tvätta partiklarna flera gånger med etanol och DI-vatten. Innan någon karakterisering av nanopartiklar, var renheten hos nanopartiklarna från obundna fria ligander övervakas av 1H NMR i D2O, som visas i figur 4. Storleks fördelningen av nanopartiklarna kännetecknades av TEM (figur 5a, b). Lokaliserad yta Plasmon resonans absorption mättes genom att förvärva UV-VIS spektra (figur 5c).
Förhållandet mellan de två ligander bestämdes genom etsning av guld kärnan med hjälp av jod, förvärva 1H NMR, och beräkna de relativa beloppen för varje ligand med hjälp av de integrerade värdena. Figur 6 visar representativa spektra samt förfarandet för NMR: s topp uppdrag. För att hitta ligand förhållandet mellan MUS och OT, beräknade vi integraler av topparna mellan 0,8-1 (I1), 1,12-1,55 (i2), 1,6-1,9 (i3), och 2,6-3 (i4) ppm. I1 Peak innehåller signal från tre OT hydrogener, i2 topp från en kombination av 14 mus HYDROGENER och 10 OT hydrogener, och i3 och i4 toppar från fyra mus hydrogener och två OT hydrogens (för varje topp). Därför, för att hitta OT procent, är det nödvändigt att normalisera I1 till 3 och tillämpa följande uttryck.
För I2,
För I3 och i4,
Dessa beräkningar visar förhållandet mellan OT och MUS, förutsatt att det finns en godtycklig enhet av OT i systemet. För figur 6bgav de tre integralerna liknande värden för OT-procent (dvs.15,3, 15,9 och 15,9 från i2, i3och i4).
Ytan täckning av nanopartiklar unders öks av TGA som visas i figur 7. TGA, NMR och TEM data (figur 3) kombineras för att beräkna ligandtätheten, vilket är antalet ligander på en enhet av ytan, approximera partiklarna till en sfär. (Denna beräkning förutsätter att na bölder som NaHSO3.) TEM data visar att den genomsnittliga diametern av nanopartiklarna är 2,4 Nm, pekar på cirka 18,08 nm2 (apar= 4PR2) av yta (ettpar) och 7,23 nm3 (Vpar= 4PR 3/3) volym per partikel (Vpar). Densiteten av guld är 19,9 g/cm3 och massan av en partikel är 1,3969 x 10-16 mg (Masspartikel = Vpar x densiteten av guld = 7,23 nm3 x 19,9 g/cm3 x 10-18 mm3/nm3). Resterande massa runt 800 ° c motsvarar guld kärnan, och det finns cirka 3,7 x 1016 partiklar (npar) som uppskattas med hjälp av npar = (massaguld/massa partikel) = 5,17 mg/1,3969 x 10-16 mg. Den totala ytan (atot) av partiklarna är 6,69 x 1017 nm2 (atot = Nparx Apar= 3,69 x 1016 x 18,08 nm2). Den NMR av jod-etsad nanopartiklar visade att MUS: OT förhållandet är 85:15 och mängden organiskt innehåll i TGA är 0,00146 g. Därför, det finns 3,26 x 1018 ligander (nligand) efter formeln för Nligand= [MassOrganic /((rOT x MwOT) + (rmus x Mwmus))/(rmus + rOT)] x NAvogadro= [0,00146 g/((15 x 146 g/mol) + (85 x 267,42 g/mol))/(85 + 15] x (6,02 x 1023) = 3,26 x 1018 . Slutligen är ligandtätheten 4,8 ligands/nm2, beräknad genom att dividera N-ligand med entot(4,8 = 3,26 x 1018/6,69 x 1017 nm2). Den stökiometriska nyckeltal vs. NMR nyckeltal av OT, som härrör från olika synteser, jämförs i figur 8.
Figur 1: Schematisk mus syntes. MUS syntes är den viktigaste punkten för reproducerbarheten av amfifila molekylers nanopartiklar syntes. Om MUS har en hög salthalt, kan det stökiometriska förhållandet mellan liganderna avvika. X = 9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: NMR-spektra av molekylerna efter varje steg i mus syntesen (400 MHz). (A) denna panel visar 1h NMR-spektrum av natrium Undec-10-enesulfonat i d2o. (B) denna panel visar 1h NMR-spektrum av natrium 11-Acetylthio-undecanesulfonat i d2o. (C) denna panel visar 1H NMR spektrum av 11-mercapto-1-undecanesulfonate i D2O. I alla spektra, * anger lösnings medels topparna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk av den amfifila nanopartikelsyntesen. Adenna panel visar preparering av en-fas kemisk Reduktions reaktion med etanol som lösnings medel. Bguld-thiolate Complex får bildas före tillsats av ett Reduktions medel. I detta skede, lösningen av guld salt blev grumlig. (C) vid droppvis tillägg av Reduktions medlet bildas Guldnanopartiklar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: renhet av nanopartiklarna från oreagerade fria ligander. (A) denna panel visar 1H NMR spektrum av nanopartiklar direkt efter syntes och vakuum torkning. D2O används som spädnings vätska för 1H NMR-analys. Skarpa toppar visas av Röda pilar visar förekomsten av fria obundna ligander. (B) denna panel visar nanopartiklarnas 1H NMR-spektrum efter en grundlig rening (dvs.tvättar och centrifugering med etanol och di-vatten). Den röda pilen pekar på den förstorade delen av spektrumet, där topparna är breda, inte skarpa som innan indikerar frånvaron av fria ligander. I båda spektra, * anger lösnings medels topparna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: storleks fördelning av nanopartiklar. (A) denna panel visar en representativ tem bild av mus: OT nanopartiklar. Skalstapeln är 20 nm. (B) denna panel visar ett histogram av kärn storleken på nanopartiklar baserat på flera tem-bilder. (C) UV-VIS spektra av nanopartiklarna visade den karakteristiska ytan Plasmon resonans toppen av nanopartiklarna vid cirka 520 Nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: beräkning av ligand-förhållande. (A) denna panel visar representativa NMR-spektra av kombinationer av disulfider (som referenser för ligander efter kärnetsning) och topp tilldelningar för olika protoner i meod-D4. (B) denna panel visar 1H NMR Spectra av etsade nanopartiklar i meod-D4. I alla spektra, * anger lösnings medels topparna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: analys av ligand-densitet. En TGA mätning av nanopartiklarna gjordes för att bestämma förhållandet och tätheten av organiskt material (ligander). Grafen av mätningarna ritas som viktprocenten vs. temperaturen. OT desorbs först, mellan 176 ° c till 233 ° c (vertikala linjer). MUS bryts ned till mindre molekyler och bränns helt på ca 800 ° c. Resterande vikt procent motsvarar den gyllene kärnan av nanopartiklarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: jämförelse mellan stökiometriska och NMR-förhållanden av OT på partiklarna. Det är möjligt att finjustera amphiphilicity av nanopartiklarna genom att ändra utgångs stökiometriska förhållandet mellan MUS och OT i reaktionen. Felstaplar visar den övre och undre gränsen för OT-innehåll som förvärv ATS med de angivna stökiometriska kvoterna. Stökiometriska förhållanden på 10%, 20%, etc., upp till 90% OT, syntetiserades för att iaktta gränserna för OT innehåll på nanopartikeln ytor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver först syntesen av mus ligand och, sedan, syntesen och karakteriseringen av amfifila molekylers mus: OT guld nanopartiklar. Syntetisera MUS med minimal salthalt möjliggör en bättre tillförlitlighet det stökiometriska förhållandet mellan ligander under nanopartikelsyntesen, vilket är en viktig faktor för reproducerbara syntesen av MUS: OT nanopartiklar med ett mål hydrofoba innehåll (figur 8). Användningen av metanol som ett vanligt lösnings medel för MUS och OT, tillsammans med syntesen av partiklarna i etanol, möjliggör en pålitlig syntes av MUS: OT guld nanopartiklar. De metoder för karakterisering presenteras här utgör en minimal lista över experiment som krävs för att förvärva tillräcklig information om nanopartiklar för att kontrol lera resultatet av deras syntes.
Det finns fyra kritiska steg i detta protokoll: (i) syntesen av MUS med en låg salthalt tillsammans med avlägsnande av färgade orenheter i det andra steget och en kristallisation av ren MUS i slutet; II trimning och bestämning av det stökiometriska förhållandet mellan MUS och OT, III) arbetet med nanopartiklarna. och (IV) karakteriseringen av nanopartiklarna.
Under bildandet av nanopartiklar binds MUS företrädes vis till nanopartikelytorna, vilket kan relateras till lösligheten hos de resulterande nanopartiklarna. Till exempel, ett 2:1 stökiometriskt matnings förhållande mellan MUS och OT resulterar i 15% av OT på ytan vid beräkning med hjälp av data från 1H NMR av etsad Guldnanopartiklar. Därför måste ett högre innehåll av OT användas under syntesen av partiklarna (figur 8) för att erhålla en Nanopartikel med en lägre mus till OT-förhållande; med andra ord, en mer hydrofobisk partikel. För att kunna bedöma det stökiometriska förhållandet mellan liganderna på ytan av nanopartiklarna är det nödvändigt att se till att det inte finns några obundna ligander i lösningen. Närvaron av obundna ligander påverkar fast ställandet av ligandförhållandet på nanopartiklarna och densiteten, tillsammans med efterföljande tester och experiment som kan leda till felaktiga tolkningar. Repetitiva rengöringscykler med olika lösnings medel (såsom etanol och DI-vatten) krävs för att eliminera alla obundna ligander och andra orenheter (biprodukter av natriumborhydrid, guld joner, etc.). 1 den första H NMR är viktigt att bekräfta renheten av nanopartiklarna. Den linje breddande effekten av ligander på grund av den komplexa kemiska miljön på nanopartiklarna breddar topparna som motsvarar liganderna, medan alla skarpa signaler kommer från obundna molekyler22. På grund av begränsad rörlighet går det dessutom inte att upptäcka NMR-toppar som motsvarar den metylen som gränsar till thiolgrupperna, vilket är en annan signatur av nanopartikeln när den inspekteras med hjälp av 1H NMR. När nanopartiklarna är rena, då metall kärnan är etsad med jod. Jod etsning är en väletablerad metod för att kvantifiera ligand förhållandet på nanopartiklar. Till exempel, två decennier sedan, Murray et al. rapporterade bestämning av enskiktslager komposition på Guldnanopartiklar efter jod etsning, där jod bryts ned i guld kärnan och frigör tiolat ligander som disulfider23. Jod-etsnings metodens tillförlitlighet har fastställts med hjälp av andra metoder. till exempel rapporterade Harkness et al. att ligand-förhållandet som erhållits från NMR är inom 1% avvikelse från masspektroskopi mätningar24.
TGA är en enkel metod för att beräkna det organiska innehållet på nanopartiklarna. Uppskattningen av ytan ligand densitet förutsätter att alla tiolat ligander binder till ytan guld atomer och alla fria ligander har avlägsnats under rening. För att bestämma ligand densitet, flera antaganden görs, främst att partiklarna är sfäriska, som används för att beräkna ytan, liksom packnings täthet, av guld kärnan. TEM ger en storleks fördelning av nanopartikelguldkärnor som kan användas för att beräkna den ungefärliga ytan av en Nanopartikel. Nanopartikelsyntesen som beskrivs här producerar en polydisperse population av partiklar med en genomsnittlig diameter på 2-3 nm och en storleks avvikelse på upp till 30%. Också, den genomsnittliga radien, som används för att beräkna den genomsnittliga volymen av en partikel (approximera partiklarna till sfärer), kombinerat med densiteten av guld, gör det möjligt att beräkna massan av en Nanopartikel. Sedan, massan mätt med TGA över 800 ° c möjliggör beräkning av antalet partiklar initialt närvarande. Genom att använda detta värde och den genomsnittliga kärn storleken kan den totala ytan av guldnanopartiklarna uppskattas. Den ligand ratio beräknas från de uppgifter som erhållits med 1H NMR spektroskopi möjliggör beräkning av antalet mol av ligander på ytan av nanopartiklarna. Den molara förhållandet mellan ligander över ytan av Guldnanopartiklar ger liganddensitet (figur 7). Rena nanopartiklar har cirka 4 ligander per nm2. TGA-data kan också användas för att uppskatta ligand-förhållandet, om det temperatur intervall i vilket de desorptionslösning från guldytan är känt för varje ligand, och desorption sker vid separata temperatur intervall.
Sammanfattnings vis, detta protokoll ger ett enkelt sätt att syntetisera mus ligand med en låg salthalt och mus: OT amfifila molekylers guld nanopartiklar. En av de viktigaste faktorerna för reproducerbarheten hos dessa nanopartiklar är den låga oorganiska salthalten i det MUS som används. Dessa nanopartiklar är stabila både som pulver och i lösning (t. ex.H2O och fysiologiskt relevanta sådana), vilket bör betonas som en förutsättning för många tillämpningar. Noggrann karakterisering av storlek och ytans egenskaper hos amfifila molekylers nanopartiklar är avgörande för framtida tillämpningar där graden av amphiphilicity kan spela en viktig roll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Z.P.G. och F.S. tackar Swiss National Science Foundation och särskilt NCCR ' Molecular system Engineering '. Z.L. och F.S. tackar stöd av Swiss National Science Foundation Division II bidrag. Alla författare tackar Quy Ong för givande diskussioner och för korrektur läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11-bromo-1-undecene | Sigma Aldrich | 467642-25 ml | |
| Sodium Sulfite | Sigma Aldrich | S0505-250 g | |
| Benzyltriethyl-ammonium bromide | Sigma Aldrich | 147125-25 g | |
| Methanol | VWR | BDH1135-2.5 LP | |
| DI water | Millipore | ZRXQ003WW | Deionized water |
| 1 L round bottom flask | DURAN | 24 170 56 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 1.00930 EMD Millipore | |
| Stirring bar | Sigma Aldrich | Z329207, | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | Sigma Aldrich | Z273554 ALDRICH | |
| Filtering flask | DURAN | 20 201 63 | |
| Filtering Buchner Funnel | FisherSci | 11707335 | |
| Ethanol >99.8%, ACS, Reagent | VWR | 2081.321DP | |
| Deuterium dioxide | Sigma Aldrich | 151882 ALDRICH | |
| Thioacetic acid 96% | Sigma Aldrich | T30805 ALDRICH | |
| Carbon black | Sigma Aldrich | 05105-1KG | |
| Celite | Sigma Aldrich | D3877 SIGMA-ALDRICH | Filtration medium |
| Condenser | Sigma Aldrich | Z531154 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent 37% | Sigma Aldrich | 320331 SIGMA-ALDRICH | |
| Sodium Hydroxide, BioXtra, pellets (anhydrous) | Sigma Aldrich | S8045 SIGMA-ALDRICH | |
| Centrifuge tubes | VWR | 525-0155P | |
| 250 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 37 | |
| 500 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 46 | |
| Nitric acid, fACS reagent 70% | Sigma Aldrich | 438073 SIGMA-ALDRICH | |
| Gold(III) chloride trihydrate >99.9% trace metal basis | Sigma Aldrich | 520918 ALDRICH | |
| 1-octanethiol >98.5% | Sigma Aldrich | 471836 ALDRICH | |
| Sodium Borohydride purum p.a.>96% | Sigma Aldrich | 71320 ALDRICH | |
| addition funnel | SIgma Aldrich | Z330655 SIGMA | |
| Funnel | DURAN | 21 351 46 | |
| 2V folded filtering papers | Whatman | 1202-150 | |
| Amicon filters | Merck | UFC903024 | |
| Iodine, ACS reagent, >99.8%, solid | Sigma Aldrich | 207772 SIGMA-ALDRICH | |
| 5 mm NMR-Tubes, Type 5HP (high precision) | Armar | 32210.503 | Length 178 mm |
| Methanol-d4 99.8 atom%D | Armar | 16400.2035 | |
| TGA crucible | Thepro | 9095-9270.45 | |
| 400 mesh carbon supported copper grid | Electron Microscopy Science | CF400-Cu | |
| quartz cuvette | Hellma Analytics | 100-1-40 |
References
- Verma, A., et al. Effect of surface properties on nanoparticle-cell interactions. Small. 6 (1), 12-21 (2010).
- Yeh, Y. -C., et al. Gold nanoparticles: preparation, properties, and applications in bionanotechnology. Nanoscale. 4 (6), 1871-1880 (2012).
- Mirza, A. Z. A novel drug delivery system of gold nanorods with doxorubicin and study of drug release by single molecule spectroscopy. Journal of Drug Targeting. 23 (1), 52-58 (2015).
- Mirza, A. Z., et al. Fabrication and characterization of doxorubicin functionalized PSS coated gold nanorod. Arabian Journal of Chemistry. , In Press (2014).
- Nel, A. E., et al. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8 (7), 543-557 (2009).
- Yeo, E. L. L., et al. Protein Corona around Gold Nanorods as a Drug Carrier for Multimodal Cancer Therapy. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (6), 1039-1050 (2017).
- Lin, J., et al. Cell membranes open "doors" for cationic nanoparticles/ biomolecules: Insights into uptake kinetics. ACS Nano. 7 (12), 10799-10808 (2013).
- Saha, K., et al. Regulation of Macrophage Recognition through the Interplay of Nanoparticle Surface Functionality and Protein Corona. ACS Nano. 10 (4), 4421-4430 (2016).
- Moyano, D. F., et al. Fabrication of corona-free nanoparticles with tunable hydrophobicity. ACS Nano. 8 (7), 6748-6755 (2014).
- Pengo, P., et al. Gold nanoparticles with patterned surface monolayers for nanomedicine: current perspectives. European Biophysics Journal. 46 (8), 749-771 (2017).
- Kuna, J. J., et al. The effect of nanometre-scale structure on interfacial energy. Nature Materials. 8 (10), 837-842 (2009).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nature Materials. 7 (7), 588-595 (2008).
- Van Lehn, R. C., et al. Lipid tail protrusions mediate the insertion of nanoparticles into model cell membranes. Nature Communications. 5, 4482-4493 (2014).
- Cagno, V., et al. Broad-spectrum non-toxic antiviral nanoparticles with a virucidal inhibition mechanism. Nature Materials. 17 (2), 195-203 (2018).
- Uzun, O., et al. Water-soluble amphiphilic gold nanoparticles with structured ligand shells. Chemical Communications. 2 (2), 196-198 (2008).
- Huang, R., et al. Colloidal stability of self-assembled monolayer-coated gold nanoparticles: The effects of surface compositional and structural heterogeneity. Langmuir. 29 (37), 11560-11566 (2013).
- Carney, R. P., et al. Electrical method to quantify nanoparticle interaction with lipid bilayers. ACS Nano. 7 (2), 932-942 (2013).
- Van Lehn, R. C., et al. Effect of particle diameter and surface composition on the spontaneous fusion of monolayer-protected gold nanoparticles with lipid bilayers. Nano Letters. 13 (9), 4060-4067 (2013).
- Huang, R., et al. Effects of surface compositional and structural heterogeneity on nanoparticle-protein interactions: Different protein configurations. ACS Nano. 8 (6), 5402-5412 (2014).
- Van Lehn, R. C., et al. Free energy change for insertion of charged, monolayer-protected nanoparticles into lipid bilayers. Soft Matter. 10 (4), 648-658 (2014).
- Ong, Q., et al. Characterization of Ligand Shell for Mixed-Ligand Coated Gold Nanoparticles. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1911-1919 (2017).
- Marbella, L. E., et al. NMR techniques for noble metal nanoparticles. Chemistry of Materials. 27 (8), 2721-2739 (2015).
- Templeton, A. C., et al. Reactivity of Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules Steric Effects. Journal of American Chemical Society. 120 (8), 1906-1911 (1998).
- Harkness, K. M., et al. A structural mass spectrometry strategy for the relative quantitation of ligands on mixed monolayer-protected gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 82 (22), 9268-9274 (2010).
