Summary
والغرض من هذا البروتوكول هو استخدام مزيج من الحسابية ومقاعد البدلاء للبحث للبحث عن تسلسل الرواية التي لا يمكن فصلها بسهولة عن تسلسل تنقية المشترك، الذي قد يكون معروفا إلا جزئيا.
Abstract
يمكن استخدام علم الجينوم مطروح في أي بحث حيث كان الهدف هو تحديد التسلسل الجيني أو البروتين، أو المنطقة العامة المضمنة في سياق أوسع المجين. علم الجينوم الاختزالي تمكن باحث لعزل تسلسل هدف من الفائدة (T) بترتيب شامل وطرح العناصر الوراثية المعروفة (مرجع, R). يمكن استخدام الأسلوب لتحديد تسلسل الرواية مثل الميتوكوندريا، والمعايشة، والفيروسات، أو germline مقيد الكروموسومات، وهي مفيدة بشكل خاص عندما تي لا يمكن أن تكون معزولة بسهولة من ر. تبدأ مع بيانات الجينوم شاملة (R + T)، الأسلوب يستخدم الأساسية المحلية المحاذاة البحث أداة (الانفجار) ضد سلسلة مرجع، أو تسلسل، لإزالة تسلسل المعروفة المطابقة (R)، تاركة وراءها الهدف (T). للطرح تعمل بشكل أفضل، ينبغي أن يكون البحث والتطوير مشروع مكتمل نسبيا يفتقد ت. منذ متواليات المتبقية بعد الطرح يتم اختبارها من خلال الكمية "تفاعل البوليميراز المتسلسل" (qPCR)، لا يلزم R تكون كاملة لأسلوب العمل. هنا نربط الخطوات الحسابية مع خطوات تجريبية في دوامة الذي يمكن تكراره حسب الحاجة، إزالة متعددة مرجع تسلسل تسلسلياً وصقل البحث عن ت. الاستفادة من علم الجينوم الاختزالي هو أنه يمكن تحديد تسلسل رواية تماما هدف حتى في الحالات التي يتم تنقية المادية صعبة أو مستحيلة أو باهظة الثمن. عيب الأسلوب هو إيجاد مرجع مناسب للطرح والحصول على T-إيجابية وسلبية عينات لاختبار قبكر. يصف لنا تنفيذنا للأسلوب في تحديد الجينات الأولى من كروموسوم مقيدة بالفعل من زيبرا فينش. في هذه الحالة تصفية حسابية تشترك ثلاث إشارات (R)، إزالة تسلسلياً على مدى ثلاث دورات: الجمعية الجينوم ناقصة وبيانات الجينوم الخام والبيانات ترانسكريبتوميك.
Introduction
والغرض من هذا الأسلوب تحديد هدف رواية (T) الجينوم تسلسل، أما من الحمض النووي الريبي، أو من سياق الجينوم، أو إشارة (R) (الشكل 1). الأسلوب مفيد جداً إذا كان الهدف لا يمكن فصلها ماديا، أو أنها ستكون مكلفة القيام بذلك. فقط بعض الكائنات الانتهاء تماما مورثات للطرح، حيث أحد الابتكارات رئيسية لدينا أسلوب هو مزيج من الحسابية وأساليب مقاعد البدلاء في دورة تمكن الباحثين لعزل تسلسل الهدف عند الإشارة لا تخلو من العيوب، أو مشروع الجينوم من كائن غير نموذجية. في نهاية دورة، يستخدم qPCR اختبار لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى الطرح أكثر. سوف تظهر تسلسل المرشحين المصادق عليها تي كشف أكبر إحصائيا في عينات تي-الإيجابية المعروفة ب qPCR.
نفذت التجسيد للأسلوب في اكتشاف المخدرات البكتيرية الأهداف الجديدة التي لم تقم المضيف هومولوجس1،2،،من34 وتحديد الفيروسات رواية من المضيفين المصابة 5،6. بالإضافة إلى تحديد تي، يمكن تحسين الأسلوب r: استخدمنا الأسلوب مؤخرا لتحديد الجينات المفقودة 936 من الجينوم مرجع زيبرا فينش ومورثة جديدة من كروموسوم germline فقط (T)7. علم الجينوم الاختزالي قيمة خاصة عند تي يرجح أن تكون متباينة جداً من تسلسل المعروفة، أو عند هوية تي غير معروف على نطاق واسع، كما هو الحال في كروموسوم مقيدة بالفعل زيبرا فينش7.
التي لا تتطلب تحديد إيجابية من T مسبقاً، مزايا رئيسية للجينوم الاختزالي أنه غير متحيز. في دراسة أجريت مؤخرا، ريدهيد et al. دراسة العلاقة بين مرض الزهايمر ووفرة الفيروسية في أربع مناطق الدماغ. لتحديد الفيروسية، ريادهياد et al. بإنشاء قاعدة بيانات للفيروسات 5158، الحد من شدة عوامل فيروسية يمكن أن تحدد هذه الدراسة. الجينوميات الاختزالي يمكن قد استخدمت للمقارنة بين الأصحاء والجينوم الزهايمر بغية عزل الفيروسات رواية المحتملة المرتبطة بهذا المرض، بغض النظر عن التشابه مع العوامل المعدية المعروفة. بينما هناك 263 الفيروسات المعروفة تستهدف الإنسان، يقدر وجود حوالي 1.67 مليون من الأنواع الفيروسية غير المكتشفة، مع 631,000-827,000 منها يمكن أن تصيب البشر9.
عزل فيروسات جديدة منطقة فيها الاختزالي الجينوميات فعالة بشكل خاص، ولكن بعض الدراسات قد لا تحتاج إلى مثل هذا أسلوب صارمة. على سبيل المثال، دراسات استخدمت الفيروسات رواية تحديد التسلسل الفائق غير متحيزة تليها النسخ العكسي وبلاست لتسلسلات فيروسية5 أو إثراء للأحماض النووية الفيروسية لاستخراج وعكس نسخ تسلسلات فيروسية 6. في حين استخدمت هذه الدراسات تسلسل حيثياته والجمعية، الطرح لم يستخدم لأن تسلسل المستهدفة التي حددت إيجابيا من خلال الانفجار. إذا كانت الفيروسات تماما الرواية ولا يتصل (أو ذات الصلة بعيد) للفيروسات الأخرى، كان علم الجينوم الاختزالي تقنية مفيدة. الاستفادة من علم الجينوم الاختزالي هو أنه يمكن الحصول على تسلسلات جديدة تماما. إذا كان يعرف الجينوم للكائن، يمكن طرح خارجاً بمغادرة أي تسلسلات فيروسية. على سبيل المثال، في دراستنا المنشورة نحن عزل تسلسل فيروسية رواية من زيبرا فينش من خلال الجينوم الاختزالي، على الرغم من أنه ليس لدينا النية الأصلية7.
علم الجينوم الاختزالي أثبت أيضا مفيدة في تحديد أهداف اللقاحات البكتيرية، ودافع عن الارتفاع الكبير في مقاومة المضادات الحيوية1،2،،من34. للتقليل من مخاطر رد فعل المناعة الذاتية، ضاقت الباحثين أهداف اللقاح المحتملة عن طريق طرح أي البروتينات التي قد هومولوجس في المضيف البشري. دراسة خاصة واحدة، تبحث في pseudotuberculosis وتدية، يتم الطرح لجينوم مضيف الفقارية من عدة مورثات بكتيرية التأكد من أن الأهداف المحتملة المخدرات لن يؤثر على البروتينات في المضيفين مما يؤدي إلى آثار جانبية 1-تدفق العمل الأساسي لهذه الدراسات هو لتحميل البروتين البكتيري، تحديد البروتينات الحيوية، إزالة البروتينات الزائدة عن الحاجة، واستخدام بلاستب لعزل البروتينات الأساسية، وبلاستب ضد البروتين المضيف لإزالة أي البروتينات مع المضيف هومولوجس 1 , 2 , 3 , 4-وفي هذه الحالة، علم الجينوم الاختزالي ضمان أن اللقاحات البلدان المتقدمة النمو لن يكون أي آثار خارج الهدف في المضيف1،2،،من34.
استخدمنا الجينوم الاختزالي لتحديد الجينات ترميز البروتين الأولى في تقييد germline كروموسوم (GRC) (في هذه الحالة، تي)، الذي تم العثور عليه في جيرملينيس ولكن الأنسجة الجسدية لا من كلا الجنسين10. قبل هذه الدراسة، كانت المعلومات الجينومية فقط أنه كان يعرف عن GRC منطقة متكررة11. وأجرى الجمعية حيثياته في الجيش الملكي النيبالي متسلسلة من أنسجة المبيض ورؤوس (R + T) من الكبار زيبرا العصافير. أجرى القضاء متواليات حسابية باستخدام المنشورة جسدية (العضلات) الجينوم تسلسل (R1)12، الخام (سانجر) قراءة البيانات (ص2) و جسدية (الدماغ) الترنسكربيتوم (ص3)13. استخدام ثلاث إشارات متتابعة كان يقودها qPCR اختبار في الخطوة 5 لكل دورة (الشكل 2ألف)، تبين أن هناك حاجة إلى تصفية إضافية. وأكد الجين α-الأدوات المكتشفة من خلال قبكر من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، والاستنساخ وتسلسلها. علينا أن نبدي في مثالنا أن هذا الأسلوب مرنة: أنها لا تعتمد على مطابقة الأحماض النووية (مقابل الحمض النووي الريبي)، ويمكن أن يؤديها هذا الطرح مع المراجع (R) التي تتألف من جمعيات أو يقرأ الخام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- نوفو دي "تسلسل بدء تجميع"
ملاحظة: أي بيانات الجيل التالي تسلسل (خ ع) يمكن استخدامها، ما دام يمكن أن تنتج جمعية من تلك البيانات. تتضمن بيانات الإدخال المناسبة إيلومينا، باكبيو، أو "نانوبوري أكسفورد" يقرأ مجمعة في ملف فاستا. لواقعية، يصف هذا القسم جمعية على أساس إيلومينا ترانسكريبتوميك محددة لدراسة زيبرا فينش أجرينا7؛ ولكن انتبه إلى أن التفاصيل سوف تختلف حسب المشروع. لمشروعنا المثال، استمدت البيانات الخام من مسك ويقرأ إقران حوالي 10 مليون تم الحصول عليها من كل عينة.
- استخدام تريموماتيك 0.3214 لإزالة محولات إيلومينا وقواعد منخفضة الجودة. في سطر الأوامر، قم بإدخال:
جافا-جرة PE تريموماتيك-0.32.jar-phred33 forward.fq.gz reverse.fq.gz-بازوت quality_and_adaptor_trimmed ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 الرائدة: 3 خلفية: 3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:40 - استخدام الكمثرى15 ف 0.9.6 لإنشاء ما يلي مدمجة عالية الجودة من تريموماتيك إخراج إقران ما يلي: استخدام المعلمات الافتراضية. في سطر الأوامر، قم بإدخال:
الكمثرى-f < quality_and_adaptor_trimmed_1P.fastq >-r < quality_and_adaptor_trimmed_2P.fastq > - استخدام الزواحف v. 1.116 لتصحيح الخطأ على ما يلي أنتجت عن طريق الكمثرى. يتبع البروتوكول خطوة بخطوة الموصوفة في17.
- استخدام الثالوث v. 2.4.018 في الوضع الافتراضي لتجميع تسلسل تصحيحها. للمكتبات الخاصة ستراند، استخدم المعلمة-SS_lib_type. الإخراج ملف فاستا (your_assembly.fasta). في سطر الأوامر، قم بإدخال:
الرمزية-سيقتيبي الثالوث-الأب SS_lib_type-max_memory ز 10 – إخراج Trinity_output-غادر quality_and_adaptor_trimmed_forward_paired_reads.fq – الحق quality_and_adaptor_trimmed_reverse_paired_reads.fq – وحدة المعالجة المركزية 10
ملاحظة: سيتم وضع الإخراج في دليل جديد، Trinity_output، وسيتم تسمية الجمعية 'Trinity.fasta' التي يمكن أن يعاد تسميته Your_assembly.fasta إذا رغبت في ذلك. راجع موقع ترينيتي لمزيد من التفاصيل: https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Running-Trinity.
2-انفجار الجمعية ضد التسلسل المرجع
ملاحظة: استخدام هذه الخطوة عند الإشارة الجمعية أو طويلة يقرأ مثل سانجر؛ إذا كان يتكون من يقرأ إيلومينا الخام، راجع الخطوة رقم 3 أدناه لتعيين ما يلي للاستعلام. وأنجزت جميع الخطوات الانفجار مع الإصدار 2.2.29+ على الرغم من الأوامر يجب أن تعمل على أي إصدار الانفجار الأخير.
- جعل قاعدة بيانات انفجار في التسلسل المرجع (nucleotide_reference.fasta) في سطر الأوامر. أدخل ما يلي في سطر الأوامر:
ماكيبلاستدب-dbtype نوكل-في nucleotide_reference.fasta-خارج nucleotide_reference.db - انفجار--مباراة الجمعية الاستعلام (تم إنشاؤه في الخطوة 1) إلى قاعدة البيانات المرجعية. للحصول على ملف إخراج، استخدم [-خارج BLAST_results.txt] واستخدامها لإنشاء جداول الإخراج (مطلوب لخطوات المعالجة اللاحقة مع البرامج النصية بيثون)، [أووتفمت-6]. ويمكن الجمع بين هذه الخيارات في أي أمر، لذلك مثال على إكمال الأمر [بلاستن-الاستعلام your_assembly.fasta-db nucleotide_reference.db-خارج BLAST_results.txt-أووتفمت 6]. إذا كان المطلوب هو وضع ه-قيمة، استخدم الخيار-افالا مع عدد مناسب، على سبيل المثال [-افالا 1e-6]. أن ندرك مع ذلك أن دورة الاختزالي فعالية عكس افالا الإعداد كما هو موضح في المناقشة.
- لزيادة صرامة، استخدم تسلسل البروتين من الجمعية كاستعلام الانفجار مع المترجمة النوكليوتيدات الانفجار (تبلاستن)، الذي يقوم بترجمة 6-طريقة لقاعدة البيانات (النوكليوتيدات). ينصح بهذا الأسلوب لمعظم نظم غير نموذجية، تجنب مشكلة شروح البروتين غير مكتملة.
- تأكد من تحديد الشفرة الجينية الصحيحة للكائن الذي يتم دراسته، باستخدام الخيار-db_gencode. للحصول على تسلسلات البروتين للاستعلام، قم بتشغيل الأمر TransDecoder.LongOrfs (من حزمة ترانسديكودير v. 3.0.1) لتحديد أطول قراءة من فتح إطارات سلاسل استعلام تجميع. أن الأمر هو [TransDecoder.LongOrfs-تي your_assembly.fasta]؛ الإخراج سيتم وضعها في دليل يسمى 'transcripts.transdecoder_dir' وسوف تحتوي على ملف يسمى longest_orfs.pep التي تحتوي على سلاسل أطول من المتوقع البروتين من كل تسلسل في your_assembly.fasta.
- لاستخدام تبلاستن، قم بتشغيل الأمر [تبلاستن-الاستعلام longest_orfs.pep-db nucleotide_reference.db-خارج BLAST_results.txt-أووتفمت 6]. في حالة توفر مرجع بروتين عالي الجودة، استخدام البروتين-بروتين مطابقة مع بلاستب بدلاً من تبلاستن.
- جعل قاعدة بيانات انفجار الإشارة البروتين [بروت-dbtype ماكيبلاستدب--في protein_reference.fasta-خارج protein_reference.db] ثم [بلاستب-الاستعلام longest_orfs.pep-db protein_reference.db-خارج BLAST_results.txt-أووتفمت 6]. تأكد من حفظ النتائج كملف للتجهيز النهائي، واستخدام جداول (أووتفمت 6) لضمان تحليل البرامج النصية بيثون لهم بشكل صحيح.
3-خريطة يقرأ على الجمعية العامة
ملاحظة: يمكن استخدام هذا الأسلوب إذا كانت مجموعة البيانات المرجعية تتألف من قراءة الجينوم الخام، بدلاً من تجميع تسلسل أو تسلسل سانجر، فيها استخدام حالة الانفجار (الخطوة 2، 1).
- استخدام التحالف-MEM v. 0.7.1219 أو bowtie220، خريطة ما يلي الخام الذي تم تنزيله (raw_reads.fastq) إلى الجمعية العامة الاستعلام. سوف يكون الإخراج تنسيق.sam. الأوامر كما يلي: أولاً مؤشر الجمعية: [التحالف مؤشر your_assembly.fasta]، ومن ثم تعيين على ما يلي [التحالف mem your_assembly.fasta raw_reads.fastq > mapped.sam]. (ملاحظة '>' الرمز هنا ليست أكبر-من إشارة؛ بدلاً من ذلك فإنه يرشد الإخراج للذهاب إلى mapped.sam ملف).
4-استخدام "بيثون السيناريو" لإزالة أي "تسلسل مطابقة"
ملاحظة: تقدم عمل البرامج النصية مع 2.7 بيثون.
- وبعد الخطوة 2، استخدم الاختزالي بيثون السيناريو باستخدام الأمر [./Non-matching_sequences.py your_assembly.fasta BLAST_results.txt]. قبل تشغيل البرنامج النصي، تأكد من أن ملف الإخراج الانفجار في الشكل 6 (جداول). سيتم إخراج البرنامج النصي المسمى ملف مع تسلسل غير متطابق في تنسيق فاستا your_assembly.fasta_non-matching_sequences_BLAST_results.txt.fasta وأيضا مطابقة تسلسل السجلات، كما your_assembly.fasta_matching_sequences_BLAST_ results.txt.fasta-غير المطابقة الملفات ستكون الأكثر أهمية، كمصدر متواليات تي المحتملة للاختبار وكذلك دورات لعلم الجينوم الاختزالي.
- بعد الخطوة 3، تشغيل removeUnmapped.py البرنامج النصي بيثون أن تتخذ كمدخلات.sam من الخطوة 3-1، ويحدد أسماء سلاسل الاستعلام دون أية قراءات مطابقة وحفظها إلى ملف نصي جديد. استخدم الأمر [./removeUnmapped.py mapped.sam] وسوف يكون الإخراج mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt. (البرنامج سيقوم بإنشاء ملف سام مخفضة إلى أسفل مع كافة غير المعينة ما يلي: إزالة؛ هذا الملف يمكن تجاهلها لأغراض هذا البروتوكول، لكن قد يكون من المفيد للتحاليل الأخرى).
- كما ناتج الخطوة السابقة قائمة بأسماء التسلسل في ملف نصي يدعى mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt، استخراج ملف فاستا مع هذه التسلسلات: [./getContig.py your_assembly.fasta mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt]. سوف يكون الإخراج ملف يسمى mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt.fasta.
5-تصميم كبسولة تفجير للتسلسل الذي ما زال
ملاحظة: في هذه المرحلة هناك ملف فاستا يحتوي على تسلسل المرشح تي. يصف هذا القسم qPCR تجريبيا لاختبار ما إذا كانت تأتي من T أو من المناطق التي لم تكن معروفة من ر. إذا كان الطرح في الخطوة 4 إزالة كافة تسلسل، ثم لم الجمعية العامة الأولى لتشمل تي، أو الطرح قد تكون شديدة الصرامة.
- استخدام جينيوس21 لتحديد تسلسل التمهيدي الأمثل يدوياً.
- تسليط الضوء على تسلسل مرشح من 21-28 شركة بريتيش بتروليوم للتمهيدي إلى الأمام. تجنب تشغيل 4 أو أكثر من أي قاعدة. محاولة لاستهداف منطقة مع تركيبة موحدة إلى حد ما من جميع باسيبايرس. غ أو ج في نهاية 3 ' واحد مفيد، تساعد على ترسيخ التمهيدي.
- انقر فوق علامة التبويب إحصائيات في الجانب الأيسر من الشاشة لعرض تسلسل أن تقدر درجة حرارة ذوبان (Tm) كما هو تسليط الضوء على منطقة المرشح. نتطلع إلى الحصول على درجة حرارة انصهار بين 55-60 درجة مئوية، مع تجنب تكرار والمسافات الطويلة G/c.
- اتبع الخطوات 5.1.1. وتقع 5.1.2 الاختيار تمهيدي عكس، 150-250 قاعدة أزواج 3 ' من التمهيدي إلى الأمام. بينما لا تحتاج إلى تطابق أطوال التمهيدي، Tm المتوقعة ينبغي أن يكون أقرب ما يكون إلى Tm التمهيدي إلى الأمام. ومن المؤكد أن عكس تكملة التسلسل (إذا كان النقر بالزر الأيمن في جينيوس بينما يتم تمييز التسلسل خيار من قائمة).
- استخدم الدالة التصميم التمهيدي ، الذي تم العثور عليه في شريط الأدوات أعلى في إطار التسلسل.
- انقر فوق الزر تصميم التمهيدي . إدراج منطقة لتضخيم تحت المنطقة المستهدفة.
- ضمن علامة التبويب خصائص ، إدراج الحجم المطلوب ودرجة حرارة ذوبان (Tm) و % GC (راجع الخطوة 5.1.1.).
- انقر فوق موافق للإشعال التي تم إنشاؤها. ترتيب الإشعال من خلال خدمة اليغو مخصص.
- التحقق من صحة أجهزة الإشعال مع مراقبة الحمض النووي (ترميز T و R) لتحسين الخرائط المواضيعية وتمديد الوقت. استخدام بوليميراز العادية والتفريد جل لمعرفة حجم الفرقة، ولكن يمكن أيضا إجراء التحسين مع qPCR اتباع الأساليب الموجودة في الخطوة 6.
- جعل تخفيف X 10 كبسولة تفجير على حد سواء إلى الأمام أو عكس حيث يكون الإشعال تركيز 10 ميكرومترات.
- استخدام مزيج PCR ميكروليتر 0.5 من دنتب، ميكروليتر 0.5 من التمهيدي إلى الأمام، ميكروليتر 0.5 لعكس التمهيدي، ميكروليتر 0.1 من [تق] [بولمرس]، 2 ميكروليتر من قالب، ميكروليتر 0.75 من المغنيسيوم، 2.5 ميكروليتر من المخزن المؤقت و 18.15 ميكروليتر من المياه حيث أن هناك 25 ميكروليتر كل قالب بتركيز 5 نانوغرام/ ميكروليتر.
- اختبار الإشعال في درجات حرارة انصهار مختلفة في البرنامج PCR. عادة ما يكون الأداء الأمثل هو درجات الحرارة تذوب لوحظ أقل قليلاً من Tm المتوقعة في كبسولة تفجير، ولكن ليس عادة فوق 60 درجة مئوية. أيضا اختبار لتمديد الأمثل مرات باستخدام هذا الدليل: 1 دقيقة لكل 1000 شركة بريتيش بتروليوم (وهكذا عادة 10-30 ثانية تبعاً لطول amplicon).
- إجراء التفريد جل نقطة النهاية للتأكد من أن أجهزة الإشعال تضخيم التسلسل المتوقع. تشغيل 25 ميكروليتر من المنتج qPCR مختلطة مع 5 ميكروليتر من 6 × صبغ الجلسرين في تاي 2% [اغروس] هلام 200 الخامس لمدة 20 دقيقة.
6- قبكر التحقق من صحة تسلسل المتبقية
ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة الإشعال التحقق من صحتها وبكر الشروط المحددة في الخطوة 5.
- تشغيل كل قالب في ثلاث نسخ مع مزيج التالية؛ ميكروليتر 12.5 من مزيج الرئيسي الأخضر بوويرسيبر، ميكروليتر 0.5 من التمهيدي إلى الأمام مع تركيز 10 ميكرومترات، ميكروليتر 0.5 لعكس التمهيدي مع تركيز 10 ميكرومترات، ميكروليتر 10.5 من الماء وميكروليتر 1 قالب الحمض النووي (في تركيز من 2 نانوغرام/ميكروليتر) ، حيث يحتوي كل جيدا 25 ميكروليتر من الحجم الإجمالي.
- تشغيل برنامج qPCR أبلغ درجة الحرارة تم التحقق من صحتها وتمديد الوقت من الخطوة 4. نحن تصميم والتحقق من صحة جميع كبسولة تفجير ليكون متوافقاً مع دورة مرحلتين، 95 درجة مئوية لذوبان الأولى 10 دقيقة، ثم دورات 40 من 95 درجة مئوية عن 30 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. ومع ذلك، برنامج (تذوب-يصلب-تمديد) ثلاث مراحل قد تكون أكثر الأمثل للإشعال وينبغي تكييف إذا لزم الأمر. نوصي بأن إنشاء منحنيات يشوه النهائي على الأقل أول مرة يعملون الإشعال في qPCR للتحقق من صحة التضخيم من منتج واحد من الحمض النووي.
- إشارات قياس qPCR/سيبر الأخضر بالنسبة إلى أكتين (أو أي عنصر تحكم آخر مناسبة 'R') "قيراط ل" جميع الحالات حساب المتوسط والانحراف المعياري 2-(الجينات Ct-β-أكتين Ct).
- (اختياري) إجراء التفريد جل نقطة النهاية تأكيد الكشف عن حجم المنتج الصحيح بواسطة qPCR. وهنا تشغيل 25 ميكروليتر من المنتج qPCR مختلطة مع 5 ميكروليتر من 6 × صبغ الجلسرين في تاي 2% [اغروس] هلام 200 الخامس لمدة 20 دقيقة.
7- كرر مع إشارة جديدة إلى المعدلة إلى أسفل البيانات.
ملاحظة: إذا كانت الخطوة 6 التحقق من صحة تسلسل محدد من T، إنهاء دورة هنا (الشكل 2أ). ومع ذلك، قد حفز مجموعة متنوعة من الاعتبارات استمرارا للدورة، على سبيل المثال، إذا كان الكثير من البحث والتطوير متواليات تبقى في الملف أو إذا تم التحقق من صحة أية تسلسلات المرشح تي قبل qPCR في الخطوة 6.
- الحصول على مرجع جديد. هذه الخطوة تمكن لتكرار جديد للدورة، وقد تتضمن بيانات الجينوم الخام أو بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي خام أخرى مجموعات البيانات المجمعة. موارد قيمة للبيانات المرجعية وتشمل قاعدة بيانات الجينوم في المركز الوطني "معلومات التكنولوجيا الحيوية" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) المخازن التي جمعت جينومات الوصول عن طريق بروتوكول نقل الملفات (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)، ويتم تخزين "الجامع التعبير الجيني" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) حيث يقرأ الخام الجيل التالي تسلسل. قد توفر مشاريع الجينوم البيانات الخام تسلسل الخاصة بهم من خلال المواقع المرتبطة بالمشروع وقواعد البيانات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وسيكون ملف الإخراج بعد تشغيل الانفجار، قائمة بتسلسل من الاستعلام التي تتطابق مع قاعدة البيانات. بعد الطرح بيثون، عددا من المنظومات تسلسل سيتم الحصول عليها، واختبارها من قبل قبكر. وتناقش النتائج هذه، والخطوات المقبلة، أدناه.
سلبية النتيجة. هناك اثنين من النتائج السلبية الممكنة التي يمكن مشاهدتها بعد الانفجار إلى مرجع التسلسل. قد يكون هناك أية نتائج الانفجار، بمعنى أن تسلسل مجموع ليس لديه أي تسلسل مماثلة للمرجع. قد يكون هذا خطأ في تحديد التسلسل المرجع الصحيح لنموذج التسلسل. الاحتمال الآخر هو أن هناك لا تسلسل فريدة من نوعها في الجمعية بداية (كل ما هو مطروح بعيداً)، ولذلك يتم العثور على لا جينات للتسلسل للفائدة. تحقق من أين جاءت الإشارة والتأكد من أنه ليس من الأنسجة نفسها كالجمعية العامة الاستعلام.
بعد تصفية حسابية، قبكر قد تؤدي إلى نتيجة سلبية، للأمثلة انظر الشكل 3أ، 3، ج الذي هناك لم يكن فرق في الكشف عبر أنسجة الطيور. لوحات A خلال C هي الجينات الممثل من الطرح مختلف دورات، أي تكرارات دوافع إضافية دورة الاختزالي وتطوير الأسلوب (الشكل 2أ، 2).
نتيجة إيجابية- نتيجة إيجابية-تحديد تسلسل الهدف الحقيقي-ويتأكد عندما يظهر المجينية الحمض النووي قبكر الكشف عن أكبر إحصائيا في الأنسجة/عينة من الفائدة بالنسبة للمرجع (الشكل 3د). وبدأ المشروع مطروح في هذه الحالة مع تسلسل الحمض النووي الريبي من الأنسجة germline من الذكور والإناث الكبار زيبرا فينش، الحصول على 10 مليون زوجاً القراءة من كل جنس. للإيجاز، وسوف يصف لنا معالجة التسلسل المبيض فقط، الذي تم الحصول على محاضر 167,929 الجمعية حيثياته . تم استخدام أسلوب الجينوميات الاختزالي (بلاستن) للقضاء على أي تسلسل مطابقة12الجينوم جسدية المنشورة التي تركت 5,060 النصوص المقابلة إلى 598 البروتينات فريدة من نوعها، مشيراً إلى أن العديد من النصوص بفضله. سانجر يقرأ الخام المستخدمة لإنشاء الجمعية العامة ثم استخدمها للمستوى التالي من الطرح تبلاستن، مما أسفر عن البروتينات 78. يقرأ المرء الطرح الأخير أجرى باستخدام الحمض النووي الريبي-seq الخام من13الفصيص السمعية التي تركت ثمانية من البروتينات. عندما تم تشغيل هذه البروتينات عن طريق نكبي nr الانفجار، كان ستة من البروتينات الفيروسية، وكان منطقة متكررة في الطيور، وكان آخر α-الأداة التي germline مقيد7 (الشكل 2ب). وخلال هذه العملية، تم تحديد 935 الجينات الجسدية التي لم تدرج سابقا في التعليق التوضيحي الجينوم كله؛ عدة أظهرت التضخيم qPCR موحدة عبر الأنسجة (الشكل 3أ، 3، 3 ج). تم التحقق من صحة الجينات α-الأداة يكون الخط مقيد باستخدام قبكر، نظراً لأنه كان يستنفد في الأنسجة الجسدية بالنسبة للخصية الحمض النووي حيث كان حاضرا في المستويات التي تعادل أكتين (الشكل 3د).
ما يمكن أن تسوء. والمشكلة الرئيسية التي يجب التغلب عليها عند استخدام هذا الأسلوب هو ضمان أن يتم استخدام التسلسل المرجعي السليم. تغليف التسلسل إشارة أفضل، في أوسع معانيها، وتعقيد الجينوم الذي يتم تضمين تسلسل الفائدة (T). وهذا قد يعني أن تسلسل بأشكال مختلفة؛ الترنسكربيتوم، والجمعية العامة، والبيانات الخام، أو بيانات من دراسات متعددة بحاجة إلى استخدامها كمراجع (الشكل 1). في هذه الدراسة زيبرا فينش، قمنا بتطوير كبسولة تفجير من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي؛ بيد الإشعال لم تنجح دائماً بسبب وجود إينترونس بين أو داخل مواقع الربط التمهيدي في الحمض النووي. قمنا باختبار كل التمهيدي حددتها PCR قبالة الحمض النووي من الخصية الحمض النووي، الذي يشفر الهدف (T) والمرجع (R)، مما يجعل عنصر تحكم إيجابية مناسبة. فشل أول كتاب في هذه المرحلة يقتضي التصميم واختبار الإشعال الجديدة حتى يتم التعرف على مجموعة مناسبة. تطبيق المزالق القياسية من الأساليب المستندة إلى بكر: التضخيم الظروف يجب أن يكون الأمثل، أكدت خصوصية التضخيم باختبار و/أو الضوابط الاستنساخ، وقالب لا يجب أن تدرج في جميع التجارب. لمزيد من المعلومات حول فحوصات قبكر، راجع22.
الشكل 1 . يمكن إزالة النهج الاختزالي تكراري مراجع متعددة (R) لاسترداد فقط تسلسل الهدف الفائدة (T) من مجموع البيانات الجينومية. قد لا تتداخل في دقة هذه الطريقة تسلسل المرجعية للمشاريع الفردية وقد تشمل مجموعات البيانات المشار إليها لا في الشكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. أساليب البصرية. (أ) مطروح دورة التخطيطي. ويمكن تكراره الدورة عدة مرات حسب الحاجة، في كل مرة استخدام تسلسلات مرجعية متميزة، للحصول على أفضل النتائج. (ب) محددة مثال دورة الاختزالي للخطوات التي نفذت في بيدرمان et al. 7، مع الخطوات مرقمة كما هو الحال في ألف، ومع العدد من تسلسل المتبقي في كل مرحلة هو مبين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . بيانات المثال النتائج قبكر بما في ذلك نتائج سلبية وإيجابية. (أ) الجينوم الحمض النووي قبكر من CHD8، إلى نتائج سلبية. (ب (الجينوم الحمض النووي قبكر من DNMT1، إلى نتائج سلبية. (ج) جينوميك qPCR الحمض النووي من CHD7، إلى نتائج سلبية. (د) المجينية الحمض النووي qPCR نابغ، مما يؤكد وجود على وجه التحديد في عينات الخصية واستنفاد من الكبد والمبيض بالنسبة أكتين، إلى نتائج إيجابية. كل اللوحات تشير إلى متوسط +/--الانحراف المعياري للقياسات الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حين علم الجينوم الاختزالي قوية، ليس نهجاً قطع كعكة، التي تتطلب التخصيص في العديد من الخطوات الرئيسية، والاختيار الدقيق لتسلسل المرجعية وعينات الاختبار. تصفية الخطوات إذا كانت الجمعية العامة الاستعلام من نوعية رديئة، قد عزل التحف الجمعية فقط. ولذلك، من المهم أن دقة التحقق من الجمعية حيثياته استخدام بروتوكول المصادقة مناسبة للمشروع المحدد. وترد المبادئ التوجيهية للجيش الملكي النيبالي-seq، في موقع ترينيتي18 للحمض النووي، وأداة مثل يمكن استخدام ريبر23 . خطوة حاسمة أخرى عند استخدام الانفجار هو الاختيار المناسب ه-القيمة، التي ستحدد ما إذا كان سيتم الطرح استرخاء أو صارمة. ومع ذلك، يحدث انعكاس في الأسلوب: مباراة أكثر صرامة للإشارة إلى فعلا طرح أقل صرامة، كما لم يتم طرح تسلسلات غير مطابقة. ولذلك، ينبغي استخدام قيمة ه (أقل صرامة) أكبر في الانفجار لطرح أكثر صرامة. أن الخطوة الأساسية النهائية للبروتوكول هو مرجع التحديد. الإشارة لأكبر قدر من الكفاءة ينبغي أن يكون كاملا بقدر الإمكان؛ ومع ذلك، لا تحتاج إلى أن تكون مثالية لاختبار qPCR يؤكد ما إذا كان تسلسل المتبقية من T أو R، وما إذا كانت تصفية أكثر من الضروري. أثناء تنفيذ البروتوكول، قد تستعمل مراجع جديدة لزيادة أسفل الجينات للتحقق من صحتها. ونلاحظ أن في بعض الأحيان قد يتغير أسلوب مطابق: لمخطوطات آخر خطوة مطروح علينا تستخدم خوارزمية التحالف في تعيين ما يلي الخام على سلاسل الاستعلام، وتستخدم بيثون مخصصة لتحديد سلاسل الاستعلام مع مطابقة لا يقرأ (الشكل 2ب).
وتشمل القيود المفروضة على هذا الأسلوب توفر سلسلة مرجع. على سبيل المثال، ماير et al. تقييم المتقدرية جينوم هومينين جديدة؛ أنها تستخدم البشر ويَسْبِر دينيسوفان للقبض على الحمض النووي، الذي كان التسلسل وتعيينها إلى مرجع بشرية24. وفي هذه الحالة، لا توجد القائمة الجينوم النووي إشارة بيانات أن الباحثون يمكن أن يكون مطروحاً ضد الحصول على الجينوم المتقدرية، مما يستلزم قراءة-رسم خرائط استراتيجية بديلة24. سوف تضيع أي مناطق ابتعدت على نطاق واسع في ميتوكندريا الرواية بالنسبة إلى الإشارة المتقدرية البشرية من قراءة ورسم الخرائط. علم الجينوم الاختزالي يقدم نهجاً المنحازة لأقل من قراءة ورسم الخرائط لكن ليس دائماً تنطبق اعتماداً على السؤال البحثي، وفي هذه الحالة يمنع انخفاض مستويات الحمض النووي القديمة هذا النوع من التسلسل التغطية المطلوبة حيثياته الجمعية ( الخطوة 1 من علم الجينوم الاختزالي).
تنقية المادية يوفر طريقة بديلة أخرى للجينوم الاختزالي. تنقية الحمض النووي الريبي أو يستخدم غالباً في تسلسل كامل بلاستيدات الخضراء ومورثات الميتوكوندريا نظراً لأن هذه الجينوم أورجانيلار أصغر بكثير من الجينوم النووي25،26،،من2728. يمكن أن تكون بشرية وأخرى أصغر المتقدرية جينومات معزولة للتسلسل من خلال التضخيم باستخدام مجموعتين من التمهيدي، متبوعاً بتنقية25. ومع ذلك، الجينوميات الاختزالي قد تكون مفيدة للحالات التي تكون أكبر من المعتاد، مواقع الربط التمهيدي متباينة أو لن تسفر عن الجينوم الكامل الجينوم المتقدرية. مثال على هذا هو في سيلياتيس، التي تكون كبيرة ومتباينة، جينومات المتقدرية الخطي29. رسم خرائط الجينوم مرجع ليس خياراً قابلاً للتطبيق سيلياتيس بسبب تباين عالية عبر الأنواع وعدم هومولوجس حتى عبر جينوسيس30. باستخدام علم الجينوم الاختزالي، يمكن عزل جينوم المتقدرية سيلياتي وتحليلها مع التقليل من إمكانات الأجزاء المفقودة للجينوم. وبالمثل، بينما كان استخدام نهج الجمعية حيثياته في الجمعية الجينوم بلاستيدات الخضراء الراتينجيه Sitka، قراءة مقارنة ينطوي عليها سد الفجوة التعيين ضد التنوب الأبيض، يحتمل أن إدخال التحيز في هذه المواقع31.
تبعاً للمشروع، والجينوم الاختزالي قد توفر الوقت والتكلفة مزايا بالنسبة إلى تنقية أو تعيين نهج، حين تقدم أقل التحيز في عملية الاكتشاف. وفي بعض الحالات، لا يمكن تسلسل المستهدفة معزولة بسهولة لأنه غير معروف تماما، أمر حيوي لبقاء الخلية (الميتوكوندريا)، أو كبيرة جداً لفصل بالتفريد هلام القياسية. تنقية الغرواني الكهربي على أساس الحجم بطيئة وتتطلب مواد انطلاق هامة (والتي قد تكون باهظة الثمن) بينما تحسين الظروف على مدى عدة محاولات. هلام نبض الميدان التفريد (بفجي) يمكن الفصل بين أجزاء الحمض النووي ما يصل إلى 107 bp (10 ميغابايت) ولكن يأخذ 2-3 أيام، وكميات كبيرة من المواد، والمعدات المتخصصة في بعض الأحيان ليست متاحة تجارياً32. كان التسلسل الوحيد الذي كان معروفا من كروموسوم المقيدة بالفعل في بيدرمان et al.، كرر فضله7. كما هذا الكروموسوم هو الأكبر في الطيور، ما يزيد على 100 ميغا بايت في طول10، تنقية كان مستحيلاً؛ ولذلك كان علم الجينوم الاختزالي قادرة على القيام بما يمكن أساليب أخرى لا. في عصر الجينوم أنها كثيرا ما أرخص وأسرع لتسلسل الآن، وتصفية بواسطة الكمبيوتر في وقت لاحق. تمكين اكتشاف تسلسل الرواية تماما، علم الجينوم الاختزالي يستخدم مزيجاً من النهج لعزل تسلسل الرواية حتى بدون تسلسل مرجعية مثالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلفين تقر بيديرمان ميشيل، بيدرسن أليسا وسالدانها جيه كولين لمساعدتها في مشروع الجينوم زيبرا فينش في مراحل مختلفة. ونعترف أيضا بيسك يفغيني للحوسبة العنقودية نظام الإدارة والمعاهد الوطنية للصحة منحة 1K22CA184297 (على J.R.B.) والمعاهد الوطنية للصحة 042767 NS (إلى C.J.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accustart II Taq DNA Polymerase | Quanta Bio | 95141 | |
| Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST) | https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment | ||
| Bowtie 2 | https://www.python.org/download/releases/2.7/ | ||
| BWA-MEM v. 0.7.12 | https://github.com/BenLangmead/bowtie2 | ||
| Geneious | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | ||
| PEAR v. 0.9.6 | http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html | ||
| Personal Computer | Biomatters | http://www.geneious.com/ | |
| PowerSYBR qPCR mix | ThermoFisher | 4367659 | |
| Python v. 2.7 | https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/ | ||
| Reptile v.1.1 | https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile | ||
| Stratagene Mx3005P | Agilent Technologies | 401456 | |
| TransDecoder v. 3.0.1 | https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/ | ||
| Trinity v. 2.4.0 | https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki |
References
- Barh, D., et al. A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens. Chemical Biology & Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).
- Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B. Journal of Computer Science & Systems Biology. 2 (5), (2009).
- Kaur, N., et al. Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB. Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).
- Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi. Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).
- Epstein, J. H., et al. Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh. PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).
- Kapoor, A., et al. Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses. MBio. 4 (2), (2013).
- Biederman, M. K., et al. Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata. Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).
- Readhead, B., et al. Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus. Neuron. 99, 1-19 (2018).
- Carroll, D., et al. The global virome project. Science. 359 (6378), 872-874 (2016).
- Pigozzi, M. I., Solari, A. J. Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata. Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).
- Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch. Chromosoma. 118, 527-536 (2009).
- Warren, W. C., et al. The genome of a songbird. Nature. 464, 757-762 (2010).
- Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines. Genomics. 100, 363-369 (2012).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).
- Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. Reptile: representative tiling for short read error correction. Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).
- MacManes, M. D., Eisen, M. B. Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads. PeerJ. 1 (113), (2013).
- Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
- Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv. , (2013).
- Langmead, B., Salzberg, S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
- Kearse, M., et al. Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. Quantitative polymerase chain reaction. Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).
- Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation. Genome Biology. 14 (5), (2013).
- Meyer, M., et al. A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos. Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).
- Gunnarsdóttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines. Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).
- King, J. L., et al. High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq. Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).
- Yao, X., et al. The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis. Plos One. 10 (6), (2015).
- Zhang, Y., et al. The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Swart, E. C., et al. The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome. Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).
- Barth, D., Berendonk, T. U. The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium. BMC Genomics. 12 (1), (2011).
- Coombe, L., et al. Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data. Plos One. 11 (9), (2016).
- Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. Pulsed-field gel electrophoresis. Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).
