ميكروفلويديكس التواصل مع صفائف ميكروليكترودي لدراسة الاتصالات العصبية ونشر إشارة محواري
Summary
ويهدف هذا البروتوكول لشرح كيفية الجمع في المختبر ميكروليكترودي صفائف أجهزة موائع جزيئية لدراسة انتقال إمكانات العمل في الثقافات العصبية. تحليل البيانات، إلا وهي كشف وتوصيف للترويج لإمكانات العمل، يتم تنفيذه باستخدام جديدة متقدمة، بعد سهلة الاستخدام ومتاحة بحرية، أداة حسابية.
Abstract
ميكروليكترودي صفائف (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) تستخدم على نطاق واسع لدراسة وظيفة الخلايا العصبية في المختبر. تسمح هذه الأجهزة المتزامنة تسجيل غير الغازية/حفز النشاط الكهربية لفترات طويلة. ومع ذلك، يمكن أن تصبح خاصية الاستشعار من الإشارات من جميع المصادر حول كل ميكروليكترودي غير المواتية عند محاولة فهم الاتصال وإشارة الدعوة في الدوائر العصبية. في شبكة الخلايا العصبية، الخلايا العصبية عدة يمكن تفعيلها في نفس الوقت ويمكن أن تولد إمكانات العمل المتداخلة، مما يجعل من الصعب تمييز وتتبع انتشار الإشارات. ونظرا لهذا القيد، وقد أنشأنا إعداد في المختبر تركز على تقييم الاتصالات الكهربية، التي قادرة على عزل وتضخيم الإشارات محواري مع عالية الدقة المكانية والزمانية. بربط أجهزة موائع جزيئية والاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، نحن قادرون على تقسيم الخلايا العصبية الثقافات مع محاذاة التي تسيطر عليها جيدا لمحاور عصبية وميكروليكتروديس. يسمح هذا الإعداد تسجيلات لإكثار ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية على مدى عدة أسابيع. جنبا إلى جنب مع خوارزميات تحليل البيانات المتخصصة، وهو يوفر الكمي مفصلة للاتصالات عدة تتعلق بخصائص مثل سرعة النشر، فشل التوصيل، ومعدل إطلاق النار، التموج anterograde، والترميز الآليات.
هذا البروتوكول يوضح كيفية إنشاء إعداد ثقافة العصبية مجزأة على الركازة المتكاملة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وكيفية الثقافة الخلايا العصبية في هذا الإعداد، وكيفية نجاح تسجيل وتحليل وتفسير النتائج من هذه التجارب. هنا، نحن إظهار كيف يبسط الإعداد الثابتة فهم الاتصالات العصبية ونشر إشارة محواري. هذه المنصات تمهد الطريق لنماذج في المختبر جديدة مع تصاميم شبكة الخلايا العصبية هندسيا والسيطرة عليها. يمكن استخدامها في سياق الثقافات العصبية متجانسة، أو مع تكوينات ثقافة المشارك فيها، على سبيل المثال، الاتصال بين الخلايا العصبية الحسية وأنواع الخلايا الأخرى هو رصد وتقييم. يوفر هذا الإعداد ظروف مثيرة جداً للاهتمام للدراسة، على سبيل المثال، النماء العصبي، الدوائر العصبية، والترميز، ونهج نيوروديجينيريشن ونيوروريجينيريشن من المعلومات.
Introduction
فهم الاتصالات الكهربائية في الدوائر العصبية خطوة أساسية الكشف عن وظيفة طبيعية، ووضع استراتيجيات علاجية لمعالجة الخلل. دمج الخلايا العصبية وحساب وترحيل إمكانات العمل (الجزائرية) التي تنتشر على طول محاور عصبية رقيقة على. التقنيات الكهربية التقليدية (مثلاً، تصحيح المشبك) هي تقنيات قوية لدراسة نشاط الخلايا العصبية ولكن غالباً ما تكون محدودة للهياكل الخلوية أكبر، مثل سوما أو dendrites. تقنيات التصوير توفر بديلاً لدراسة الإشارات محواري مع عالية الدقة المكانية، ولكنها صعبة من الناحية الفنية لأداء وعدم السماح بالقياسات الطويلة الأجل1. وفي هذا السياق، يمكن الجمع بين ميكروليكترودي صفائف (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) وميكروفلويديكس مساهمة قوية في الكشف عن الخصائص الأساسية لانتقال النشاط وإشارة neuron´s داخل الشبكات العصبية في المختبر2 , 3.
تكنولوجيا شركة طيران الشرق الأوسط تعتمد على التسجيلات خارج الخلية من الخلايا العصبية الثقافات. المزايا الرئيسية لهذه المنهجية الكهربية هي قدرته على دعم التحفيز الفورية وطويلة الأجل وتسجيل في مواقع متعددة وفي طريقة غير الغازية3. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مصنوعة من ميكروليكتروديس موصلة ومقاومة للتآكل متوافق حيويا، وارتفاع جزءا لا يتجزأ من الركازة رقاقة زجاج. متوافقة مع الخلية التقليدية الثقافة الأحيائية-الطلاء التي عن طريق تعزيز التصاق الخلايا إلى حد كبير زيادة مقاومة الختم بين الركيزة والخلايا3،4. وعلاوة على ذلك، فهي تنوعاً في التصميم وقد تختلف في حجمها ميكرويليكتروديس والهندسة والكثافة. إجمالاً، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف العمل كخلية التقليدية الثقافة السفن مع ميزة السماح المتزامنة العيش-التصوير والكهربية التسجيلات/التحفيز.
استخدام تكنولوجيا شركة طيران الشرق الأوسط ساهمت دراسة الميزات الهامة للشبكات العصبية5. ومع ذلك، هناك ميزات المتأصلة التي تحد من الأداء للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لدراسة الاتصالات ونشر وكالة الأنباء الجزائرية في دائرة العصبية. تمكين تسجيلات من الخلايا المفردة وهياكل حتى سوبسيلولار مثل محاور عصبية من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، ولكن إذا ما قورنت بإشارات سمال، إشارات محواري لديها نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة جداً (الاستخبارات)6. وعلاوة على ذلك، يعوق خاصية الاستشعار عن إمكانات الحقل خارج الخلية من جميع المصادر حول كل ميكروليكترودي تتبع انتشار الإشارات في دائرة العصبية.
قد أظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا، بيد أن ظروف تسجيل أفضل يتحقق قبل وبعد ميكروليكتروديس محاذاة حدود ميكروتشانيلس الضيقة التي يمكن أن تنمو محاور عصبية. يوفر هذا التكوين زيادة كبيرة في دائرة الاستخبارات الوطنية أن نشر إشارات محواري يمكن بسهولة اكتشاف7،،من89،10،،،من1112 13. استراتيجية يتحالف أجهزة موائع جزيئية مع تكنولوجيا طيران الشرق الأوسط يخلق المكروية معزولة كهربائياً مناسبة لتضخيم الإشارات محواري11. وعلاوة على ذلك، وجود ميكروليكتروديس الاستشعار متعددة على طول ميكروجروفي شرطا أساسيا لكشف وتوصيف لإكثار إشارة محواري.
يمكن تكييفها للعديد من الأسئلة البحثية14هذه المنصات في المختبر مع تصاميم شبكة الخلايا العصبية يمكن السيطرة عليها بشدة. هذه المنابر هي مناسبة لاستخدامها في سياق الثقافات الخلايا العصبية ولكن يمكن توسيعها لمهندس تكوينات الثقافة المشتركة، حيث يمكن رصد وتقييم الاتصال بين الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى. وهكذا يوفر هذا الإعداد ظروف مثيرة جداً للاهتمام لاستكشاف عدد من الدراسات المتصلة بالعصبية مثل النماء العصبي ودوائر الخلايا العصبية وترميز المعلومات، نيوروديجينيريشن ونيوروريجينيريشن. وعلاوة على ذلك، الاقتران مع النماذج الناشئة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent15،16 يمكن فتح سبل جديدة في تطوير العلاجات المحتملة للبشرية من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي.
لدينا مختبر باستخدام منصة هذا الجمع بين ميكروليكتروديس ميكروفلويديكس (µEF) لفهم العمليات العصبية على المستوى الخلوي وشبكة الاتصال وأثرها في الفيزيائية-والجهاز العصبي باثولوجي. ونظرا لقيمة هذه المنصة في ميدان علم الأعصاب، والغرض من هذا البروتوكول لشرح كيفية إنشاء ثقافة العصبية مجزأة على الركازة المتكاملة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، كيف يمكن لثقافة العصبية في هذا النظام الأساسي، وكيفية تسجيل بنجاح، تحليل وتفسير النتائج من هذه التجارب. التأكيد ستثري هذا البروتوكول الأدوات التجريبية للثقافات العصبية في الدراسة للاتصالات العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية تجميع µEF، وتتألف من جهاز موائع جزيئية وشركة طيران الشرق الأوسط مع التصاميم الموحدة المتاحة تجارياً، وكيفية تحليل البيانات المسجلة.
عند تصميم تجربة، أن الباحثين يجب أن تراعي أنه محدود النموذجي في المختبر بالشبكة الثابتة اتفاق بيئي م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومولت هذا العمل FEDER-الصناديق Fundo يوروبيو للتنمية الإقليمية من خلال المنافسة عام 2020–برنامج أوبيراسيونال للقدرة التنافسية، وتدويل (المراسلة)، البرتغال عام 2020، والبرتغالية تمول عن طريق إقليم العاصمة الاتحادية-مؤسسة الفقرة أ Ciência ه تكنولوجيا/الهنود دا Ciência، ه تكنولوجيا متفوقة إنسينو في إطار المشروع يبحث/CTM-نان/3146/2014 (برنامج التعليم بالمراسلة-01-0145-فدر-016623). وأيد خوسيه ج ماتيوس إقليم العاصمة الاتحادية (PD/BD/135491/2018). باولو أغيار أيده Ciência Programa-Programa أوبيراسيونال الصلاحية البشرية (POPH)-تعزيز العمالة العلمية والتربوية ومكتيس والبرنامج إينفيستيجادور إقليم العاصمة الاتحادية، POPH و Fundo يوروبيو الاجتماعية. كانت ملفقة أجهزة موائع جزيئية في إينيسك-مايكروسيستمز، وتكنولوجيات النانو، البرتغال، تحت إشراف جواو بيدرو كوندي وتشو فرجينيا.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
