Summary
Dit artikel presenteert een methode voor het bestuderen van nicotinerge acetylcholine-receptoren (nAChRs) in muis hersenen plakjes door nicotine uncaging. Wanneer in combinatie met de gelijktijdige patch klem opname en 2-foton laser scanning microscopie, verbindt nicotine uncaging nicotinerge receptor functie met cellulaire morfologie, bieden een dieper begrip van cholinerge neurobiologie.
Abstract
Acetylcholine (ACh) werkt via receptoren te moduleren van een verscheidenheid van neuronale processen, maar het heeft zijn uitdagend te koppelen ACh receptor functie met subcellular locatie in cellen waar deze functie wordt uitgevoerd. Studeren de subcellular locatie van nicotinerge ACh-receptoren (nAChRs) in native hersenweefsel, werd een optische methode ontwikkeld voor precieze release van nicotine op afzonderlijke locaties in de buurt van neuronale membranen tijdens elektrofysiologische opnames. Patch-geklemd neuronen in de hersenen segmenten zijn gevuld met kleurstof te visualiseren van hun morfologie tijdens 2-foton laser scanning microscopie, en nicotine uncaging wordt uitgevoerd met een lichte flits door zich te richten een 405 nm laserstraal in de buurt van een of meer van de cellulaire membranen. Cellulaire huidige verlegging worden gemeten, en een hoge resolutie driedimensionale (3D) beeld van de opgenomen neuron is getroffen op grond waarvan verzoening van nAChR reacties met cellulaire morfologie. Deze methode zorgt voor een gedetailleerde analyse van de functionele verdeling van de nAChR in complexe weefsel preparaten, belooft om het inzicht van cholinerge transmissie te vergroten.
Introduction
Cholinerge signalering moduleert talrijke processen van de hersenen, waaronder attentional controle, bewuste beweging en beloning1,2. Geneesmiddelen die verbeteren van acetylcholine (ACh) transmissie worden gebruikt voor de behandeling van cognitieve stoornissen geassocieerd met de ziekte van Alzheimer, impliceert een belangrijke rol voor de cholinerge systemen in cognitie3. Een beter begrip van cholinerge receptoren en circuits in gezonde en zieke Staten kan leiden tot betere therapeutische benaderingen voor verschillende neurologische ziekten/aandoeningen.
Nicotinerge ACh-receptoren (nAChRs) zijn een familie van ligand-gated ionenkanalen die flux caties in reactie op ACh endogene of exogene nicotine van tabaksproducten. Gezien het feit dat ze behoorden tot de allereerste receptoren van de neurotransmitter beschreven4, is nAChR farmacologie en locatie in spiervezels goed begrepen voor spier-achtige receptoren. Daarentegen, is relatief weinig bekend over de farmacologie en subcellular distributie van inheemse nAChRs in de hersenen. Deze lacunes in de kennis werd onlangs behandeld door het ontwikkelen van een nieuwe chemische sonde die voorziet in ruimtelijk beperkte en snelle activering van nAChRs in hersenweefsel tijdens cellulaire beeldvorming en elektrofysiologische opname5. Hier worden de belangrijkste methodologische stappen betrokken bij deze aanpak beschreven, met het algemene doel van verbetering van de mogelijkheid om nAChR functie verbinding met neuronale structuur.
Photoactivatable nicotine (PA-Nic; chemische naam: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarine-4-yl] methyl-nicotine) kunnen photolyzed met ~ 405 nm laser knippert om efficiënt release nicotine5,6. Voorafgaand aan uncaging, PA-Nic is stabiel in de oplossing en vertoont geen ongewenst farmacologische of fotochemische functies5. Na fotolyse, vrijgegeven nicotine voorspelbaar activeert nAChRs en de uncaging bijproducten zijn farmacologisch inert5. Een continuous-wave laser wordt gebruikt als de fotolyse lichtbron met een uitgangsvermogen > 1 mW gemeten bij het monster. Wanneer gelokaliseerd, gerichte foto-stimulatie wordt gecombineerd met de mogelijkheid om te zoeken van cellulaire membranen met 2-foton laser scanning microscopie (2PLSM), en de twee belangrijkste voordelen van deze benadering volledig worden gerealiseerd: fotolyse snelheid en ruimtelijke precisie.
In de meeste opzichten is fotolyse van PA-Nic superieur aan andere methoden van het leveren van nAChR liganden aan receptoren in de hersenen segmenten. Dergelijke benaderingen omvatten Bad toepassing7 en lokale drug levering via een puffer Pipetteer8. Overwegende dat de voormalige aanpak heeft de neiging om te benadrukken over de langetermijneffecten van de toegepaste drug, kan de laatste benadering last van variabiliteit in reactie-kinetiek tussen proeven en over cellen. Geen van deze alternatieve benaderingen kan adequaat receptor activiteiten in verschillende cellulaire locaties uit de dezelfde neuron onderscheiden. Optogenetically-geactiveerde versie van ACh is gebruikt voor onderzoek van inheemse nAChRs9,10,11, maar het is niet bewezen nuttig voor toewijzing subcellular nAChR locaties. Bovendien, de meeste studies met behulp van deze aanpak hebben vertrouwd op een ChR2-uiten bacteriële kunstmatig chromosoom transgene muis met abnormale cholinerge transmissie12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolyse is niet de alleen optische aanpak voor het bestuderen van cholinerge receptoren. Een gekooide carbachol werd gebruikt om functioneel kaart ACh receptor activiteiten in gekweekte cellen18 en hersenen segmenten19, maar was niet commercieel beschikbaar voor vergelijkende studies tijdens de ontwikkeling van PA-Nic. Een ruthenium-bis (bipyridine)-nicotine complexe (RuBi-nicotine) werd gemeld dat voor nicotine uncaging20, maar commerciële preparaten van RuBi-nicotine bewezen inferieur aan PA-Nic in een head-to-head vergelijking studeren5. Het wellicht nuttig om te herhalen van dergelijke vergelijkende experimenten met niet-commerciële, sterk gezuiverd RuBi-nicotine, zoals haar zichtbaar absorptie PA-Nic's functies voor cholinerge studies kan complimenteren. Tot slot, nAChRs zijn ook optisch gemanipuleerd met behulp van een combinatie van foto-schakelbare liganden en genetisch gemodificeerde receptoren21. Deze aanpak vormt een aanvulling op de PA-Nic fotolyse in hersenweefsel, met de mogelijkheid/eis van genetische doelgerichtheid van de gewijzigde nAChR gezien als zowel een voordeel als een nadeel.
Verschillende belangrijke vereisten van deze aanpak moeten worden opgemerkt. Eerst, is een passende visualisatie methode nodig om nauwkeurig het vinden van de neuronale membraan. Beeldbewerking met conventionele epi-fluorescentie microscopie kan het volstaan bij de studie van gekweekte cellen, maar voor het opnemen van neuronen in de hersenen segmenten of andere preparaten dik weefsel, 2PLSM of confocale microscopie is een vereiste. Ten tweede, een geschikte methode is nodig om de positie van de laserstraal fotolyse. Deze aanpak maakt gebruik van een dual-galvanometer scan hoofd met twee onafhankelijke x-y spiegels voor het scannen van het raster van de beeldvorming en punt photoactivation met behulp van de uncaging laser beam22,23,24. Andere, meer beperkte oplossingen zijn mogelijk, zoals (1) een honkslag-galvanometer scan hoofd dat als alternatief raster scant de imaging lichtbundel en de uncaging-straal of (2) gewoon regisseren de uncaging balk naar het midden van het gezichtsveld, zodanig dat de cel wordt gebracht Dit standpunt voor flash fotolyse. Ten derde, een systeem is vereist voor gelijktijdige elektrofysiologische opnemen als men wil verzamelen van fysiologische signalen tijdens experimenten. De bovengenoemde eisen kunnen worden voldaan met een geschikt geheel optische beeldvormende techniek, als recent beschreven5. Hieronder een gedetailleerd protocol is opgenomen dat beschrijft de belangrijkste stappen van deze aanpak.
Protocol
Werk met betrekking tot de hersenen segment voorbereiding werd gecontroleerd en goedgekeurd door het Noordwestelijke Universiteit Animal Care en gebruik Comité (protocol #IS00003604).
Let op: Lasers gebruikt voor punt foto-stimulatie zijn zichtbaar Klasse IIIb lasers die kunnen schade toebrengen aan de ogen. 2PLSM vereist een nabij-infrarood (NIR) klasse IV laser (> 500 mW), die heeft het potentieel om ernstige schade aan de ogen en zelfs brandwonden veroorzaken in andere weefsels. Goede laser beam insluiting, systeem sloten, plus gemanipuleerde en administratieve controles zijn vereist voor de veilige werking van laser gebaseerde apparatuur. Altijd zoeken naar lokale laser veiligheid personeel bij het werken met lasers.
1. de calibratie en verificatie van de Uncaging Laser
-
Laser macht moeten worden geleverd aan het monster te kwantificeren.
- Zet op de 405 nm laser (100 mW maximumvermogen met 5 V stuursignaal) en laat het lasersysteem warm voor ongeveer 10 minuten.
Opmerking: De laser is nog steeds sluiter (met 0 V station) en er is geen uitgang macht tot de laser een stuurspanning voor het moduleren van het vermogen is verzonden. - Plaats een Energiemeter in het weefsel monster vlak of in de plaats van de condensor lens. Hiermee centreert u handmatig de meter ten opzichte van de optische pad/objectief.
- De meter instellen door de juiste golflengtegebied (400-1100 nm). Nul de meter door indrukken van de juiste knop.
- Gebruiken van de software, selecteer 100 (out van max 1000; 1000 = 5 V) voor de 405 nm laser macht, waarin de laser tot 10% van de volledige macht. Indien gewenst, de stuurspanning laser ook kan worden ingebracht in de PrairieView systeem via VoltageRecord om een digitale record van de opdracht signaal timing en energieniveau.
- Record de lezing van de Energiemeter.
- Selecteer 150 (15% van max 1000) voor de 405 nm laservermogen en opnemen van de lezing van de Energiemeter. Herhaal dit voor de volgende uitvoer te verzamelen van een laser vermogenscurve bevoegdheden: 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, en 1000.
- Zet op de 405 nm laser (100 mW maximumvermogen met 5 V stuursignaal) en laat het lasersysteem warm voor ongeveer 10 minuten.
-
De uncaging laser galvanometers kalibreren. Voer de volgende stappen uit wanneer er een wijziging in de optische onderdelen van het systeem, wanneer er een bezorgdheid over nauwkeurige vlek positionering, of regelmatig elke maand.
- Installeer de 60 x water dompelen Microscoop objectief die zal worden gebruikt in photostimulation en imaging experimenten. Selecteer in de acquisitie/imaging-software, de 60 x objectief en een optische zoom-instelling van 1 (zie stap 3.1.4.2.).
- Markeer een opgevulde cirkel op een schone microscopie glasplaatje met een rode permanent marker. Plaats de dia in het werkgebied van de Microscoop, met de markeerdraad richting de doelstelling.
- Pre-focus de Microscoop op de rode marker-regio met een 4 x of 10 x doelstelling. Voeg 1-2 mL water naar de top van de rode marker dot/spot en vervolgens overschakelt naar de doelstelling van 60 x en de doelstelling onderdompelen in het water. Focus van het objectief op de dunne rode marker-regio.
- Schakel over naar de 2-foton laser scannen. Voor de meeste systemen, torentje te positie #1, verplaatsen van het prisma van de trinocular uit het licht weg, de scan hoofd mirror verplaatsen naar voorgrond te verplaatsen en de golflengte van de laser op ~ 900 nm. De optie 512 x 512 pixel vak voor de afbeelding overname parameters, die is het standaard pixel element voor de stimulatie spiegel kalibratieroutine.
- Start systeem scannen met een imaging laser macht groter dan minimum en fine-tunen van de objectieve focus op de dunne rode marker fluorescentie laag. Kies een veld op het gebied van de fluorescentie van puin duidelijk en gelijkmatig bekleed met de markeerdraad.
Opmerking: PrairieView 5.4 acquisitie/imaging software gebruikt de setup in dit protocol. - Open de Uncaging Galvo kalibratie functie binnen het menu Tools-kalibratie/uitlijning van de software. Maak een wandeling door de branden van vlekken tutorial voor de ruimtelijke kalibratie van het tweede galvanometer spiegel paar.
- Binnen de branden vlekken tutorial, kies de 405 nm laser, selecteert u een laser stimulatie vermogen van 400 en een duur van de stimulatie van 20 ms. dit klein moet opleveren (~ 1-5 µm diameter) gaten in de rode markering.
Opmerking: Instellingen zoals ~ 2-4 mW en 1-10 ms worden doorgaans gebruikt, maar de instellingen worden bepaald door het monster. PA-Nic foto-stimulatie energiebeheerinstellingen dreigen te worden veel lager dan de macht tijdens de kalibratie moet een zichtbaar gat in de rode marker dia lasertherapie. Deze kalibratieroutine is nuttig voor het opsporen van photostimulation plekken maar mag niet worden gebruikt voor het afleiden van absolute photostimulation volumes tijdens fysiologische reacties. - Selecteer Update te stimuleren en het beeld vernieuwen nadat het centrum plek branden en het ronde rode lampje naar de werkelijke locatie van de plek. Doe dit voor het centrum plek, de juiste centrum plek, de lagere centrum plek, en ten slotte voor een raster van negen plekken (alle hoeken en randen plus het midden van de afbeelding).
Opmerking: De centreren, rechts en lagere gecorrigeerde plek locaties bepalen de stimulatie galvanometer spanningen te definiëren van de echte centrum- en X- en Y-schaal factoren aan de stimulatie spiegel paar aan de beeldvorming spiegel-paar. De software zal schalen, en bijwerken, alle daaropvolgende MarkPoints experimenten uitgevoerd op zoom instellingen verschillend van de ruimtelijke kalibratie-zoom.
- Binnen de branden vlekken tutorial, kies de 405 nm laser, selecteert u een laser stimulatie vermogen van 400 en een duur van de stimulatie van 20 ms. dit klein moet opleveren (~ 1-5 µm diameter) gaten in de rode markering.
- Test de kalibratie door het venster MarkPoints te openen en de parameters van de stimulatie in gedefinieerde spot(s) in een nieuw gebied van het monster handmatig te activeren. Zorg ervoor dat de juiste, meest recente kalibratie-bestand is geladen in het venster MarkPoints . Activeren van de functie van het MarkPoints/groep of MarkPoints serie op een gedefinieerde spot(s) of gebruik maken van de functie Live/ablatie rechts/links klik op de muis overal op het beeld tijdens live scannen om toe te passen van een test-puls en om te controleren of de juiste kalibratie.
Opmerking: De laser branden ter plaatse moet nu worden perfect gecentreerd op de MarkPoints -indicator. - Controleren en te registreren van de activering van de laser pulse macht en tijdelijke duur door te onttrekken uitspanning de schijf in het VoltageRecord -programma (zie stap 1.1.4). Ook het opnemen van de positie van elk punt van de stimulatie met behulp van een geschaalde spanning signaal van de feedback-signalen afkomstig van het paar van foto-stimulatie galvanometer spiegels.
2. voorbereiding van de Photoactivatable, Nicotine (PA-Nic)
- Een aliquoot gedeelte van het gelyofiliseerd photoactivatable drug ophalen in opslag.
Opmerking: Het volgende protocol is specifiek voor PA-Nic; Pas zo nodig voor andere photoactivatable drugs. Hoewel PA-Nic uitzonderlijke stabiliteit5 aantoont, redelijke voorzorgsmaatregelen te beschermen tegen blootstelling aan fel licht tijdens de voorbereiding en/of experimenten. Dit kan worden bereikt door gewoon werken bij weinig licht; beperken tot rode gefilterd licht is niet nodig. -
Uitvoeren van lokale toepassing van PA-Nic.
- Een glazen micropipet met een diameter van de opening van 20-40 µm met een programmeerbare Pipetteer trekker trek.
- Filteren ~ 1 mL van de oplossing met een 0,22 µm filter opnemen. Resuspendeer een hoeveelheid PA-Nic in gefilterde opnameoplossing opleveren een definitieve concentratie van 2 mM. Bijvoorbeeld, het ontbinden van een hoeveelheid van 100 nmol gelyofiliseerde vorm in 50 µL van gefilterde opnameoplossing.
Opmerking: De samenstelling van een voorgestelde opname oplossing kan worden gevonden in recente publicaties5,6 -PA-Nic fotolyse in dienst. - Back-fill de lokale toepassing pipet met 50 µL van 2 mM PA-Nic.
- Beveilig de lokale toepassing pipet in een pipet houder gemonteerd op een micromanipulator. De pipet houder via passende buizen verbinden met een druk uitwerpen systeem geschikt voor duurzame lagedruk toepassing (1-2 psi).
- Manoeuvreren met behulp van de micromanipulator, de lokale toepassing pipet in de extracellulaire opnameoplossing en positie het pipette uiteinde iets boven de muis hersenweefsel gelegen ~ 50 μm uit de cel van belang. Raadpleeg een vorige verslag voor een gedetailleerde protocol van muis hersenen segment voorbereiding en patch klem opnames8.
- Controleer de toepassingsparameters door kort toe te passen druk (1-2 psi). Er moet minimaal tot geen verplaatsing van de cel van belang. Als belangrijke beweging gebeurt, verplaatsen de lokale toepassing pipet verder weg (in de laterale en/of axiale richting) uit de cel van belang.
- Na het bereiken van stabiele hele cel patch klem (details die zijn opgenomen in een voorafgaande bekendmaking8), inschakelen van lage druk (1-2 psi) toepassing die gebruikmaakt van de juiste handmatige schakelaar op het apparaat van de ejectie druk. Verzadigen het weefsel rondom de cel met PA-Nic voor 1-2 min voordat u verdergaat met de volgende stap.
-
Uitvoeren van Bad toepassing (superfusion) van PA-Nic op het segment van de hersenen.
- Ontbinden van een hoeveelheid van PA-Nic in een hoeveelheid oplossing geschikt is voor continu recirculatie opleveren een eindconcentratie van 100 μM opnemen. Bijvoorbeeld, Los een 1 μmol aliquoot in 10 mL van oplossing voor het opnemen met behulp van een standaard 15 mL-buis.
- Open de juiste flow-control in het systeem van de perfusie eerst recirculatie van de PA-Nic-oplossing bij een snelheid van 1,5-2 mL/min. Recirculatie vindt plaats voor de duur van de opname. U wilt besparen waardevolle drug, het volume van de recirculatie te minimaliseren door middel van leidingen met een minimale inwendige diameter en/of door het verkorten van de totale lengte van de buis in de perfusie-systeem gebruikt.
Opmerking: Door deze stappen, kan het volume voor Bad recirculatie worden verminderd tot 5 mL van PA-Nic oplossing. PA-Nic oplossingen kunnen vaak worden gebruikt voor twee opeenvolgende dagen binnen dezelfde week opnemen als opgeslagen beschermd tegen licht bij 4 ° C. - Tijdens de recirculatie, continu bubble de oplossing met carbogen (5% O2, 95% CO2) en onderhouden van de bad-temperatuur van 32 ° C.
- Behouden van het segment van de hersenen in oplossing opnemen terwijl u werkt met PA-Nic in omstandigheden met weinig licht.
3. beeldvorming neuronen met 2-Photon Laser Scanning Microscopie
- Uitvoeren van levende visualisatie van de cel.
- Identificeren/visualiseren een mediale habenula (MHb) neuron met doorvallend licht of differentiële inmenging van de infra-rood contrast (IR/DIC) optica en een videocamera en een stabiele hele cel patch klem opname stand. Verwijzen naar een vorige protocol voor meer informatie over patch klem opnames van neuronen in terdege voorbereid muis hersenen segmenten8.
- Na de oprichting van de hoog-weerstand (> 1 GΩ) cel-ingeschrevenen configuratie, maar voordat de inbraak, schakelen de set-up en software aan laser scanmodus.
- Na inbraak, gebruiken laser scannen om te controleren of een imaging kleurstof (verdund tot een eindconcentratie van 100-200 µM in een standaard intracellulaire Pipetteer oplossing eerder beschreven8) is passief (door diffusie) vullen van het neuron. Laat de kleurstof (bijvoorbeeld Alexa Fluor 488 in groene fotomultiplicator buis [bet] kanaal, bet 2; of Alexa Fluor 568 of 594 in rode bet kanaal, bet 1) Vul de cellulaire compartimenten voor minstens 20-30 min voordat de experimenten die visualisatie van vereisen elke cellulaire compartimenten buiten het soma.
Opmerking: Distale compartimenten (dendritische structuren, stekels, axonen, enz.) 30-40 min volledig te vullen25voorschrijven. - De software Live Scan functie gebruiken om te visualiseren de neuron en subcellular compartiment van belang. Kies imaging parameters waarmee voor nauwkeurige live visualisatie van neuronale functies. Manipuleren van verschillende instellingen om te beïnvloeden of te wijzigen het scherm visualisatie (contrast), resolutie, signal-to-noise (S/N) verhouding en afbeelding frame Acquisitietijd:
-
Look-opwaarts-tabel (LUT). Open het venster van de LUT met behulp van het juiste pictogram aan de zijkant van het venster van elke afbeelding. Eenmaal geopend, de LUT vloer (min) en het plafond (max) instelling van het specifieke beeld kanaal om visualisatie van signaal contrast weergegeven op het scherm aanpassen. Verlaagt u de maximale waarde naar ~ 1000 (uit 4096, 12-bits detectie), die helpen zal te trekken uit de dimmer signalen bij het eerst zoeken naar cellen, signaal en structuur.
Opmerking: Deze instellingen alleen van invloed op de weergegeven signaal, niet de gedetecteerd/opgenomen waarden. Menselijke ogen kunnen meestal alleen opmaken contrast tot en met ~ 50 grijze niveaus26. -
Optische zoom. Software besturingselementen gebruiken om te selecteren van 1 X optische zoom en gebruik besturingselementen om te zoeken van het gewenste gebied in het weefsel pannen. Deze zoominstelling opbrengsten het grootste plein, gescand gezichtsveld, en stuurt de grootste spanningen/scan hoeken, naar de galvanometer spiegels.
Opmerking: De standaardconfiguratie is voor een 12 x 12 mm gezichtsveld in de scan hoofd wat zich naar 12 mm verdeeld door objectieve vergroting in het monster vertaalt. Dus, een 60 x objectief opbrengsten gescande afbeeldingen van 200 µm per zijde bij 1 x optische zoom. Hogere waarden van de optische zoom scan minder ruimte. 2 x optische zoom is vaak de meest nuttige instelling voor het visualiseren van hele neuronen. 4 x kan bruikbaar zijn voor het visualiseren van subcellular aspecten van neuronen. -
Aantal pixels. Selecteer om te vullen 1 x optische zoom, 1024 x 1024 pixels per lijn met behulp van software-besturingselementen. Stel het aantal pixels per lijn in de gevangen en weergegeven beeld details mogelijk uit het objectief niet te verliezen. Gebruik de volgende praktische pixelwaarden voor een 60 x / 1.0 numerieke diafragma (nvt) doel: 1024 x 1024 voor zoom 1, 512 x 512 voor zoom 2 en 256 x 256 voor zoom 4. De uiteindelijk pixelgrootte (~0.17 µm; 12 mm/vergroting/zoom/pixels) moet de helft, of minder, van de laterale resolutie gedefinieerd door het objectief.
Opmerking: Resolutie van de afbeelding wordt alleen bepaald door de golflengte van de laser en de objectieve nb (0.4 µm resolutie van twee-foton opgewonden [2PE] met 920 nm en een doelstelling NA 1.0)27. De criteria voor de volledige excitatie nb, zoals vermeld op de lens, is dat de 1/e2 intensiteit van de laser beam diameter wedstrijden (of "opvulling") de ingang leerling (2 x buis lens brandpuntsafstand x nb / vergroting) van het objectief. De lens van de buis in de hier beschreven systeem heeft een brandpuntsafstand van 180 mm. -
Pixel Nadruktijd . Software besturingselementen selecteren 4 µs voor de pixel nadruktijd, een nuttige standaardwaarde gebruiken.
Opmerking: De pixel Nadruktijd wijzigt niet het gemiddelde signaal gedetecteerd; het heeft alleen invloed op de intra-pixel gemiddeld en deze veranderingen kunnen worden gevisualiseerd door middel van de kwaliteit van het beeld via de S/N. De afbeelding pixel Nadruktijd is altijd een veelvoud van 0.4 µs eenheden en voor grotere dwell tijden de intensiteit van de 12-bit-beperkte waarde van elke pixel van de afbeelding is het gemiddelde van de 0.4 µs monsters. Omdat de S/N ratio verbetert als de vierkantswortel van het aantal monsters per pixel Nadruktijd (4 µs is gelijk aan tien monsters of 3.16-fold verbetering in S/N), wordt in de verbetering van de beeldkwaliteit afnemende meeropbrengsten voor waarden die veel groter zijn dan 12 µs bereikt. -
Scannen rotatie en regio van belang (ROI). De hoek van de afbeelding instellen op 0° rotatie met behulp van de besturingselementen van de software (geen actie kan worden vereist, zoals 0° rotatie de standaardinstelling voor de meeste imaging systemen is). Als het monster wordt geplaatst in een "upside-down"-oriëntatie, 180° rotatie ' spiegelen ' de afbeelding selecteren
Opmerking: Draaien van het beeld, in een bepaalde hoek, bieden een betere pasvorm voor het hele gebied van belang van een gevulde cel. Rotatie kan ook een duidelijker basis voor het uitlijnen van structurele veranderingen en voor het uitvoeren van latere analyse opleveren. Selecteren van een gebied van belang binnen de gescande afbeelding op een bepaalde zoom (stap 3.1.4.2) instelling behoudt het aantal oorspronkelijke pixels (stap 3.1.4.3), maar de beperking in totaal aantal gebied en pixels kan drastisch verhogen de framesnelheid, mits verbeterde temporele resolutie van signaal veranderingen. -
Frame gemiddeld. Selecteer een startende frame gemiddelde instelling van 2 beelden gebruiken van de software.
Opmerking: De uiteindelijke afbeeldingscontrast (S/N) wordt bepaald door de totale fotonen verzameld/gedetecteerd binnen het signaal pixels van de afbeelding. Gemiddeld van meerdere afbeeldingsframes kunt verbeteren de ratio S/N, mits de steekproef niet verplaatst of niet tijdens imaging gebleekt is. Het signaal van belang blijft dezelfde waarde tijdens frame gemiddeld terwijl de ruis in de afbeelding wordt verminderd met de vierkantswortel van het aantal frames gemiddeld. Kleine structuren in fluorescentie beelden vereisen vaak gemiddeld tussen pixel, pixels in de afbeelding (vaak genoemd ROIs), en/of frame gemiddeld combineren. Gemiddeld stijgt scannen tijd door het aantal plaatjes één frame kiest voor gemiddelde.
-
Look-opwaarts-tabel (LUT). Open het venster van de LUT met behulp van het juiste pictogram aan de zijkant van het venster van elke afbeelding. Eenmaal geopend, de LUT vloer (min) en het plafond (max) instelling van het specifieke beeld kanaal om visualisatie van signaal contrast weergegeven op het scherm aanpassen. Verlaagt u de maximale waarde naar ~ 1000 (uit 4096, 12-bits detectie), die helpen zal te trekken uit de dimmer signalen bij het eerst zoeken naar cellen, signaal en structuur.
- De Panbesturing Scan rotatieen Optische Zoom hulpmiddelen gebruiken om te oriënteren van de locatie van het monster tijdens het scannen. Als motor fase manipulatie noodzakelijk is om de positie van het monster, het vermijden van grote stap maten aan de X-, Y- en Z-as om te voorkomen dat doelstelling/condensor botsingen, trillingen of blootstelling van de laserstraal reflecterende oppervlakken.
- Het verzamelen van een Z-stapel. Met behulp van het hulpprogramma Z-serie , selecteert u een beginnen en beëindigingspositie met de cel van belang. Selecteer een stap-grootte (1 µm) en vervolgens Beeld achtereenvolgens het neuron in elke Z-vlak die de cel bevat.
Opmerking: Z-stack overname instellingen zal variëren tussen neuron type en vullen van de kleurstof. Optimale parameters voor Z-stack verwerving moeten onafhankelijk van de parameters die worden gebruikt voor levende imaging worden bepaald. Z-stack overname kan worden uitgevoerd vóór en/of na optopharmacology experimenten. Indien mogelijk, uit te voeren Z-stack overname na optopharmacology om te voorkomen dat cellulaire schade veroorzaakte van 2PLSM en te voorzien in optimale kleurstof vullen van kleine cellulaire compartimenten.
4. laser Flash fotolyse tijdens elektrofysiologische opnames
Opmerking: Toepassing van 405 nm of 473 nm laser bevoegdheden van ≥ 1 mW produceert fosforescentie binnen het glas van objectieve en condensor lenzen. Deze gegenereerde licht is direct gerelateerd aan de laser verlichting macht; de uitstoot is aanwezig in de groene en rode spectrale vensters en opgewonden statuswaarden levens heeft in de ms-assortiment. Deze achtergrond stimulatie artefact wordt gezien in alle lenzen getest en in water dompelen objectieven van alle grote fabrikanten van objectieven. Condensor lenzen produceren veel hogere fosforescentie dan objectieven. Dit "signaal" motiveert het gebruik van mechanische bekistingen voor bescherming van de gevoelige gallium arsenide calciumfosfide (GaAsP) bet kathoden tijdens foto-stimulatie evenementen. Met behulp van een normaal gesloten mechanische sluiter (gesloten wanneer u niet actief scant) vertegenwoordigt de beste oplossing voor bescherming van gekoelde GaAsP PMTs.
- Voor een zandloper-type photostimulation straal geometrie, geen focus lenzen in de lichtpad optica dat anders smalle / de laserstraal vernauwen zou als het binnenkomt de objectieve ingang leerling te verwijderen.
- Met behulp van MarkPoints, selecteer de instelling die enkel ter plaatse.
Opmerking: Andere foto-stimulatie instellingen (meerdere spots, een raster van spots, spiraal scannen) zijn mogelijk binnen de MarkPoints. Enkele plek is het eenvoudigst. Experimentele doelen en biologische verschillen kunnen vergen een andere instelling. - Bijwerken van de afbeelding met behulp van de optie Live scannen voor kort beeld en opsporen van de subcellular interessegebied. Periodiek bijwerken van de afbeelding om te identificeren van elke potentiële kleine driften in focus.
- Gebruik software besturingselementen het verhogen van de optische zoom (dat wil zeggen, selecteer een hogere optische zoom-instelling dan het huidige), indien nodig, te kleine structuren (d.w.z., stekels of distale dendrites) visualiseren.
- Plaats MarkPoints één plek crosshairs onmiddellijk aangrenzende (~0.5 μm) aan de celmembraan. Niet plaats de foto-stimulatie plek direct boven een cellulaire functie, aangezien dit kan leiden tot photodamage.
- De parameters voor foto-stimulatie software gebruiken in MarkPoints. De eerste richtsnoeren als volgt toepassen: 1-50 ms duur, 1-4 mW laser kracht en ≥1 proces.
- Selecteer Uitvoeren MarkPoints te initiëren van het MarkPoints -protocol en observeren electrofysiologie data-acquisitie in real-time.
- Herhaal stap 4.2-4.7 meerdere malen te evalueren van de samenhang en de stabiliteit, of het ontbreken daarvan, van de amplitude van de reactie en kinetiek.
Representative Results
Voor fotolyse zijn stimulatie, de blootstelling dosis (intensiteit en tijd), blootstelling locatie en straal geometrie belangrijke variabelen. Het systeem zoals beschreven in dit artikel is geschikt voor twee verschillende photostimulation balken, instelbaar via een lens in/out van het photostimulation licht pad verplaatsen voordat de lichtbundel de galvanometer-systeem. Zonder deze lens, de photostimulation-straal vult de ingang leerling van de 60 x / 1.0 nb water-dompelen [60 x WD] doelstelling, productie van een in de buurt van diffractie-beperkte, sub-µm plek op het brandvlak binnen het monster. Dit is gekoppeld aan photostimulation licht met een zandloper vorm, uitbreiding van boven en onder de focale plek symmetrische met de optische as. Met de lens ingevoegd in het pad, photostimulation laserlicht is gericht in de ingang leerling van het objectief en vervolgens wordt afgesloten als een potlood-achtige lichtbundel. Deze balk, die naar verwachting zijn ~ 10 µm in diameter voor een doelstelling van 60 x, breidt uniform/verticaal in het monster. In deze modus zullen de lichtintensiteit op een bepaalde locatie binnen de spot stimulatie ~ 1% van de in de buurt van diffractie-beperkte kleine plek intensiteit. Hogere machten van de laser zijn dus meestal vereist bij het gebruik van ~ 10 µm spot stimulatie. Voor alle experimenten gemeld in dit artikel, werd een zandloper-type photostimulation-balk gebruikt.
De geleverde monster macht kan worden afgeplot tegen de instelling van de ingangsspanning, na het meten van de kracht van de laser op het monster met behulp van een Energiemeter. Deze studies een 60 x WD doelstelling met een afstand van 2 mm gebruiken, maar het is niet ondergedompeld in water voor metingen van de macht om te voorkomen dat potentiële schade aan het element van de detector. Wanneer doelstellingen met genoemde nb > 0.95 worden gemeten in lucht (zonder immersie vloeistof), kan er verlies van de totale interne reflectie op het voorvlak lenselement toe te schrijven aan de lagere index (lucht). In dit geval voor een nauwkeuriger voorbeeld vermogensmeting (om te corrigeren voor de totale interne reflectie verliezen), de gemeten kracht te verhogen door de 1.0 nb objectieve (1.0/0.95)2 gemeten in lucht. Figuur 1a toont een typische plot van het input/output voor 405 nm en 473 nm zichtbare lasers die zijn opgenomen in de laser lanceren systeem in deze studie. Deze lasersystemen zijn ideaal voor foto-stimulatie dosis belichting om de volgende redenen: (1) ze zijn vooraf gekalibreerd om direct lineaire vermogen ten opzichte van de ingangsspanning (0-5 V), (2) ze voorzien van een stille sluiter-operatie (geen laser output), en (3) ze hebben snelle, sub-ms intensiteit hartslagsturing duur (0.1 ms responstijd). Als u ter plaatse foto-stimulatie met een laser/galvo systeem, is routine kalibratie van MarkPoints plekken een belangrijke taak. Figuur 1b (linker paneel) toont een systeem dat uit kalibratie (gewenste punt ter stimulering van de foto niet leidt tot een nauwkeurige stimulatie van dat punt, zoals aangegeven door het branden holes locatie), met een terugkeer naar de nauwkeurige positionering van de vlek na kalibratie ( Figuur 1b, rechter paneel).
PA-Nic is bescheiden TL (uitstoot piek op ~ 510 nm), exposeren effectieve excitatie tussen 350-450 nm (1-foton excitatie) of 700-900 nm (2-foton excitatie)5. Om te visualiseren PA-Nic tijdens lokale toepassing, PA-Nic (1 mM) werd toegepast in de buurt van hersenweefsel gevolgd door gelijktijdige beeldvorming van de hersenen (1) weefsel optische verdeelde transmissie verband via Dodt contrast en (2) de uitgestoten fluorescentie van excitatie (900 nm) van PA-Nic. PA-Nic 2PE fluorescentie was gemakkelijk aantoonbaar tijdens druk uitwerpen uit een lokale toepassing Pipet (Figuur 2a). Nicotine en een monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-methyl cumarine, zijn de belangrijkste fotochemische producten van de PA-Nic fotolyse reactie5. Met behulp van hetzelfde imaging instellingen/parameters die werden gebruikt voor PA-Nic imaging, was het weefsel beeld tijdens levering van nicotine (1 mM) of 7-carboxymethylamino-4-methyl cumarine (1 mM). Geen fluorescerende signaal was gevonden (Figuur 2a, middelste en onderste panelen), aan de specificiteit van de PA-Nic resultaten te tonen. Ten slotte, PA-Nic werd toegepast binnen hersenweefsel en PA-Nic fluorescentie emissie was beeld (Figuur 2b). Deze aanpak bevestigt dat PA-Nic aanwezig in 100-200 µm voor de lokale toepassing Pipet is. Samen, bevestigen deze gegevens dat PA-Nic effectief aan hersenen weefsel via lokale applicatie wordt geleverd.
Elektrofysiologie opnames met gelijktijdige 2PLSM voor visualisatie van cellulaire structuren vereist de detective om evenwicht overwegingen voor beide onderdelen van het experiment, en vaak een smalle tijd venster (~ 20 min) is beschikbaar voor geldige de aanwinst van de gegevens van het monster uit een gepatchte cel. Zonder overwegen cellulaire visualisatie, is het raadzaam om te beginnen opnemen zo spoedig mogelijk na inbraak omdat opname van stabiliteit heeft de neiging te dalen met de tijd. Echter wanneer imaging een vereiste is, mogen elektrofysiologische overwegingen voldoende tijd voor verhoging van de concentratie van de fluorescentie in kleine/externe structuren. Dit wordt geïllustreerd door het onderzoek van een concentratie van de kleurstof vullen kromme28, wat soms handig afleiden als een nieuw celtype imaging is. Figuur 3 toont enkele voorbeeld neuronen beeld als Z-stacks via 2PLSM en stortte in een projectie van maximale intensiteit voor presentatiedoeleinden. Figuur 3a toont beelden van hoge kwaliteit waar neuronale morfologie lijkt te zijn voltooid, lawaai tot een minimum beperkt en puin interfereert niet met interpretatie van cellulaire morfologie. Figuur 3b toont beelden van lagere kwaliteit, vanwege een lagere verhouding van signaal-naar-achtergrond en aanzienlijke puin. Dit puin wordt vaak weergegeven als bolvormige zakken van intense fluorescentie, die voortvloeien uit ejectie van imaging kleurstof uit de patch pipet terwijl het naderen van de cel. Met name opname van 100 µM PA-Nic in het bad (bij het uitvoeren van Bad toepassing) heeft de neiging om de verhouding van signaal-naar-achtergrond en leidt tot suboptimale afbeeldingscontrast. Alexa Fluor 568 of 594 is vaak vrij nuttig in lokale toepassing experimenten als een finder kleurstof of als een normaliserend 2PE referentie/normalisatie signaal. Een effectieve golflengte voor twee-foton excitatie van deze kleurstoffen is ~ 780 nm27, waarmee gelijktijdig visualisatie van PA-Nic en identificatie van cellulaire compartimenten. Deze golflengte, echter, is niet volledig voorkomen dat twee-foton fotolyse van PA-Nic5. Alexa Fluor 488 is gunstig in PA-Nic Bad-toepassing experimenten; Als enthousiast met een passende golflengte ≥900 nm, worden twee-foton fotolyse van PA-Nic5 vermeden terwijl nog het handhaven van geschikte visualisatie van cellulaire compartimenten.
Figuur 4 ziet u voorbeeldgegevens voor gelokaliseerde PA-Nic laser flash fotolyse bij MHb neuronen in de hersenen segmenten. Figuur 4a (bovenste panelen) toont een voorbeeld van een "" referentiebeeld, die een screen-capture van het laatste beeld van de 2PLSM genomen is voordat het protocol van MarkPoints werd uitgevoerd, bedekt met de foto-stimulatie ter plaatse locatie. Figuur 4a (lager afbeelding panelen) toont een ingezoomde weergave van de foto-stimulatie ter plaatse overlay op de cellulaire morfologie. De bijbehorende tijd-gecorreleerde elektrofysiologische reactie op PA-Nic fotolyse wordt weergegeven in de onderste panelen van figuur 4a. Vorige werk aangetoond dat deze stromingen gevoelig voor nAChR antagonisten5 zijn. Figuur 4b vertegenwoordiger worden gegevens weergegeven uit verschillende cellen waar één plek fotolyse werd uitgevoerd met een tussenpoos van ofwel 1 s of 10 s. overwegende dat een 10 s interval toegestaan voldoende hersteltijd voor de basislijn met huidige, een korter interval voor 1 s geleid tot een geleidelijke verhoging van het huidige protocol van bedrijf overgegaan. De toenemende huidige suggereert dat nicotine niet genoeg tijd hadden om uit de buurt van het systeem met de 1 Hz interval29diffuus. Dergelijke tijdelijke reactie analyses moeten worden uitgevoerd DOVO op elk nieuwe celtype bestudeerd, zoals de neurofarmacologie van nAChRs tussen celtypes verschillen kan.
Figuur 1: Photostimulation laser calibratie. (een) foto-stimulatie laservermogen. Macht op het vlak van de steekproef (door middel van een 60 x / 1.0 nb water dompelen doelstelling) werd gemeten voor 405 nm en 473 nm foto-stimulatie lasers op de aangegeven uitgangsinstelling. (b) foto-stimulatie laser kalibratie. Scherm vastleggen beelden tonen de ruimtelijke relatie tussen de beoogde foto-stimulatie stip en de overeenkomende locatie waar foto-stimulatie zich heeft voorgedaan (burn-gat) voor (links) en na (rechts) lopende kalibratie in MarkPoints. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de lokale toepassing PA-Nic. (een) detectie van PA-Nic vanuit een lokale toepassing pipet. 1 mM PA-Nic, fotolyse bijproduct of nicotine waren opgelost in ACSF, in een lokale toepassing pipet geladen en afgeleverd op hersenweefsel tijdens 2PLSM (900 nm excitatie) imaging met dezelfde grafische instellingen voor elk medicijn. Laser scannen Dodt contrast transmissie afbeelding toont de weefsel/pipet overwegende dat een GaAsP kathode bet werd gebruikt voor het vastleggen van de fluorescentie emissie. (b) PA-Nic (1 mM) was geperfundeerd in hersenweefsel en beeld via 2PLSM zoals in (een) om te laten zien van de laterale verspreiding van PA-Nic met behulp van haar intrinsieke fluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: verwerving van 2-foton laser scanning microscopie beelden. (een) optimale 2PLSM Z-stacks. Twee voorbeelden van 2PLSM Z-stack maximumlichtsterkte projecties zijn getoond MHb neuronen met goed opgelost dendrites en weinig tot geen storende puin. (b) sub-optimale 2PLSM Z-stacks. Twee voorbeelden van 2PLSM Z-stack maximumlichtsterkte prognoses worden voor MHb neuronen omringd door puin (kleurstof de pipet uitgezet tijdens cel aanpak) weergegeven. Dergelijke beelden zijn moeilijker te interpreteren dan beelden zoals die worden weergegeven in (een). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Laser flash fotolyse van PA-Nic. (een) MarkPoints referentie afbeeldingen en innerlijke stromingen opgeroepen door PA-Nic fotolyse. Een MHb neuron, ruwe referentie afbeeldingen staan voor MarkPoints foto-stimulatie proeven op een enkele (aangegeven) cellulaire plaats. Merk op dat voor sommige foto-stimulatie locaties (het meest rechtse beeld in deze serie), de dendritische structuur is in focus maar het soma en de proximale dendriet zijn niet. Onder de referentieafbeelding van elke, wordt de nicotine uncaging-opgeroepen inkomende stroom uitgezet. (b) tussen stimulus intervallen voor PA-Nic fotolyse. Exemplar opnames worden weergegeven voor MHb neuronen waar nicotine was herhaaldelijk uncaged op dezelfde perisomatic locatie met een onderlinge stimulans interval van 1 s of 10 s. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De keuze van PA-Nic toepassing/leveringsmethode is de meest kritische stap in deze techniek gelokaliseerde foto-stimulatie. De twee methoden, de toepassing van het bad en de lokale perfusie, biedt elk verschillende voordelen en beperkingen. De keuze wordt grotendeels beïnvloed door de nAChR functionele expressie niveau in het celtype van belang. Het is handiger bad om toepassing te gebruiken als functionele expressie niveaus hoog, zijn omdat Bad toepassing voor een uniforme sonde concentratie rond de opgenomen cel zorgt, data interpretatie te vergemakkelijken. Bad toepassing elimineert ook de behoefte aan een tweede perfusie pipet in het weefsel, waardoor het hele proces makkelijker. Bad toepassing van dure verbindingen echter kosten meer per experiment.
Algemeen, gaat probleemoplossing proberen te begrijpen waarom geen nAChR activering gezien volgende flash fotolyse is. Wanneer u werkt met een celtype die niet eerder met PA-Nic onderzocht is, lokale bladerdeeg-toepassing van ACh moet worden uitgevoerd door de onderzoeker of nicotine vaststellen of voldoende receptoren functioneel zijn uitgedrukte5. Om te controleren dat het systeem geschikt is voor het opsporen van fotolyse reacties, moet controle experimenten in mediale habenula neuronen die uitdrukking geven aan grote hoeveelheden receptor30gebeuren. Op dit gebied van de hersenen is PA-Nic Bad toepassing mogelijk, dat is beter voor validatie experimenten. Alleen na het uitvoeren van deze experimenten validatie moet men overgaan tot een ongedwongen celtype. Als de experimenteel systeem is gevalideerd en reacties erg klein of niet detecteerbaar blijven, het gerechtvaardigd kan zijn om te verhogen de concentratie van PA-Nic, verhogen van de intensiteit van de flits of de impulstijd, het toevoegen van een positieve allosteric modulator nAChR ter verbetering van nAChR activiteit6, of een combinatie van deze.
Af en toe, uncaging reacties zijn te groot, met aanzienlijke nAChR activering resulterend in indirecte spanning gated nb+ channel activering en unclamped naar binnen stromen toe te schrijven aan slechte ruimte klem. Deze artefacten, die volledig duistere nAChR naar binnen stromen en data interpretatie onmogelijk maken, kunnen door opname van QX-314 (2 mM) in de pipet opname worden geëlimineerd. Ze kunnen ook worden geëlimineerd door vermindering van de concentratie van PA-Nic of door het verminderen van de intensiteit van de flits of de impulstijd. In alle zichtbaar licht foto-stimulatie experimenten, moet voorzichtigheid worden betracht bij de keuze van de stimulatie sites om te voorkomen dat onbedoelde stimulatie/fotolyse boven of onder het gewenste brandvlak. Daarnaast en wanneer van toepassing, de kracht van de laser moet altijd worden getitreerd om te reproduceren van fysiologische reacties. Het is vooral belangrijk om te beseffen van de z-as photostimulation bij het werken met gekooide liganden, zoals liganden die zijn geactiveerd boven/onder de focale plek kunnen nog diffuus en interactie met het biologische systeem (dwz, -receptoren) bestudeerd.
PA-Nic laser flash fotolyse wellicht niet geschikt voor alle onderzoekers, zoals verschillende beperkingen bestaan. De eerste is de relatief hoge kosten van een geschikt set-up. Bij het werken met intact hersenen segmenten, uncaging in de buurt van kleine diameter structuren zoals dendrites vereist een geavanceerde visualisatie systeem zoals een 2-foton microscoop. Afgezien van de hoge kosten van een Ti:sapphire, afstembare IR gepulste laser voor presterende 2-foton microscopie, verhoogt een dual-galvanometer systeem dat kan zelfstandig verder positionering twee laserstralen de kosten van het systeem. Totale systeemkosten kunnen worden verlaagd met behulp van een huis-gebouwde systeem als de onderzoeker beschikt over voldoende deskundigheid en tijd om te bouwen, oplossen en onderhouden van een dergelijk systeem. Een tweede beperking vaak gaat om lage nAChR functionele expressie, die kan gedeeltelijk worden opgevangen door maatregelen te nemen zoals hierboven vermeld, maar dit kan geen garantie voor succes. Meestal, als een ligand-geactiveerde stromingen na bladerdeeg-toepassing van agonisten niet kunt meten, PA-Nic flash fotolyse onder spanning klem kan geen aanvaardbare resultaten opleveren. Een derde beperking betreft de intrinsieke fluorescentie van PA-Nic. PA-Nic ~ 405 nm licht absorbeert en stoot in een vergelijkbaar bereik als de groen fluorescente proteïne (GFP) of Alexa 4885. Als PA-Nic concentraties ~ 1 mM overschrijden, kan deze eigenschap fluorescentie maken het uitdagend om te visualiseren gelijktijdig neuronale structuren. Om te verhelpen dit, is het van cruciaal belang om gemakkelijk de transportbesturing van PA-netwerkkaart uit de perfusie-pipet te kunnen. Van tijd tot tijd werd de PA-Nic stroom gestopt zodat fluorescerende moleculen te verspreiden weg. Dit toegestaan opnieuw beeldvorming van het neuron voor het controleren van de contante positie van de uncaging lichtbundel. Een vierde mogelijke beperking wil impliceert het gebruik van 405 nm licht voor fotolyse. Kortere golflengten zoals 405 nm zijn meer vatbaar voor verstrooiing in complexe weefsel zoals een segment van de hersenen. Dus, op een bepaalde flash intensiteit en duur, uncaging reactie amplitudes en verval kinetiek kunnen worden differentieel beïnvloed door de diepte van de focus van de uncaging binnen het segment. Conclusies over de biologische aspecten van nAChRs moeten rekening houden met dit belangrijke voorbehoud.
Deze gelokaliseerde laser flash fotolyse techniek is onlangs gebruikt om te ontdekken van nieuwe details over nAChR neurobiologie. Bijvoorbeeld verbetert chronische nicotine blootstelling perisomatic en dendritische nAChR functie in mediale habenula neuronen5. Het werd ook gebruikt om te helpen tonen, voor de eerste keer, dat ventrale tegmental gebied glutamaat neuronen express functionele nAChRs in hun perisomatic en dendritische cellulaire compartimenten6. Er zijn dat veel potentiële toekomstige gebruik van deze techniek, en de aanpak kan worden toegepast op andere belangrijke neuron typen waarvan bekend is dat uitdrukkelijke nAChRs, zoals corticale piramidale neuronen31 of interneuronen in de hersenschors32, striatum33 , en hippocampus19. Deze techniek kan ook worden gecombineerd met farmacologie en/of nAChR gen bewerken34 om te lokaliseren specifieke receptor subtypes aan verschillende neuronale compartimenten. De aanpak kan gemakkelijk aangepast worden aan andere cumarine-caged verbindingen, met inbegrip van maar niet beperkt tot, parallel met PA-Nic5ontwikkeld. Ten slotte, PA-Nic flash fotolyse kan een dag worden gebruikt in een dier wakker/gedragen om nicotine van actie in de roman gedrags farmacologie paradigma's te bestuderen.
Disclosures
D.L.W. dient als een betaalde consultant voor Bruker Nano fluorescentie microscopie.
Acknowledgments
De auteurs bedanken laboratorium leden van de volgende noordwesten belangrijkste onderzoekers: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy en Anis aannemer. Dit werk werd ondersteund door de ons National Institutes of Health (NIH) (subsidies DA035942 en DA040626 naar R.M.D.), de PhRMA Foundation (Genootschap voor M.C.A.) en HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
| Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
| (-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
| 7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
| 1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
| Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
| Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
| Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
| 6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
| QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
| Power Meter | ThorLabs | S120C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Solutions | |||
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Thiourea | Sigma | T8656 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components of 2-Photon Microscope | |||
| Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
| Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
| Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
| Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
| OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
| OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
| Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
| Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
| Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
| X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
| B&W CCD camera; Watec, 0.5 in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
| 595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
| 565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
| GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
| 525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
| High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |
References
- Zhang, C., et al. Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications. Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).
- Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).
- Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation. Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).
- Katz, B., Thesleff, S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).
- Banala, S., et al. Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology. Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).
- Yan, Y., et al. Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission. Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).
- Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).
- Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Ren, J., et al. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).
- Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity. Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).
- Zhang, J., et al. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. Cell. 166 (3), 716-728 (2016).
- Chen, E., et al. Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus. Neuroscience. 218, 1-11 (2012).
- Ting, J. T., Feng, G. Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).
- Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice. Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).
- Kolisnyk, B., et al. ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains. The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).
- Denk, W. Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).
- Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons. The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).
- Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).
- Tochitsky, I., et al. Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).
- Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities. Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).
- Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons. Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).
- Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons. Elife. 6, (2017).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Science STKE. (219), pl5 (2004).
- Inoue, S., Spring, K. Video microscopy: The fundamentals. , 2 edn, Plenum Press. 163-186 (1997).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing. Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).
- Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses. Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).
- Shih, P. Y., et al. Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula. The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).
- Verhoog, M. B., et al. Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity. Nature Communications. 7, 12826 (2016).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Xiao, C., et al. Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).
- Peng, C., et al. Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission. European Journal of Neuroscience. , (2018).
