Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering
Summary
Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.
Abstract
Micro-elektrode matrices (MEA’s) worden veel gebruikt om neuronale functie in vitrote studeren. Deze apparaten kunnen gelijktijdige niet-invasieve opname/stimulatie van elektrofysiologische activiteit voor lange periodes. Echter kan de eigenschap van sensing signalen van alle bronnen rond elke micro-elektrode ongunstige worden, wanneer het proberen te begrijpen van de communicatie en signaal doorgeven in neuronale schakelingen. In een neuronale netwerk, verschillende neuronen kunnen gelijktijdig worden geactiveerd en overlappende actie potentieel, waardoor het moeilijk te discrimineren en bijhouden van het doorgeven van het signaal kunnen genereren. Gezien deze beperking, hebben we een in vitro opstelling gericht op de beoordeling van elektrofysiologische mededeling, die in staat te isoleren en versterken van axonale signalen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie is opgericht. Door interfacing microfluidic apparaten en multilaterale milieu-akkoorden, kunnen we gecompartimenteerd neuronale culturen met een goed gecontroleerde aanpassing van de axonen en microelectrodes. Deze setup kunt opnames van spike vermeerdering met een hoge signaal-/ ruisverhouding in de loop van enkele weken. Gecombineerd met gespecialiseerde data analyse algoritmen, het biedt gedetailleerde kwantificering van verscheidene communicatie gerelateerde eigenschappen zoals propagatie snelheid geleiding mislukking, vuren tarief, anterograde spikes, en mechanismen te coderen.
Dit protocol laat zien hoe maak je een verzuilde neuronale cultuur setup over substraat-geïntegreerd MEAs, hoe cultuur neuronen in deze setup, en hoe succesvol opnemen, analyseren en interpreteren van de resultaten van dergelijke experimenten. Hier, laten we zien hoe de gevestigde setup vereenvoudigt het begrip van neuronale communicatie en axonale signaal doorgeven. Deze platformen de weg vrijmaken voor nieuwe in vitro modellen met gemanipuleerde en controleerbare neuronale netwerk topografieën. Ze kunnen worden gebruikt in het kader van homogene neuronale culturen, of met co cultuur configuraties waar, bijvoorbeeld, communicatie tussen de sensorische neuronen en andere celtypes wordt gecontroleerd en beoordeeld. Deze instelling biedt zeer interessante voorwaarden om te studeren, bijvoorbeeld, neurologische, neuronale circuits, codering, neurodegeneratie en neuroregeneration benaderingen informatie.
Introduction
Inzicht elektrische communicatie in neuronale circuit is een fundamentele stap te onthullen van de normale functie, opstellen van therapeutische strategieën om aan te pakken van de disfunctie. Neuronen integreren, berekenen en Relais actie potentials (APs) die langs hun dunne axonen propageren. Traditionele elektrofysiologische technieken (bijvoorbeeld patch klem) krachtige technieken te bestuderen van neuronale activiteit zijn maar zijn vaak beperkt tot de grotere cellulaire structuren, zoals het soma of de dendrites. Imaging technieken bieden een alternatief om te bestuderen van axonale signalen met hoge ruimtelijke resolutie, maar ze zijn technisch moeilijk te voeren en op lange termijn metingen1niet toegestaan. In dit verband kan de combinatie van micro-elektrode arrays (MEA’s) en microfluidics maken een krachtige bijdrage in het vrijgeven van de fundamentele eigenschappen van neuron´s activiteit en signaal transmissie binnen neuronale netwerken in vitro2 , 3.
MEA technologie is gebaseerd op extracellulaire opnames van neuronale culturen. De belangrijkste voordelen van deze elektrofysiologische methodologie zijn de mogelijkheid om op lange termijn, gelijktijdige stimulatie en opname op meerdere plaatsen en in een niet-invasieve manier3te ondersteunen. MEA’s zijn gemaakt van biocompatibel, hoge geleidend en corrosiebestendige microelectrodes ingebed in een glas wafer substraat. Ze zijn compatibel met conventionele cel cultuur bio-coatings, die door het bevorderen van cel adhesie aanzienlijk verhogen van de verzegeling weerstand tussen de ondergrond en cellen3,–4. Bovendien, ze zijn veelzijdig in design en kunnen variëren in grootte van de microelectrodes, de meetkunde en de dichtheid. Globaal, multilaterale milieuovereenkomsten werken als conventionele cel kweekvat met het voordeel van het toestaan van gelijktijdige live-imaging en elektrofysiologische opnames/stimulatie.
Het gebruik van MEA technologie heeft bijgedragen aan de studie van belangrijke kenmerken van neurale netwerken5. Echter, er zijn inherente functies die de prestaties van multilaterale milieu-akkoorden voor het bestuderen van de mededeling en APs vermeerdering in een neuronale circuit beperken. MEA’s inschakelen opnames van afzonderlijke cellen en zelfs subcellular structuren zoals axonen, maar in vergelijking met somal signalen, axonale signalen hebben een zeer lage signaal-ruisverhouding (SNR)6. Bovendien belemmert het kenmerk van extracellulaire veld potentieel uit alle bronnen rond elke micro-elektrode sensing het volgen van signaal doorgeven in een neuronale circuit.
Recente studies hebben echter aangetoond dat betere opname omstandigheden kunnen worden bereikt door het hebben van de microelectrodes uitgelijnd binnen smalle microchannels waarin axonen kunnen groeien. Deze configuratie biedt dat een aanzienlijke toename van de SNR zodanig dat teeltmateriaal van axonale signalen kan gemakkelijk worden gedetecteerd7,8,9,10,11,,12, 13. De strategie van het Bondgenootschap microfluidic apparaten met MEA-technologie creëert een elektrisch geïsoleerde communicatie geschikt voor het versterken van axonale signalen11. Bovendien is de aanwezigheid van meerdere sensing microelectrodes langs een microgroove is fundamenteel voor de detectie en karakterisatie van axonale signaal doorgeven.
Dergelijke platforms in vitro met zeer controleerbaar neuronale netwerk topografieën kunnen worden aangepast aan vele onderzoek vragen14. Deze platforms zijn geschikt om te worden gebruikt in het kader van neuronale culturen maar ingenieur co cultuur configuraties, waar de communicatie tussen de neuronen en andere celtypes kan worden gecontroleerd en beoordeeld kunnen worden uitgebreid. Deze opstelling biedt dus zeer interessante voorwaarden om te verkennen van een aantal neurale-gerelateerde studies zoals neurologische, neuronale circuits, codering van informatie, neurodegeneratie en neuroregeneration. Bovendien kan de combinatie met opkomende modellen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen15,16 nieuwe wegen openen in de ontwikkeling van mogelijke therapieën voor ziekten bij de mens dat invloed op het zenuwstelsel.
Ons lab is het gebruik van dit platform combineren microelectrodes met microfluidics (µEF) te begrijpen van de neuronale processen op cellulair en netwerk niveau en hun betrokkenheid bij de fysio- en pathologische zenuwstelsel. Gezien de waarde van dergelijke platform op het gebied van de neurowetenschappen, het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe maak je een verzuilde neuronale cultuur over substraat-geïntegreerd MEAs, hoe cultuur neuronen in dit platform en hoe succesvol opnemen, analyseren en interpreteren van de resultaten van dergelijke experimenten. Dit protocol zal zeker de experimentele toolbox voor neuronale culturen in de studie van de mededeling van de neurale verrijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol ziet hoe te monteren van een µEF, samengesteld uit een microfluidic-apparaat en een MEA met standaard verkrijgbare designs, en hoe om de opgenomen gegevens te analyseren.
Bij het ontwerpen van een experiment, moeten onderzoekers rekening houden dat de in vitro -model wordt beperkt door de MEA vast raster, die microgroove regelingen bedwingt. Het gebruik van een bepaalde microfluidic of MEA ontwerp zal afhangen van de specifieke experimentele behoeften…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door FEDER – Fundo Europeu de Desenvolvimento regionale fondsen door middel van de COMPETE 2020 – Operacional-programma voor concurrentievermogen en internationalisering (POCI), Portugal-2020, en door Portugezen financiert door FCT – Fundação para Ciência l a g e een Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in het kader van het project PDTC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus werd gesteund door FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar werd gesteund door Programa Ciência – Programa Operacional Potencial Humano (POPH) – bevordering van wetenschappelijke werkgelegenheid, ESF en MCTES en programma Investigador FCT, POPH en Fundo sociale Europeu. De apparaten van de microfluidic werden vervaardigd op INESC – Microsystems en nanotechnologieën, Portugal, onder toezicht van João Pedro Conde en Virginia Chu.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
