Summary
يتم استخدام أسلوب أوتوراديوجرافي بشكل روتيني لدراسة ملزمة راديوليجاندس إلى أقسام الأنسجة لتحديد الأدوية النوعية أو الكمية.
Abstract
في المختبر autoradiography يهدف إلى تصور توزيع تشريحية من بروتين فائدة في الأنسجة من الحيوانات التجريبية، فضلا عن البشر. ويستند الأسلوب ملزمة محددة من راديوليجاند إلى هدفها البيولوجية. لذلك، أقسام الأنسجة المجمدة هي المحتضنة مع راديوليجاند الحل والربط إلى الهدف بعد ذلك مترجمة قبل الكشف عن تسوس المشعة، على سبيل المثال، باستخدام فيلم حساس أو فوسفور imaging لوحات. عرض أوتوراديوجرامس الرقمية الناتجة عن القرار المكانية الرائع، الذي يتيح للقياس الكمي والتعريب لربط راديوليجاند في هياكل تشريحية متميزة. وعلاوة على ذلك، يسمح التحديد الكمي لتوصيف الدوائية ليجند تقارب عن طريق الانفصال من الثوابت (كد)، الثوابت تثبيط (كأنا)، فضلا عن كثافة مواقع الربط (بكحد أقصى) في الأنسجة المحددة. وهكذا، الأسلوب يوفر معلومات حول هدف التعريب ويجند الانتقائية. هنا، يتمثل الأسلوب مع الوصف أوتوراديوجرافيك من حمض عالية تقارب γ-هيدروكسيبيوتريك (GHB) مواقع في أنسجة المخ الثدييات، مع التركيز بوجه خاص على اعتبارات منهجية فيما يتعلق بمقايسة الربط الربط معلمات، الاختيار في راديوليجاند وطريقة الكشف.
Introduction
أوتوراديوجرافي الطريقة التي توفر صوراً اضمحلال الإشعاعي. يتم استخدام التقنية بشكل روتيني لدراسة توزيع الأنسجة من البروتين من الفائدة في المختبر يقوم على تفاعل معينة الدوائي بين مجمع راديولابيليد وهدفها. وهذا يوفر معلومات مباشرة حول الانتقائية ليجند للهدف. ويمكن أيضا استخدام أوتوراديوجرافي في المختبر لتحديد الكمية من معلمات الربط الدوائي من راديوليجاندس، مثل ثابت التفكك (كد) وكثافة من مواقع الربط (بكحد أقصى)، وكذلك لتحديد تثبيط الثابت (Ki)1،يغاندس المتنافسة2. بالمقارنة مع الربط راديوليجاند هوموجيناتي التقليدية، قد أوتوراديوجرافي بميزة القدرة على تصور التشريح المكانية وتفاصيل مقتضبة عن أنماط التعبير الإقليمي3. ولذلك طريقة autoradiography بديل ذات صلة إلى إيمونوسيتوتشيميستري، لا سيما في حالة عدم وجود جسم تم التحقق من صحتها. Autoradiography وينفذ بسهولة في مختبر النظائر المشعة قياسية نظراً لتوافر راديوليجاند مناسبة مع خصوصية الدوائية المطلوبة، الوصول إلى كريوستات مبضع إعداد أقسام الأنسجة، وتصوير مناسبة جهاز قادر على تحليل توزيع النشاط الإشعاعي في أقسام الأنسجة الخاصة بكل منها. جدير بالذكر أن معيار تحديد مهم راديوليجاند كمية محدودة من الربط بالمواقع غير المستهدفة. هذا يمكن أن يكون للبروتينات، الأغشية أو مواد مثل البلاستيك أو عوامل أخرى، وهو يشار إليها باسم الربط غير محددة. عادة، غير محددة ملزمة غير ستثربل لكن يمكن أن تكون ستثربل إذا كان ذلك ينطوي على بروتين خارج الهدف محدد. أفضل طريقة للتحقق من صحة ملزمة محددة الحقيقية مقارنة بالانسجة التي تفتقر إلى الهدف، مثلاً، وراثيا هندسة الأنسجة (المغلوب)4.
هنا، يوضح المنهجية مع وصف الموقع عالية تقارب ملزمة لحمض هيدروكسيبيوتريك γ (GHB) في الدماغ الثدييات أوتوراديوجرافيك. فهم التفاعل الدوائي بين GHB وموقعها ملزمة صلة GHB دواء سريرياً مفيدة في علاج الخدار وإدمان الكحول5، ولكن أيضا مكوناً طبيعية من الدماغ الثدييات وترفيهية 6من المخدرات. ووصفت مواقع الربط GHB عالية تقارب أولاً استخدام [ح]3[GHB ملزمة للفئران الدماغ هوموجيناتي7. على مر السنوات، مواصلة الدراسات أوتوراديوجرافي مع [ح]3[GHB والتماثلية [ح]3[قد أظهرت سي إس-382 بكثافة عالية لربط مواقع في مناطق فوريبرين من الفئران8،9،10،9 من الماوس ، خنزير الدماغ11والإنسان القرد12. ومع ذلك، ظلت هوية الجزيئية وأهميتها الفنية الدقيقة من مواقع الربط هذه بعيد المنال.
ووضعت مع نية لزيادة تمييز مواقع الربط، وتيسيرا لدراسات عن دور GHB الفسيولوجية، راديوليجاندس متعددة تتضمن نظائر مختلفة تتمتع بمختلف الانتماءات ([ح]3[GHB، [3 ح] سي إس-382، [ح]3[هوكبكا و [125أنا] بنوف-GHB)14،13،،من1516(استعرض في17) (الشكل 1). تركيبة انتقائية عالية تقارب راديوليجاندس وكثافة أنسجة عالية جداً لربط مواقع قد سمحت لإنتاج صور عالية الجودة باستخدام الفوسفور التصوير تقنية9،11. جنبا إلى جنب مع موجز للنقاط العملية في إعداد تجربة أوتوراديوجرافيك ومثالا لتجسيد التفاصيل، سيركز القسم مناقشة ط) اختيار النويدات المشعة، وثانيا) اختيار شروط المقايسة، والثالث) استخدام الفوسفور لوحات التصوير مقابل فيلم الأشعة السينية. والهدف العام من هذه الورقة تقديم التفاصيل التقنية والمنهجية والعلمية على تقنية أوتوراديوجرافي لإعلام حول توزيع الأنسجة وتحليل الأهداف البروتين الدوائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجرى جميع الحيوانات التعامل مع امتثالا للمبادئ التوجيهية من "الحيوان الدنماركي التجريب المفتشية".
ملاحظة: بروتوكول وصف هنا تغطي إعداد الأنسجة (أيأنسجة المخ الماوس)، في المختبر أوتوراديوجرافيك المقايسة بتفصيل كاف لإعداد الأسلوب في مختبر جديد، والتعرض فوسفور imaging لوحات، وكذلك تحليل دينسيتوميتريك اللاحقة من أوتوراديوجرامس (الشكل 2) بهدف إضفاء الطابع المحلي والتحديد الكمي لربط راديوليجاند في هياكل تشريحية متميزة. لمقارنة النسيجي، يرد بروتوكول لتلطيخ كريسيل البنفسجي. وعلاوة على ذلك، تحديد الربط غير محددة مع يجند متنافسة يندرج في إطار البروتوكول. للحصول على وصف مفصل في كيفية تحديد كد، بكحد أقصى أو كأنا، انظر المنشور السابق4.
1-الأنسجة إعداد كريوسيكتيونينج
- Euthanize الماوس بخلع عنق الرحم وتشريح فورا خارج الدماغ باستخدام مقص وملقط. مباشرة المضي قدما إلى الخطوة التالية لتجنب تلف الأنسجة.
- الأداة الإضافية-تجميد الأنسجة بغمر في مسحوق الثلج الجاف وغاز CO2 أو إيسوبينتاني. نقل الأنسجة المجمدة مباشرة إلى كريوستات مع درجة حرارة تعيين إلى-20 درجة مئوية. وبدلاً من ذلك، تخزين الأنسجة في-80 درجة مئوية حتى التجهيز.
ملاحظة: تجنب المتكررة من ذوبان الجليد/تجميد للحد من تلف الأنسجة. - واسمحوا الأنسجة تأقلم إلى-20 درجة مئوية في كريوستات لمدة 20 دقيقة قبل إجراء مزيد من المعالجة لتجنب تمزيق النسيج.
- تغطية حامل مناديل مع تضمين المتوسطة خارج كريوستات ومكان العينة الأنسجة المجمدة بسرعة في الاتجاه المرغوب فيه بينما لا يزال السائل المتوسطة التضمين. على سبيل المثال، ضع الدماغ الفأرة رأسياً على المخيخ بغية تحقيق الأقسام الاكليلية روسترال. نقل حامل مناديل مرة أخرى إلى كريوستات وفضح المتوسطة التضمين لدرجات حرارة أدناه-10 درجة مئوية لتصلّب.
ملاحظة: ينبغي أن تكون مغلفة عينات الأنسجة الهشة في تضمين المتوسطة ضمن قوالب الأنسجة قبل تصاعد. - موقف حامل مناديل في مبضع كريوستات. ضبط اتجاه الأنسجة لتجنب الفروع المائلة.
- قطع الأنسجة، بالتوجيه من أطلس ستيريوتاكسيك18 في أقسام من السمك المطلوب (12 ميكرومتر الموصى [ح]3[المسمى يغاندس). بدقة تصويب وتتكشف المقطع مع فرشاة صغيرة الحجم إذا لزم الأمر وذوبان الجليد-جبل المقطع إلى شريحة مجهر. تسلسلياً جمع الأجزاء من منطقة أهمية بالنسبة للنسخ المتماثل التقنية المطلوبة (مثلاً، 4 أقسام كل شريحة).
- السماح بالمقاطع في أن أيردري ح 1 قبل مواصلة التعامل مع الشرائح.
ملاحظة: إضافة المواد المجففة إلى الشريحة مربعات يقلل الرطوبة بناء على مقاطع الأنسجة. بروكوتول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا عن طريق تخزين المقاطع الطويلة الأجل في الشريحة مربعات في-80 درجة مئوية.
2. في المختبر أوتوراديوجرافي
تنبيه: النشاط الإشعاعي. ويعمل في أحد مختبرات معتمدة وفقا للوائح المحلية. ارتداء الملابس الواقية. التصرف وفقا تسوس المشعة أو الاستعانة بمصادر خارجية لشركة معتمدة.
- ذوبان الجليد الفروع لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتسمية الشرائح مع الظروف التجريبية. استخدام قلم رصاص لأنه سوف حمم الشرائح في الإيثانول خلال تلطيخ اللاحقة.
- ضع الشرائح أفقياً في علب بلاستيكية.
ملاحظة: تحديد المواقع الشرائح على منصة مرتفعة داخل علب بلاستيكية يسهل تعاملها. - قبل إينكوباتي المقاطع التي شنت على الشرائح الموجودة في المخزن المؤقت للمقايسة تتكيف المستهدفة في السؤال (ليستخدم بروتوكول GHB، 50 مم خبو4 المخزن المؤقت pH 6.0) بعناية تطبيق وحدة تخزين مناسبة على الشريحة (700 ميليلتر للمقاطع الاكليلية القوارض 3-4).
ملاحظة: تأكد من أن كل قسم مغطى تماما بالسائل.- وتغطي في علب بلاستيكية بغطاء من أجل تجنب التبخر واحتضان مسبقاً في درجة حرارة ذات الصلة (للبروتوكول GHB إينكوباتي مسبقاً لمدة 30 دقيقة في RT) تحت لطيف المستمر (20 لفة في الدقيقة) تهتز على شاكر لوحة.
- لتحديد ربط غير محددة، الملحق العازلة المقايسة مع تركيز المجمع غير موسومة (للبروتوكول GHB، 1 مم GHB) ذات الصلة.
ملاحظة: قد لا تكون الحضانة قبل اللازمة.
- من أجل إيقاف السائل ما قبل الاحتضان من كل شريحة ونقل الشرائح إلى علبة بلاستيكية.
- لتجنب الجفاف، فورا احتضان الفروع مع تركيز راديوليجاند في المخزن المؤقت للفحص تحت الشروط المطلوبة ذات الصلة (للبروتوكول GHB، 1 نانومتر [ح]3[هوكبكا ح 1 في RT) التي تغطي الأجزاء تماما مع راديوليجاند الحل (700 ميليلتر للمقاطع الاكليلية القوارض 3-4).
- احتضان تحت ظل لطيف المستمر (20 لفة في الدقيقة) تهتز من علب بلاستيكية مع غطاء مغلق.
ملاحظة: يمكن التحقق من أن تركيز راديوليجاند عن طريق العد قاسمة في عداد التﻷلؤ سائل.
- احتضان تحت ظل لطيف المستمر (20 لفة في الدقيقة) تهتز من علب بلاستيكية مع غطاء مغلق.
- إزالة الحل الحضانة بصب قبالة السائل ونقل الشرائح إلى رف شريحة مجهر. ينتقل فورا إلى الخطوة التالية لتجنب الجفاف القسم.
- يغسل الشرائح. لبروتوكول GHB وتغسل بمقايسة المثلج المخزن المؤقت مرتين ل 20 ثانية وشطف ثم مرتين بغمس حامل الشرائح في الصواني مليئة بالماء المقطر المثلج لإزالة الأملاح. ضع الشرائح عمودياً في رفوف للتجفيف على الأقل 1 ح في الرايت أو مجموعة الشرائح لمدة 5 دقائق مع منفاخ الجافة لدرجات الحرارة الباردة.
ملاحظة: يجب أن يكون الأمثل الغسيل، مثلاً، الغسيل واسعة قد تكون مفيدة لتقليل ملزمة غير محددة. - نقل الشرائح إلى التبعي تحتوي على مسحوق بارافورمالدهيد (PFA) للتثبيت بين عشية وضحاها مع أبخرة منهاج عمل بيجين في الرايت حفاظا على سلامة المجمع يجند المستهدفة.
تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة. بوسيتيونثي التبعي في الدخان هود وتجنب ملامسة الجلد/العين منهاج عمل بيجين. - في اليوم التالي، نقل الشرائح إلى مربع مجففة تحتوي على هلام السليكا ح 3 على RT للقضاء على الرطوبة.
3-التعرض لألواح تصوير الفوسفور والمسح الضوئي
- وضع المقاطع في كاسيت لوحة تصوير الإشعاعي محمية مع الأنسجة التي تواجه. للاحقة الكمي لربط راديوليجاند، تشمل عبارة [ح]3[في كل كاسيت. ترتيب المقاطع شكل عشوائي وفضح المقاطع للمقارنة المباشرة في الكاسيت نفسه.
- محو الفوسفور التريتيوم تراعي التصوير لوحة مباشرة قبل الاستخدام من أجل إزالة الإشارات المتراكمة من التخزين وإزالة الإشارات الخلفية. ولذلك، تحميل اللوحة في آلة التصوير الفوسفور وأن يعرض عليه مرئية/الأشعة تحت الحمراء الخفيفة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إزالة اللوحة من الفوسفور آلة التصوير ووضعه مباشرة على المقاطع في الكاسيت. تأكد من أن يتم إغلاق الكاسيت تماما. تعرض المقاطع إلى لوحة التصوير الفوسفور لمدة 3 أيام في الرايت محمية من الضوء.
- لأن يمحو ضوء إشارة من لوحة التصوير، بعناية فتح الكاسيت في الظلام وفورا نقل لوحة التصوير في مربع تصوير الفوسفور في الظلام أو مكان تصوير الفوسفور في غرفة مظلمة.
ملاحظة: تأكد من يرمز الترتيب المكاني للشرائح أثناء التعرض بغية تحديد العينات الفردية على الصورة الرقمية بعد تحليل. ولذلك، عرض لوحات التصوير الفوسفور أيضا إحدى زوايا قطع في زاوية متميزة من أجل تحديد الاتجاه الصحيح للوحة على الصورة الرقمية. - تفحص اللوحة في أعلى دقة ممكنة للحصول على صورة رقمية.
4. اختياري: كريسيل تلطيخ البنفسجي من أقسام الأنسجة
- إعداد حل كريسيل البنفسجي 1% بخلط 5 غ خلات كريسيل البنفسجي في 500 مل مياه (dH2س) حتى يذوب (حوالي 2 ح). التصفية من خلال ورقة تصفية باستخدام قمع في زجاجة 500 مل جديدة. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 3.5-3.8.
- تعيين موضع تلطيخ الشريحة تحت غطاء الدخان. إعداد الصواني مع الحلول التالية في علب البولي بروبلين أبيض (باستثناء زيلين نفط):
ألف 50% درهم ethanol/50%2س
ب 70% ethanol/30% dH2س
جيم 100% إيثانول
د إيثانول 100%
هاء 100% dH2س
واو 1% كريسيل البنفسجي
زاي حمض الخليك 0.07% (إضافة 175 ميليلتر من حامض الخليك إلى 250 مل من dH2س).
حاء – 100% زيلين نفط في علب مقاومة للمذيبات الخضراء
أولاً زيلين نفط 100% في علب مقاومة للمذيبات الخضراء - نقل الشرائح إلى غطاء الدخان ووضعها في حامل شريحة.
- إذابة الدهون عن طريق زيادة سلسلة متدرجة من الإيثانول في dH2س إلى 100% إيثانول (علبة من أ إلى د) بغمس الشرائح لمدة 1 دقيقة.
- ترطيب العينات إلى dH2س عن طريق تنازلي تركيزات إيثانول (علبة من أ إلى د بترتيب عكسي، متبوعاً بدرج ه) بواسطة غمس الشرائح لمدة 1 دقيقة.
- تزج العينات في حل كريسيل البنفسجي لمدة 10 دقائق.
- شطف العينات في حمض الخليك 0.07% برفع الشرائح صعودا وهبوطاً بلطف ل 4-8 s. يغسل الشرائح بالغمس في dH2س لمدة 1 دقيقة.
- يذوي العينات بالانغماس الشرائح لمدة 30 ثانية في ترتيب تصاعدي تركيزات إيثانول (علبة من أ-د).
- نقل العينات من خلال علب اثنين من زيلين نفط 100% (علبة حاء وطاء) إخماد في الإيثانول.
- ترطيب العينات إلى dH2س عن طريق تنازلي تركيزات إيثانول (علبة من أ إلى د بترتيب عكسي، متبوعاً بدرج ه) بواسطة غمس الشرائح لمدة 1 دقيقة.
- إزالة الشرائح من المحلول الملحي مع الملقط. إضافة بضع قطرات من المذيبات العضوية تركيب وسائط كل شريحة وإضافة ساترة 24 × 60 مم في الأعلى لحماية العينات. إزالة فقاعات الهواء بين العينة وساترة بالضغط بلطف على ساترة.
ملاحظة: الاحتفاظ الشرائح المتبقية في زيلين نفط خلال تصاعد لمنع التجفيف. - الجافة الشرائح بين عشية وضحاها في غطاء دخان في الرايت
- الحصول على صورة للعينة مجهر و 1.25 X الهدف.
5-دينسيتوميتريك تحليل الصور الرقمية
- قياس الكثافة البصرية النسبي (قضبان) كل المعايرة القياسية من عبارة [ح]3[مع برنامج تحليل صورة.
- حدد منطقة متساوية في الحجم لكل نقطة من عبارة [ح]3[باستخدام أداة إنشاء المنطقة من عنصر القائمة تحديد المنطقة. تعيين رقم لكل المنطقة المحددة عن طريق النقر على الرقم تحت عنصر القائمة التسمية.
- تصدير قيم التطوير التنظيمي لكل نقطة من المعايرة القياسية بواسطة النقر فوق الملف | ه صدير | تقرير المنطقة 2D. نقل قيم رود إلى جدول بيانات وتطبيع بحجم المساحة المحددة. إجراء الانحدار الخطي للحصول على منحنى قياسي لمزيد من التحليل دينسيتوميتريك.
ملاحظة: تأكد من أن المناطق المختارة هي المسمى بغية تحديد مطابقة القيم رود والعينات.
- إجراء التقدير الكمي أوتوراديوجرامس استخدام الملكية برامج التصوير بتحديد المنطقة التي تهم (ROI) باستخدام أداة إنشاء المنطقة في كل قسم، وقياس المواد المستنفدة للأوزون. حدد المنطقة نفسها في كل قسم عن طريق إنشاء قالب لمنطقة الفائدة التي يتم نسخها وتعديلها يدوياً إلى اختلافات طفيفة في تشريح الدماغ لكل أوتوراديوجرام. تحديد تشريح للعائد على الاستثمار بمقارنة أوتوراديوجرامس مع أطلس الدماغ18. وعند مقارنة العلاجات المتعددة، إجراء تحليل أعمى والعشوائية بغية تجنب الانتقاء المتحيز من رويس.
- تصدير قيم رود وأحجام لمناطق مختارة في جدول بواسطة النقر فوق الملف | ه صدير | تقرير المنطقة 2D.
- تقسيم قضيب قياس دوروا المحدد بالمنطقة للحصول على الكثافة في منطقة محددة.
- قياس قضيب الخلفية اللوحة وتصدير قيم رود المناظرة وحجم المنطقة في جدول بيانات. طرح إشارة خلفية متوسط من كل قيمة قضيب من كل عائدات الاستثمار.
- متوسط قضبان replicates التقنية، أي، قسم يعيد استخدام أنسجة من الحيوان نفسه.
- استخدام المنحنى القياسي لتحويل قضبان إلى وحدات راديوليجاند ملزمة، أي.، nCi/mg الأنسجة مكافئات (TE).
ملاحظة: يتم استخدام TE المدة لأنه يتم إنشاء المعايير مع مواد محاكاة الأنسجة. - التعبير عن ملزمة بتحويل لجنة التحقيق الوطنية/mg نمول/mg TE وفقا للنشاط المحدد في راديوليجاند (المعادلة 1).
(1) - للحصول على قيم محددة ملزمة، طرح ملزمة غير محددة من مجموع ملزمة.
- متوسط ربط كل تكرار البيولوجية باستخدام متوسط التقنية يتطابق كل حيوان (التي تم الحصول عليها في الخطوة 5، 6).
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام بروتوكول وصف، كان تصور التشريحية توزيع مواقع الربط GHB عالية تقارب مع GHB التناظرية [ح]3[راديولابيليد هوكبكا في الدماغ الماوس، والتي قطعت إلى أقسام الاكليلية، السهمي والأفقية (الرقم 3 ). ولوحظت مستويات عالية من الربط في قرن آمون وقشرة، ملزمة أقل في المخطط ولا ملزمة اكتشفت في المخيخ، المقابلة لأنماط التعبير عنها السابقة عالية تقارب GHB مواقع9،10، 11،12. كما هو موضح هنا، أن الهياكل التشريحية قد يمكن تصور استخدام طائرات تقطيع مختلفة ويمكن أن يدعم سلامة تشريحية تلطيخ كريسيل البنفسجي. لمواقع الربط عالية تقارب GHB، مؤكدة خصوصا المناطق مع الربط راديوليجاند منخفضة، مثل المخيخ، مع اللاحقة تلطيخ الأنسجة (الشكل 3). وتوجد أقسام الاكليلية في أغلب الأحيان في9،الأدب10. وهم عمليا لأغراض الكمية كما يمكن الحصول على كمية أكبر من أقسام من الدماغ واحدة. أقسام السهمي والأفقية تتميز بتصور ملزمة في جميع أنحاء معظم الدماغ القوارض داخل قسم واحد وبالتالي توفير نظرة عامة كبيرة. ويبين الشكل 4حفظ مواقع الربط GHB عالية تقارب في الدماغ الثدييات التطوري. [ح]3[ تم الكشف عن مواقع الربط هوكبكا في الماوس وفار، وكذلك كما هو الحال في أنسجة المخ خنزير تمكين مقارنة تشريح الدماغ الإجمالي بين الأنواع. عموما، التطوري الحفظ والتوزيع الإقليمي دراسات قد تساعد في توصيف بروتين اهتمام، في هذه الحالة إلى حد كبير هدفا جديداً، وهكذا قد تعطي مؤشرات حول الوظيفة الفسيولوجية في19.
وقد سبر مواقع الربط GHB عالية تقارب مع GHB راديوليجاندس، الذي عرض مختلف الانتماءات لمواقع الربط ولكن أنشطة محددة قابلة للمقارنة (الشكل 5). [ح]3[ هوكبكا وأبدى سابقا أن يكون كد 74 شمال البحر الأبيض المتوسط، وأعلى من راديوليجاند المتاحة تجارياً [ح]3[382 سي إس مع كد من 697 نانومتر، كلاهما يحدد في pH 6.0 بالكمية أوتوراديوجرافي9. وهكذا، [ح]3[هوكبكا تزخر بكثير من حساسية أعلى، مما يؤدي إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء ممتازة. نظراً لحساسية أقل من [ح]3[راديوليجاند سي إس-382، أعلى تركيزات يجب أن تستخدم من أجل الحصول على مستويات مماثلة من الربط (قارن ياكسيس في الشكل 5). بالمقارنة مع [ح]3[GHB، حتى أعلى تركيزات راديوليجاند (30 نانومتر) اللازمة لتحقيق مستويات الربط قابلة للمقارنة. هذا الغالب بسبب تقارب أقل بكثير (كأنا من 4.5 ميكرومتر) من هذا راديوليجاند20. ومع ذلك، تركيز راديوليجاند أعلى يزيد أيضا من مستوى الربط غير محددة9،10 مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء أقل وبالتالي. هذه السلسلة من التجارب يسلط الضوء على أهمية وجود راديوليجاند النسب العالية لإنتاج صور عالية الجودة.
لأنه يعبر عن مواقع GHB تقارب عالية إلى مستويات عالية جداً في مناطق فوريبرين (60 ملغ pmol/17)، تحديد معلمات الدوائية بمنحنيات تشبع من الصعب أصلاً استخدام التصوير الحساسة الفوسفور التريتيوم القياسية لوحات بسبب خطر الصور oversaturated. ولذلك، كد القيم من أجل [ح]3[هوكبكا [ح]3[وتم الحصول على سي إس-382 بتحديد كأنا القيم الأولى منحنيات التشرد مثلى، ومن ثم حساب كد (الشكل 6)9. لمعظم راديوليجاندس، سيكون بديلاً لاستخدام النظائر المشعة-تمييع كما يتم بصورة روتينية في فحوصات ملزمة هوموجيناتي. وعلاوة على ذلك، تم تحديد قيمد ك في قيم الأس الهيدروجيني مختلفة. ومن الواضح أن الأكثر كفاءة هي المسمى مواقع GHB عالية تقارب في pH 6.0 (6A الشكل و الشكل 6)، منذ تغيير الاعتداء الشروط على درجة الحموضة 7.4 درجة كبيرة تؤثر على تقارب يجند. وهكذا، كد ل [ح]3[هوكبكا على درجة الحموضة 7.4 حوالي 30 مرة أعلى من الناحية العددية في pH 6.0. زيادة درجة الحموضة زيادة النتائج في درجة أعلى من الربط غير محددة, الذي يصبح تحذير عند استخدام [ح]3[سي إس-382، حيث يمكن الحصول على كميات قليلة فقط من ملزمة محددة في درجة الحموضة 7.4 (6E الشكل). وهذا يعرقل في الواقع تحديد معلمات الدوائية باستخدام هذه راديوليجاند في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي9، توضح مرة أخرى القوة في وجود راديوليجاند مع أنها تقارب عالية قدر الإمكان.
رقم 1: الهياكل لاستهداف مواقع الربط GHB عالية تقارب راديوليجاندس. [ح]3[3-هيدروكسيسيكلوبينت-1-شرق حمض الكربوكسيلية ([ح]3[هوكبكا)14, [ح]3[(ﻫ، RS)-6,7,8,9-تيتراهيدرو-5-هيدروكسي-5ح-بينزوسيكلوهيبت-6-يليديني حامض الخليك (سي إس-382) ([ح]3[سي إس-382)15 وحمض هيدروكسيبيوتريك γ [ح]3[([ح]3[GHB)16 راديوليجاندس تريتياتيد مع نشاط محددة قابلة للمقارنة (20-40 Ci/ملمول)، فضلا عن]125([ I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate 125أنا] بنوف-GHB)13 مع نشاط مولى المقدرة لعام 2000 Ci/ملمول21. يتم تمييز العنصر الهيكلي GHB باللون الأحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: نظرة عامة التخطيطي لبروتوكول أوتوراديوجرافي في المختبر . (1) هو euthanized الحيوان، والأنسجة تشريح وجمدت المفاجئة على الثلج الجاف. ثم هو مقطوع الأنسجة في كريوستات، ذوبان الجليد التي شنت على شرائح المجهر وهي المحتضنة المقاطع (2) مع راديوليجاند حتى الربط التوازن. لتحديد ربط غير محددة، تستكمل الحلول مع المحل غير موسومة هيكل المواد الكيميائية ذات الصلة ولكنها ليست متطابقة. (3) بعد ذلك، تتم إزالة راديوليجاند غير منضم بالغسيل في المخزن المؤقت للمقايسة وإزالة الأملاح قبل الشطف المقطر H2o. عند أبواب جافة، يتم تنفيذ التثبيت بارافورمالدهيد (PFA) لإنشاء تفاعل البروتين يجند بشكل دائم. الأقسام ثم يتعرض فوسفور imaging لوحات. (4) بعد وقت التعرض كافية، يتم تفحص لوحات للحصول على أوتوراديوجرامس الرقمية. (5) في نهاية المطاف، يتم تنفيذ تحليل الصور باستخدام تعاريف للمناطق ذات الاهتمام (رويس)، والربط هو كمياً. في المثال المبين، موضحة الكثافة الضوئية (ODs) في أقسام القشرة الماوس (يسار) والحصين (وسط). ويتم القياس الكمي بتعريض الأقسام مشفوعة عبارة [ح]3[(يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: أوتوراديوجرامس الممثل لشمال البحر الأبيض المتوسط [ح]3[1 هوكبكا ملزم للماوس الدماغ المقاطع. (أ) راديوليجاند ملزم ل coronal، أقسام الأنسجة السهمي وأفقي لتوضيح أهمية تقطيع الطائرة على التعريف بالهياكل التشريحية. (ب) كريسيل البنفسجي تلطيخ للأقسام المناظرة في الأنسجة للتحقق من المناطق التشريحية، ولا سيما المناطق مع انخفاض/غياب الربط راديوليجاند. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: أوتوراديوجرامس الممثل لشمال البحر الأبيض المتوسط [ح]3[1 هوكبكا ملزمة في الأنواع المختلفة. مقارنة بين الفئران (A)، والماوس (ب) و (ج) خنزير في المختبر أوتوراديوجرامس بغية توضيح الحفظ التطوري لربط مواقع المناطق القشرية وهيبوكامبال جنبا إلى جنب مع تشريح الدماغ الإجمالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: القياس الكمي للربط بمواقع الربط GHB عالية تقارب مع حساسية مختلفة إلى GHB راديوليجاندس من أوتوراديوجرافي في المختبر في الدماغ شرائح من اللحاء الماوس والحصين. تبلغ عن ربط مجموع مكافئات الأنسجة فمول/mg (TE) راديوليجاندس (A) [ح]3[هوكبكا (1 نانومتر) و (ب) [ح]3[سي إس-382 (7 nM) و GHB (ج) [ح]3[(30 نانومتر) (أنشطة محددة مماثلة). لم يتم الكشف عن الربط الخاصة بعدم حضور GHB 1 ملم أو 1 ملم هوكبكا لأي من راديوليجاندس (غير معروضة). وترد البيانات يعني ± SD من أربعة replicates البيولوجية كل إجراء في replicates التقنية الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6: نتائج تمثيلية لتحديد أوتوراديوجرافيك كد وبماكس القيم بالتشرد تنافسية مثلى من [ح]3[هوكبكا و [ح]3[سي إس-382 في أقسام الماوس القشرية في 6.0 درجة الحموضة ودرجة الحموضة 7.4 من أجل توضح تأثير الرقم الهيدروجيني على تقارب راديوليجاندس. (كد وبماكس حسبت باستخدام المجمع نفسه راديوليجاند والمنافس، ومن خلال التصميم الأوليةكانا القيم22). (أ) أوتوراديوجرامس مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء مثلى لشمال البحر الأبيض المتوسط [ح]3[1 هوكبكا ملزمة في pH 6.0. (ب) تغيير درجة الحموضة العازلة إلى 7.4 يتطلب تركيز هوكبكا [ح]3[أعلى (8 نانومتر) للوصول إلى مستويات كبيرة ملزمة. (ج) ربط سجل تركيز الناتجة المنحنيات؛ يعني ± sem. (د) 5 نانومتر [ح]3[سي إس-382 ملزمة في pH 6.0 ينتج منخفضة غير محددة ملزمة، بينما (ه) 40 نانومتر [ح]3[سي إس-382 غير كافية للحصول على ملزمة على درجة الحموضة 7.4. (و) ربط سجل تركيز الناتجة المنحنيات؛ يعني ± sem. بيانات تم الحصول عليها من 3-4 replicates البيولوجية كل إجراء في 3-5 التقنية replicates، فقط [ح]3[سي إس-382 تجارب على درجة الحموضة 7.4 أجريت مع replicates البيولوجية فقط 2. لكلا راديوليجاندس، 1 مم GHB واستخدمت لتحديد ربط غير محددة. للحصول على مزيد من التفاصيل عن التحليل وحساب كد وبكحد أقصى، انظر9. هذا الرقم تم تكييفها وطبعها من المنشور السابق9 بإذن من السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في أغلب الأحيان تتحدد نوعية الإنزيم أوتوراديوجرافيك حساسية راديوليجاند. عاملاً مساهما رئيسيا هو النظائر المشعة المحددة، التي تعطي بتوافر يغاندس المعروفة أو بجدوى تقنيات وضع العلامات المحددة للعائد يغاندس مع النشاط المحدد المناسب (أي، ومقدار النشاط الإشعاعي كل وحدة مول من راديوليجاند)23ومع كميات محدودة من التدهور الكيميائي. عدد كبير من راديوليجاندس يغاندس المعروفة هي المسمى مع التريتيوم9،10،24،،من2526، التي تستدل على العديد من المزايا. أولاً، التريتيوم (3ح) تتميز بنصف عمر طويل (سنوات 12.43) تعزيز التخزين الطويل الأجل لدفعات الفردية. وثانيا، عدم تشويه التفاعل يجند-الهدف من النويدات المشعة كما 3ح-يغاندس تمييزه بيولوجيا من مركباتها الأصل. التريتيوم تنبعث منخفضة الطاقة β–-الجسيمات التي السفر مسافات قصيرة فقط في الأنسجة الناتجة في القرار المكانية العالية و، في وقت لاحق، هياكل أكبر التمييز بين التشريحية4. ومع ذلك، وسمها التريتيوم يمكن فقط إنتاج تسفر عن أنشطة محددة متوسطا. وهذا يرجع إلى أن تتوفر 3ح-المصادر الملوثة بالهيدروجين غير مشعة. عموما، هناك حاجة ارتفاع النشاط المحدد، راديوليجاند أقل تسفر عن كشف حساسة23. وعلاوة على ذلك، ينبغي اعتبار أن 3ح-يغاندس لديهم إمكانية الخضوع لتبادل الهيدروجين مع الماء تبعاً لاستقرار 3ح-التسمية. وللتعويض عن التعبير منخفضة أو منخفضة جداً من نشاط معين، يمكن استخدام اليود-125 ك النويدات المشعة13. النشاط القصوى المحددة من اليود-125 تقريبا 100-fold أعلى من التريتيوم. ومع ذلك، هناك عدة اعتبارات إضافية يجب أن تتم عند العمل مع اليود-125. على سبيل المثال، إضافة اليود-125 يدفع عادة التعديلات الهيكلية في الجزيء مما قد يؤثر في التفاعلات يجند المستهدفة. كما اليود-125 نصف عمر 60 يوما، ينبغي النظر في تصحيح تسوس اليومية للنشاط النوعي والكمي ليجند المستهدفة التفاعلات23. 125 يغاندس تنبعث الفوتونات γ، وعلى الرغم من حساسية أعلى كثيرا، إنتاج صور منخفضة الدقة. وهذا سبب العلاقة العكسية بين القرار والطاقة القصوى للنظائر المشعة (كما هو مبين أدناه). أخيرا، بالمقارنة مع التريتيوم، زيادة ينبغي توخي الحذر عند التعامل مع اليود-125 بسبب الطاقة أعلى من النويدات المشعة.
اعتماداً على النويدة، سمك قسم الأنسجة قد تؤثر على القرار. Β الطاقة المنخفضة–-الإشعاع التريتيوم يحد الوصول الأنسجة إلى ما يقارب 5 ميكرومتر بسبب سيلفابسوربتيون. نتيجة لذلك، التحديد الكمي لا يتأثر بسمك الأنسجة عندما يتجاوز سمك الفرع 5 ميكرومتر27،28. على النقيض من ذلك، قد الاضمحلال الإشعاعي للنظائر المشعة ذات الطاقة العالية أكبر اختراق أنسجة، أسفر عن دقة الصورة أقل لأن يغاندس مع مسافة أكبر من المتوسط كشف تسهم أيضا في تشكيل الصورة. ونتيجة لذلك، تعزيز أقسام أرق دقة أعلى النويدات المشعة العالية الطاقة1.
ويتطلب إنشاء بروتوكول أوتوراديوجرافيك المعرفة بشروط الربط الأمثل (مثلاً، العازلة، ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة) ومعلمات الدوائية من راديوليجاند من حيث النسب وحركية. إذا كان قد اتسم راديوليجاند لا قبل، هي الدراسات الاستكشافية اللازمة29. اختيار بتركيز راديوليجاند أمثل وتسترشد كل تقارب راديوليجاند والوفرة من مواقع الربط. عادة، يتم استخدام تركيز مما يعكس 5-6 مرات كد التأكد من أن جميع مواقع الربط المشبعة30. وثمة نهج آخر يهدف إلى تحقق أعلى نسبة من إجمالي-إلى-غير محددة ملزمة بتحديد تركيزات راديوليجاند أدناه كد31 وحفظ الحل راديوليجاند في نفس الوقت. وهذا النهج مفيد بشكل خاص عندما يكون الموقع ملزم وفرة عالية في فحص الأنسجة نظراً لأن زيادة تركيزات عالية راديوليجاند فرصة أوفيرساتوراتينج أوتوراديوجرامس، هوكبكا القضية ل [ح]3[و GHB عالية تقارب ربط المواقع9. وعلاوة على ذلك، من أجل كفاءة تسمية جميع السكان من البروتين المستهدف، من الناحية المثالية ينبغي لها أن تربط راديوليجاند لكل هدف محتمل والتشكلات. استخدام يضع فقط خاصة في مستقبلات أوتوراديوجرافي، قد تكشف عددا جزئية مستقبلات مجموع أن بعض قد تكون موجودة في الدول منخفضة تقارب مؤثر. وفي المقابل، عرض الخصوم محايدة في أغلب الأحيان تقارب مستقبلات جميع الدول26،29.
وعلاوة على ذلك، تجري تجارب ملزمة عموما تحت شروط الربط التوازن. ولذلك، ينبغي تحديد الوقت اللازم للتوصل إلى توازن ملزمة بموجب الشروط التجريبية المطلوبة (تركيز راديوليجاند الثابتة والمخزن المؤقت ودرجة الحرارة) في تجارب جمعية لضمان الربط التوازن داخل النطاق تجربة4،،من2330. بعد حضانة راديوليجاند، راديوليجاند غير منضم هو غسله قبل عدة إينكوبيشنز مع المخزن المؤقت للمقايسة وعادة تبعتها الشطف في المقطر ح2O. الإشارات إلى الضجيج النسب يمكن أن يكون الأمثل عن طريق ضبط درجة الحرارة والوقت اعتماداً على الانفصال من معدل ال26،راديوليجاند،من3031.
راديوليجاندس قد عرض ملزم للمواد غير البيولوجية، أيربط غير محددة. ويعرف راديوليجاند ملزم للمكونات الخلوية غير الهدف المقصود ملزمة غير محدد. ويتم تقييم مساهمة ملزمة غير محدد بمبلغ إجمالي قدرة راديوليجاند ملزمة حضور يجند غير موسومة متنافسة التي تستهدف نفس موقع الربط راديوليجاند. كما يتم تزويد المجمع غير مشعة (المحل) في 10,000-fold الزائدة، وتحتل الموقع ملزم ويمكنك ربط راديوليجاند فقط لإيقاف استهداف مواقع26،،من3132. من الأهمية بمكان ينبغي أن يكون المجمع غير موسومة بنية كيميائية مختلفة من راديوليجاند وبهذا يقلل من خطر الإصابة مما أدى إلى تشريد كل ملزمة محددة، فضلا عن غير محدد23. الخاصة بعدم ربط الناشئة عن ملزمة للأغشية يمكن أن يكون مشكلة كبيرة لا سيما في حالة راديوليجاندس إلى حد ما محبتين. وفي بعض الحالات، قد إزالة مستقبلات غير منضم راديوليجاند إجراءات الغسيل واسعة النطاق وبالتالي تحسين محددة ملزمة نسب29.
عند اختيار مخزن مؤقت مقايسة، من الأهمية بمكان النظر في تأثير القوة الأيونية والرقم الهيدروجيني على التفاعل يجند المستهدفة. التفاعلات الالكتروستاتيكي وبخاصة بين يغاندس القطبية ومكونات ماء من مواقع الربط تتأثر بقوة الأيونية للمخزن المؤقت. ولذلك، قد تؤثر على مكملات مع أيونات الفموي الأحادي التكافؤ أو divalent المستمر23،تقارب فعال33. إذا كان تكوين المخزن المؤقت المثلى للتفاعل درس يجند المستهدفة غير معروف، ينبغي استكشاف مختلف المخازن المؤقتة المشتركة في التجارب الرائدة. كما يمكن استكمال المخازن المؤقتة مع مضادات الأكسدة مثل حمض الأسكوربيك ومثبطات الإنزيمات29،34المهينة. وعلاوة على ذلك، التأين لفئات معينة داخل موقع الربط أو يجند نفسه يتأثر بدرجة الحموضة وله آثار حاسمة على ثابت التوازن الملزم، والثوابت معدل الحركية وغير محددة ملزمة23،33. على سبيل المثال، ربط الموقع مع مختلف GHB راديوليجاندس لطيف السبر GHB عالية تقارب يوضح أهمية الأس الهيدروجيني على هذا الهدف الملزم (الشكل 6). وصف الرقم الهيدروجيني الأمثل لتفاعل مستقبلات يجند ويجوز أيضا أن أدلة حول أهمية الهدف فيما يتعلق بأهميتها البيولوجية.
عامل حاسم آخر في autoradiography الرقمية هو وقت التعرض، أي، والوقت اللازم لتحقيق أوتوراديوجرامس القابلة للقياس الكمي بتعريض أقسام الأنسجة راديولابيليد فوسفور imaging لوحات. وتقوم التقديرات على مقدار النشاط الإشعاعي في العينة، والطاقة وفترة نصف العمر للنظير المشع، فضلا عن أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء المطلوب. على وجه الخصوص، لفترة طويلة نتائج وقت التعرض في الصور المشبعة والإشارات الخلفية عالية. ويمكن تخفيض الإشارات الخلفية مرتفعة عن طريق تخزين أشرطة الكاسيت داخل بيئات محمية من الرصاص لتجنب الإشعاع الكوني1،4. ومع ذلك، إذا ما تحققت أوتوراديوجرامس دون المستوى الأمثل، العينة يمكن أن يتعرض عدة مرات، شريطة أن المجمع المستهدف يجند هو ثابت ونصف من النويدات المشعة يسمح بذلك.
فوسفور imaging لوحات يمكن إعادة استخدامها، وقد عمر طويلاً عند التعامل معها بشكل صحيح، أي، ينبغي تجنب الانحناء ولوحات وينبغي أن تكون مخزنة في بيئة جافة. التعامل مع الفوسفور التصوير لوحات تسترشد بحساسيتها للإشعاع الكوني والضوء. وبالتالي، من المهم أن يمحو اللوحة قبل كل استخدام للتقليل من الإشارات الخلفية. ويتم التعرض لأقسام الأنسجة راديولابيليد إلى لوحات التصوير في أشرطة الكاسيت محمية من الإشعاع خالية تماما من الضوء. عند نقل اللوحة للماسح الضوئي في نهاية وقت التعرض، أي ضوء المحيطة ينبغي أيضا تجنب الاتصال قصيرة حتى مع الضوء الأبيض يقلل من الإشارات المتراكمة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تفحص لوحات فورا بعد إزالة العينة لتجنب إشارة يتلاشى. عيوب استخدام الفوسفور التصوير لوحات هو مظهر المحتملة من المصنوعات اليدوية وبقايا 'شبح الصور' بعد الاستخدام المتكرر من لوحات1.
ويتطلب العمل مع التريتيوم التصوير لوحات دون طلاء واقية للسماح بالإشعاع المنخفضة للطاقة تصل إلى بلورات الفوسفور. ولذلك ألواح التصوير الحساسة التريتيوم الفوسفور أكثر حساسية للتلوث أو التلف بسبب معالجة غير صحيحة. بمجرد الملوثة، لوحات التريتيوم حساسة لا يمكن تنظيفها وتحتاج إلى استبدال. التثبيت المجمع المستهدف يجند مع منهاج عمل بيجين البخار يقلل التلوث المحتملة اللوحة، إطالة عمر به. وعلاوة على ذلك، جفاف الأنسجة بعد التثبيت خطوة حاسمة منذ التريتيوم اللوحات الحساسة حساسة للرطوبة. نظراً لطبيعتها الحساسة، ينبغي أن لا تستخدم لوحات التريتيوم المراعية لسائر النظائر1،4. وفي المقابل، اللوحات للنظائر المشعة ذات الطاقة العالية مثل اليود-125 أكثر قوة ويمكن حتى تنظيف سطحها بالمسح مع الإيثانول 70%.
تقليديا، وقد استخدمت الفيلم راديوسينسيتيفي لتسجيل المكانية من الاضمحلال الإشعاعي. وفي حين يمكن الحصول على صور ذات دقة عالية، أوتوراديوجرافي الفيلم نقائص عديدة. إلى جانب الضرورة للمواد الكيميائية الخطرة وغرفة مظلمة للتنمية، وفيلم الأشعة السينية تتميز بمجموعة ديناميكية ضيقة. ولذلك، قد يكون ضروريا لفضح أقسام راديولابيليد مرارا وتكرارا مع أوقات التعرض مختلفة بغية تحقيق الصور القابلة للقياس الكمي غير المشبعة35. وعلاوة على ذلك، يسلك فيلم الأشعة السينية محدودة الحساسية الناتجة في أوقات التعرض المستمر للعينة المسمى مع النظائر منخفض من الطاقة، أي. تسوس التريتيوم قد يتطلب عدة أشهر من التعرض. حساسية منخفضة جنبا إلى جنب مع مجموعة الخطي الصغيرة يجعل التقنية الغاية وقتاً طويلاً، لا سيما عند شروط المقايسة المثلى يجب أن تكون حازمة الأولى1،35.
مع تطور فوسفور imaging لوحات، والعديد من هذه القيود قد تناول35،،من3637. لوحات التصوير خدمة لتخزين صور اضمحلال المشعة، يمثل هذا الترتيب المكاني راديوليجاند في عينات الأنسجة بشكل مؤقت. BaFBr:Eu فوتوستيمولابل2+ الفوسفور بلورات تستخدم لالتقاط الطاقة الإشعاعية المنبعثة من العينة، كالطاقة العالية الإشعاع (مثل الأشعة السينية وأشعة غاما أو جسيمات بيتا) النتائج في الإثارة من الاتحاد الأوروبي2+ إلى الاتحاد الأوروبي3+ وما يترتب عليها من تعويض الإلكترون المفرج عنهم في الفوسفور شعرية4،37. تعريض صفيحة التصوير بالضوء المرئي أو الأشعة تحت الحمراء يعكس رد فعل ويتم الإفراج عن أي الإلكترون المحاصرين وتنبعث أثناء تحول الاتحاد الأوروبي3+ إلى الاتحاد الأوروبي2+ التﻷلؤ. الضوء المنبعثة متناسباً مع مقدار النشاط الإشعاعي والكشف عنها ضوئي تمكين إنشاء أوتوراديوجرام الرقمية37. ويوفر هذا النظام زيادة في حساسية مصحوبة بانخفاض ملحوظ في وقت التعرض من الشهر إلى أيام3. علاوة على ذلك، النطاق الديناميكي الخطي هو زيادة كبيرة، مما يقلل من فرصة للصور oversaturated. الخطي ويرد ضمن أربعة إلى خمسة أوامر من حجم وتم التحقق من مرارا وتكرارا3،35،36،،من3738. على الرغم من أن أوتوراديوجرافي الفيلم لا يزال يوفر القرار المكانية متفوقة، أسفرت الجهود في مسح تكنولوجيا تحسين القرار من 300 إلى 25 ميكرون (حجم بكسل)، مما يسمح للتمييز المفصل بين المناطق التشريحية3. عموما، يتم تيسير الفوسفور لوحات التصوير الحصول أوتوراديوجرامس الرقمية على حد سواء نظراً زيادة نطاق الخطي وحساسية. الوقت خفض التعرض وأسلوب تنمية مبسطة إلى حد كبير يؤدي إلى تقليل الوقت لتحليل البيانات مما يتيح أعلى من الناتج.
مقارنة autoradiography، تتسم معلمات الدوائية المفيدة مثل تقارب وكثافة أيضا عادة بتطبيق راديوليجاندس في الأنسجة هوموجيناتي ملزمة فحوصات. ويمتاز هذا الأسلوب نتائج عن طريق قياس انبعاث بيتا الاضمحلال المشعة مع كاشف التﻷلؤ سائل كفاءة2. ينفذ في اتباع نهج متعدد جيدا، مثلاً، في لوحات microtiter 96-جيدا، وهذه الاختبارات مفيدة لفحص مكتبات للمركبات وعدد أكبر من العلاقات تعتمد على التركيز. علاوة على ذلك، إجراء تحليل التشبع مع هذا الإعداد في كثير من الأحيان أكثر مجدية بالمقارنة مع أوتوراديوجرافي، الذي يعرض خطر الصور oversaturated مع تركيزات عالية من راديوليجاند. ومع ذلك، أداء التشرد مثلى من تركيز راديوليجاند منخفضة ثابتة مع يغاندس غير المشعة من أجل الحصول على كد وبماكس تلتف مشكلة الصور oversaturated (الشكل 6)22. ملزمة هوموجيناتي وأوتوراديوجرافي إنتاج تقديرات مماثلة ليجند تقارب الثوابت بينما قد الاستهانة بكثافة الأنسجة من البروتين ذات الأهمية في ربط هوموجيناتي. ومن ثم، اقترح أن اضطراب غشاء الخلية المتزامن مع هوموجينيساتيون الأنسجة قد يسفر عن فقدان مستقبلات أو تغيير ربط شروط3،33. وعلاوة على ذلك، قد تنتج أخطاء في تشريح الأنسجة homogenates ملوثة بالانسجة من المناطق المجاورة في الدماغ. وبالمقارنة، من أنماط الربط المعقدة حتى في نواة صغيرة تصور واختلاف سبب القرار التشريحية المكانية في أوتوراديوجرافي3،33.
كما يتصور Immunohistochemistry توزيع بروتين فائدة تشريحيا. الأسلوب قادرة على إنتاج صور عالية الدقة التشريحية، كما يمكن التعرف على مكونات الأنسجة المنفصلة على المستوى الخلوي ومستويات سوبسيلولار حتى باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني. ويتم تقييم مستويات التعبير استناداً إلى كثافة تلطيخ. ومع ذلك، الكمي المطلق لمستويات التعبير أمر صعب نظراً لعدم وجود إشارة مناسبة المعايير39. وعلاوة على ذلك، إيمونوهيستوتشيميستري مرهون بتوافر جسم الانتقائي، وتم التحقق من صحتها جيدا الذي غالباً ما يكون هناك مشكلة في البحث مستقبلات.
قبل اتخاذ قرار بشأن أداء أوتوراديوجرافي في المختبر ، بذل العديد من الاعتبارات. أولاً وقبل كل شيء، إعداد الأنسجة بعد الوفاة بما في ذلك تقطيع فضلا عن تجميد المتكررة وذوبان الجليد قد تؤثر على الحفاظ على ربط مواقع2. وعلاوة على ذلك، الأسلوب يعتمد على توافر راديوليجاند الكافية، مما يعرض تقارب عالية والانتقائية للهدف في السؤال2. يجب أن يتم عرض راديوليجاند ربط هامة المواقع المستهدفة، وأنها ينبغي أن تظهر أيضا الشخصية حركية مواتية. وهذا ضروري لأن المجمع المستهدف يجند ويجب أن تبقى سليمة خلال نطاق التجربة. وعلاوة على ذلك، عندما توجد مركبات غير مشعة مناسبة، الأخذ النويدات المشعة قد تصبح عاملاً حاسما. وهكذا، جزيء الفائدة ينبغي أن تكون مجهزة مجموعات وظيفية مناسبة لكفاءة راديولابيلينج، الذي يتيح إنتاج راديوليجاندس مع نشاط محدد عالية بما فيه الكفاية والاستقرار الكيميائي40. وثمة عيب آخر من أوتوراديوجرافي في المختبر أن الأسلوب فقط يسمح باستخدام الحيوان مرة. أكثر أناقة هو التمديد في فيفو التصوير أساليب مثل موقف التصوير المقطعي (PET)، الذي يتيح المسح المتكرر لنفس الحيوان وتصميم الأشغال وخصائص الربط الحيوي. الحيوانات الأليفة ذات قيمة خاصة لدراسة أعلى الثدييات41 والجرعة الأمثل في الدراسات ما قبل السريرية 42،،من4344.
عدة تعديلات تقنية أوتوراديوجرافيك يمتد تطبيقه من حيث توصيف الأهداف الدوائية في الدول صحية والمريضة وكذلك في اكتشاف المخدرات والتنمية على حد سواء. أولاً وقبل كل شيء، أن التقدم الذي أحرز مؤخرا في تكنولوجيا التصوير أدت إلى تطوير أوتوراديوجرافي في الوقت الحقيقي. كشف الغاز α/β-الجزيئات تفادي الحاجة إلى تصوير لوحات أو الفيلم بالقياس المباشر من ديسينتيجريشنز، وبالتالي إنتاج سريع الرقمية أوتوراديوجرامس45.
وعلاوة على ذلك، تمكن autoradiography في المختبر الدراسات من الأداء الوظيفي لز إلى جانب البروتين مستقبلات (جبكرس) على رأس معلومات حول توزيع تشريحية في الأنسجة بعد الوفاة. هذا البديل من الأسلوب الذي ينطوي على الحضانة لأقسام الأنسجة مع التماثلية الموسومة إشعاعيا لثلاثي جانسين (غتب)، أي [35S] جانسين 5 '-γ-ثيوتريفوسفاتي ([35S] GTPγS)، جنبا إلى جنب مع مؤثر غير المشعة لهذه العملية. عندما يربط مؤثر ويتسبب استجابة لهذه العملية، على إدماج [35S] GTPγS يمكن أن تكون مترجمة وكمياً عن طريق أوتوراديوجرافي، الذي يعكس فقط تنشيط مستقبلات السكان2،46،47 .
السابقين فيفو autoradiography يمثل إصدار آخر من هذا الأسلوب، الذي يقيم الربط الإقليمي من راديوليجاند بعد الإدارة للحيوانات تجريبية حية. وبعد التضحية بالحيوان، كريوسيكتيونينج الأنسجة المعنية، ونتيجة التعرض أوتوراديوجرافيك في أوتوراديوجرامس التي تعكس راديوليجاند ملزمة في فيفو2. السابقين فيفو autoradiography عادة يعمل ضمن برامج اكتشاف وتطوير العقاقير من أجل الحصول على معلومات حول التشكيل الجانبي الحرائك الدوائية قيادة المركبة، أي الاستيعاب، والتوزيع، والايض وإفراز (ADME) . أوتوراديوجرافي الجسم كله خاصة توفر نظرة فاحصة حول توزيع الأدوية لجميع الأعضاء والأنسجة. بيد أن تحديد الربط غير محددة والتحديد الكمي أكثر صعوبة بالمقارنة مع أوتوراديوجرافي في المختبر نتيجة الأيض ممكن وتدهور راديوليجاند وأي وسيلة تجرف غير منضم يجند48.
كما يستخدم أوتوراديوجرافي للاختبارات الأولية وتوصيف الحيوانات الأليفة يغاندس4. غالباً ما تستخدم النويدات المشعة عالية الكربون-11 والفلور-18 للحيوانات الأليفة يغاندس. الحيوانات الأليفة تطبيق بارزة، وغير الغازية راديوليجاندس لأنه يمكن الحصول على الصور الثلاثية الأبعاد القابلة للقياس الكمي من راديوليجاند ملزمة في الحيوانات حية11،،من4049.
في المختبر autoradiography استخدام الفوسفور التصوير لوحات تمثل أسلوب تحليل قيمة لتوصيف المستهدفة يجند التفاعلات الدوائية. الأسلوب ينتج نتائج استنساخه بالوظيفة من بروتوكول سريعة وبسيطة نسبيا متى تم إنشاء شروط الفحص الأمثل. يتحدد التوزيع التشريحية لبروتين اهتمام داخل به المكروية الأصلي، الذي يتيح دراسة دورها الفسيولوجية والدوائية والمرضية في الأنسجة السليمة والمريضة الجثة من الحيوانات التجريبية، وكذلك 2،البشر47.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وكان دعم العمل مؤسسة Lundbeck (منحة R133-A12270) ومؤسسة نوفو نورديسك (منحة NNF0C0028664). يشكر المؤلفون الدكتور أليس ماريك لتوريد راديوليجاند [ح]3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Merck Millipore | 107017 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BAS-TR2040 Imaging Plate | GE Healthcare Life Science | 28956481 | 20x40 cm - Sensitive to tritium |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) | Merck Millipore | 100579 | |
| O.C.T. Compound, 12 x 125 mL | Sakura | 4583 | Tissue-Tek |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 631-9483 | microscope slides |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura Finetek Denmark ApS | 4451 | |
| Tritium Standard on Glas | American Radiolabeld Chemicals, Inc. | ART 0123 | |
| Xylene substitute | Sigma-Aldrich | A5597 |
References
- Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
- Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
- Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
- Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
- Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
- Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
- Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
- Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
- Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
- Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
- Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
- Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
- Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
- Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
- Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
- Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
- Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
- Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
- Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
- Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
- DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
- Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
- Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
- Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
- López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
- Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
- Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
- Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
- Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
- Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
- Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
- Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
- Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
- Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
- Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
- Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
- Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
- Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
- Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
- Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
- Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
- Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
- Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
- Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
- Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).
