Este artículo presenta un método para el estudio de los receptores acetilcolina nicotínicos (nAChRs) en rebanadas de cerebro de ratón por uncaging de nicotina. Cuando se combina con revisión simultánea abrazadera grabación y láser de 2 fotones microscopía, nicotina uncaging conecta función del receptor nicotínico con morfología celular, proporcionando una comprensión más profunda de la neurobiología colinérgico.
Acetilcolina (ACh) actúa a través de receptores para modular una variedad de procesos neuronales, pero ha sido difícil vincular la función del receptor de ACh con localización subcelular dentro de las células donde se realiza esta función. Para estudiar la localización subcelular de los receptores ACh nicotínicos (nAChRs) en el tejido cerebral nativo, fue desarrollado un método óptico precisa liberación de nicotina en lugares discretos cerca de las membranas neuronales durante las grabaciones electrofisiológicas. Fijada por el parche de neuronas en cerebro rebanadas están llenos de tinte para visualizar su morfología durante microscopía láser 2 fotones, y nicotina uncaging se ejecuta con un flash de luz concentrándose un rayo de láser de 405 nm cerca de uno o más de las membranas celulares. Celulares actuales desviaciones se miden, y alta resolución imagen tridimensional (3D) de la neurona registrada está hecha para permitir la reconciliación de las respuestas del nAChR con morfología celular. Este método permite un análisis detallado de la distribución funcional nAChR en preparaciones de tejido complejo, prometiendo mejorar la comprensión de la neurotransmisión colinérgica.
Señalización colinérgica modula numerosos procesos del cerebro, incluyendo el control atencional, el movimiento volitivo y recompensa1,2. Fármacos que mejoran la transmisión de acetilcolina (ACh) se utilizan para tratar el deterioro cognitivo asociado con la enfermedad de Alzheimer, lo que implica un papel importante para los sistemas colinérgicos en cognición3. Una mejor comprensión de los receptores colinérgicos y circuitos en Estados sanos y enfermos podría conducir a mejores enfoques terapéuticos para varias enfermedades neurológicos, trastornos.
Receptores de ACh nicotínicos (nAChRs) son una familia de canales ligand-bloqueados del ion que flujo de cationes en respuesta a ACh endógena o exógena nicotina de tabaco. Habida cuenta de que estaban entre los primeros receptores de neurotransmisores que describe4, farmacología nAChR y ubicación en las fibras musculares es bien entendido por los receptores de tipo muscular. Por el contrario, comparativamente poco se sabe sobre la farmacología y de la distribución subcelular de nAChRs nativo en el cerebro. Esta brecha en conocimiento recientemente se abordó mediante el desarrollo de una nueva sonda química que permite la activación espacial limitada y rápida de nAChRs en el tejido cerebral durante la proyección de imagen celular y grabación electrofisiológica5. Aquí, se describen los pasos metodológicos fundamentales en este enfoque, con el objetivo de aumentar la capacidad de conectar la función del nAChR con estructura neuronal.
Nicotina Photoactivatable (PA-Nic; nombre químico: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarina-4-yl] metilo-nicotina) puede ser fotolizada con ~ 405 nm láser parpadea para eficientemente liberar nicotina5,6. Antes de uncaging, PA-Nic es estable en solución y exhibe ningún inconveniente características farmacológicas o fotoquímica5. Después de fotólisis, liberado de la nicotina activa como era de esperarse nAChRs y los derivados uncaging son farmacológicamente inerte5. Un láser de onda continua es utilizado como fuente de luz con una potencia de salida fotólisis > 1 mW medido en la muestra. Cuando localizada, Foto estimulación específica se combina con la capacidad para ubicar las membranas celulares con láser de 2 fotones microscopía (2PLSM), y se dieron cuenta de las dos principales ventajas de este enfoque: velocidad de fotólisis y precisión espacial.
En la mayoría de los respectos, fotólisis de PA-Nic es superior a otros métodos de entrega nAChR ligandos a receptores dentro de rebanadas de cerebro. Estos enfoques incluyen baño uso7 y local de la droga entrega a través de un soplador pipeta8. Mientras que el enfoque anterior tiende a insistir en los efectos a largo plazo de la droga aplicada, este último enfoque puede sufrir de la variabilidad en la cinética de la respuesta entre los ensayos y a través de las células. Ninguno de estos enfoques alternativos pueden distinguir adecuadamente las actividades del receptor en diferentes localizaciones celulares de la neurona misma. Optogenetically-activa la liberación de ACh se ha utilizado para la investigación del nAChRs nativa9,10,11, pero no ha probado útil para las localizaciones subcelulares nAChR asignación. Además, la mayoría de los estudios utilizando este enfoque ha confiado en expresar ChR2 cromosoma artificial bacteriano transgénico ratón con transmisión colinérgica anormal12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotólisis no es el enfoque sólo óptico para el estudio de los receptores colinérgicos. Una jaula carbachol fue utilizado funcionalmente asignar actividades del receptor de ACh en células cultivadas rebanadas de cerebro y18 19, pero no estaba comercialmente disponible para estudios comparativos durante el desarrollo del PA-NIC. Un bis de rutenio (bipyridine)-complejo de nicotina (nicotina RuBi) fue divulgado para permitir la nicotina uncaging20, pero preparaciones comerciales de RuBi-nicotina resultado inferior a la PA-Nic en una comparación cabeza a cabeza el estudio5. Puede ser útil repetir tales experimentos comparativos con no-comercial, altamente purificada RuBi-nicotina, como su absorción visible podría complementar características PA-Nic estudios colinérgicos. Por último, nAChRs han también sido ópticamente manipulados usando una combinación de foto-conmutable ligandos y receptores modificados genéticamente21. Este enfoque es complementario a fotólisis PA-Nic en el tejido cerebral, con la capacidad/necesidad de selección genética de lo nAChR modificado visto como una ventaja y un inconveniente.
Cabe señalar algunos requisitos claves de este enfoque. En primer lugar, es necesario un método de visualización apropiado para localizar exactamente la membrana neuronal. Proyección de imagen con microscopía de epifluorescencia convencional puede ser suficiente al estudiar las células cultivadas, pero para la grabación de las neuronas en rebanadas de cerebro u otras preparaciones de tejido grueso, 2PLSM o microscopía confocal es un requisito. En segundo lugar, un método adecuado es necesario posicionar el rayo láser de fotólisis. Este enfoque utiliza una galvanómetro de doble exploración cabeza con dos espejos independientes x-y para el escaneo de trama de la imagen haz punto de fotoactivación con la uncaging laser viga22,23,24. Otros, más limitadas soluciones son posibles, tales como (1) una cabeza de escaneo galvanómetro solo que alternativamente trama explora el rayo de proyección de imagen y el haz uncaging o (2) simplemente dirigiendo el haz uncaging en el centro del campo de visión tal que la célula se lleva a esta posición para flash photolysis. En tercer lugar, un sistema es necesario para grabación electrofisiológica simultánea si se desea recoger señales fisiológicas durante los experimentos. Los requisitos anteriores se pueden resolver con una técnica de imagen todo óptico adecuada, como el recientemente descrito5. A continuación, se incluye un protocolo detallado que describe los pasos clave de este enfoque.
La elección del método de entrega de aplicaciones PA-Nic es el paso más crítico en esta técnica de foto-estimulación localizada. Los dos métodos, uso de baño y la perfusión local, cada una ofrece diferentes ventajas y limitaciones. La elección se ve afectada en gran medida por el nivel de expresión funcional del nAChR en el tipo de la célula de interés. A menudo es preferible utilizar la aplicación del baño cuando los niveles de expresión funcional son altos, como aplicación de baño permite una concentración de sonda uniforme que rodea la célula grabada, facilitando la interpretación de los datos. Aplicación de baño también elimina la necesidad de una segunda pipeta de perfusión en el tejido, facilitando todo el proceso. Sin embargo, aplicación de baño de costosos compuestos costos más por experimento.
Solución de problemas implica comúnmente, tratando de entender por qué ninguna activación nAChR es visto siguiente flash photolysis. Cuando se trabaja con un tipo de células que no se ha estudiado previamente con el PA-Nic, el investigador debe realizar puff-aplicación local de ACh o nicotina para determinar si suficientes receptores son funcionalmente expresado5. Para validar que el sistema es capaz de detectar respuestas de fotólisis, experimentos de control debe hacerse en medial de la habénula neuronas que expresan grandes cantidades de receptor30. En esta área del cerebro, PA-Nic baño aplicación es posible, que es preferible para los experimentos de validación. Sólo después de realizar estos experimentos de validación debería uno pasar a un tipo de células estudiadas. Si el sistema experimental ha sido validado y las respuestas siguen siendo muy pequeño o no detectable, puede estar justificado para aumentar la concentración de PA-Nic, aumentar la intensidad del flash o la duración del pulso, añadir un modulador alostérico positivo del nAChR mejorar nAChR actividad6, o alguna combinación de estos.
Ocasionalmente, uncaging las respuestas son demasiado grandes, con la activación del nAChR significativas dando por resultado la tensión indirecta privada Na+ canal activación y liberadas corrientes hacia el interior debido a la abrazadera del espacio pobre. Estos artefactos, que completamente oscurecen nAChR hacia corrientes y hacen imposible la interpretación de los datos, se pueden eliminar por la inclusión de QX-314 (2 mM) en la pipeta de la grabación. También puede ser eliminados mediante la reducción de la concentración de PA-Nic o reduciendo la intensidad del flash o la duración del pulso. En todos los experimentos de foto-estimulación de luz visible, se debe tener cuidado al seleccionar los sitios de estimulación para evitar estimulación involuntaria/fotólisis por encima o por debajo del plano focal deseado. Además y cuando proceda, la potencia del láser siempre debe ser graduada para reproducir respuestas fisiológicas. Es especialmente importante ser consciente de fotoestimulación del eje z cuando se trabaja con ligandos enjaulados, como ligandos que se activan por encima/por debajo el punto focal pueden todavía difuso e interactuar con el sistema biológico (es decir, receptores de, ) bajo estudio.
Fotólisis de destello láser PA-Nic puede no ser apropiado para todos los investigadores, existen varias limitaciones. El primero es el relativamente alto costo de una instalación adecuada. Cuando se trabaja con cortes de cerebro intacto, uncaging cerca de estructuras de diámetro pequeño como las dendritas requiere un sistema de visualización sofisticada como un microscopio de 2 fotones. Además el alto costo de una TI: zafiro, láser pulsado sintonizable de IR para realizar 2 fotones microscopía, un sistema de doble-galvanómetro capaz de posicionar independientemente dos rayos láser más incrementa el costo del sistema. Coste total del sistema puede reducirse mediante el uso de un sistema de fabricación casera si el investigador dispone de suficiente experiencia y tiempo para construir, solucionar problemas y mantener dicho sistema. Una segunda limitación a menudo implica la expresión funcional nAChR baja, que puede mitigarse parcialmente por pasos como se mencionó anteriormente, pero esto no puede garantizar el éxito. Por lo general, si uno no puede medir corrientes ligand-activado después de hojaldre-aplicación de agonistas, PA-Nic flash photolysis debajo de la abrazadera de tensión no puede producir resultados aceptables. Una tercera limitación implica la intrínseca fluorescencia de PA-NIC PA-Nic absorbe ~ 405 nm luz y emite en un rango similar como la proteína verde fluorescente (GFP) o Alexa 4885. Cuando las concentraciones de PA-Nic exceden ~ 1 mM, esta propiedad de fluorescencia puede hacer difícil visualizar simultáneamente estructuras neuronales. Para mitigar esto, es fundamental para poder controlar fácilmente el flujo de PA-Nic de la pipeta de la perfusión. Periódicamente, el flujo de PA-Nic se detuvo para permitir que moléculas fluorescentes a difuso lejos. Esto permite volver a la proyección de imagen de la neurona para el control de la posición del punto de la viga uncaging. Una cuarta limitación potencial mencionar consiste en el uso de 405 nm luz de fotólisis. Longitudes de onda más cortas como 405 nm son más propensos a la dispersión en el tejido complejo como un trozo de cerebro. Así, en una determinada intensidad del flash y la duración, uncaging amplitudes de respuesta y cinética del decaimiento pueden ser diferencialmente afectados por la profundidad de la uncaging dentro de la rebanada. Conclusiones sobre aspectos biológicos del nAChRs deben considerar esta importante ADVERTENCIA.
Esta técnica de fotólisis de destello láser localizado recientemente se ha utilizado para descubrir nuevos detalles sobre neurobiología del nAChR. Por ejemplo, la exposición crónica de la nicotina mejora perisomatic y función del nAChR dendríticas en medial de la habénula neuronas5. También fue utilizado para ayudar a demostrar, por primera vez, que las neuronas glutamato de área tegmental ventral expresan funcional nAChRs perisomatic y dendríticas compartimentos celulares6. Hay que muchas posibilidades de futuro uso de esta técnica, y el enfoque podría aplicarse a otros tipos de neurona clave que expresa nAChRs, como las neuronas piramidales corticales31 o interneuronas en la corteza cerebral32, estriado33 e hipocampo19. Esta técnica podría también combinarse con Farmacología o nAChR gene edición34 para localizar subtipos de receptores específicos a los diferentes compartimientos neuronales. El enfoque puede adaptarse fácilmente a otros compuestos de cumarina enjaulado, incluyendo pero no limitado a, los que se desarrollaron en paralelo con PA-Nic5. Finalmente, PA-Nic flash photolysis un de puede día utilizar en un animal despierto/comportamiento para estudiar la acción de la nicotina en paradigmas de la farmacología conductual novela.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de los siguientes investigadores principales noroeste: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy y contratista de Anis. Este trabajo fue apoyado por el nos institutos nacionales de salud (NIH) (becas DA035942 y DA040626 a R.M.D.), la Fundación PhRMA (beca a M.C.A.) y HHMI.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |