Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Autoradiografi som en enkel og kraftfuld metode for visualisering og karakterisering af farmakologiske mål

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

Metoden for Autoradiografi bruges rutinemæssigt til at studere bindingen af radioligands til væv sektioner for bestemmelse af kvalitative eller kvantitative farmakologi.

Abstract

In vitro Autoradiografi sigter mod at visualisere anatomiske fordelingen af en protein af interesse i væv fra såvel forsøgsdyr som mennesker. Metoden er baseret på specifikke bindingen af en radioligand til sine biologiske mål. Derfor, frossen væv sektioner inkuberes med radioligand løsning, og bindingen til målet er efterfølgende lokaliseret ved påvisning af radioaktivt henfald, for eksempel ved hjælp af lysfølsomme film eller fosfor imaging plader. Resulterende digital autoradiograms vise bemærkelsesværdige rumlige opløsning, der giver mulighed for kvantificering og lokalisering af radioligand binding i forskellige anatomiske strukturer. Derudover kvantificering giver mulighed for den farmakologiske karakterisering af ligand affinitet med dissociation konstanter (Kd) samt hæmning konstanter (Kjeg) og massefylden af bindingssteder (Bmax) i udvalgte væv. Således giver metoden, der oplysninger om både målet lokalisering og ligand selektivitet. Her, er teknikken eksemplificeret med autoradiographic karakterisering af høj-affinitet γ-hydroxybutyric syre (GHB) bindende websteder i pattedyr hjernevæv, med særlig vægt på metodiske overvejelser vedrørende bindende assay parametre, valget af radioligand og påvisningsmetoden.

Introduction

Autoradiografi er en metode, der giver billeder af radioaktivt henfald. Teknikken bruges rutinemæssigt til at studere væv distribution af et protein af interesse i vitro baseret på en specifik farmakologisk samspillet mellem en radioaktive stof og sit mål. Dette giver direkte oplysninger om selektivitet af liganden for målet. In vitro Autoradiografi kan også anvendes til kvantitativ bestemmelse af farmakologiske bindingsparametrene af radioligands, såsom dissociationskonstant (Kd) og tæthed af bindingssteder (Bmax), samt til bestemmelse af hæmning konstant (Kjeg) af konkurrerende ligander1,2. Sammenlignet med traditionelle homogenatet radioligand bindende, har Autoradiografi fordelen at være i stand til at visualisere rumlige anatomi og med kortfattet angivelse af regionale udtryk mønstre3. Metoden til Autoradiografi er derfor et relevant alternativ til immuncytokemi, især i mangel af en valideret antistof. Autoradiografi er nemt at implementere i en standard radioisotop laboratorium givet tilgængeligheden af en passende radioligand med den påkrævede farmakologiske specificitet, adgang til en mikrotom kryostaterne til forberedelse af væv sektioner, og en egnet imaging enhed, der er i stand til at analysere fordelingen af radioaktivitet i afsnittene respektive væv. Navnlig er en vigtig udvælgelseskriterium for radioligand en begrænset mængde af binding til ikke-målarter websteder. Dette kan være at andre proteiner, membraner eller materialer som plast eller filtre, og er kollektivt benævnt ikke-specifik binding. Normalt, ikke-specifik binding er ikke-mættet men kan være mættet, hvis det drejer sig om en bestemt ud-target protein. Den bedste måde at validere sande specifikke bindende er at sammenligne med væv mangler mål, fxgenetisk manipuleret (knock-out) væv4.

Her, er metoden, der illustreret med en autoradiographic karakterisering af høj-affinitet bindingssted for γ-hydroxybutyric syre (GHB) i hjernen, pattedyr. Forstå den farmakologiske interaktion mellem GHB og sit bindingssted er relevant som GHB er både et klinisk nyttigt lægemiddel i behandling af narkolepsi og alkoholisme5, men også en naturlig bestanddel af pattedyr hjernen og et rekreativt Drug6. Høj-affinitet GHB bindingssteder blev først beskrevet ved hjælp af [3H] GHB binding til rotte hjernen homogenatet7. I år, yderligere Autoradiografi undersøgelser med [3H] GHB og analog [3H] NCS-382 har viste en høj tæthed af bindende websteder i forhjernen regioner af rotte8,9,10, mus9 , gris11og abe/menneske hjernen12. Imidlertid har den molekylære identitet og nøjagtige funktionelle relevansen af disse bindingssteder forblev undvigende.

Med hensigten yderligere karakterisere bindingsstederne og lette undersøgelser på den fysiologiske rolle af GHB, flere radioligands inkorporerer forskellige isotoper begavet med forskellige tilhørsforhold har udviklet ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA og [125jeg] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revideret i17) (figur 1). Kombination af selektiv høj-affinitet radioligands og en meget høj væv tæthed af bindingen websteder har tilladt til fremstilling af billeder i høj kvalitet ved hjælp af fosfor imaging teknik9,11. Sammen med en skitse af de praktiske punkter i oprettelsen af et autoradiographic eksperiment og en illustration til at eksemplificere detaljer, vil afsnittet diskussion understrege i) valget af radionuklid, ii) valget af assay betingelser og iii) anvendelse af fosfor Imaging plader versus X-ray film. Det overordnede mål med dette papir er at give videnskabelige, tekniske og metodiske detaljer på Autoradiografi teknik for at informere om væv distribution og farmakologiske analyse af protein mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr håndtering blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra den danske dyr eksperimenter inspektorat.

Bemærk: Protokollen beskrevet her dækker væv forberedelse (dvs., mus hjernevæv), in vitro- autoradiographic analysen i tilstrækkelige detaljer til at konfigurere metoden i en ny lab, eksponering for fosfor imaging plader samt efterfølgende densitometric analyse af autoradiograms (figur 2) med formålet at lokalisere og kvantificere radioligand binding i forskellige anatomiske strukturer. For histologiske sammenligning er en protokol for cresyl violet farvning inkluderet. Bestemmelse af ikke-specifik binding med en konkurrerende ligand er desuden medtaget i protokollen. For en detaljeret beskrivelse af, hvordan at bestemme Kd, Bmax eller K,jeg, se tidligere publikation4.

1. væv forberedelse af Cryosectioning

  1. Aflive mus af cervikal dislokation og straks dissekere ud af hjernen ved hjælp af saks og pincet. Direkte videre til det næste trin at undgå vævsskader.
  2. Snap-freeze væv ved neddykning i pulveriseret tøris, gasformige CO2 eller isopentane. Direkte overføre den frosne væv til en kryostaten med temperaturen indstillet til-20 ° C. Alternativt kan du gemme væv ved-80 ° C indtil behandling.
    Bemærk: Undgå gentagne optøning/nedfrysning for at reducere vævsskade.
  3. Lad vævet acclimate til-20 ° C i kryostaten i 20 min. før yderligere behandling for at undgå væv brud.
  4. Dække væv indehaveren med indlejring medium uden for kryostaterne og hurtigt sted frossen væv prøven i den ønskede retning, mens indlejring mediet er stadig flydende. For eksempel, Placer musen hjerne vertikalt op på cerebellum opnå rostralt koronale sektioner. Overføre væv indehaveren tilbage til kryostater og udsætte temperaturer nedenfor indlejring mellemlang-10 ° C til hærdning.
    Bemærk: Skrøbelige væv modellen skal være belagt med indlejring medium inden for væv formene før montering.
  5. Position væv indehaveren i mikrotomen af kryostaterne. Justere retningen af væv til at undgå skrå afsnit.
  6. Skære væv med vejledning af et stereotaxisk atlas18 i dele af ønskede tykkelse (12 µm anbefales til [3H] mærket ligander). Forsigtigt glatte og udfolde sektion med en børste af lille størrelse, hvis det er nødvendigt og tø-mount afsnittet på et objektglas. Sekventielt indsamle afsnittene fra region af interesse for ønskede tekniske replikation (fx, 4 sektioner pr. dias).
  7. Tillad sektioner på dias til at lufttørre i 1 time før videre håndtering.
    Bemærk: Tilsætning af tørremiddel materiale til dias kasser minimerer fugt opbygge på afsnittene væv. Procotol kan blive standset her ved at gemme sektioner langsigtede i dias kasser ved-80 ° C.

2. in vitro Autoradiografi

Forsigtig: radioaktivitet. Arbejde i et certificeret laboratorium i overensstemmelse med lokale regulativer. Bær beskyttende tøj. Overensstemmelse med radioaktivt henfald eller outsource til en certificeret virksomhed.

  1. Tø sektioner i mindst 30 min. ved stuetemperatur (RT). Label dias med forsøgsbetingelser. Bruge en blyant, fordi diasene vil blive badet i ethanol under efterfølgende farvning.
  2. Placere dias vandret i plastik bakker.
    Bemærk: Positionering dias på en ophøjet platform inden for plastik bakker letter deres håndtering.
  3. Pre incubate afsnittene monteret på dias i analysebuffer justeret til target pågældende (for GHB protokollen, 50 mM KHPO4 buffer pH 6.0 bruges) ved omhyggeligt at anvende en passende mængde i diaset (700 µL til 3-4 gnaver koronale sektioner).
    Bemærk: Sørg for, at hvert afsnit er dækket helt med væske.
    1. Dække de plastik bakker med låg for at undgå fordampning og pre inkuberes ved relevante temperatur (for GHB protokol pre incubate for 30 min på RT) under konstant blid (20 rpm) ryster på en plade shaker.
    2. Til bestemmelse af ikke-specifik binding, supplere analysebuffer med relevante koncentration af umærkede sammensatte (for GHB protokol, 1 mM GHB).
      Bemærk: Præ-inkubation kan ikke være nødvendigt.
  4. Hæld præ-inkubation væske fra hvert dias og overføre dias tilbage til plast bakke.
  5. For at undgå dehydrering, inkuberes straks sektioner med relevante koncentrationen af radioligand i analysebuffer ønskede betingelser (for GHB protokol, 1 nM [3H] HOCPCA for 1 h i RT) ved at dække sektioner helt med radioligand løsning (700 µL til 3-4 gnaver koronale sektioner).
    1. Inkuber under konstant blid (20 rpm) ryster af plastik bakker med lukket låg.
      Bemærk: Radioligand koncentration kan valideres ved at tælle en alikvot i en flydende scintillation counter.
  6. Fjerne inkubation løsning ved at hælde ud af væsken og overføre dias i et mikroskop dias rack. Straks gå videre til næste trin for at undgå afsnit dehydrering.
  7. Vask dias. GHB-protokollen vask med iskold analysebuffer to gange for 20 s og derefter skylles to gange ved dypning dias rack i bakkerne fyldt med iskolde destilleret vand for at fjerne salte. Placer dias lodret i stativer til lufttørring i mindst 1 time på RT eller tør dias i 5 min. med en blæser sat til kold temperatur.
    Bemærk: Vask skal optimeres, fxomfattende vask kan være nyttige for faldende ikke-specifik binding.
  8. Overføre dias til en fiksator, der indeholder PARAFORMALDEHYD (PFA) pulver til natten fiksering med PFA dampe på RT for at beskytte integriteten af ligand-mål-komplekset.
    Forsigtig: PFA er giftigt. Positionthe fiksator i fume hood og undgå hud/øjenkontakt med PFA.
  9. Den følgende dag, overføre dias til en ekssikkator kasse indeholdende silica gel til 3 h i RT at fjerne fugt.

3. eksponering for fosfor Imaging plader og Scanning

  1. Placere sektionerne i en stråling-skærmet imaging plade kassette med vævet opad. For efterfølgende kvantificering af radioligand bindende, omfatte en [3H] mikroskala i hver kassette. Arrangere afsnittene tilfældigt og udsætte sektioner for direkte sammenligning i den samme kassette.
  2. Slette tritium-følsomme fosfor imaging plade umiddelbart før brug for at fjerne akkumuleret signaler fra opbevaring og til at fjerne baggrunden signaler. Derfor, læg pladen i fosfor tænkelig maskine og udsættes for synlige/infrarød lys efter instrukser fra fabrikanten.
  3. Fjerne pladen fra fosfor tænkelig maskine og straks placerer det på sektionerne i kassetten. Kontroller, at kassetten er lukket helt. Udsætte sektioner til fosfor imaging pladen i 3 dage på RT afskærmet fra lyset.
  4. Fordi lys sletter signal fra den billeddiagnostiske plade, omhyggeligt åbne kassetten i mørke og straks overføre imaging pladen ind i boksen mørke af en fosfor imager eller placere fosfor imager i et mørkt rum.
    Bemærk: Sørg for at notere den rumlige arrangement af diasene under eksponering for at identificere individuelle modellen på det digitale billede efter analyse. Derfor, fosfor imaging plader også vise et hjørne skåret i en særskilt vinkel for at identificere den korrekte orientering af plade på det digitale billede.
  5. Skan plade med den højeste opløsning, muligt at opnå et digitalt billede.

4. valgfri: Cresyl Violet farvning af væv sektioner

  1. Forberede 1% cresyl violet løsning ved at blande 5 g af cresyl violet acetat i 500 mL deioniseret vand (dH2O) indtil opløst (ca 2 h). Der filtreres gennem et filtrerpapir, ved hjælp af en tragt ind i en ny 500 mL flaske. Justere pH på 3,5-3,8.
  2. Placer slide farvning sæt under stinkskab. Forbered bakker med de følgende løsninger i hvid polypropylen bakker (undtagen xylen):
    a. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% ethanol
    d. 100% ethanol
    e. 100% dH2O
    f. 1% cresyl violet
    g. 0,07% eddikesyre (tilføje 175 µL af eddikesyre til 250 mL af dH2O).
    h. 100% xylen i grøn solvens-resistente bakker
    i. 100% xylen i grøn solvens-resistente bakker
  3. Overføre dias til stinkskab og placere dem i et dias rack.
  4. Opløses lipider gennem stigende sorterede serie af ethanol i dH2O i 100% ethanol (bakke a-d) ved at dyppe dias i 1 minut.
  5. Rehydrere modellerne til dH2O ved faldende koncentrationer ethanol (bakke a-d i omvendt rækkefølge, efterfulgt af bakke e) ved at dyppe dias i 1 minut.
  6. Fordyb modellerne i cresyl violet løsning i 10 min.
  7. Skyl enhederne i 0,07% eddikesyre ved at løfte slides op og ned forsigtigt for 4-8 s. vask dias ved at dyppe i dH2O for 1 min.
  8. Dehydrere prøverne ved nedsænkning af dias til 30 s i stigende koncentrationer ethanol (bakke a-d).
  9. Overføre prøver gennem to bakker 100% xylen (bakke h og i) til at slukke ethanolen.
  10. Rehydrere modellerne til dH2O ved faldende koncentrationer ethanol (bakke a-d i omvendt rækkefølge, efterfulgt af bakke e) ved at dyppe dias i 1 minut.
  11. Fjern dias fra saltvand med pincet. Tilsæt et par dråber af organisk opløsningsmiddel montering media pr. slide og tilføje en 24 x 60 mm coverslip ovenpå at beskytte prøver. Fjerne luftbobler mellem modellen og coverslip ved forsigtigt at trykke på coverslip.
    Bemærk: Hold de resterende dias i xylen under montering til at forhindre udtørring.
  12. Tør dias natten over i et stinkskab på RT.
  13. Få et billede af modellen med et mikroskop og 1,25 X mål.

5. densitometric analyse af digitale billede

  1. Måle relative optisk tætheder (stænger) af hver kalibreringsstandardens fra [3H] individuel med en billede analyse software.
    1. Vælg et område af samme størrelse for hver [3H] mikroskala benytter en værktøj til oprettelse af regionen fra menupunktet Region bestemmelse. Tildele et nummer til hver valgte område ved at klikke på nummeret under menupunktet etiket.
    2. Eksportere OD-værdier for hvert punkt i kalibreringsstandardens ved at klikke på fil | E ksporter | 2D region rapport. Overføre stang værdier til et regneark og normalisere af størrelsen af det valgte område. Udføre lineær regression for at opnå en standardkurve for yderligere densitometric analyse.
      Bemærk: Sørg for, at de udvalgte områder er mærket for at identificere matchende stang værdier og prøver.
  2. Udføre kvantificering af autoradiograms ved hjælp af proprietære imaging software ved at vælge regionen af interesse (ROI) ved hjælp af en Region oprettelsen værktøj i hver sektion og måle dens ODs. Vælg det samme område i hver sektion ved at oprette en skabelon for det pågældende område, som er kopieret og manuelt justeres mindre ændringer i hjernen anatomi for hver autoradiogram. Identificere ROI anatomi ved sammenligning af autoradiograms med en hjerne atlas18. Når flere behandlinger sammenlignes, udføre analyse blindet og randomiseret for at undgå partiske udvalg af ROIs.
  3. Eksport stang værdier og størrelser af udvalgte områder i et regneark ved at klikke på fil | E ksporter | 2D region rapport.
  4. Opdele den målte stang af den valgte ROI af dets område at opnå tæthed pr. specifikke område.
  5. Måle stang på baggrund af pladen og eksport tilsvarende stang værdier og størrelse i et regneark. Subtraher det gennemsnitlige baggrundskoncentrationer signal fra hver stang værdien af hver ROI.
  6. Gennemsnit stænger af tekniske replikater, dvs., afsnit replikater ved hjælp af væv fra de samme dyr.
  7. Bruger standardkurven til at konvertere stænger i enheder af radioligand binding, dvs., nCi/mg væv ækvivalenter (TE).
    Bemærk: Sigt TE bruges fordi standarder er genereret med materialer simulerer væv.
  8. Express bindende ved omdannelse af nCi/mg nmol/mg TE efter den specifikke aktivitet af radioligand (ligning 1).
    Equation(1)
  9. For at opnå specifikke bindingsværdier, trække ikke-specifik binding fra samlede bindende.
  10. Gennemsnitlige bindingen af alle biologiske replikat ved hjælp af gennemsnittet af tekniske replikater af hvert enkelt dyr (fremstillet i trin 5.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af beskrevet protokollen, anatomiske fordelingen af høj-affinitet GHB bindingssteder blev visualiseret med det radioaktive GHB analoge [3H] HOCPCA i mus hjerne, som var skåret i vandrette, koronal og sagittal sektioner (figur 3 ). Høje niveauer af bindende blev observeret i hippocampus og cortex, lavere bindende i striatum og ingen bindende blev opdaget i lillehjernen, svarende til tidligere rapporteret udtryk mønstre af høj-affinitet GHB websteder9,10, 11,12. Som vist her, de anatomiske strukturer kan visualiseres ved hjælp af forskellige skære fly og anatomiske integritet kan støttes af cresyl violette pletter. For GHB høj-affinitet bindingssteder, er især regioner med lav radioligand bindende, såsom lillehjernen, bekræftet med efterfølgende farvning af væv (figur 3). Koronale sektioner er oftest findes i litteraturen9,10. De er praktiske til kvantitative formål som et højere antal sektioner kan fås fra en hjerne. Sagittal og horisontale sektioner har fordelen at visualisere bindende i det meste af den gnaver hjernen inden for én sektion hvilket giver godt overblik. Figur 4illustrerer den evolutionære bevarelse af høj-affinitet GHB bindingssteder i pattedyr hjernen. [3H] HOCPCA bindingssteder blev opdaget i mus, rotte samt som pig hjernevæv muliggør sammenligning af brutto hjernen anatomi mellem arter. Generelt, evolutionær bevarelse og regionale fordeling undersøgelser kan støtte betydeligt i karakterisering af et protein af interesse, i dette tilfælde en roman mål, og dermed kan give indikationer om den fysiologiske funktion19.

Høj-affinitet GHB bindingssteder var probed med GHB radioligands, som viser forskellige tilhørsforhold for bindingssteder, men tilsvarende specifikke aktiviteter (figur 5). [3H] HOCPCA var tidligere vist sig at have en Kd 74 nM, som er overlegen i forhold til de kommercielt tilgængelige radioligand [3H] NCS-382 med en Kd af 697 nM, begge opgjort på pH 6.0 ved kvantitative Autoradiografi9. Således [3H] HOCPCA er udstyret med meget højere følsomhed, fører til en fremragende signal / støj-forhold. På grund af den lavere følsomhed af [3H] NCS-382, højere radioligand koncentrationer skal anvendes til at opnå lignende niveauer af bindende (sammenligne y-axes i figur 5). I forhold til [3H] GHB, endda højere radioligand koncentrationer (30 nM) er nødvendige for at opnå sammenlignelige bindende niveauer. Dette er overvejende på grund af de betydeligt lavere affinitet (Kjeg på 4,5 µM) af denne radioligand20. Imidlertid øger højere radioligand koncentration også niveauet af ikke-specifik binding9,10 med en derfor lavere signal / støj-forhold. Denne serie af eksperimenter fremhæver vigtigheden af at have en høj-affinitet radioligand for at producere høj kvalitet billeder.

Fordi de høj-affinity GHB sites er udtryk for så høje niveauer i forhjernen regioner (60 pmol/mg17), er bestemmelse af farmakologiske parametre af mætning kurver i sagens natur svært ved hjælp af standard tritium følsomme fosfor imaging plader på grund af risikoen for overmættede billeder. Derfor Kd værdier for [3H] HOCPCA og [3H] NCS-382 har opnået ved første afgørende Kjeg værdier af homologe forskydning kurver, og derefter beregning af Kd (figur 6)9. For de fleste radioligands, ville en alternativ være at bruge isotop-fortynding som sker rutinemæssigt i homogenatet bindende assays. Desuden er Kd værdier fastsat på forskellige pH-værdier. Åbenbart, høj-affinitet GHB websteder mærkes mest effektivt ved pH 6.0 (figur 6A og figur 6D), da skiftende assay betingelser, pH 7,4 væsentligt påvirke ligand affinitet. Således, at Kd for [3H] HOCPCA ved pH 7,4 er ca. 30 gange større numerisk end ved pH 6.0. Stigende pH yderligere resulterer i en højere grad af ikke-specifik binding, som bliver en advarsel, når du bruger [3H] NCS-382 hvor kun små mængder af særlige bindende kan fås ved henvendelse til pH 7,4 (figur 6E). Dette hindrer faktisk bestemmelse af farmakologiske parametre ved hjælp af denne radioligand ved fysiologisk pH9, igen illustrerer kraften i at have en radioligand med som høj affinitet som muligt.

Figure 1
Figur 1: strukturer af radioligands rettet mod de høj-affinity GHB bindingssteder. [3H] 3-hydroxycyclopent-1-en carboxylsyre ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - tetrahydro-5-hydroxy-5H- benzocyclohept-6-ylidene eddikesyre (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 og [3H] γ-hydroxybutyric syre ([3H] GHB)16 som tritiumholdigt radioligands med sammenlignelige specifik aktivitet (20-40 Ci/mmol) samt [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125jeg] BnOPh-GHB)13 med en anslået molar aktivitet af 2000 Ci/mmol21. GHB strukturelle element er fremhævet med rødt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk oversigt over protokollen af in vitro- Autoradiografi. (1) dyret er aflivet, væv er dissekeret og snap-frosset på tøris. Væv er derefter sectioned på en kryostaten, tø-monteret på objektglas og (2) sektioner er inkuberes med radioligand indtil ligevægt bindende. Til bestemmelse af ikke-specifik binding, er løsninger suppleret med et umærket displacer på en beslægtet men ikke identiske kemiske struktur. (3) efterfølgende, ubundne radioligand fjernes ved vask i analysebuffer og salte er elimineret ved skylning med destilleret H2O. Når afsnittene er tørre, er PARAFORMALDEHYD (PFA) fiksering udført for at permanent etablere ligand-protein interaktion. Sektioner er derefter udsat for fosfor imaging plader. (4) efter tilstrækkelig eksponeringstid scannes plader for at få digitale autoradiograms. (5) i sidste ende billedanalyse udføres ved hjælp af definitioner af regioner af interesse (ROIs), og bindingen er målbare. I eksemplet vist er optisk tætheder (ODs) illustreret i dele af musen cortex (venstre) og hippocampus (midten). Kvantificering foretages ved at udsætte sektioner sammen med [3H] individuel (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentant autoradiograms af 1 nM [3H] HOCPCA binding til musen hjerne sektioner. (A) Radioligand binding til koronale, sagittal og horisontale væv sektioner til at illustrere betydningen af den skæring fly på synligheden af anatomiske strukturer. (B) Cresyl violet farvning af tilsvarende væv afsnit til at kontrollere anatomiske regioner, særligt regioner med lav/fraværende radioligand bindende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative autoradiograms af 1 nM [3H] HOCPCA binding i forskellige arter. Sammenligning af (A) rotte, (B) mus og (C) gris in vitro- autoradiograms for at illustrere evolutionære bevarelse af bindende websteder til kortikale og hippocampus regioner sammen med grov hjernen anatomi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Kvantificering af binding til høj-affinitet GHB bindingssteder med forskellig følsomhed at GHB radioligands af in vitro- Autoradiografi i hjernen skiver fra mus cortex og hippocampus. Samlede bindende er rapporteret som fmol/mg væv ækvivalenter (TE) for radioligands (A) [3H] HOCPCA (1 nM) og (B) [3H] NCS-382 (7 nM) og (C) [3H] GHB (30 nM) (tilsvarende specifikke aktiviteter). Ikke-specifik binding blev ikke fundet i nærværelse af 1 GHB eller 1 mM HOCPCA for nogen af radioligands (ikke vist). Data er præsenteret som betyder ± SD af fire biologiske replikater hver udført i tre tekniske replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative resultater af autoradiographic bestemmelse af Kd og Bmax værdier af homologe konkurrencedygtige forskydning af [3H] HOCPCA og [3H] NCS-382 i mus kortikale sektioner på pH 6.0 og pH 7,4 for at illustrere pH indflydelse på affinitet af radioligands. (Kd og Bmax blev beregnet ved hjælp af det samme stof som radioligand og konkurrent, gennem indledende bestemmelse af Kjeg værdier22). (A) Autoradiograms med optimale signal-støj-forholdet til 1 nM [3H] HOCPCA bindende ved pH 6.0. (B) ændre buffer pH til 7.4 kræver en højere [3H] HOCPCA koncentration (8 nM) at opnå betydelig bindende niveauer. (C) resulterende log-koncentration bindende kurver; betyde ± SEM. (D) 5 nM [3H] NCS-382 bindende ved pH 6.0 resulterer i lave ikke-specifik binding, mens (E) 40 nM [3H] NCS-382 er utilstrækkelige til at indhente bindende ved pH 7,4. (F) resulterende log-koncentration bindende kurver; betyde ± SEM. Data blev indhentet fra 3-4 biologiske replikater hver udført i 3-5 tekniske replikater, kun [3H] NCS-382 eksperimenter på pH 7,4 blev udført med kun 2 biologiske replikater. For begge radioligands, 1 mM GHB blev brugt til bestemmelse af ikke-specifik binding. Du kan finde flere oplysninger om analyse og beregning af Kd og Bmax,9. Dette tal er blevet tilpasset og Genoptrykt fra tidligere publikation9 med tilladelse fra Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvaliteten af en autoradiographic analyse bestemmes oftest af følsomheden af radioligand. En stor medvirkende faktor er den valgte radioisotop, der er givet af tilgængeligheden af kendte ligander eller af gennemførligheden af specifik mærkning teknikker til at give ligander med passende specifikke aktivitet (dvs., mængden af radioaktivitet per enhed mol af en radioligand)23og med begrænsede mængder af kemiske nedbrydning. Et stort antal radioligands af kendte ligander er mærket med tritium9,10,24,25,26, som udleder flere fordele. For det første er tritium (3H) kendetegnet ved en lang halveringstid (12.43 år) at fremme langsigtede oplagring af individuelle batcher. For det andet, ligand-target interaktion ikke fordrejes af radionuklid som 3H-ligander er biologisk skelnes fra deres overordnede forbindelser. Tritium udsender lavenergi β--partikler, som kun korte afstande i væv resulterer i høj rumlige opløsning og efterfølgende, større skelnen mellem anatomiske strukturer4. Ikke desto mindre, der tritium mærkning, kan der kun produceres for at give moderat høje specifikke aktiviteter. Herved at ledige 3H-kilder er forurenet med ikke-radioaktive brint. Generelt, jo højere den specifikke aktivitet, det mindre radioligand er nødvendig for at give følsomme påvisning23. Desuden bør det overvejes at 3H-ligander har mulighed for at gennemgå brint udveksling med vand afhængig af stabiliteten af 3H-etiket. For at kompensere for lav udtryk eller for lav specifik aktivitet, kan jod-125 bruges som radionuklid13. Maksimal specifik aktivitet af jod-125 er ca. 100-fold højere end for tritium. Flere yderligere overvejelser skal dog gøres, når du arbejder med jod-125. For eksempel, inducerer tilsætning af jod-125 normalt strukturelle ændringer i molekyle, der kan påvirke ligand-target interaktioner. Som jod-125 har en halveringstid på 60 dage, betragtes som korrektion for daglige forfald for specifikke aktivitet og kvantificering af ligand-target interaktioner23. 125 Ligander udsender γ-fotoner og trods meget højere følsomhed, producere lavere opløsning billeder. Dette skyldes den omvendt forhold mellem beslutning og den maksimale energi af isotop (som drøftet nedenfor). Endelig, i forhold til tritium, øget bør udvises forsigtighed ved håndtering af jod-125 på grund af den højere energi samt isotopens.

Afhængigt af nuklid, kan væv snittykkelse påvirke beslutningen. Lavenergi-β--stråling af tritium begrænser sin væv rækkevidde til ca. 5 µm på grund af selvoptagethed. Som følge heraf er kvantificering ikke påvirket af væv tykkelse når snittykkelsen overstiger 5 µm27,28. Derimod har radioaktivt henfald af højenergi isotoper en større væv penetration, hvilket resulterer i lavere billedopløsning, fordi ligander med en større afstand til påvisning medium også bidrager til billedet dannelse. Følgelig fremme tyndere dele højere opløsning for højenergi radionuklider1.

Etablering af en autoradiographic protokol kræver kendskab til optimal bindende betingelser (f.eks.buffer, pH og temperatur) og farmakologiske parametre af radioligand affinitet og kinetik. Hvis radioligand ikke har været præget før, er sonderende undersøgelser nødvendige29. At vælge en optimal radioligand koncentration er guidede både affinitet af radioligand og overfloden af bindende websteder. Normalt, anvendes en koncentration, som afspejler 5 - 6 gange Kd for at sikre at alle bindingssteder er mættede30. En anden tilgang sigter mod at give det højeste forholdet mellem alt-til-ikke-specifik binding ved at vælge radioligand koncentrationer under Kd31 og gemme radioligand løsning på samme tid. Denne fremgangsmåde er især nyttig, når bindingssted er meget rigelige i de undersøgte væv, da høje radioligand koncentrationer vil øge chancen for oversaturating autoradiograms, som den sag for [3H] HOCPCA og høj-affinitet GHB bindende websteder9. Derudover så effektivt mærke hele befolkningen i den målrettede protein, bør radioligand ideelt binde til alle mulige mål konformationer. Især i receptor Autoradiografi, kan brugen af agonister kun afsløre en delvis antal samlede receptorer, da nogle kan være til stede i lav-affinitet agonist stater. Derimod vise neutral antagonister oftest affinitet for alle receptor stater26,29.

Derudover er bindende eksperimenter generelt udført under ligevægtsforhold bindende. Derfor tid til at nå ligevægt bindende under de ønskede forsøgsbetingelser (fast radioligand koncentration, buffer og temperatur) bør fastsættes i foreningen eksperimenter at sikre ligevægt bindende inden for rammerne af den eksperiment4,23,30. Efter radioligand inkubation, ubundne radioligand vaskes af flere inkubationer med analysebuffer og typisk efterfulgt af skylning i destilleret H2O. Signal-støj forhold kan optimeres ved at justere temperatur og tid afhængigt af den dissociation sats på radioligand26,30,31.

Radioligands kan vise bindende til ikke-biologiske materialer, dvs., ikke-specifik binding. Radioligand binding til cellulære komponenter end de tilsigtede mål er defineret som uspecifik bindende. Bidrag af uspecifik binding til det samlede beløb for radioligand bindende er vurderet i overværelse af en konkurrerende umærkede ligand, der er rettet mod den samme bindingssted som radioligand. Som de ikke-radioaktivt stof (displacer) er leveret 10,000-fold overskydende, det indtager bindingssted og radioligand kan kun bindes til off-target websteder26,31,32. Afgørende, bør det umærkede sammensatte være af en anden kemisk struktur end radioligand da dette sænker risikoen for fortrænger både specifikke samt ikke-specifik binding23. Ikke-specifik binding som følge af binding til membraner kan være et stort problem især for temmelig lipofile radioligands. I nogle tilfælde kan omfattende vask procedurer fjerne ikke-receptor bundne radioligand og derfor forbedre de specifikke bindende nøgletal29.

Når du vælger en analysebuffer, er det afgørende at overveje effekten af Ioniske styrke og pH på ligand-target interaktion. Især elektrostatisk interaktioner mellem polar ligander og hydrofile komponenter af bindende websteder er påvirket af den ioniske styrken af bufferen. Derfor kan tilskud med monovalent eller divalent ioner påvirker effektiv affinitet konstant23,33. Hvis optimal buffer sammensætning for studerede ligand-target interaktion er ukendt, bør forskellige fælles buffere undersøges i pilotforsøg. Buffere kan også suppleres med anti-oxidanter som ascorbinsyre og hæmmere af nedværdigende enzymer29,34. Derudover ionisering af specifikke grupper inden for bindingssted eller på liganden, selv er påvirket af pH og har kritiske effekter på konstanten ligevægt bindende, kinetic sats konstanter og ikke-specifik binding23,33. For eksempel, illustrerer sondering høj-affinitet GHB bindende site med forskellige GHB radioligands pænt betydningen af pH på denne bindende mål (figur 6). Kendetegner den optimale pH for ligand-receptor interaktion kan også give fingerpeg om betydningen af mål i forbindelse med biologisk relevans.

En anden afgørende faktor i digital Autoradiografi er eksponeringstiden, dvs, tid til at opnå målbare autoradiograms ved at udsætte de radioaktive væv sektioner til fosfor imaging plader. Estimater er baseret på mængden af radioaktivitet i prøven, energi og half-life af isotopen samt det ønskede signal / støj-forhold. Især langvarig eksponering tid resultater i mættede billeder og høj baggrund signal. Forhøjede baggrund signal kan reduceres ved at gemme kassetter i bly-skærmet miljøer at undgå kosmisk stråling1,4. Ikke desto mindre, hvis suboptimal autoradiograms er opnået, modellen kan blive udsat flere gange, forudsat at ligand-target komplekset er fast og half-life samt isotopens tillader det.

Fosfor imaging plader kan genbruges og har en lang levetid når de håndteres korrekt, dvs., bøjning bør undgås, og pladerne skal opbevares i et tørt miljø. Håndtering af fosfor imaging plader er styret af deres følsomhed over for lys og kosmisk stråling. Det er således vigtigt at slette plade før hver brug for at minimere baggrund signal. Eksponering af radioaktive væv sektioner til billedbehandling pladerne er gjort i stråling-skærmet kassetter helt lys. Når du overfører pladen til scanneren i slutningen af eksponeringstiden, skal enhver omgivende lys bør også undgås, da selv kort kontakt med hvidt lys reducerer akkumulerede signal. Derudover skal plader scannes umiddelbart efter fjernelse af modellen at undgå signal fading. En ulempe ved at bruge fosfor imaging plader er potentielle udseendet af artefakter og resterende 'ghost billeder' efter gentagen brug af plader1.

Arbejde med tritium kræver imaging plader uden en beskyttende belægning, der giver mulighed for lav energi stråling at nå fosfor krystaller. Tritium-følsomme fosfor imaging plader er derfor mere følsomme over for forurening eller skade som følge af ukorrekt håndtering. Når forurenet, tritium-følsomme plader ikke kan renses og skal udskiftes. Fiksering af ligand-target kompleks med PFA damptryk mindsker risikoen for kontaminering af pladen, forlænge dens levetid. Derudover er dehydrering af væv efter fiksering et afgørende skridt, da tritium følsomme plader er følsomme over for fugt. På grund af dens ømtålelige karakter, bør tritium-følsomme plader ikke anvendes til andre isotoper1,4. Derimod plader for højenergi isotoper som jod-125 er mere robuste og deres overflade kan endda rengøres ved at tørre med 70% ethanol.

Traditionelt, er radiosensitive film blevet brugt til den rumlige optagelse af radioaktivt henfald. Mens billeder med høj opløsning kan fås, har film Autoradiografi flere begrænsninger. Ud over behovet for farlige kemikalier og et mørkekammer for udvikling, er X-ray film karakteriseret ved en smal dynamikområde. Derfor kan det være nødvendigt at udsætte radioaktive dele gentagne gange med forskellig eksponering gange for at opnå kvantificerede ikke-mættet billeder35. Derudover udstiller X-ray film begrænset følsomhed resulterer i vedvarende eksponering gange for modellen forsynes med lavenergi isotoper, dvs. tritium forfald kan kræve flere måneders eksponering. Lav følsomhed over for kombineret med små lineære område gør teknikken meget tidskrævende, især når optimal assay betingelser skal være beslutsomme første1,35.

Med udviklingen af fosfor imaging plader, har flere af disse begrænsninger været adresseret35,36,37. Imaging pladerne tjener til midlertidigt gemme billeder af radioaktivt henfald, der repræsenterer den rumlige arrangement af radioligand i væv prøvemateriale. Photostimulable BaFBr:Eu2+ fosfor krystaller er brugt til at fange den radioaktive energi, der udsendes af prøven, som høj energi stråling (f.eks., x-stråler, gammastråler eller beta-partikler) resulterer i excitation af Eu2+ til Eu3+ og deraf følgende diffusering af de frigivne elektron i fosfor gittermaster4,37. Udsætter de billeddiagnostiske plade til synlig eller infrarød lys vender reaktionen, dvs, den fangne elektron er udgivet og under omdannelsen af Eu3+ til Eu2+ luminescens udsendes. Det udsendte lys er proportional med mængden af radioaktivitet og dens afsløring af en photomultiplier muliggør skabelsen af en digital autoradiogram37. Dette system giver en stigning i følsomheden ledsaget af en markant nedgang i eksponeringstid fra måneder til dage3. Ovenpå, er den lineære dynamiske område betydeligt forøget, som reducerer chancen for overmættede billeder. Linearitet er givet inden for fire til fem størrelsesordener og er blevet valideret gentagne gange3,35,36,37,38. Selv om filmen Autoradiografi stadig giver overlegen rumlige opløsning, resulterede bestræbelser i scanningsteknologi i forbedring af beslutningen fra 300 til 25 µm (pixelstørrelse), giver den detaljerede differentiering mellem anatomiske områder3. Samlet set fosfor imaging plader lette tilegnelsen af digitale autoradiograms både på grund af en øget lineære område og følsomhed. Reduceret eksponeringstid og en forenklet udvikling teknik betydeligt føre til nedsat tid for dataanalyse giver mulighed for højere overførselshastighed.

I forhold til Autoradiografi, er nyttige farmakologiske parametre såsom affinitet og tæthed også almindeligt karakteriseret ved anvendelse af radioligands i væv homogenatet bindende assays. Denne metode har fordelen at producere resultater ved at måle β-udsendes radioaktivt henfald med en flydende scintillation detektor i en effektiv måde2. Der udføres i en multi godt tilgang, fx i 96-brønd mikrotiter plader, er disse analyser nyttige for screening af biblioteker af forbindelser og et større antal koncentration-afhængige relationer. Oven i dette, udførelse af mætning analyse med denne opsætning er ofte mere realistisk i forhold til Autoradiografi, som viser en risiko for overmættede billeder med høj radioligand koncentrationer. Dog omgår udfører homologe forskydning af en fast lav radioligand fusion med ikke-radioaktive ligander for at få Kd og Bmax problemet med overmættede billeder (figur 6)22. Homogenatet bindende og Autoradiografi producerer lignende estimater for ligand affinitet konstanter boer væv tæthed af protein af interesse kan være undervurderet i homogenatet binding. Således, det er blevet foreslået at cellemembranen forstyrrelser samtidig med væv homogenisering kan resultere i receptor tab eller ændret bindende betingelser3,33. Derudover kan fejl i væv dissektion producere homogeniseret forurenet med væv fra tilstødende hjerneregioner. I sammenligning er endog komplekse bindende mønstre i små kerner visualiseret og differentiable på grund af den anatomiske rummæssige i Autoradiografi3,33.

Immunhistokemi også visualiserer fordelingen af en protein af interesse anatomisk. Metoden er i stand til at producere billeder med lang anatomiske dagsorden, som diskret væv komponenter kan identificeres på cellulært niveau og endda subcellulært niveau ved hjælp af elektronmikroskopi. Udtrykket niveauer er vurderet baseret på intensiteten af farvning. Ikke desto mindre er absolut kvantificering af udtryk niveauer vanskelig på grund af manglen på passende reference standarder39. Immunhistokemi er desuden afhængig af tilgængeligheden af en selektiv, godt validerede antistoffer, som ofte er et problem i receptor forskning.

Før der træffes beslutning om at udføre i vitro Autoradiografi, skal flere overvejelser gøres. Først og fremmest kan post mortem væv forberedelse herunder skæring og gentagen nedfrysning og optøning påvirke bevarelsen af bindende websteder2. Derudover afhænger metoden af tilgængeligheden af en passende radioligand, som viser høj affinitet og selektivitet til målet i spørgsmål2. Radioligand bør ikke vise betydelig binding til websteder fra målet, og det bør også vise en gunstig kinetiske profil. Dette er nødvendigt, fordi ligand-target komplekset skal forblive intakte under anvendelsesområdet for eksperimentet. Derudover når egnet ikke-radioaktive stoffer findes, kan indførelsen af radionukleid blive en afgørende faktor. Således bør molekyle af interesse være udstyret med passende funktionelle grupper for effektiv den radioaktive mærkning, der muliggør produktionen af radioligands med tilstrækkelig høj specifik aktivitet og kemiske stabilitet40. En anden ulempe ved in vitro- Autoradiografi er, at metoden, der kun tillader brug af et dyr en gang. Mere elegant er udvidelsen i vivo billeddannelse metoder såsom holdning emissions tomografi (PET), som giver mulighed for gentagen scanning af de samme dyr og bestemmelse af belægning og dynamisk bindende egenskaber. PET er særligt værdifuldt for studiet af større pattedyr41 og dosis optimering i prækliniske studier 42,43,44.

Flere ændringer af den autoradiographic teknik udvide dens anvendelse både med hensyn til karakterisering af farmakologiske mål i raske og syge stater samt i narkotikamisbrug opdagelse og udvikling. Først og fremmest har de seneste fremskridt i imaging-teknologi ført til udvikling af real-time Autoradiografi. Gasdetektorer af α, β-partikler fjerne behovet for billedbehandling plader eller film ved direkte måling af disintegrations, dermed producere hurtigt digital autoradiograms45.

Derudover muliggør in vitro- Autoradiografi undersøgelser af funktionaliteten i G protein koblede receptorer (GPCRs) på toppen af oplysninger om deres anatomiske distribution i post mortem væv. Denne variant af metoden indebærer inkubation af væv sektioner med en radioaktivt mærket analog af Guanosinmonofosfat trifosfat (GTP), dvs., [35S] Guanosinmonofosfat 5'-γ-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), sammen med en ikke-radioaktive agonist af GPCR. Når agonist binder og fremkalder en reaktion af GPCR, inkorporering af [35S] GTPγS kan være lokaliseret og kvantificeret via Autoradiografi, som afspejler kun aktiveret receptor befolkning2,46,47 .

Ex vivo Autoradiografi repræsenterer en anden version af den teknik, der vurderer de regionale bindingen af en radioligand efter administration til et levende eksperimentelle dyr. Efter ofringen af dyret, cryosectioning væv pågældende og autoradiographic eksponering resulterer i autoradiograms som afspejler radioligand bindende i vivo2. Ex vivo Autoradiografi er almindeligvis ansat inden for drug discovery og udvikling af programmer for at få oplysninger om den farmakokinetiske profil af en bly sammensatte, dvs., dets absorption, distribution, metabolisme og udskillelse (ADME) . Især hele kroppen Autoradiografi giver indsigt om narkotika distribution til alle organer og væv. Men bestemmelse af ikke-specifik binding og kvantificering er vanskeligere i forhold til in vitro- Autoradiografi på grund af mulig metabolisering og nedbrydning af radioligand og ingen midler til at vaske væk ubundet ligand48.

Autoradiografi bruges også til indledende test og karakterisering af PET ligander4. Højenergi radionuklider carbon-11 og fluor-18 er oftest bruges til PET ligander. PET er en fremtrædende, ikke-invasiv ansøgning om radioligands fordi kvantificerbare 3D billeder af den radioligand bindende i et levende dyr kan opnås11,40,49.

In vitro Autoradiografi ved hjælp af fosfor imaging plader repræsenterer en værdifuld analyse metode for farmakologiske karakterisering af ligand-target interaktioner. Metoden producerer reproducerbare resultater ved ansættelse af en relativt hurtig og enkel protokol, når optimal assay betingelserne er fastlagt. Anatomiske distribution af et protein af interesse bestemmes inden for sin indfødte mikromiljø, som giver studier af dets farmakologiske, fysiologiske og patologiske rolle i sund og syge post mortem væv af forsøgsdyr samt mennesker2,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Arbejdet var støttet af Lundbeckfonden (Grant R133-A12270) og Novo Nordisk Fonden (Grant NNF0C0028664). Forfatterne takke Dr. Aleš Marek for levering af [3H] radioligand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

Neurovidenskab sag 145 Radioligand radioaktive Autoradiografi affinitet udtryk fosfor imaging HOCPCA γ-hydroxybutyric syre GHB NCS-382 kvantitative farmakologi
Autoradiografi som en enkel og kraftfuld metode for visualisering og karakterisering af farmakologiske mål
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter