Summary
Denne artikel præsenterer en metode til at studere nicotinsyre acetylcholin receptorer (nAChRs) i mus hjernen skiver af nikotin uncaging. Når kombineret med samtidige patch klemme optagelse og 2-foton laser scanning mikroskopi, forbinder nikotin uncaging nicotinsyre receptoren funktion med cellulære morfologi, giver en dybere forståelse af kolinerge neurobiologi.
Abstract
Acetylkolin (ACh) fungerer via receptorer til at graduere en bred vifte af neuronal processer, men det har udfordrende for at sammenkæde ACh receptor funktion med subcellulært placering i celler hvor denne funktion er udført. For at studere subcellulært placeringen af nicotinsyre ACh receptorer (nAChRs) i native hjernevæv, blev en optisk metode udviklet til præcise frigivelse af nikotin diskrete steder nær neuronal membraner under elektrofysiologiske optagelser. Patch-fastspændt neuroner i hjernen skiver er fyldt med farvestof til at visualisere deres morfologi i løbet af 2-foton laser scanning mikroskopi, og nikotin uncaging er udført med en lys flash ved at fokusere en 405 nm laserstråle i nærheden af en eller flere cellemembraner. Cellulære nuværende omlaegninger måles, og en høj opløsning tredimensional (3D) billede af indspillede neuron er lavet til at tillade afstemning af nAChR svar med cellulære morfologi. Denne metode giver mulighed for detaljeret analyse af nAChR funktionelle fordeling i komplekse væv præparater, lovede at øge forståelsen af kolinerge neurotransmission.
Introduction
Kolinerge signalering modulerer talrige hjernen processer, herunder attentional kontrol, viljesmæssige bevægelse og belønning1,2. Lægemidler, der forbedrer acetylkolin (ACh) transmission bruges til at behandle kognitiv svækkelse forbundet med Alzheimers sygdom, hvilket indebærer en vigtig rolle for kolinerge systemer i kognition3. En bedre forståelse af kolinerge receptorer og kredsløb i raske og syge stater kan føre til bedre terapeutiske tilgange til flere neurologiske sygdomme/lidelser.
Nicotinsyre ACh receptorer (nAChRs) er en familie af ligand-gated Ionkanaler, der flux kationer reaktion på endogene ACh eller eksogen nikotin fra tobaksvarer. I betragtning af at de var blandt de allerførste neurotransmitter receptorer er beskrevet4, er nAChR farmakologi og placering i muskelfibre velforståede for muskel-type receptorer. Derimod er relativt lidt kendt om farmakologi og subcellulært distribution af indfødte nAChRs i hjernen. Denne forskel i viden var for nylig rettet ved at udvikle en roman kemiske sonde, der giver mulighed for rumligt begrænset og hurtig aktivering af nAChRs i hjernevæv under cellulære imaging og elektrofysiologiske optagelse5. Her, er de vigtige metodologiske trin i denne fremgangsmåde beskrevet, med det overordnede mål om at forbedre evnen til at forbinde nAChR funktion med neuronal struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kemisk navn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarin-4-yl] methyl-nikotin) kan være photolyzed med ~ 405 nm laser blinker effektivt frigive nikotin5,6. Før uncaging, PA-Nic er stabil i løsning og udviser ingen uheldige farmakologiske eller fotokemisk funktioner5. Efter fotolyse, frigivne nikotin forudsigeligt aktiverer nAChRs og den uncaging biprodukter er farmakologisk inaktive5. En kontinuerte laser bruges som fotolyse lyskilde med en udgangseffekt > 1 mW målt på prøven. Når lokaliseret, målrettede foto-stimulation er kombineret med evnen til at finde cellemembranerne med 2-foton laser scanning mikroskopi (2PLSM), og de to vigtigste fordele ved denne tilgang er fuldt realiseret: fotolyse hastighed og rumlige præcision.
I de fleste henseender er fotolyse af PA-Nic overlegen i forhold til andre metoder til at levere nAChR ligander til receptorer i hjernen skiver. Sådanne strategier omfatter bad ansøgning7 og lokale stof levering via en kuglefisk pipette8. Der henviser til, at den tidligere strategi har tendens til at over understrege de langsigtede virkninger af det anvendte stof, kan den sidstnævnte tilgang lider af variation i respons kinetik mellem forsøg og på tværs af celler. Ingen af disse alternative tilgange kan tilstrækkeligt skelne receptor aktiviteter i forskellige cellulære steder fra den samme neuron. Optogenetically-aktiveret frigivelse af ACh har været brugt i undersøgelsen af indfødte nAChRs9,10,11, men det har ikke vist sig nyttigt for kortlægning subcellulært nAChR placeringer. Endvidere, de fleste undersøgelser udnytter denne tilgang har påberåbt sig en ChR2-udtrykker bakteriel kunstige kromosom Transgene mus med unormale kolinerge transmission12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolyse er ikke kun optisk tilgang til at studere kolinerge receptorer. En bur carbachol blev brugt til funktionelt kort ACh receptor aktiviteter i kulturperler celler18 og hjernen skiver19, men var ikke kommercielt tilgængelige for sammenlignende undersøgelser under udviklingen af PA-Nic. En ruthenium bis (bipyridine)-nikotin komplekse (RuBi-nikotin) blev rapporteret til at gøre det muligt for nikotin uncaging20, men kommercielle præparater af RuBi-nikotin viste sig ringere end PA-Nic i et head-to-head sammenligning studere5. Det kan være nyttigt at gentage sådanne sammenlignende forsøg med ikke-kommercielle, meget renset RuBi-nikotin, som dens synlige absorption kunne komplimentere PA-NICs funktioner til kolinerge undersøgelser. Endelig har nAChRs også været optisk manipuleres ved hjælp af en kombination af foto-omstillelig ligander og genetisk modificerede receptorer21. Denne tilgang er et supplement til PA-Nic fotolyse i hjernevæv med evnen/kravet om genetiske målretning af den ændrede nAChR opfattes som både en fordel og en ulempe.
Flere vigtige krav af denne fremgangsmåde skal bemærkes. Først, en passende Visualisering metode er nødvendigt til præcist lokalisere neuronal membranen. Billedbehandling med konventionelle epi-Fluorescens mikroskopi kan være tilstrækkelig, når man studerer kulturperler celler, men for optagelse fra neuroner i hjernen skiver eller andre præparater, tykt væv, 2PLSM eller Konfokal mikroskopi er et krav. For det andet en egnet metode er nødvendig for at placere fotolyse laserstråle. Denne metode udnytter en dual-Drejespoleinstrument scan hoved med to uafhængige x-y spejle til raster scanning af imaging stråle og punkt photoactivation ved hjælp af den uncaging laser stråle22,23,24. Andre, mere begrænset løsninger er mulige, som (1) en enkelt-Drejespoleinstrument scan hoved at alternativt raster scanner imaging strålen og uncaging bom, eller (2) blot lede uncaging bjælken til midten af synsfeltet, således, at cellen er bragt til denne holdning til flash fotolyse. For det tredje, et system er nødvendig for samtidige elektrofysiologiske optagelse, hvis man ønsker at indsamle fysiologiske signaler under eksperimenter. Ovenstående krav kan opfyldes med en egnet all-optiske billeddannelse teknik, som for nylig beskrevet5. Nedenfor, en detaljeret protokol er inkluderet, der beskriver de vigtigste trin i denne fremgangsmåde.
Protocol
Arbejde vedrørende til hjernen skive forberedelse blev gennemgået og godkendt af Northwestern University Animal Care og brug Udvalget (protokol #IS00003604).
Forsigtighed: Lasere bruges til punkt foto-stimulation er synlige klasse IIIb lasere, der har potentiale til at forårsage skade på øjne. 2PLSM kræver en nær-infrarødt (NIR) klasse IV laser (> 500 mW), som har potentiale til at forårsage alvorlig skade på øjne og endda forbrændinger i andre væv. Ordentlig laser stråle indeslutning, system blokeringsanordninger, plus manipuleret og administrative kontrol skal sikre sikker drift af laser-baseret udstyr. Altid opsøge lokale laser sikkerhedspersonale, når du arbejder med lasere.
1. kalibrering og verifikation af den Uncaging Laser(s)
-
Kvantificere laser power leveres til prøven.
- Drej på 405 nm laser (100 mW maksimal effekt med 5 V kontrolsignal) og lad det laser system varme op omkring 10 min.
Bemærk: Laseren er stadig lukker (med 0 V-drev), og der er ingen udgangseffekt indtil laser sendes en kontrol spænding til at modulere udgangseffekten. - Placer en energimåler i væv prøve fly eller i stedet for kondensator linse. Manuelt centrere meter i forhold til det optiske sti/mål linse.
- Sæt måleren til det korrekte bølgelængdeområdet (400-1100 nm). Nul meter af deprimerende den relevante knap.
- Brug software kontrol, markere 100 (ud af max 1000, 1000 = 5 V) til 405 nm laser magt, som sætter laseren til 10% af fuld effekt. Hvis det ønskes, laser kontrol spænding også kan inddrages i PrairieView system via VoltageRecord at give en digital post for kommandoen signal timing og magt niveau.
- Optage læsning fra wattmeteret.
- Vælg 150 (15% af max 1000) til 405 nm laser power output og optage læsning fra wattmeteret. Gentag dette for de følgende output beføjelser til at indsamle en laser effektkurven: 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, og 1000.
- Drej på 405 nm laser (100 mW maksimal effekt med 5 V kontrolsignal) og lad det laser system varme op omkring 10 min.
-
Kalibrere de uncaging laser galvanometers. Udfør følgende trin, når der er en ændring af de optiske komponenter i systemet, når der er en bekymring for præcis spot positionering, eller regelmæssigt hver måned.
- Installere 60 x vand-dypning mikroskop mål linse, der skal bruges i photostimulation og billeddiagnostiske eksperimenter. Erhvervelse/billedbehandling software, Vælg 60 x mål linse og en optisk zoomindstilling af 1 (Se trin 3.1.4.2.).
- Markere en udfyldt cirkel på et rent glas mikroskopi dias med en rød permanent markør. Placer diasset på stadiet mikroskop med markør mod målet.
- Pre fokusere mikroskop på den røde mærkeområde med en 4 x eller 10 x mål. Tilføje 1-2 mL vand til toppen af rød markør prik/plet og derefter skifte til 60 x mål og nedsænkes målet i vandet. Fokus mål linsen på den tynde røde mærkeområde.
- Skifte til 2-foton laser scanning. For de fleste systemer, flytte tårn position #1, flytte trinocular prisme ud af stien let flytte scanningen hovedet spejl til front og laser bølgelængden ~ 900 nm. Vælg indstillingen 512 x 512 pixel boks for image erhvervelse parametre, som er standard pixel element for stimulation spejl kalibreringen rutine.
- Start system scanning med en billeddannelse laser magt større end minimum og finjustere den objektive fokus på tynd rød markør fluorescens lag. Vælg et felt i feltet fluorescens tydeligt af vragrester og jævnt overtrukket med markør.
Bemærk: Opsætning i denne protokol bruger PrairieView 5.4 erhvervelse/imaging software. - Åbn Uncaging Galvo kalibreringsfunktionen i menuen værktøjer-kalibrering/tilpasning af softwaren. Gå gennem den brænde steder tutorial for den rumlige kalibrering af andet Drejespoleinstrument spejl par.
- I selvstudiet brænde steder vælge 405 nm laser, Vælg en laser stimulation magt af 400 og stimulation varighed af 20 ms. dette bør give små (~ 1-5 µm diameter) huller i en rød markør.
Bemærk: Indstillinger såsom ~ 2-4 mW og 1-10 ms bruges typisk, men indstillingerne bestemmes af prøven. PA-Nic foto-stimulation strømindstillinger vil sandsynligvis være langt lavere end den effekt, der under kalibrering til ablate en synlig hul i diasset rød markør. Denne kalibreringen rutine er nyttig til at lokalisere photostimulation steder, men bør ikke bruges til at udlede absolutte photostimulation mængder under fysiologiske reaktioner. - Vælg opdatering til at stimulere og genopfriske billedet efter center stedet brænde og flytte den runde røde indikator til den faktiske spot placering. Gør dette til centrum spot, højre center stedet, lavere center stedet, og endelig til et gitter af ni steder (alle hjørner og kanter plus i midten af billedet).
Bemærk: Centreret, højre og nederste korrigeret spot steder bestemme stimulation Drejespoleinstrument spændinger til at definere sande centrum og X og Y skalering faktorer til at matche stimulation spejl par til billedbehandling spejl parret. Softwaren vil skalere og opdatere, alle efterfølgende MarkPoints eksperimenter udført på zoom-indstillinger forskellig fra den rumlige kalibrering zoom.
- I selvstudiet brænde steder vælge 405 nm laser, Vælg en laser stimulation magt af 400 og stimulation varighed af 20 ms. dette bør give små (~ 1-5 µm diameter) huller i en rød markør.
- Teste kalibrering ved at åbne vinduet MarkPoints og manuelt aktivere stimulation parametre i definerede stedet i et nyt område af prøven. Sikre at den korrekte, seneste kalibrering fil indlæses i vinduet MarkPoints . Aktivere funktionen MarkPoints/gruppe eller MarkPoints serien på et defineret stedet eller udnytte funktionen Live/Ablation til højre/venstre klik på musen hvor som helst på billedet under levende scanning for at anvende en test puls og kontrollere korrekt kalibrering.
Bemærk: Laser brænder spot bør nu være perfekt centreret på indikatoren for MarkPoints . - Overvåge og registrere aktivering af laser puls magt og tidsmæssige varighed ved at trykke ud køre spænding til programmet VoltageRecord (Se trin 1.1.4). Ligeledes registrere placeringen af hver stimulation sted ved hjælp af et skaleret spænding signal fra feedback signaler afledt af par af foto-stimulation Drejespoleinstrument spejle.
2. forberedelse af Photoactivatable nikotin (PA-Nic)
- Hente en alikvot af frysetørret photoactivatable stof fra opbevaring.
Bemærk: Følgende protokol er specifikke for PA-Nic; Juster efter behov for andre photoactivatable lægemidler. Selv om PA-Nic demonstrerer enestående stabilitet5, tage rimelige forholdsregler for at beskytte det mod udsættelse for lys under forberedelse og/eller eksperimenter. Dette kan ske ved blot arbejder i svagt lys; begrænse til røde filtreret lys er ikke nødvendigt. -
Udføre lokal anvendelse af PA-Nic.
- Trække et glas mikropipette med åbningen diameter på 20-40 µm med en programmerbar pipette puller.
- Filtrer ~ 1 mL optagelse løsning med et 0,22 µm filter. Resuspend en mængde af PA-Nic i filtreret optagelse løsning til at give en endelig koncentration på 2 mM. For eksempel, opløse en 100 nmol frysetørret alikvot i 50 µL af filtrerede optagelse løsning.
Bemærk: En foreslåede optagelse løsning sammensætning kan findes i de seneste publikationer5,6 beskæftiger PA-Nic fotolyse. - Back-fill lokal applikation pipette med 50 µL af 2 mM PA-Nic.
- Sikre lokal applikation pipette til en pipette indehaveren monteret på en micromanipulator. Tilsluttes et pres udslyngning system i stand til at vedvarende lavtryks ansøgning (1-2 psi) afpipetteres indehaveren via passende slanger.
- Ved hjælp af micromanipulator, manøvrere lokal applikation pipette til ekstracellulære optagelse løsning og holdning pipette spidsen lidt over musen hjernevæv beliggende ~ 50 μm fra celle af interesse. Konsultere en tidligere rapport om en detaljeret protokol af musen hjernen skive forberedelse og patch klemme optagelser8.
- Kontrollere parametrene anvendelse af kortvarigt pressionsmiddel (1-2 psi). Der bør være minimal til nogen forskydning af cellen af interesse. Hvis betydelig bevægelse sker, skal du flytte lokal applikation pipette yderligere væk (i den laterale og/eller aksial retning) fra celle af interesse.
- Efter opnåelse af stabil hele cellen patch klemme (detaljer som indgår i en forudgående offentliggørelse8), drej på lavt tryk (1-2 PSI) overførelse benytter den passende manuel switch på pres udslyngning enhed. Mætte i vævet omkring cellen med PA-Nic for 1-2 min før du fortsætter til næste trin.
-
Udføre bad ansøgning (superfusion) af PA-Nic til hjernen skive.
- Opløse et antal PA-Nic i et volumen på optagelse løsning egnet til kontinuerlig recirkulering til at give en endelig koncentration på 100 μM. For eksempel, opløses en 1 μmol alikvot i 10 mL af optagelse løsning ved hjælp af et standard 15 mL tube.
- Begynde recirkulation af PA-Nic løsningen med en sats på 1,5-2 mL/min. ved at åbne passende flow-styringen i perfusion system. Recirkulation opstår for varigheden af optagelsen. For at spare værdifuld stof, minimere recirkulation lydstyrken ved hjælp af slanger med en minimal indre diameter og/eller ved at forkorte den samlede længde af slanger, der anvendes i perfusion system.
Bemærk: Ved at tage disse skridt, kan lydstyrken for bad recirkulation reduceres til 5 mL af PA-Nic løsning. PA-Nic løsninger kan ofte bruges til to på hinanden følgende registrering dage inden for den samme uge, hvis det opbevares beskyttet mod lys ved 4 ° C. - Under recirkulation, løbende boble løsning med carbogen (5% O2, 95% CO2) og vedligeholde bad temperatur på 32 ° C.
- Bevare hjernen udsnittet i optagelse løsning mens du arbejder med PA-Nic i svagt lys.
3. imaging neuroner med 2-foton Laser Scanning mikroskopi
- Udføre live visualisering af cellen.
- Identificere/visualisere en mediale habenula (MHb) neuron ved hjælp af gennemlysning eller infrarød differential interferens kontrast (IR/DIC) optik og et videokamera og etablere en stabil hele cellen patch klemme optagelse. Henvise til en tidligere protokol for detaljer om patch klemme optagelser fra neuroner i akut forberedt mus hjernen skiver8.
- Efter oprettelse af high-modstand (> 1 GΩ) celle-attached konfiguration, men før indbrud, skifte set-up og software til laser scanning mode.
- Efter indbrud, bruge laser scanning for at kontrollere, at en tænkelig farvestof (fortyndet til en endelig koncentration på 100-200 µM i en standard intracellulære pipette løsning beskrevet tidligere8) er passivt (ved diffusion) fylde neuron. Tillad farvestof (fx Alexa Fluor 488 i grøn photomultiplier tube [ydelse] kanal, ydelse 2; eller Alexa Fluor 568 eller 594 i røde ydelse kanal, ydelse 1) til at fylde de cellulære rum til mindst 20-30 min før du forsøger eksperimenter, der kræver visualisering af enhver cellulære rum uden for soma.
Bemærk: Distale rum (dendritiske strukturer, pigge, axoner, osv.) kan kræve, at 30-40 min. til at fylde helt25. - Brug software Live Skan funktion for at visualisere neuron og subcellulært rum af interesse. Vælg imaging parametre, der giver mulighed for nøjagtig live visualisering af neuronal funktioner. Manipulere forskellige indstillinger for at påvirke eller ændre display visualisering (kontrast), opløsning, signal / støj (S/N) forhold og image frame erhvervelse tid:
-
Look-table (LUT). Åbn vinduet LUT ved hjælp af passende ikon på siden af enhver billedvinduet. Når åbner, skal du justere LUT gulv (min) og loft (max) indstilling af specifikke billede kanal til at forbedre visualisering af signal kontrast vises på skærmen. Sænke den maksimale værdi til ~ 1000 (ud af 4096, 12-bit detektion), som vil bidrage til at trække ud lysdæmper signaler når først søger celler, signal og struktur.
Bemærk: Disse indstillinger påvirker kun den viste signal, ikke opdaget/registreret værdier. Menneskelige øjne kan typisk kun gøre ud kontrast til ~ 50 grå niveauer26. -
Optisk zoom. Brug software kontrol til at vælge 1 X optisk zoom og brug panorering kontrol for at finde det ønskede område i vævet. Denne zoomindstilling udbytter største plads, scannet synsfelt, og sender de største spændinger/scan vinkler, til Drejespoleinstrument spejle.
Bemærk: Standardkonfigurationen er til en 12 mm x 12 mm synsfeltet inde i scanningen hovedet, hvilket svarer til 12 mm divideret med objektive forstørrelse inde i prøven. Derfor, en 60 x mål linse udbytter scannede billeder af 200 µm per side på 1 x optisk zoom. Højere optisk zoom værdier Skan mindre område. 2 x optisk zoom er ofte den mest nyttige indstilling til at visualisere hele neuroner. 4 x kan være nyttige til at visualisere subcellulært aspekter af neuroner. -
Antal pixel. Supplement 1 x optisk zoom, Vælg 1024 x 1024 pixels per linje ved hjælp af software kontrol. Angive antallet af pixel pr. linje i erobrede og viste billede ikke at miste detaljer muligt fra den objektive linse. Brug de følgende praktiske pixelværdier til en 60 x / 1,0 numerisk blænde (NA) mål: 1024 x 1024 for zoom 1, 512 x 512 for zoom 2 og 256 x 256 for zoom 4. Ende pixelstørrelse (~0.17 µm; 12 mm/forstørrelse/zoom/pixel) bør være halvdelen, eller mindre, af den laterale opløsning defineret af formålet objektivet.
Bemærk: Billedopløsningen er kun defineret af laser bølgelængde og den objektive NA (0.4 µm beslutning fra to-foton glade [2PE] med 920 nm og en 1,0 Nielsen objektivt)27. Kriterierne for fuld excitation NA, som er angivet på objektivet, er der 1/e2 intensiteten af laser stråle diameter kampe (eller "fylder") indgangspupillen (2 x tube objektivets brændvidde x NA / forstørrelse) af formålet objektivet. Tube linsen i systemet beskrevet her har en brændvidde på 180 mm. -
Pixel hviletid . Brug software kontrol til at vælge 4 µs for pixel hviletid, en nyttig standardværdi.
Bemærk: Ændre pixel hviletiden ændrer ikke den gennemsnitlige signal opdaget; det påvirker kun den intra-pixel gennemsnit og disse ændringer kan visualiseres gennem billedkvaliteten via S/N. Billede pixel hviletiden er altid et multiplum af 0,4 µs enheder, og for større dwell gange 12-bit-begrænsede intensitet værdi af hvert billede pixel er gennemsnittet af 0,4 µs prøver. Da S/N-forholdet forbedrer som kvadratroden af antallet af prøver pr. pixel hviletid (4 µs er lig med ti prøver eller 3.16-fold forbedring i S/N), når forbedring i billedkvaliteten aftagende afkast for værdier meget større end 12 µs. -
Scan Rotation og Region af interesse (ROI). Indstille image vinkel på 0° rotation ved hjælp af software kontrol (ingen handling kan være nødvendigt, da 0° rotation er standardindstillingen for de fleste Billeddannende systemer). Hvis prøven placeres i en "upside-down" orientering, Vælg 180° rotation til "flip" billedet.
Bemærk: Rotere billedet, i enhver given vinkel, kan give en bedre pasform for hele området af interesse for en fyldt celle. Rotation kan også give et klarere grundlag til at justere strukturelle ændringer og til at udføre efterfølgende analyse. At vælge en region af interesse inden for det scannede billede på en given zoom (trin 3.1.4.2) indstilling bevarer indfødte pixel nummer (trin 3.1.4.3), men begrænsningen i antallet af området og pixels kan dramatisk øge billedhastighed, giver forbedret tidsmæssige opløsning af signal ændringer. -
Ramme i gennemsnit. Vælg en start frame gennemsnitlige indstilling af 2 rammer ved hjælp af software kontrol.
Bemærk: Endelige billedkontrast (S/N) er defineret ved de samlede fotoner indsamlet/opdaget inden for signal pixel i billedet. Gennemsnit af flere billedrammer kan forbedre S/N-forhold, forudsat at stikprøven bevæger sig ikke eller er ikke bleget under imaging. Signal om interesse forbliver den samme værdi under rammen gennemsnit mens støj i billedet er reduceret med kvadratroden af antallet af rammer i gennemsnit. Små strukturer i fluorescens billeder kræver ofte indbyrdes pixel gennemsnit, kombinere pixel i billedet (ofte kaldet ROIs) og/eller ramme i gennemsnit. Ramme gennemsnit øger scanningstiden af antallet af billeder man vælger at gennemsnittet.
-
Look-table (LUT). Åbn vinduet LUT ved hjælp af passende ikon på siden af enhver billedvinduet. Når åbner, skal du justere LUT gulv (min) og loft (max) indstilling af specifikke billede kanal til at forbedre visualisering af signal kontrast vises på skærmen. Sænke den maksimale værdi til ~ 1000 (ud af 4096, 12-bit detektion), som vil bidrage til at trække ud lysdæmper signaler når først søger celler, signal og struktur.
- Brug Pan-regulatoren, Skan Rotationog Optisk Zoom til at orientere den prøve placering under scanning. Hvis motor fase manipulation er nødvendig for at placere prøven, undgå store skridt størrelser til X, Y og Z-aksen til at forhindre mål/kondensator kollisioner, vibrationer eller eksponering af laserstrålen til reflekterende overflader.
- Indsamle en Z-stak. Du bruger værktøjet Z-serien , Vælg en start og stop holdning, der indeholder cellen af interesse. Vælg et trin størrelse (1 µm) og derefter fortløbende billede neuron i hver Z-plan, der indeholder cellen.
Bemærk: Z-stakken erhvervelsen indstillinger varierer mellem neuron type og fylde farvestof. Optimale parametre for Z-stakken erhvervelsen bør fastsættes uafhængigt af parametre, der bruges til live imaging. Z-stakken erhvervelsen kan udføres før og efter optopharmacology eksperimenter. Hvis det er muligt, udføre Z-stakken erhvervelsen efter optopharmacology at undgå cellulære skader induceret fra 2PLSM og give mulighed for optimal farvestof påfyldning af små cellulære rum.
4. laser Flash fotolyse under elektrofysiologiske optagelser
Bemærk: Anvende 405 nm eller 473 nm laser beføjelser ≥ 1 mW producerer Morild inde glas mål og kondensatoren linser. Denne genererede lys er direkte relateret til laser belysningsstyrke magt; emissionen er til stede i de grønne og røde spektrale windows og har ophidset tilstand levetider i rækken ms. Denne baggrund stimulation artefakt er set i alle objektiver testet og vand-dypning målet linser fra alle store producenter af målet linser. Kondensatoren objektiver producere meget højere Morild end målet linser. Denne "signal" motiverer anvendelse af mekaniske forskalling for beskyttelse af følsomme gallium arsenide indiumfosfid (GaAsP) ydelse katoder under foto-stimulation begivenheder. Ved hjælp af en normalt lukket mekaniske lukker (lukket når ikke aktivt scanning) repræsenterer den bedste løsning til beskyttelse af afkølet GaAsP PMTs.
- For et timeglas-type photostimulation beam geometri, skal du fjerne fokus linser i lysbanen optik, der ville ellers smal/snøre laserstrålen da den går ind for objektive indgangspupillen.
- Brug MarkPointsat markere indstillingen enkelt spot.
Bemærk: Andre foto-stimulation indstillinger (flere steder, et gitter af steder, spiral scanning) er muligt inden for MarkPoints. Enkelt spot er den enkleste. Eksperimentelle mål og biologiske forskelle kan nødvendiggøre en anden indstilling. - Opdatere billedet ved hjælp af indstillingen Lever Skan kort billede og Find den subcellulært område af interesse. Jævnligt opdatere billedet for at identificere alle potentielle lille fejltrin i fokus.
- Brug software kontrol til at øge den optiske zoom (dvs, vælge en højere optisk zoomindstilling end det nuværende), hvis det er nødvendigt, at visualisere små strukturer (dvs, pigge eller distale dendritter).
- Placer MarkPoints enkelt spot sigtekornet umiddelbart tilstødende (~0.5 μm) til cellemembranen. Ikke sted foto-stimulation stedet direkte over en cellulær funktion, da dette kan føre til solskader.
- Angiv parametre for foto-stimulation ved hjælp af software kontrol i MarkPoints. Anvende retningslinjerne begynder som følger: 1-50 ms varighed, 1-4 mW laser power og ≥ 1 retssag.
- Vælg Kør MarkPoints at indlede MarkPoints protokol og observere Elektrofysiologi datafangst i realtid.
- Gentag trin 4.2-4.7 flere gange at evaluere sammenhæng og stabilitet, eller mangel på samme, svar amplitude og kinetik.
Representative Results
For fotolyse er stimulation, eksponering dosis (intensitet og tid), eksponering placering og beam geometri vigtige variabler. Det system, der er beskrevet i denne artikel er habil i to forskellige photostimulation bjælker, justerbar via flytte en linse i/ud af stien photostimulation lys før strålen træder Drejespoleinstrument system. Uden denne linse, photostimulation stråle fylder indgangspupillen af 60 x / 1,0 NA vand-dypning [60 x WD] mål, producerer en nær-diffraktion-begrænset, sub-µm spot på fokalplan inde i prøven. Dette er forbundet med photostimulation lys med en timeglas figur, strækker sig over og under den fokale spot symmetrisk med den optiske akse. Med linse indsat i stien, photostimulation laserlys er fokuseret ind indgangspupillen af formålet objektivet og derefter afslutter som en blyant-lignende stråle. Denne stråle, som forventes at blive ~ 10 µm i diameter for en 60 x mål, udvider ensartet/lodret under hele prøven. I denne tilstand bliver lysintensitet på enhver given placering inden for stimulation stedet ~ 1% af nær-diffraktion-begrænset lille spot intensitet. Således er højere laser beføjelser typisk kræves, når du bruger ~ 10 µm spot stimulation. For alle eksperimenter rapporteret i denne artikel, blev et timeglas-type photostimulation beam brugt.
Den leverede prøve magt kan plottes i indstillingen indgangsspænding efter måling af laser effekten på prøven ved hjælp af en energimåler. Disse undersøgelser bruger en 60 x WD mål med en arbejdende afstand af 2 mm, men det er ikke nedsænket i vand for at undgå potentielle skader på elementet detektor magt målinger. Når målene med opført NA > 0,95 måles i luften (uden nedsænkning væske), der kan være total interne reflection tab på linsen forsiden element på grund af den lavere indeks (luft). I dette tilfælde, for en mere præcis prøve effektmåling (at korrigere for total interne reflection tab), øge den målte effekt 1,0 Nielsen objektivt (1,0/0.95)2 målt i luften. Figur 1a viser en typisk input/output plot til 405 nm og 473 nm synlige lasere, der er indarbejdet i laser lanceringen systemet i denne undersøgelse. Disse laser-systemer er ideelle til foto-stimulation eksponeringskontrol dosis af følgende årsager: (1) de er pre kalibreret til at give direkte lineær power output i forhold til input-spændingen (0-5 V), (2) de giver en lydløs lukkeren drift (med ingen laser output), og (3) de har hurtig, sub-ms intensitet puls varighed kontrol (0,1 ms svar). Når du bruger spot photo-stimulation med en laser/galvo system, er rutinemæssig kalibrering af MarkPoints steder en væsentlig opgave. Figur 1b (venstre panel) viser et system, der er ude af kalibrering (ønskede punkt til foto-stimulere ikke resulterer i præcise stimulation af punkt, som angivet af brænde-hullers placering), med en tilbagevenden til nøjagtig positionsbestemmelse af stedet efter kalibrering ( Figur 1b, højre panel).
PA-Nic er beskedent fluorescerende (emission peak på ~ 510 nm), udstiller effektiv excitation mellem 350-450 nm (1-foton excitation) eller 700-900 nm (2-foton excitation)5. For at visualisere PA-Nic under lokal applikation, PA-Nic (1 mM) blev anvendt i nærheden af hjernevæv efterfulgt af samtidige billeddannelse af (1) hjernen væv optisk sektioneret transmission forbindelse via Dodt kontrast og (2) udsendte fluorescens fra excitation (900 nm) af PA-Nic. PA-Nic 2PE fluorescens var let kan påvises under pres udslyngning fra en lokal applikation pipette (figur 2a). Nikotin og en monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-methyl cumarin, er de vigtigste fotokemisk produkter af PA-Nic fotolyse reaktion5. Ved hjælp af den samme imaging indstillinger/parametre, der er anvendt til PA-Nic imaging, var vævet afbildet under levering af enten nikotin (1 mM) eller 7-carboxymethylamino-4-methyl cumarin (1 mM). Ingen fluorescerende signal blev fundet (figur 2a, mellemste og nedre paneler), demonstrerer specificiteten af PA-Nic resultater. Endelig, PA-Nic blev anvendt i hjernevæv og PA-Nic fluorescens emission blev afbildet (figur 2b). Denne tilgang bekræfter, at PA-Nic er til stede i 100-200 µm i lokal applikation pipette. Sammen, bekræfter disse data, at PA-Nic effektivt leveres til hjernen væv via lokal applikation.
Elektrofysiologi optagelser med samtidige 2PLSM til visualisering af cellulære strukturer kræver investigator balance betragtninger for begge komponenter af eksperimentet, og ofte en smal gang vindue (~ 20 min) er tilgængelig for gyldig prøven dataopsamling fra en lappet celle. Uden at overveje cellulære visualisering, er det bedste praksis til at begynde at optage hurtigst muligt efter indbrud fordi optagelse stabilitet har tendens til at falde med tiden. Dog skal imaging er et krav, elektrofysiologiske overvejelser give tilstrækkelig tid til fluorescens koncentration stigninger i mindre og fjerne strukturer. Dette er eksemplificeret ved at undersøge et farvestof koncentration fylde kurven28, der er undertiden nyttigt at udlede når imaging en ny celletype. Figur 3 viser flere eksempel neuroner afbildet som Z-stakke via 2PLSM og kollapsede til en maksimal intensitet projektion til præsentation formål. Figur 3a viser billeder i høj kvalitet hvor neuronal morfologi synes at være komplet, støj er minimeret, og snavs ikke forstyrrer fortolkning af cellulære morfologi. Figur 3b viser billeder af lavere kvalitet, på grund af en lavere signal til baggrund forholdet og betydelige rester. Denne aflejringskegler optræder ofte som sfæriske lommer af intens fluorescens, som følge af udslyngning af imaging farvestof fra patch pipette mens nærmer cellen. Især inddragelsen af 100 µM PA-Nic i badet (når du udfører bad ansøgning) tendens til at reducere signal til baggrund forholdet og fører til optimale billedets kontrast. Alexa Fluor 568 eller 594 er ofte ganske nyttigt i lokal applikation eksperimenter, som en finder farvestof eller som en normalisere 2PE reference/normalisering signal. En effektiv bølgelængde for to-foton excitation af disse farvestoffer er ~ 780 nm27, som giver mulighed for samtidige visualisering af PA-Nic og identifikation af cellulære rum. Denne bølgelængde, dog undgå ikke helt to-foton fotolyse af PA-Nic5. Alexa Fluor 488 er fordelagtige i PA-Nic bad-ansøgning eksperimenter; Når ophidset med en egnet bølgelængde ≥900 nm, kan to-foton fotolyse af PA-Nic5 undgås samtidig bibeholde passende visualisering af cellulære rum.
Figur 4 viser eksempeldata for lokaliserede PA-Nic laser flash fotolyse på MHb neuroner i hjernen skiver. Figur 4a (øvre paneler) viser et eksempel på en "reference" image, som er et skærmbillede af den sidste 2PLSM billede taget før MarkPoints protokol blev kørt, belagt med foto-stimulation spot placering. Figur 4a (sænke billede paneler) viser en zoomet visning af foto-stimulation spot overlejret på de cellulære morfologi. Den tilsvarende tid-korreleret elektrofysiologiske svar på PA-Nic fotolyse er vist i figur 4alavere paneler. Tidligere arbejde viste, at disse strømme er følsomme over for nAChR antagonister5. Figur 4b viser repræsentative data fra forskellige celler hvor enkelt spot fotolyse blev udført med et interval på enten 1 s eller 10 s. en 10 s interval mulighed for tilstrækkelig opsving tid til grundlinjen holding aktuelle, et kortere interval på 1 s førte til en gradvis stigning i den aktuelle som protokollen bedrift fortsatte. Den stigende nuværende tyder på, at nikotin ikke havde tid nok til at diffuse væk fra systemet med 1 Hz intervallet29. Sådan tidsmæssig reaktion analyser skal udføres de novo på enhver ny celletype undersøges, som neuropharmacology af nAChRs kan variere mellem celletyper.
Figur 1: Photostimulation laser kalibrering. (en) foto-stimulation laser power output. Magt på prøve flyet (gennem en 60 x / 1,0 NA vand-dypning mål) blev målt til 405 nm og 473 nm foto-stimulation lasere på indstillingen angivne output. (b) foto-stimulation laser kalibrering. Raster fange billeder viser den rumlige forhold mellem tilsigtede foto-stimulation stedet og den tilsvarende placering hvor foto-stimulation opstod (burn-hul) før (venstre) og efter (højre) kører kalibrering i MarkPoints. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: PA-Nic lokal applikation. (en) påvisning af PA-Nic fra en lokal applikation pipette. 1 mM PA-Nic, fotolyse biprodukt eller nikotin blev opløst i ACSF, indlæses i en lokal applikation pipette og udleveres på hjernevæv under 2PLSM (900 nm excitation) imaging ved hjælp af de samme indstillinger for hvert stof. Laser scanning Dodt kontrast transmission billede viser væv/pipette mens en GaAsP katode ydelse blev brugt til at fange fluorescens emission. (b) PA-Nic (1 mM) var perfunderet i hjernevæv og afbildet via 2PLSM som (en) til at vise den lateral spredning af PA-Nic ved hjælp af dens iboende fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: erhvervelse af 2-foton laser scanning mikroskopi billeder. (en) Optimal 2PLSM Z-stakke. To eksempler på 2PLSM Z-stakken maksimal intensitet fremskrivninger er vist for MHb neuroner med godt løst dendritter og lidt at ingen interfererende debris. (b) sub-optimale 2PLSM Z-stakke. To eksempler på 2PLSM Z-stakken maksimal intensitet fremskrivninger er vist for MHb neuroner omgivet af vragrester (farvestof bortvist fra pipetten under celle tilgang). Sådanne billeder er mere vanskeligt at fortolke end billeder som dem, der vises i (et). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Laser flash fotolyse af PA-Nic. (en) MarkPoints reference billeder og indadgående strøm fremkaldt af PA-Nic fotolyse. For en MHb neuron, er rå reference billeder vist for MarkPoints foto-stimulation forsøg på en enkelt (angivet) cellular placering. Bemærk, at for nogle foto-stimulation placeringer (det yderste højre billede i denne serie), dendritiske struktur er i fokus, men soma og proksimale dendrit er ikke. Under hver reference billede, er nikotin uncaging-fremkaldte indadgående strøm afbildet. (b) mellem stimulus intervaller for PA-Nic fotolyse. Exemplar optagelser er vist for MHb neuroner hvor nikotin blev gentagne gange uncaged på det samme perisomatic sted med Inter stimulus interval af 1 s eller 10 s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Valget af PA-Nic anvendelse/levering metode er den mest afgørende skridt i denne teknik, lokaliserede foto-stimulation. De to metoder, bad ansøgning og lokale perfusion, tilbyder hver forskellige fordele og begrænsninger. Valget er i vid udstrækning påvirket af niveauet nAChR funktionelle udtryk i celletype af interesse. Det er ofte at foretrække at bruge bad program når funktionelle udtryk niveauer er høje, som bad ansøgningen giver mulighed for en ensartet sonde koncentration omkring de indspillede celle, lette data fortolkning. Bad ansøgning også eliminerer behovet for en anden perfusion pipette i vævet, hvilket gør hele processen lettere. Dog forbindelser bad anvendelse af dyre koster mere pr. eksperiment.
Almindeligt, indebærer fejlfinding forsøger at forstå, hvorfor ikke nAChR aktivisering er set følgende flash fotolyse. Når du arbejder med en celletype, der ikke er tidligere blevet undersøgt med PA-Nic, investigator skal udføre lokale puff-anvendelse af ACh eller nikotin til at afgøre, om tilstrækkelig receptorer er funktionelt udtrykt5. For at validere, at systemet er i stand til at opdage fotolyse svar, foretages kontrol eksperimenter i mediale habenula neuroner, der udtrykker store mængder af receptor30. I denne hjerne område er PA-Nic bad ansøgning mulige, hvilket er at foretrække for validering eksperimenter. Kun efter at have udført disse validering eksperimenter bør man gå videre til en unstudied celletype. Hvis den eksperimentelle system er blevet valideret og svar er fortsat meget små eller ikke målbart, det kan være berettiget til at øge koncentrationen af PA-Nic, øge flash intensitet eller impulslængde, tilføje en nAChR positive allosteriske modulator til at forbedre nAChR aktivitet6, eller en kombination af disse.
Lejlighedsvis, uncaging svar er for stor, med betydelige nAChR aktivering resulterer i indirekte spænding gated Na+ kanal aktivering og unclamped indad strømninger på grund af dårlig plads klemme. Disse artefakter, som helt obskure nAChR indad strømninger og umuliggør data fortolkning, kan elimineres ved optagelse af QX-314 (2 mM) i optagelse pipette. De kan også fjernes ved at reducere koncentrationen af PA-Nic eller ved at reducere flash intensitet eller impulslængde. I alle synlige lys foto-stimulation eksperimenter, skal der udvises forsigtighed til når du vælger stimulation websteder for at undgå utilsigtede stimulation/fotolyse over eller under den ønskede fokalplan. Derudover og da gældende, laser power skal altid titreres til at reproducere fysiologiske reaktioner. Det er især vigtigt at være opmærksom på z-aksen photostimulation, når du arbejder med bur ligander, som ligander, der aktiveres over/under den fokale sted kan stadig diffus og interagere med det biologiske system (dvs., receptorer) under undersøgelsen.
PA-Nic laser flash fotolyse kan ikke være egnet til alle efterforskere, som flere begrænsninger findes. Først er den relativt høje pris på et passende set-up. Når du arbejder med intakt hjernen skiver, uncaging nær lille diameter strukturer som dendritter kræver et avanceret visualisering system som en 2-foton mikroskop. Bortset fra den høje pris på en Ti:sapphire, afstemmelige IR pulserende laser til højtydende 2-foton mikroskopi, øger en dual-Drejespoleinstrument system i stand til uafhængigt positionering to laserstråler yderligere system omkostninger. Samlede system omkostninger kan reduceres ved hjælp af et hjem-bygget system hvis investigator har tilstrækkelig ekspertise og tid til at konstruere, fejlfinding og vedligeholde et sådant system. En anden begrænsning ofte indebærer lav nAChR funktionelle udtryk, som kan være delvis mindsket ved at træffe foranstaltninger som ovenfor nævnt, men dette kan ikke garantere succes. Typisk, hvis man ikke kan måle ligand-aktiveret strømme efter puff-anvendelse af agonister, kan PA-Nic flash fotolyse under spænding klemme ikke give acceptable resultater. En tredje begrænsning indebærer den iboende fluorescens af PA-Nic. PA-Nic absorberer ~ 405 nm lys og udsender i et lignende udvalg som grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller Alexa 4885. Når PA-Nic koncentrationerne overstiger ~ 1 mM, kan denne fluorescens egenskab gøre det udfordrende at samtidig visualisere neuronal strukturer. For at afbøde dette, er det kritisk at kunne nemt styre strømmen af PA-Nic fra perfusion pipette. Med jævne mellemrum, blev PA-Nic flow stoppet for at tillade fluorescerende molekyler til diffuse væk. Dette er tilladt re-tænkelig af neuron til at kontrollere den spot placering af uncaging bjælken. En fjerde potentielle begrænsning at nævne indebærer brug af 405 nm lys for fotolyse. Kortere bølgelængder som 405 nm er mere tilbøjelige til spredning i komplekse væv som en hjerne skive. Således, på en given flash intensitet og varighed, uncaging svar amplituder og decay kinetik kan varierende påvirkes af dybden af uncaging fokus i Skive. Konklusioner om biologiske aspekter af nAChRs bør tage denne vigtige forbehold i betragtning.
Denne lokaliserede laser flash fotolyse teknik er for nylig blevet brugt til at afdække nye detaljer om nAChR neurobiologi. For eksempel, forbedrer kronisk nikotin eksponering perisomatic og dendritiske nAChR funktion i mediale habenula neuroner5. Det blev også brugt til at hjælpe vise, for første gang, at ventrale tegmentale område glutamat neuroner express funktionelle nAChRs i deres perisomatic og dendritiske cellulære rum6. Der er mange potentielle fremtidige anvendelser af denne teknik, og tilgangen kunne anvendes på andre centrale neuron typer, der er kendt for at udtrykke nAChRs, såsom kortikale pyramideformet neuroner31 eller interneurons i hjernebarken32, striatum33 , og hippocampus19. Denne teknik kan også kombineres med farmakologi og/eller nAChR-gen redigering34 for at lokalisere specifikke receptor undertyper til forskellige neuronal rum. Metoden kan være let tilpasses til andre cumarin fra burhøns forbindelser, herunder, men ikke begrænset til, dem udviklet parallelt med PA-Nic5. Endelig, PA-Nic flash fotolyse måske en dag bruges i dyrets vågen/opfører sig til at studere Nikotins indsats i romanen adfærdsmæssige farmakologi paradigmer.
Disclosures
D.L.W. fungerer som en betalt konsulent for Bruker Nano Fluorescens mikroskopi.
Acknowledgments
Forfatterne takke laboratorium medlemmer af de følgende nordvestlige delforsøgsledere: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy og Anis entreprenør. Dette arbejde blev støttet af os National Institutes of Health (NIH) (tilskud DA035942 og DA040626 til R.M.D.), PhRMA Foundation (fellowship til M.C.A.) og HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
| Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
| (-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
| 7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
| 1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
| Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
| Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
| Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
| 6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
| QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
| Power Meter | ThorLabs | S120C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Solutions | |||
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Thiourea | Sigma | T8656 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components of 2-Photon Microscope | |||
| Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
| Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
| Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
| Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
| OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
| OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
| Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
| Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
| Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
| X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
| B&W CCD camera; Watec, 0.5 in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
| 595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
| 565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
| GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
| 525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
| High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |
References
- Zhang, C., et al. Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications. Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).
- Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).
- Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation. Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).
- Katz, B., Thesleff, S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).
- Banala, S., et al. Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology. Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).
- Yan, Y., et al. Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission. Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).
- Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).
- Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Ren, J., et al. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).
- Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity. Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).
- Zhang, J., et al. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. Cell. 166 (3), 716-728 (2016).
- Chen, E., et al. Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus. Neuroscience. 218, 1-11 (2012).
- Ting, J. T., Feng, G. Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).
- Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice. Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).
- Kolisnyk, B., et al. ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains. The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).
- Denk, W. Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).
- Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons. The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).
- Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).
- Tochitsky, I., et al. Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).
- Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities. Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).
- Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons. Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).
- Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons. Elife. 6, (2017).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Science STKE. (219), pl5 (2004).
- Inoue, S., Spring, K. Video microscopy: The fundamentals. , 2 edn, Plenum Press. 163-186 (1997).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing. Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).
- Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses. Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).
- Shih, P. Y., et al. Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula. The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).
- Verhoog, M. B., et al. Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity. Nature Communications. 7, 12826 (2016).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Xiao, C., et al. Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).
- Peng, C., et al. Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission. European Journal of Neuroscience. , (2018).
