Summary
自体影像学方法通常用于研究放射线与组织切片的结合, 以确定定性或定量药理学。
Abstract
体外自动摄影的目的是想象实验动物和人类对组织感兴趣的蛋白质的解剖分布。该方法是基于辐射寡核苷酸及其生物目标的特定结合。因此, 冷冻组织切片用辐射和溶液孵育, 然后通过检测放射性衰变来定位与目标的结合, 例如, 使用光敏膜或荧光粉成像板。由此产生的数字自动测底图显示出显著的空间分辨率, 从而能够在不同的解剖结构中对辐射寡核苷酸进行定量和定位。此外, 定量允许通过离解常数 (kd)、抑制常数 (k i) 以及选定组织中的结合位点密度 (b最大值) 对配体亲和力进行药理鉴定.因此, 该方法提供了有关目标定位和配体选择性的信息。在这里, 这项技术的例子是在哺乳动物脑组织中高亲和力γ-羟基丁酸 (ghb) 结合位点的自体成像表征, 特别强调了有关结合试验的方法学考虑。参数、辐射点的选择和检测方法。
Introduction
自动摄影是一种提供放射性衰变图像的方法。该技术通常用于研究一种感兴趣的蛋白质在体外的组织分布, 其基础是放射性标记化合物与其靶点之间的特定药理相互作用。这提供了有关目标配体选择性的直接信息。体外自体影像学也可用于定量测定放射性药物的药理结合参数, 如离解常数 (kd) 和结合位点密度 (b最大值), 以及用于测定竞争配体1,2的抑制常数 (k i)。与传统的同质辐射结合相比, 自动影像学具有能够可视化空间解剖和给出区域表达模式简洁细节的优点 3。因此, 自体影像学方法是免疫细胞化学的相关替代方法, 尤其是在没有经过验证的抗体的情况下。在标准的放射性同位素实验室中, 由于有合适的放射位基因和所需的药理特异性, 可以使用用于制备组织切片的微孔低温恒温器, 以及适当的成像, 因此可以很容易地在标准的放射性同位素实验室进行自体测药能够分析各自组织切片中放射性分布的装置。值得注意的是, 辐射寡核苷酸的一个重要选择标准是与非目标地点的结合数量有限。这可以是其他蛋白质, 膜或材料, 如塑料或过滤器, 并统称为非特异性结合。通常情况下, 非特异性结合是不饱和的, 但如果它涉及特定的非目标蛋白, 则可以是饱和的。验证真正的特定结合的最佳方法是将缺乏目标的组织进行比较,例如基因工程 (淘汰赛) 组织4。
在这里, 该方法说明了与自交图表征的高亲和力结合位点的γ-羟基丁酸 (ghb) 在哺乳动物大脑中。了解 ghb 与其结合部位之间的药理作用具有重要意义, 因为 ghb 既是治疗嗜睡和酒精中毒的临床有用药物, 也是哺乳动物大脑的天然成分和娱乐药物6。高亲和力 ghb 结合位点首次被描述使用 [3h] ghb 结合大鼠大脑均质7。多年来, 进一步的自体影像学研究 [3h] ghb 和类似 [3h] ncs-382 已显示高密度结合位的前脑区域的大鼠 8,9,10, 小鼠9猪11和猴子人的大脑 12。然而, 这些结合位点的分子特性和确切的功能相关性仍然难以捉摸。
为了进一步确定结合位点的特征, 并便利对 ghb 的生理作用进行研究, 开发了含有不同亲和力的不同同位素的多种放射性寡头 ([3h] ghb, [3h] ncs-382、[3h] hopcca 和 [125i] bnoph-ghb)13、14、15、16(17 审查)(图 1)。选择性高亲和力放射性和非常高的组织密度的结合结合结合结合, 使使用荧光粉成像技术9,11的高质量图像得以产生。除了在建立自动摄影实验的实际要点和一个例子来说明细节的情况外, 讨论部分将强调 (一) 放射性核素的选择, (二) 检测条件的选择, 以及 (三) 荧光粉的使用成像板与 x 射线胶片的对比。本文的总体目标是提供有关自体影像学技术的技术、方法和科学细节, 以了解蛋白质靶的组织分布和药理分析。
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Protocol
所有动物处理都是按照丹麦动物实验监察局的准则进行的。
注: 此处描述的协议包括组织准备 (即小鼠脑组织)、体外自动影像学检测, 以便在新的实验室中建立该方法、暴露于荧光粉成像板以及随后对自动影像学进行密度分析 (图 2), 目的是在不同的解剖结构中定位和定量放射性寡核苷酸结合。为了进行组织学比较, 包括了环己基紫罗兰色染色的协议。此外, 确定具有竞争配体的非特定结合已列入议定书。有关如何确定 kd、b最大值或 ki 的详细说明, 请参阅以前的出版物4。
1. 冷冻切片组织的制备
- 通过颈椎脱位使小鼠安乐死, 并立即使用剪刀和钳子解剖大脑。直接进入下一步, 以避免组织损伤。
- 通过在粉状干冰、气体二氧化碳或异戊烷中浸泡来冷冻组织。将冷冻组织直接转移到温度设置为-20°c 的低温恒温器中。或者, 将组织保存在-80°c, 直到处理。
注: 避免反复解冻/冷冻, 以减少组织损伤。 - 在进一步处理之前, 让组织在低温恒温器中符合-20°c-20°c, 以避免组织破碎。
- 用冷冻恒温器外的嵌入介质覆盖组织支架, 并在嵌入介质仍是液体的情况下, 快速将冷冻组织标本置于所需的方向。例如, 将鼠标大脑垂直地放在小脑上, 以实现正常的冠状部分。将组织支架转移回低温恒温器, 并将嵌入介质暴露在-10°c 以下的温度下进行硬化。
注: 在安装之前, 应将易碎的组织标本涂在组织模具内的嵌入介质中。 - 将组织支架放置在低温恒温器的微体中。调整组织的方向, 以避免倾斜的部分。
- 在立体导图集18 的引导下, 在所需厚度的部分 (建议 [3h] 标记的配体为12微米) 切割组织。如有必要, 请小心地拉直并展开部分, 并将该部分解冻安装在显微镜幻灯片上。按顺序从感兴趣的区域收集部分, 以便进行所需的技术复制 (例如, 每张幻灯片4个部分)。
- 在进一步处理之前, 请让滑梯上的部分风干1小时。
注: 在滑箱中添加干燥剂材料可最大限度地减少组织部分积聚的水分。通过将部分长期存放在-80°c 的幻灯片箱中, 可以在这里暂停。
2.体外自动影像学
注意: 放射性。根据当地法规在经过认证的实验室工作。穿防护服。根据放射性衰变或外包给经认证的公司。
- 在室温 (rt) 下解冻部分至少30分钟。使用实验条件标记幻灯片。使用铅笔, 因为幻灯片将沐浴在乙醇在随后的染色。
- 将幻灯片水平放置在塑料托盘中。
注: 在塑料托盘内的高架平台上定位幻灯片有助于其处理。 - 通过在滑块上仔细地将适当的体积 (3-4 个啮齿类动物冠状切片为 700μl), 对安装在检测缓冲液中的部分进行预培养, 并根据问题进行调整 (对于 ghb 协议, 使用 50 mm khpo 4 缓冲液 ph 6.0)。
注: 请确保每个部分完全覆盖液体。- 用盖子覆盖塑料托盘, 以避免在相关温度下蒸发和预孵化 (对于 ghb 协议在 rpm 预孵化 30分钟), 在板振动台的不断温和 (20 转/分) 晃动下。
- 用于测定非特异性结合, 用相关浓度的未标记化合物补充测定缓冲液 (适用于 ghb 协议, 1 mm ghb)。
注: 预孵化可能不需要。
- 从每张幻灯片中倒出预孵化液, 然后将滑块转移回塑料托盘。
- 为避免脱水, 请在所需条件下 (对于 ghb 协议, 1 nm [3 h] hocpca, 1 nm [3h] hocpca, 在 rt 上覆盖这些部分, 将这些部分完全覆盖在辐射寡并且溶液 (低千千四只啮齿类动物冠状切片, 为 700μl)。
- 在紧闭盖子的塑料托盘在不断温和 (20 转/分) 晃动下孵化。
注: 在液体闪烁计数器中计数一个脂肪, 可以验证辐射和浓度。
- 在紧闭盖子的塑料托盘在不断温和 (20 转/分) 晃动下孵化。
- 通过将液体倒出并将幻灯片转移到显微镜滑块架中, 取出培养液。立即继续执行下一步, 以避免部分脱水。
- 清洗幻灯片。对于 ghb 协议, 用冰凉检测缓冲液清洗两次, 时间为 20秒, 然后通过将滑盘架浸入充满冰凉蒸馏水的托盘中进行两次冲洗, 以去除盐分。将滑块垂直放置在机架中, 以便在 racks 进行至少1小时的空气干燥, 或将滑块干燥 5分钟, 并将鼓风机设置为冷温度。
注: 清洗必须优化,例如, 大量清洗可能有助于减少非特异性结合。 - 将滑块转移到含有聚甲醛 (pfa) 粉末的固定器中, 以便在 rt 使用 pfa 蒸汽进行隔夜固定, 从而保护配体靶向复合物的完整性。
注意: pfa 是有毒的。将固定器定位在烟罩中, 避免与 pfa 进行皮眼接触。 - 第二天, 将幻灯片转移到含有硅胶的干燥箱, 在 rt 工作 3小时, 以消除水分。
3. 接触荧溶成像板和扫描
- 将切片放置在带辐射屏蔽的成像板盒中, 组织朝上。为了随后对放射性寡核苷酸和结合进行定量, 在每个盒式磁带中包括一个 [3h] 的微刻度。随机排列各部分, 并在同一盒式磁带中公开部分以进行直接比较。
- 在使用前立即擦除对三敏感磷成像板, 以消除存储中累积的信号并消除背景信号。因此, 请将板材加载到荧光粉成像机中, 并根据制造商的说明将其暴露在可见光下。
- 从荧光粉成像机上取下板材, 并立即将其放置在盒式磁带中的部分。确保盒式磁带已完全关闭。在免受光线保护的 rt 中, 将切片暴露在荧光材料成像板上3天。
- 由于光线会擦除成像板发出的信号, 因此请在黑暗中小心地打开盒式磁带, 并立即将成像板转移到荧光粉成像仪的暗箱中, 或将荧光粉成像仪放置在黑暗的房间中。
注: 请确保在曝光过程中标记幻灯片的空间排列, 以便在分析后识别数字图像上的单个标本。因此, 荧光粉成像板也以不同的角度显示一个角部切割, 以确定该板在数字图片上的正确方向。 - 以尽可能高的分辨率扫描板, 以获得数字图像。
4. 可选: 组织切片的 cresyl 紫罗兰染色
- 将5克状醋酸甲酯混合在500毫升去离子水 (dh2o)中, 制备1% 的环氧基紫罗兰色溶液, 直至溶解 (约 2小时)。使用漏斗过滤滤纸, 将其过滤成新的500毫升瓶。将 ph 值调整为 3.5-3.8。
- 将设置的幻灯片染色设置在烟罩下。在白色聚丙烯托盘 (二甲苯除外) 中使用以下溶液准备托盘:
a. 50% 乙醇/50%dh2o
b. 70% 乙醇/30% dh2o
c. 100% 乙醇
d. 100% 乙醇
e. 100% dh2o
f. 1% 环氧基紫罗兰色
g. 0.07% 醋酸 (将175μl 的醋酸加入250毫升的 dh2o)。
h. 绿色耐溶剂托盘中的100% 二甲苯
i. 100% 二甲苯在绿色耐溶剂托盘中 - 将幻灯片传输到通风罩, 并将其放置在幻灯片架中。
- 通过将 dh2o中的分级系列乙醇加入100% 乙醇 (托盘 a-d), 将滑块浸渍 1分钟, 将脂质溶解。
- 通过浸渍滑块 1分钟, 将样品补充至dh2o,方法是降低乙醇浓度 (按相反顺序降低托盘 a-d, 然后是托盘 e)。
- 将样品浸泡在环己基紫罗兰溶液中10分钟。
- 用0.07% 的醋酸将试样冲洗干净, 轻轻向上和向下提起 4-8, 用 dh2o 浸渍 1年, 将滑块冲洗干净.
- 将滑块浸入乙醇浓度上升的 30分钟, 使样品脱水。
- 将样品通过两个100% 二甲苯 (托盘 h 和 i) 的托盘转移, 以淬火乙醇。
- 通过浸渍滑块 1分钟, 将样品补充至dh2o,方法是降低乙醇浓度 (按相反顺序降低托盘 a-d, 然后是托盘 e)。
- 用钳子从盐水中取出幻灯片。在每张幻灯片上添加几滴有机溶剂安装介质, 并在顶部添加 24 x 60 mm 的盖板, 以保护样品。轻轻按压样品和覆盖物之间的气泡。
注: 在安装过程中, 将剩余的滑块保存在二甲苯中, 以防止干燥。 - 在 rt 的烟罩里连夜擦干滑梯。
- 用显微镜和 1.25 x 目标获取标本的图片。
5. 数字图像的密度分析
- 使用图像分析软件从 [3h] 微刻度测量每个校准标准的相对光学密度 (rod)。
- 使用用于创建 "区域"的工具, 从菜单项 "区域" 确定中为[ 3h] 微刻度的每个点选择一个大小相等的区域。通过单击菜单项 "标签"下的"数字", 为每个选定区域分配一个数字。
- 通过单击"文件"导出校准标准的每个点的 od 值e报告.将 rod 值传输到电子表格, 并按所选区域的大小进行规范化。执行线性回归, 以获得进一步密度分析的标准曲线。
注: 确保所选区域的标签, 以确定匹配的 rod 值和样本。
- 使用专有成像软件, 使用每个部分的区域创建工具选择感兴趣的区域 (roi) 并测量其 od, 从而对自动影像学进行量化。通过为感兴趣的区域创建一个模板, 在每个部分中选择相同的区域, 该模板将被复制并手动调整为每个自动标记的大脑解剖的微小变化。通过将自动影像学与大脑地图集18进行比较, 确定 roi 的解剖结构。当比较多个处理时, 执行盲目和随机的分析, 以避免偏颇的 roi 选择。
- 通过单击"文件",将选定区域的 rod 值和大小导出到电子表格中e报告.
- 将所选 roi 的测量 rod 除以其面积, 以获得每个特定区域的密度。
- 测量板的背景的 rod, 并将相应的 rod 值和面积大小导出到电子表格中。从每个 roi 的每个 rod 值中减去平均背景信号。
- 技术复制的平均 rod,即使用同一动物的组织复制的部分。
- 使用标准曲线将 rod 转换为辐射和结合的单位,即nCi/mg 组织等价物 (te)。
注: 之所以使用 te 一词, 是因为标准是用模拟组织的材料生成的。 - 根据放射线的特异性活性 (公式 1), 通过将 nci变 mg 转化为 nmomsg/ge 来表达结合。
(2) - 若要获取特定绑定值, 请从总绑定中减去非特定绑定。
- 通过使用每种动物的技术复制平均值 (在步骤5.6 中获得), 平均每种生物复制的结合。
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Representative Results
使用所述协议, 利用小鼠大脑中的放射性 ghb 模拟 [3h] hocpca 对高亲和力 ghb 结合位点的解剖分布进行了可视化, 该模拟被切割成冠状、矢状和水平部分 (图 3).).在海马和皮层中观察到高度的结合, 在纹状体中较低的结合, 在小脑中没有发现结合, 这与以前报告的高亲和力 ghb 位点9、10的表达模式相对应。 11,12。如图所示, 解剖结构可以通过不同的切片平面进行可视化, 解剖完整性可以通过 cresyl 紫红色染色来支持。对于 ghb 高亲和力结合位点, 特别是低半径结合区 (如小脑), 随后通过组织染色得到确认 (图 3)。日冕部分在文学9,10最经常被发现。它们对于定量是实用的, 因为可以从一个大脑获得更多的部分。矢状和水平部分的优势是在一个部分内的啮齿类动物大脑中可视化结合, 从而提供了很好的概述。图 4显示了哺乳动物大脑中高亲和力 ghb 结合位点的进化守恒。[3h]在小鼠、大鼠和猪脑组织中检测到 hocpca 结合位点, 以便对不同物种之间的大脑解剖进行比较。一般来说, 进化保护和区域分布研究可能有助于对感兴趣的蛋白质进行定性, 在这种情况下是一个新的目标, 因此可能表明其生理功能19。
用 ghb 辐射剂对高亲和力 ghb 结合位点进行了研究, 该辐射剂显示了与结合位点的不同亲和力, 但具有可比的具体活动 (图 5)。[3h]hocca 以前被证明有 74 nm 的kd , 这优于市售的辐射和 [3h] ncs-382, kd 为 697 nm, 均由定量自体成像9确定为 ph 6.0。因此, [3h] hopcca 具有更高的灵敏度, 从而获得了出色的信噪比。由于 [3h] ncs-382 灵敏度较低, 必须使用较高的辐射和浓度才能获得类似水平的结合 (图 5中的 y 轴比较)。与 [3h] ghb 相比, 要达到可比的结合水平, 还需要更高的辐射和浓度 (30 nm)。这主要是由于这种辐射寡核苷酸和20的亲和力显著降低 (4.5μm 的k i) 。然而, 较高的辐射和浓度也增加了非特异性结合的水平 9,10 , 因此信噪比较低。这一系列实验突出了具有高亲和力的辐射点对于生成高质量图像的重要性。
由于高亲和力 ghb 位点在前脑区域表达到如此高的水平 (60 pmolsg17), 使用标准的三铵敏感荧光粉成像, 通过饱和曲线确定药理参数本身就很困难由于图像过饱和的风险而导致的。因此, 通过同源位移曲线首先确定 k i 值, 然后计算 k d (图 6) 9, 得到了 [3h] hocca 和 [3h]ncs-382 的 kd值 。对于大多数放射性核素, 另一种选择是使用同位素稀释, 就像通常在均质结合检测中所做的那样。此外, 在不同的 ph 值下还确定了 kd 值。显然, 高亲和力 ghb 位点的标签最有效的是 ph 6.0 (图 6a和图 6A), 因为将检测条件变化为 ph 7.4 会对配体亲和力产生重大影响。因此, ph 值7.4 下的 [3h] hocpca 的 kd 在数值上大约比 ph 6.0 时高出30倍。增加 ph 值会导致更高程度的非特异性结合, 这在使用 [3h] ncs-382 时成为一个警告, 在 ph 值7.4 时只能获得少量的特定结合 (图 6e)。这实际上妨碍了使用这种辐射寡核苷酸和生理 ph 值9确定药理参数,这再次说明了具有尽可能高的辐射寡核苷酸和高亲和力的力量。
图 1: 针对高亲和力 ghb 结合站点的辐射位点结构.[3H]3-羟基环酮-1-烯羧酸 ([3h] hopcca)14, [3h] (e, rs)-6, 7, 8, 9-四氢-5-羟基-5-苯环己基-6-乙基二烯乙酸 (ncs-382) ([3h] ncs-382)15和 [3h] γ-羟基丁酸 ([3h] ghb) 16 作为具有相当比重 (20-40 ci变 mmol)的三角辐射寡核苷酸, 以及 [125I]4-羟基-4-[4-(2-4-合氧) 苯基酸 ( [[125i] bnoph-ghb)13 , 估计摩尔活性为 2000 ci\ mmol21。ghb 结构元素以红色突出显示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:体外自体摄影协议示意图概述。(1) 动物被安乐死, 组织被解剖, 并在干冰上冷冻。然后将组织切割在低温恒温器上, 解冻安装在显微镜幻灯片上, (2) 切片用放射线和平衡结合孵育。为了确定非特定的结合, 溶液中补充的是一个没有标签的替代品的相关的, 但不完全相同的化学结构。(3) 随后, 未结合的放射性发光物通过洗涤在测定缓冲液中去除, 盐通过蒸馏 h2o 冲洗消除。当切片干燥时, 进行聚甲醛 (pfa) 固定, 以永久建立配体-蛋白质相互作用。然后, 切片暴露在荧光粉成像板中。(4) 经过足够的曝光时间后, 扫描板材以获得数字自动录像。(5) 最终, 使用感兴趣区域 (roi) 的定义进行图像分析, 并对绑定进行量化。在所示的示例中, 光学密度 (od) 在鼠标皮层 (左) 和海马 (中部) 的部分进行了说明。量化是通过将截面与 [3h] 微刻度 (右) 一起公开来完成的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 1 nm [3h] hocpca 与小鼠大脑切片结合的代表性自底图.(a) 辐射寡核苷酸结合到冠状、矢状和水平组织切片部分, 以说明切片平面对解剖结构可见性的重要性。(b) 对相应的组织切片进行 cresyl 紫罗兰色染色, 以验证解剖区域, 特别是低无半径结合区。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 1 nm [3h] hocpca 在不同物种中结合的代表性自底图。比较 (a) 大鼠、(b) 小鼠和 (c) 猪体外自底物图, 以说明结合位点与大脑大解剖的进化保护。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 通过小鼠皮层和海马脑片的体外自体定位, 对对 ghb 辐射体有不同敏感性的高亲和力 ghb 结合位点结合的定量。总结合报告为放射性寡头 (a) [3 h] hocca (1nm) 和 (b) [3h] ncs-382 (7 nm) 和 (c) [3h] ghb (30 nm) (类似的具体活动) 的 fmolg/mg 组织等价物 (te).对于任何一种辐射点, 在存在 1 mm ghb 或 1 mm hopcca 的情况下都没有检测到非特定的结合 (未显示)。数据以4个生物复制的平均值±sd 表示, 每个副本在三个技术复制中执行。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 在 ph 6.0 和 ph 7.4 的小鼠皮质切片中,通过同源竞争位移 [3h] hocca 和 [3h] ncs-382 对 kd 和b 最大值进行自交联测定的结果, 以便说明 ph 值对放射性寡头亲和力的影响。(kd和 b最大值是通过初步测定 ki值22计算的, 使用与辐射和竞争对手相同的化合物计算的)。(a) 在 ph 6.0 时结合 1 nm [3h] hocpca 的最佳信噪比的自动记录。(b) 将缓冲液 ph 值改为7.4 需要较高的 [3h] hopcca 浓度 (8 nm) 才能达到显著的结合水平。(c) 生成的对数浓度结合曲线;平均±sem. (d) 5 nm [3h] ncs-382 在 ph 6.0 处结合导致低非特异性结合, 而 (e) 40 nm [3h] ncs-382 不足以获得 ph 7.4 时的结合。(f) 生成的对数浓度结合曲线;平均±sem. 数据是从3-4 个生物复制中获得的, 每个复制在3-5 个技术复制中进行, 只有 [3 h] 在 ph 7.4 时进行了 [3h] ncs-382 实验, 仅在2个生物复制中进行。对于这两种放射性核素, 使用了 1 mm ghb 来测定非特异性结合。有关 kd 和 b最大值的分析和计算的详细信息, 请参见9。经 elsevier 批准, 对这一数字进行了改编, 并从以前的出版物9中转载。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
自体影像学检测的质量通常是由放射线的敏感性决定的。一个主要的促成因素是选定的放射性同位素, 它是根据已知配体的供应情况或特定标签技术产生具有适当特定活性 (即放射性的数量) 的配体的可行性得出的每单位摩尔的一个半径)23和有限的化学降解量。大量已知配体的放射性被贴上了9、10、24、25、26的标记, 这推断了几个优势。首先, (3h) 的特点是半衰期长 (12.43年), 促进单个批次的长期储存。其次, 配体-目标相互作用不会被放射性核素扭曲, 因为3h-配体在生物学上与其亲本化合物无法区分。发射低能β-粒子, 这些粒子在组织中的距离很短, 因此空间分辨率很高, 随后解剖结构之间的区别更大4。尽管如此, 标记只能产生适度较高的具体活动。这是因为现有的 3个h 源受到非放射性氢的污染。一般来说, 比活动越多, 产生敏感检测所需的半径就越少 23.此外, 应考虑到3h 配体有可能与水进行氢交换, 这取决于3个h 标签的稳定性。为了补偿低表达或低特异性活性, 碘-125 可作为放射性核素13。碘-125 的最大特异性活性比三元高出约100倍。然而, 在使用碘-125 时, 还必须考虑其他几个因素。例如, 碘-125 的加入通常会导致分子的结构改变, 从而影响配体-目标的相互作用。由于碘-125 的半衰期为 60天, 因此应考虑对日常衰变进行校正, 以确定特定的活性和对配体-目标相互作用的量化 23。125i-配体发射γ光子, 尽管灵敏度要高得多, 但产生低分辨率图像。这是由于分辨率与同位素的最大能量之间的反比关系 (如下文所述)。最后, 与相比, 由于放射性核素的能量较高, 在处理碘-125 时应更加小心。
根据放射性核素的不同, 组织切片厚度可能会影响分辨率。由于自吸,的低能β-辐射将其组织范围限制在约5μm。因此, 当截面厚度超过 5μm27,28 时, 定量不受组织厚度的影响。相比之下, 高能同位素的放射性衰变具有更大的组织渗透率, 从而降低图像分辨率, 因为与检测介质的距离较大的配体也有助于图像的形成。因此, 较薄的截面可提高高能放射性核素1的分辨率。
建立自体摄影协议需要了解最佳结合条件 (例如缓冲液、ph 值和温度) 以及辐射寡核苷酸在亲和力和动力学方面的药理参数。如果放射线和以前没有被描绘过, 探索性研究是必要的29。选择最佳的辐射和浓度既取决于辐射位点的亲和力, 也取决于结合位点的丰富程度。通常情况下, 浓度反映5-6 倍 kd 用于确保所有结合位点饱和 30.另一种方法旨在通过选择低于 kd 31的辐射和浓度, 同时保存辐射和溶液, 从而产生最高的总比与非特异性结合的比率。当结合位点在被检测的组织中非常丰富时, 这种方法尤其有用, 因为高辐射和浓度会增加自体脂肪图过度饱和的机会, 例如 [3h] hocpca 和高亲和力 ghb 的情况绑定站点9。此外, 为了有效地标记目标蛋白的整个种群, 放射线和理想的约束所有可能的目标构象。特别是在受体自动摄影中, 激动剂的使用可能只揭示部分的总受体, 因为有些可能存在于低亲和力激动剂状态。相反, 中性拮抗剂最常见的是显示亲和力的所有受体状态26,29。
此外, 结合实验一般是在平衡结合条件下进行的。因此, 在所需的实验条件下达到平衡结合所需的时间 (固定辐射和浓度、缓冲液和温度) 应在关联实验中确定, 以确保在所述范围内的平衡结合。实验4,23,30。在辐射和孵化后, 未绑定的辐射石被几个孵育与检测缓冲液冲走, 然后在蒸馏的h2o 中冲洗。辐射寡核苷酸的离解率为26、30、31。
放射性寡核苷酸可能表现为与非生物材料的结合,即非特异性结合。与预期目标以外的细胞成分的辐射和结合被定义为非特异性结合。非特定结合对辐射与结合总量的贡献是在存在的情况下评估的, 该配体的目标是与辐射寡核苷酸相同的结合位点。由于非放射性化合物 (取代剂) 的供应超过了 10, 000倍, 它占据了结合位点和辐射位点,只能与目标外的位点结合 26、31、32。关键的是, 未标记的化合物应具有不同的化学结构, 而辐射寡核苷酸, 因为这降低了取代特定和非特定结合23的风险。与膜结合所产生的非特异性结合可能是一个主要问题, 特别是在相当亲脂性的放射体的情况下。在某些情况下, 广泛的洗涤程序可能会去除非受体结合的放射寡核苷酸, 从而提高特定的结合比率 29。
在选择检测缓冲液时, 考虑离子强度和 ph 值对配体-目标相互作用的影响至关重要。特别是极性配体与结合位点亲水成分之间的静电相互作用受缓冲液离子强度的影响。因此, 补充一价或二价离子可能会影响有效亲和力常数 23,33。如果所研究的配体-目标相互作用的最佳缓冲液组成未知, 则应在试验实验中探索不同的公共缓冲液。缓冲器还可以补充抗氧化剂, 如抗坏血酸和降解酶的抑制剂 29,34。此外, 结合部位内或配体本身上特定基团的电离受到 ph 值的影响, 并对平衡结合常数、动力学速率常数和非特异性结合23,33有关键影响。例如, 用不同的 ghb 辐射点探测高亲和力 ghb 结合位点很好地说明了 ph 值在这个结合目标上的重要性 (图 6)。描述用于配体受体相互作用的最佳 ph 值也可以提供有关目标与其生物学相关性的重要性的线索。
数字自动摄影的另一个关键因素是曝光时间,即通过将放射性标记的组织切片暴露在荧光粉成像板上来实现可量化的自动影像学所需的时间。估计数是根据样品中的放射性量、同位素的能量和半衰期以及所需的信噪比计算的。特别是, 长时间曝光会导致饱和图像和高背景信号。通过将盒式磁带存储在铅屏蔽环境中, 可以减少升高的背景信号, 以避免宇宙辐射1,4。然而, 如果达到次优自动定位图, 样品可以暴露多次, 前提是配体-目标复合物是固定的, 而且放射性核素的半衰期允许它。
磷成像板可以重复使用, 如果处理得当, 使用寿命较长,即应避免弯曲, 并应将其存放在干燥的环境中。荧光粉成像板的处理是由它们对光和宇宙辐射的敏感性引导的。因此, 重要的是要在每次使用之前擦除板材, 以最大限度地减少背景信号。在完全没有光线的辐射屏蔽盒中, 将放射性标记的组织切片暴露在成像板上。在曝光时间结束时将板材传输到扫描仪时, 也应避免任何环境光, 因为即使与白光的短接触也会减少累积信号。此外, 应在取出样品后立即扫描板材, 以避免信号褪色。使用荧光粉成像板的一个缺点是, 在反复使用这些板1后, 可能会出现文物和残留的 "幽灵图像"。
与一起工作需要在没有保护涂层的情况下进行成像, 以使低能辐射到达荧光粉晶体。因此, 对三敏感荧光粉成像板由于处理不当而对污染或损坏更加敏感。一旦受到污染, 对三质敏感的板就不能清洗, 需要更换。用 pfa 蒸汽固定配体靶复合体可减少板材的潜在污染, 延长其使用寿命。此外, 固定后组织脱水是一个关键的步骤, 因为钛敏感板对水分敏感。由于其微妙的性质, 三敏感板不应用于其他同位素1,4。相比之下, 碘-125 等高能同位素的板材更坚固, 甚至可以用70% 的乙醇擦拭清洗其表面。
传统上, 辐射敏感膜被用于放射性衰变的空间记录。虽然可以获得高分辨率的图像, 但电影自动摄影有几个局限性。除了危险化学品的必要性和开发的暗室外, x 射线胶片的特点是动态范围狭窄。因此, 为了实现可量化的不饱和图像 35, 可能有必要在不同的曝光时间内反复暴露放射性标记的部分。此外, x 射线胶片的灵敏度有限, 导致贴有低能量同位素标签的样品的曝光时间持续,即:三铵衰变可能需要几个月的暴露。灵敏度低, 线性范围小, 使得该技术非常耗时, 特别是在必须首先确定 1,35的最佳检测条件时。
随着荧光粉成像板的发展, 其中一些限制已得到解决 35,36,37。成像板用于临时存储放射性衰变的图像, 表示放射性寡核苷酸在组织标本中的空间排列。可发光的 bafb:eu2+荧光粉晶体用于捕获样品发出的放射性能量, 因为高能辐射 (如x 射线、伽马射线或β粒子) 会导致 eu2+ 的激发到 eu3+和被释放的电子的随后捕获在荧光粉格子4,37。将成像板暴露在可见光或红外光上会逆转反应,即被捕获的电子被释放, 并且在 eu3+转换为 eu2+发光的过程中被释放。发射的光与放射性量成正比, 通过光电倍增管检测到它可以创建一个数字自动图像 37.该系统提高了灵敏度, 同时将接触时间从一个月明显缩短到第3天。除此之外, 线性动态范围也大大增加, 从而减少了过度饱和图像的发生机会。线性度在4到5个数量级内, 已反复验证 3、35、36、37、38。虽然胶片自动摄影仍然提供卓越的空间分辨率, 但扫描技术的努力使分辨率从300到 25μm (像素大小) 提高, 从而可以在解剖区域3之间进行详细区分。总体而言, 荧光粉成像板由于线性范围和灵敏度的增加, 有助于获得数字自动图像。减少了曝光时间, 简化了开发技术, 显著缩短了数据分析时间, 从而提高了吞吐量。
与自动影像学相比, 在组织同质化结合检测中应用放射性寡核苷酸也通常具有亲和力和密度等有用的药理参数。这种方法的优点是用液体闪烁探测器用液体闪烁探测器测量β发射的放射性衰变2。在多井方法中进行,例如在96 孔微滴度板中, 这种检测方法可用于筛选化合物库和更多的浓度依赖关系。除此之外, 使用此设置进行饱和分析通常比自动摄影更可行, 自动摄影显示高辐射和浓度的过度饱和图像的风险。然而, 对固定的低辐射和浓度进行同源位移, 以获得 kd和 b最大值, 则规避了过饱和图像的问题 (图 6)22。同质结合和自体造影产生类似的估计配体亲和力常数, 而组织密度的利益蛋白质可能被低估在均质结合。因此, 有人提出, 细胞膜破裂伴随组织同质化可能会导致受体丢失或改变结合条件 3,33。此外, 组织解剖中的错误可能会产生被邻近大脑区域的组织污染的均质体。相比之下, 即使是在小核中的复杂结合模式是可视化和可微的, 由于空间解剖分辨率在自动影像学 3,33。
免疫组织化学也可以解剖地观察感兴趣的蛋白质的分布。该方法能够产生具有高解剖分辨率的图像, 因为离散组织成分可以在细胞水平上识别, 甚至可以用电子显微镜在亚细胞水平上进行识别。根据染色的强度评估表达水平。然而, 由于缺乏适当的参考标准39,很难对表达水平进行绝对量化。此外, 免疫组织化学依赖于选择性的、经过验证的抗体的可用性, 这通常是受体研究中的一个问题。
在决定进行体外自动摄影之前, 需要考虑几个问题。首先, 尸检组织准备, 包括切片以及反复冻结和解冻可能会影响结合位点的保存2。此外, 该方法取决于是否有足够的辐射, 这显示了高亲和力和选择性的目标在问题 2。辐射点不应显示出与目标外位点的显著结合, 也应表现出良好的动力学剖面。这是必要的, 因为在实验范围内, 配体目标复合体必须保持完整。此外, 当存在适当的非放射性化合物时, 引入放射性核素可能成为一个关键因素。因此, 感兴趣的分子应配备适当的官能团, 以有效地进行放射性标记, 从而能够生产具有足够高的特异活性和化学稳定性的放射性核素 40。体外自动摄影的另一个缺点是, 这种方法只允许使用动物一次.更优雅的是对体内成像方法 (如位置发射断层扫描 (pet) 的扩展, 它可以重复扫描同一动物, 并确定占用率和动态结合特性。pet 对于研究高级哺乳动物41 和临床前42、43、44的剂量优化特别有价值。
对自体摄影技术的一些修改扩展了其在健康和患病状态下药理靶标的表征以及药物发现和开发方面的应用。首先, 成像技术的最新进展导致了实时自动摄影技术的发展。αβ粒子的气体探测器通过直接测量分解, 无需成像板或薄膜, 从而产生快速的数字自动图像45。
此外,体外自体摄影使 g 蛋白偶联受体 (gpcr) 的功能的功能的基础上, 其解剖分布在尸检组织的信息。该方法的这一变种涉及用放射性标记的三磷酸鸟苷类似物 (gtp) 培养组织切片,即[35s] 鸟苷 5 '-γ-硫代磷酸盐 ([35s] gtp2s), 以及的非放射性激动剂。当激动剂结合并引起 gpcr 的反应时, [35s] gtpγs 的结合可以通过自动影像学进行局部化和量化, 这只反映了激活的受体群2,46,47.
体外自动摄影代表了另一种版本的技术, 它评估了辐射寡核苷酸的区域结合和给药后对活体实验动物的关系。在动物的牺牲后, 对有关组织进行冷冻标记, 并进行自动摄影接触, 形成反映体内辐射寡聚和结合2的自动影像学。体外自体摄影通常用于药物发现和开发计划, 以获得有关铅化合物的药代动力学特征的信息,即其吸收、分布、代谢和排泄 (adme).特别是全身自动摄影为所有器官和组织提供了有关药物分布的见解。然而, 与体外自动影像学相比, 非特异性结合和定量的测定更为困难, 因为放射线可能代谢和降解, 而且没有办法洗掉未结合的配体48。
自动影像学也用于 pet 配体4的初步测试和表征。高能放射性核素碳-11 和氟-18 最常用于 pet 配体。pet 是辐射寡核苷酸的一个突出的、非侵入性的应用, 因为可以获得活体动物中的放射性结合的可量化的三维图像,40,49.
利用荧光粉成像板进行体外自体影像学检查是一种有价值的方法, 用于配体-靶相互作用的药理表征。一旦建立了最佳的检测条件, 该方法将采用相对快速和简单的协议, 从而产生可重现的结果。感兴趣的蛋白质的解剖分布是在其本地微环境中确定的, 这使得研究其在实验动物健康和患病的尸检组织中的生理、药理和病理作用以及人类2,47。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了 lundbeck 基金会 (grant r133-a12270) 和 novo nordisk 基金会 (grant nnf0c0028664) 的支持。提交人感谢 alešmarek 博士提供的 [3h] 辐射寡核苷酸。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Merck Millipore | 107017 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BAS-TR2040 Imaging Plate | GE Healthcare Life Science | 28956481 | 20x40 cm - Sensitive to tritium |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) | Merck Millipore | 100579 | |
| O.C.T. Compound, 12 x 125 mL | Sakura | 4583 | Tissue-Tek |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 631-9483 | microscope slides |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura Finetek Denmark ApS | 4451 | |
| Tritium Standard on Glas | American Radiolabeld Chemicals, Inc. | ART 0123 | |
| Xylene substitute | Sigma-Aldrich | A5597 |
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