Summary
De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.
Abstract
In vitro autoradiografie is gericht op het visualiseren van de anatomische distributie van een proteïne van belang in weefsel van proefdieren evenals mensen. De methode is gebaseerd op de specifieke binding van een radioligand naar haar biologische doel. Daarom, bevroren weefselsecties worden geïncubeerd met radioligand oplossing, en de binding aan de doelstelling vervolgens is gelokaliseerd door de detectie van radioactief verval, bijvoorbeeld met behulp van lichtgevoelige film of fosfor imaging platen. Resulterende digitale autoradiograms weer opmerkelijke ruimtelijke resolutie, waarmee de kwantificering en localisatie van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Bovendien voorziet kwantificering de farmacologische karakterisering van ligand affiniteit op door middel van dissociatieconstanten (Kd), remming-constanten zijn (Kik), alsmede de dichtheid van bandplaatsen (Bmax) in geselecteerde weefsels. De methode biedt dus informatie over zowel de doel lokalisatie en de selectiviteit van het ligand. Hier, wordt de techniek geïllustreerd met autoradiografie karakterisering van het zuur met hoge-affiniteit γ-hydroxybutyraat (GHB) bindend sites in zoogdieren hersenweefsel, met speciale nadruk op methodologische overwegingen met betrekking tot de bepaling van de bindende parameters, de keuze van de radioligand en de detectiemethode.
Introduction
Autoradiografie is een methode waarmee beelden van radioactief verval. De techniek is routinematig gebruikt om de studie van de verdeling van de weefsel van een proteïne van belang in vitro op basis van een specifieke farmacologische interactie tussen een radioactief gelabelde stof en haar doelstelling. Dit voorziet rechtstreekse informatie over de selectiviteit van het ligand in het doel. In vitro autoradiografie kan ook worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van farmacologische bindende parameters van radioligands, zoals de dissociatieconstante (Kd) en de dichtheid van bandplaatsen (Bmax), alsmede voor het bepalen van de remming constante (Ki) van concurrerende liganden1,2. Vergeleken met traditionele homogenaat radioligand binding, heeft autoradiografie het voordeel van kunnend visualiseren ruimtelijke anatomie en beknopte vermelding van regionale expressie patronen3. De methode van autoradiografie is daarom een relevante alternatief voor immunocytochemie, met name in het ontbreken van een gevalideerde antilichaam. Autoradiografie is eenvoudig toe te passen in een standaard isotoop laboratorium gegeven van de beschikbaarheid van een geschikte radioligand met de vereiste farmacologische specificiteit, toegang tot een microtoom cryostaat voor het voorbereiden van weefselsecties, en een geschikte beeldvorming apparaat welk vermag de verdeling van de radioactiviteit in de respectieve weefselsecties analyseren. Met name is een belangrijk selectiecriterium voor de radioligand een beperkte hoeveelheid binding aan doelsoort sites. Dit kan naar andere eiwitten, membranen of materialen zoals plastic of filters, en wordt gezamenlijk aangeduid als niet-specifieke binding. Meestal kan niet-specifieke binding is niet-verzadigbare maar verzadigbare als het gaat om een specifieke uit-target proteïne. De beste manier van valideren waar specifieke binding is te vergelijken met weefsels ontbreekt het doel, bijvoorbeeldgenetisch gemanipuleerde (knock-out) weefsel4.
De methodologie is hier, geïllustreerd met de autoradiografie karakterisering van de hoge-affiniteit bindende site voor zuur van γ-hydroxybutyraat (GHB) in de hersenen van zoogdieren. Inzicht in de farmacologische interactie tussen GHB en zijn bindende plaats is van belang als GHB zowel een klinisch nuttig drug in de behandeling van narcolepsie en alcoholisme5, maar ook een natuurlijk bestanddeel van de zoogdieren hersenen en een recreatieve is drug6. Hoge-affiniteit GHB bandplaatsen waren eerst beschreven met behulp van [3H] GHB binding aan de rat hersenen homogenaat7. Door de jaren heen, verder autoradiografie studies met [3H] GHB en de analoge [3H] NCS-382 heeft een hoge dichtheid van bindende sites in reukkolf gebieden van rat8,9,10, muis9 , varken11en aap/mens hersenen12. De moleculaire identiteit en exacte functionele relevantie van deze bandplaatsen hebben bleef echter ongrijpbaar.
Met de bedoeling om te verder karakteriseren de bandplaatsen en te vergemakkelijken van studies over de fysiologische rol van GHB, meerdere radioligands integratie van verschillende isotopen begiftigd met verschillende affiniteiten zijn ontwikkeld ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA en [125ik] BnOPh-GHB)13,14,15,16(herzien in17) (figuur 1). De combinatie van selectieve hoge-affiniteit radioligands inwoners en een bevolkingsdichtheid van de zeer hoge weefsel van de binding sites hebben toegestaan voor de productie van hoge-kwaliteit beelden met behulp van de fosfor imaging techniek9,11. Samen met een overzicht van de praktische punten bij het opzetten van een autoradiografie experiment en een illustratie te illustreren details, zal de sectie discussie benadrukken i) de keuze van de radionuclide, ii) de keuze van assay voorwaarden, en iii) het gebruik van fosfor Imaging platen versus X-ray film. Het algemene doel van deze paper is te voorzien in technische, methodologische en wetenschappelijke bijzonderheden over de techniek van autoradiografie informeren over weefsel distributie en farmacologische analyse van eiwit doelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier behandeling werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Deense dier experimenten inspectie.
Opmerking: Het protocol hier beschreven dekt weefsel voorbereiding (d.w.z., muis hersenweefsel), de in vitro autoradiografie assay in voldoende detail voor het opzetten van de methode in een nieuw lab, de blootstelling aan fosfor imaging platen, evenals Na diverse densitometric analyses van autoradiograms (Figuur 2) met als doel lokaliseren en kwantificeren van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Voor histologisch vergelijking is een protocol voor cresyl violet kleuring opgenomen. Bovendien is de bepaling van niet-specifieke binding met een concurrerende ligand is opgenomen in het protocol. Zie voor een gedetailleerde beschrijving over het bepalen van Kd, Bmax of Kikvorige publicatie4.
1. de weefsels voorbereiding door Cryosectioning
- De muis euthanaseren door cervicale dislocatie en onmiddellijk ontleden uit de hersenen met behulp van schaar en pincet. Direct doorgaan naar de volgende stap om weefselschade te voorkomen.
- Module-freeze het weefsel door onderdompeling in poedervorm droogijs, gasvormige CO2 of tolueen. Rechtstreeks overbrengen in het bevroren weefsel een cryostaat met de temperatuur instellen tot-20 ° C. U kunt ook bewaren het weefsel bij-80 ° C tot verwerking.
Opmerking: Vermijd herhaalde ontdooien/freezing ter vermindering van weefselbeschadiging. - Laat het weefsel acclimatiseren tot-20 ° C in de cryostaat gedurende 20 minuten vóór verdere verwerking om te voorkomen dat weefsel verbrijzelen.
- Dekking van de houder van de weefsel met insluiten medium buiten de cryostaat en plaats het bevroren weefsel model snel in de gewenste richting terwijl het insluiten medium nog vloeibaar is. Plaats de muis hersenen verticaal op het cerebellum bijvoorbeeld, met het oog op de rostraal coronale secties. De houder van het weefsel terug overzetten naar de cryostaat en bloot de insluiten middellange tot temperaturen hieronder-10 ° C voor de verharding.
Opmerking: Kwetsbare weefsel model moet worden bekleed in insluiten medium binnen de weefsel mallen vóór montage. - Plaats de houder van het weefsel in de microtoom van de cryostaat. De afdrukstand van het weefsel te vermijden schuine secties aanpassen.
- Knip het weefsel met de begeleiding van een stereotaxic atlas18 in secties van de gewenste dikte (12 µm aanbevolen voor [3H] geëtiketteerd liganden). Zorgvuldig rechtzetten en ontvouwen van de sectie met een borstel van geringe omvang, indien nodig en dooi-mount de sectie op een microscoopglaasje. Sequentieel verzamelen de secties uit de regio van belang zijn voor de gewenste technische replicatie (bijvoorbeeld, 4 punten per dia).
- Toestaan de secties op de dia's gedurende 1 uur drogen voor verdere verwerking.
Opmerking: Toevoeging van de dessicant materiaal aan dia dozen minimaliseert vocht ophoping op de weefselsecties. Procotol kan hier worden onderbroken door secties op lange termijn op te slaan in dia vakken-80 ° C.
2. in vitro autoradiografie
Let op: radioactiviteit. Werken in een gecertificeerd laboratorium volgens plaatselijke voorschriften. Draag beschermende kleding. Vervreemden overeenkomstig radioactief verval of uitbesteden aan een gecertificeerde bedrijf.
- Ontdooi de secties gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Label de dia's met experimentele omstandigheden. Gebruik een potlood omdat de dia's zullen worden gebaad in ethanol tijdens latere kleuring.
- Plaats de dia's horizontaal in plastic bakjes.
Opmerking: Positionering van dia's op een verhoogd platform binnen kunststof dienbladen vergemakkelijkt hun behandeling. - Vooraf incubate de secties gemonteerd op de dia's in assay buffer aangepast naar doel in kwestie (voor GHB protocol, 50 mM KHPO4 buffer pH 6.0 wordt gebruikt) door nauwkeurige toepassing van een passende omvang op de dia (700 µL voor 3-4 knaagdier coronale secties).
Opmerking: Zorg ervoor dat elke sectie volledig met vloeistof bedekt is.- Dekking van de plastic schaaltjes met deksel teneinde te vermijden van verdamping en vooraf Incubeer bij relevante temperatuur (voor GHB protocol vooraf incubate gedurende 30 minuten op RT) onder constante zacht (20 rpm) schudden in een roteerapparaat plaat.
- Voor de bepaling van niet-specifieke binding, aanvulling assay buffer met relevante concentratie van compound (voor GHB protocol, 1 mM GHB).
Opmerking: Pre-incubatie kan niet noodzakelijk zijn.
- Giet af pre-incubatie vloeistof uit elke dia en de dia's ook terug overzetten naar de kunststof lade.
- Voorkom uitdroging, incubeer onmiddellijk de secties met relevante concentratie van radioligand in assay buffer gewenste voorwaarden (voor GHB protocol, 1 nM [3H] HOCPCA voor 1 h bij RT) bestrijkt de secties volledig met de radioligand oplossing (700 µL voor 3-4 knaagdier coronale secties).
- Incubeer onder onder constante zacht (20 rpm) schudden van kunststof bakjes met gesloten deksel.
Opmerking: De radioligand concentratie kan worden gevalideerd door het tellen van een aliquoot deel in een vloeibare scintillatietelling teller.
- Incubeer onder onder constante zacht (20 rpm) schudden van kunststof bakjes met gesloten deksel.
- Verwijderen van de incubatie-oplossing door het gieten van de vloeistof en breng de dia's in een Microscoop dia rek. Onmiddellijk overgaan tot de volgende stap om te voorkomen dat de sectie uitdroging.
- De dia's te wassen. Voor het protocol van GHB, wassen met ijskoude assay buffer tweemaal voor 20 s en vervolgens spoel tweemaal door dompelen de rek van de dia in de schaaltjes gevuld met ijskoude gedestilleerd water te verwijderen van zouten. Plaats van de dia's verticaal in rekken voor droging gedurende ten minste 1 uur op RT of de dia's gedurende 5 minuten droog met een ventilator koude temperatuur instelt.
Opmerking: Wassen moet worden geoptimaliseerd, bijvoorbeelduitgebreide wassen nuttig kan zijn voor verminderen van niet-specifieke binding. - De dia's overbrengen in een fixatiemiddel met paraformaldehyde (PFA) poeder voor overnachting fixatie met PFA dampen op RT ter bescherming van de integriteit van het ligand-target complex.
Let op: PFA is giftig. Positionthe fixatiemiddel in rook kap en Vermijd contact met de huid/ogen met PFA. - De volgende dag, worden de dia's overbrengen in een exsiccator doos met silicagel voor 3U op RT om vocht te elimineren.
3. Gasbedwelming met behulp Phosphor Imaging platen en scannen
- Plaats de secties in een cassette imaging plaat straling-afgeschermd met het weefsel naar boven. Voor de daaropvolgende kwantificering van radioligand binding, deelnemen aan een microscale [3H] elke cassette. Regelen van de secties willekeurig en bloot de secties voor directe vergelijking in de dezelfde cassette.
- De tritium-gevoelige fosfor imaging plaat onmiddellijk vóór gebruik ter opheffing van geaccumuleerde signalen uit de opslag te wissen en te elimineren achtergrond signalen. Daarom, laden van de plaat in fosfor imaging machine en worden blootgesteld aan zichtbaar/infrarood licht volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwijder de plaat uit fosfor imaging machine en plaats deze onmiddellijk naar de secties in de cassette. Zorg ervoor dat de cassette volledig is gesloten. Bloot in de secties aan de fosfor imaging plaat voor 3 dagen op RT beschermd tegen licht.
- Omdat licht signaal van de beeldvorming plaat wist, zorgvuldig openen van de cassette in het donker en onmiddellijk overdracht van de beeldvorming plaat in het donkere vak van een fosfor imager of plaats de fosfor imager in een donkere kamer.
Opmerking: Zorg ervoor om te specificeren van de ruimtelijke rangschikking van de dia's tijdens de blootstelling teneinde individuele specimen op het digitale beeld na analyse. Daarom, fosfor imaging platen ook weergeven één hoek gesneden in een verschillende hoek teneinde de correcte oriëntatie van de plaat op de digitale foto. - Scan de plaat met de hoogste resolutie mogelijk om een digitale beeld te krijgen.
4. Optioneel: Cresyl Violet kleuring van weefselsecties
- 1% cresyl violet-oplossing te bereiden door het mengen van 5 g cresyl violet acetaat in 500 mL gedeïoniseerd water (dH2van O) tot het is opgelost (ongeveer 2 h). Filtreer door een filtreerpapier met behulp van een trechter in een nieuwe fles van 500 mL. Breng de pH op 3,5-3.8.
- Positie de kleuring van de dia ingesteld onder zuurkast. Laden met de volgende oplossingen in wit polypropyleen laden (met uitzondering van xyleen) bereiden:
a. 50% ethanol/50% dH2O
b. 70% ethanol/30% dH2O
c. 100% ethanol
d. 100% ethanol
e. 100% dH2O
f. 1% cresyl violet
g. 0,07 procent azijnzuur (Voeg 175 µL van azijnzuur aan 250 mL dH2O).
h. 100% xyleen in groene oplosmiddel-resistente laden
i. 100% xyleen in groene oplosmiddel-resistente laden - De dia's overbrengen in de zuurkast en plaats ze in een dia-rack.
- Los de lipiden door toenemende gesorteerde reeks van ethanol in dH2O in 100% ethanol (lade a-d) door dompelen de dia's voor 1 min.
- Hydrateren de specimens dH2O t/m aflopende concentraties van ethanol (lade a-d in omgekeerde volgorde, gevolgd door lade e) door dompelen de dia's voor 1 min.
- Dompel de specimens in cresyl violet oplossing gedurende 10 minuten.
- Spoel de specimens in 0,07 procent azijnzuur door het opheffen van de dia's op en neer zachtjes voor 4-8 s. Wash de dia's door dompelen in dH2O voor 1 min.
- Uitdrogen van de specimens door onderdompeling van de dia's voor 30 s in oplopende concentraties van ethanol (lade a-d).
- Overdracht van de specimens via twee dienbladen van 100% xyleen (lade h en i) om quench de ethanol.
- Hydrateren de specimens dH2O t/m aflopende concentraties van ethanol (lade a-d in omgekeerde volgorde, gevolgd door lade e) door dompelen de dia's voor 1 min.
- Verwijder de dia's uit de zoutoplossing met een tang. Voeg een paar druppels van organisch oplosmiddel montage media per dia en voeg een dekglaasje 24 x 60 mm aan bovenop te beschermen van monsters. Het verwijderen van luchtbellen tussen het model en de dekglaasje aan door zachtjes te drukken op het dekglaasje aan.
Opmerking: Houd de resterende dia's in xyleen tijdens montage om te voorkomen dat het drogen. - Droog de dia's die 's nachts in een zuurkast op RT.
- Een beeld krijgen van model met een microscoop en 1.25 X doelstelling.
5. densitometric analyse van digitaal beeld
- Het meten van relatieve optische dichtheid (staven) van elke ijkstandaard uit de microscale [3H] met de software van de analyse van een afbeelding.
- Selecteer een gebied van gelijke grootte voor elk punt van de [3H] microscale met behulp van een tool voor regio creatie van het menu-item regio bepaling. Een nummer toewijzen aan elke geselecteerde gebied door te klikken op het getal onder de menu-item- Label.
- OD-waarden voor elk punt van de ijkstandaard exporteren door te klikken op bestand | E xport | 2D regio verslag. ROD waarden overbrengen naar een werkblad en normaliseren door de grootte van het geselecteerde gebied. Lineaire regressie om te verkrijgen van een standaard curve voor verdere densitometric analyse uit te voeren.
Opmerking: Zorg ervoor dat de geselecteerde gebieden worden geëtiketteerd om overeenkomende waarden van ROD en monsters te identificeren.
- Uitvoeren van kwantificering van autoradiograms met behulp van de merkgebonden beeldbewerkingssoftware door het selecteren van de regio van belang (ROI) met behulp van een hulpmiddel van de verwezenlijking van de regio in elke sectie en het meten van de ODs. Selecteer dezelfde regio in elke sectie door een sjabloon voor de regio van belang, dat is gekopieerd en handmatig aangepast aan kleine variaties in de anatomie van de hersenen voor elk autoradiogram te maken. Het identificeren van de anatomie van de ROI door vergelijking van autoradiograms met een hersenen atlas18. Wanneer meerdere behandelingen worden vergeleken, analyses uit te voeren de verblind en gerandomiseerde teneinde vooringenomen selectie van ROIs.
- ROD waarden en grootte van de geselecteerde gebieden in een spreadsheet exporteren door te klikken op bestand | E xport | 2D regio verslag.
- Verdeel de gemeten staaf van de geselecteerde ROI door het gebied te verkrijgen van de dichtheid per specifiek gebied.
- Meten van de staaf van de achtergrond van de plaat en bijbehorende ROD-waarden en oppervlakte exporteren naar een werkblad. Het signaal van de gemiddelde achtergrond van elke staaf waarde van elke ROI aftrekken.
- Gemiddelde de staafjes technische wordt gerepliceerd, dat wil zeggen, sectie wordt gerepliceerd met behulp van weefsel van hetzelfde dier.
- Gebruik de standaard curve staven omzetten in eenheden van radioligand binding, dwz., nCi/mg weefsel equivalenten (TE).
Opmerking: De term TE wordt gebruikt omdat normen worden gegenereerd met materialen simuleren van weefsel. - Express bindende door conversie van nCi/mg naar nmol/mg TE volgens de specifieke activiteit van de radioligand (vergelijking 1).
(1) - Aftrekken voor het verkrijgen van specifieke bindende waarden, niet-specifieke binding van totale bindend.
- Gemiddelde de binding van elke biologische repliceren met behulp van het gemiddelde van de technische repliceert van elk dier (verkregen in stap 5.6).
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol beschreven, was de anatomische distributie van de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen gevisualiseerd met de hoeveelheid radioactief gemerkte GHB analoge [3H] HOCPCA in de hersenen van de muis, die werd gesneden in coronale, Sagittaal en horizontale secties (Figuur 3 ). Hoge niveaus van bindende werden waargenomen in de hippocampus en de cortex, lagere binding in het striatum en geen bindende werd ontdekt in het cerebellum, overeenkomt met vorige gemelde expressiepatronen van de hoge-affiniteit GHB sites9,10, 11,12. Zoals hier wordt getoond, de anatomische structuren kunnen worden gevisualiseerd met behulp van verschillende vectorafbeeldingsbestanden vlakken en anatomische integriteit kan worden ondersteund door cresyl violet kleuring. Voor GHB hoge-affiniteit bandplaatsen, met name de regio's met lage radioligand binding, zoals cerebellum, bevestigd met latere kleuring van het weefsel (Figuur 3). Coronale secties zijn meestal te vinden in de literatuur9,10. Ze zijn praktisch voor kwantitatieve doeleinden, omdat een grotere hoeveelheid secties kan worden verkregen uit een brein. Sagittaal en horizontale secties hebben het voordeel van het visualiseren van bindende gedurende het grootste deel van de knaagdier hersenen binnen één sectie waardoor goed overzicht. Figuur 4illustreert de evolutionaire instandhouding van de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen in de hersenen van zoogdieren. [3H] HOCPCA bandplaatsen werden ontdekt in muis, rat zo goed zoals varken hersenweefsel waardoor vergelijking van bruto hersenen anatomie tussen soorten. In het algemeen, evolutionaire instandhoudings- en regionale distributie studies aanzienlijk kunnen steun bij de karakterisering van een proteïne van belang, in dit geval een nieuwe doelgroep, en kunnen dus geven aanwijzingen over de fysiologische functie19.
De hoge-affiniteit GHB bandplaatsen waren gesondeerd met GHB radioligands, welke verschillende affiniteiten voor de bandplaatsen maar vergelijkbare specifieke activiteiten (Figuur 5) worden weergegeven. [3H] HOCPCA werd eerder aangetoond dat een K-d 74 nM, die superieur aan de verkrijgbare radioligand [3H is] NCS-382 met een K-o van 697 nM, beide vastgesteld op pH 6.0 door kwantitatieve autoradiografie9. Dus, [3H] HOCPCA is begiftigd met veel hogere gevoeligheid, wat leidt tot een uitstekende signaal-ruisverhouding. Vanwege de lagere gevoeligheid van [3H] NCS-382, hogere radioligand concentraties moeten worden gebruikt om het verkrijgen van vergelijkbare niveaus van bindende (vergelijk y-axes in Figuur 5). In vergelijking met [3H] GHB, zelfs hogere radioligand concentraties (30 nM) nodig om vergelijkbare bindende niveaus te bereiken zijn. Dit is voornamelijk toe te schrijven aan de aanzienlijk lagere affiniteit (Kik 4,5 µm) van deze radioligand20. Echter verhoogt hogere radioligand concentratie ook het niveau van niet-specifieke binding9,10 met een bijgevolg lager signaal-/ ruisverhouding. Deze reeks experimenten benadrukt het belang van het hebben van een hoog-affiniteit radioligand voor het produceren van hoge kwaliteit beelden.
Omdat de hoge-affiniteit GHB sites zijn uitgedrukt op een zo hoog niveau in de reukkolf regio's (60 pmol/mg17), is de vaststelling van de farmacologische parameters door verzadiging curven inherent moeilijk met behulp van standaard tritium gevoelige fosfor imaging platen vanwege het risico van oververzadigde afbeeldingen. Daarom, Kd waarden voor [3H] HOCPCA en [3H] NCS-382 zijn verkregen door eerste bepalende Kik waarden door homologe verplaatsing curven, waarna de berekening van Kd (Figuur 6)9. Voor de meeste radioligands zou een alternatief gebruiken isotoop-verdunning zoals routinematig in homogenaat bindende analyses wordt gedaan. Bovendien, Kd waarden zijn vastgesteld op verschillende pH-waarden. Blijkbaar, de hoge-affiniteit GHB sites bij pH 6.0 (figuur 6A en figuur 6D) zo efficiënt mogelijk geëtiketteerd worden, aangezien de voorwaarden op een pH van 7,4 aanzienlijk veranderen assay effect ligand affiniteit. Dus, de Kd voor [3H] HOCPCA met een pH van 7,4 is ca. 30 keer hoger dan die bij pH 6.0 numeriek. Verhoging van de pH verder resulteert in een hogere mate van niet-specifieke binding, wordt een waarschuwing bij het gebruik van [3H] NCS-382 waar alleen lage bedragen van specifieke binding kunnen worden verkregen met een pH van 7,4 (Figuur 6 sexies). Dit belemmert in feite de bepaling van farmacologische parameters met behulp van deze radioligand bij fysiologische pH9, opnieuw ter illustratie van de macht in het hebben van een radioligand met als hoge affiniteit mogelijk.
Figuur 1: structuur van radioligands gericht op de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen. [3H] 3-hydroxycyclopent-1-een carbonzuur ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - tetrahydro-5-hydroxy-5H- benzocyclohept-6-ylidene azijnzuur (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 en [3H] γ-hydroxybutyraat zuur ([3H] GHB)16 als tritiumhoudend radioligands met vergelijkbare specifieke activiteit (20-40 Ci/mmol), alsmede [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125ik] BnOPh-GHB)13 met een geschatte molaire activiteit van 2000 Ci/mmol21. Het structurele element van GHB is rood gemarkeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Schematisch overzicht van het protocol van in vitro autoradiografie. (1) het dier is euthanized, weefsel is ontleed en module-bevroren op droog ijs. Weefsel is vervolgens gesegmenteerd op een cryostaat, dooi-gemonteerd op Microscoop dia's en (2) secties worden geïncubeerd met radioligand tot evenwicht bindend. Voor de bepaling van niet-specifieke binding, worden oplossingen aangevuld met een verdringer van een verwante maar niet identieke, chemische structuur. (3) daarna, niet-afhankelijke radioligand wordt verwijderd door wassen in assay buffer en zouten worden verwijderd door spoelen met gedistilleerd H2O. Wanneer secties droog zijn, wordt paraformaldehyde (PFA) fixatie uitgevoerd om permanent de ligand-eiwit interactie. Secties worden vervolgens blootgesteld aan fosfor imaging platen. (4) na voldoende blootstellingstijd, worden platen gescand voor digitale autoradiograms. (5) uiteindelijk beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van definities van regio's van belang (ROIs), en de binding wordt gekwantificeerd. In het getoonde voorbeeld worden optische dichtheid (ODs) geïllustreerd in delen van muis cortex (links) en hippocampus (midden). Kwantificering wordt gedaan door bloot secties samen met een [3H] microscale (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Representatieve autoradiograms van 1 nM [3H] HOCPCA binding met muis brain secties. (A) Radioligand binding met coronale, Sagittaal en horizontale weefselsecties om te illustreren het belang van de afdelen vliegtuig op de zichtbaarheid van anatomische structuren. (B) Cresyl paarse verkleuring van de overeenkomstige weefselsecties om te controleren of anatomische gebieden, met name de regio's met een lage/afwezig radioligand binding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Representatieve autoradiograms van 1 nM [3H] HOCPCA binding in verschillende soorten. Vergelijking van (A) rat, muis (B) en (C) varken in vitro autoradiograms om te illustreren evolutionaire instandhouding van sites te binden aan corticale en hippocampal regio's samen met bruto hersenen anatomie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Kwantificering van binding aan de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen met verschillende gevoeligheid voor GHB radioligands met behulp van in vitro autoradiografie in hersenen plakjes van muis cortex en hippocampus. Totale bindend wordt gerapporteerd als fmol/mg weefsel equivalenten (TE) voor de radioligands (A) [3H] HOCPCA (1 nM) en (B) [3H] NCS-382 (7 nM) en (C) [3H] GHB (30 nM) (soortgelijke specifieke activiteiten). Niet-specifieke binding is niet aangetroffen in aanwezigheid van 1 mM GHB of 1 mM HOCPCA voor elk van de radioligands (niet afgebeeld). Gegevens worden gepresenteerd zoals ± SD van vier biologische replicatieonderzoeken die elk uitgevoerd in drie technische replicatieonderzoeken betekenen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Representatieve resultaten van autoradiografie bepaling van Kd en B-max waarden door homologe concurrerende verplaatsing van [3H] HOCPCA en [3H] NCS-382 in de corticale secties van de muis bij pH 6.0 en pH 7.4 ter illustreren de invloed van pH op affiniteit van radioligands. (Kd en Bmax werden berekend op basis van de dezelfde samenstelling als radioligand en concurrent, door middel van de aanvankelijke vaststelling van K waardenik 22). (A) Autoradiograms met optimale signal-to-noise verhouding voor 1 nM [3H] HOCPCA inbinden op pH 6.0. (B) wijzigen van de pH van de buffer aan 7.4 vereist een hogere concentratie van [3H] HOCPCA (8 nM) om belangrijke bindende niveau te bereiken. (C) Resulting log-concentratie bindende bochten; bedoel ± SEM. (D) 5 nM [3H] NCS-382 inbinden op pH 6.0 resulteert in lage niet-specifieke binding, overwegende dat (E) 40 nM [3H] NCS-382 niet volstaat om het verkrijgen van bindende met een pH van 7,4. (F) Resulting log-concentratie bindende bochten; ± SEM. gegevens is verkregen uit 3-4 biologische replicatieonderzoeken die elk uitgevoerd in 3-5 technische replicaten, alleen [3H] NCS-382 experimenten met een pH van 7,4 werden uitgevoerd met slechts 2 biologische replicatieonderzoeken betekenen. Voor beide radioligands, 1 mM die GHB werd gebruikt voor de bepaling van niet-specifieke binding. Zie voor meer informatie over de analyse en berekening van Kd en Bmax,9. Dit cijfer is aangepast en overgenomen van eerdere publicatie9 met toestemming van Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kwaliteit van een autoradiografie bepaling wordt meestal bepaald door de gevoeligheid van de radioligand. Een belangrijke factor is de geselecteerde isotoop, dat wordt gegeven door de beschikbaarheid van bekende liganden of het haalbaar is specifieke etikettering technieken aan opbrengst liganden met passende specifieke activiteit (dat wil zeggen, de hoeveelheid radioactiviteit per eenheid mol van een radioligand)23en met een beperkte hoeveelheid chemische aantasting. Een groot aantal radioligands van bekende liganden zijn voorzien van tritium9,10,24,25,,26, die afleidt van verschillende voordelen. Ten eerste, tritium (3H) wordt gekenmerkt door een lange halfwaardetijd (12.43 jaar) bevordering van de langetermijnopslag van afzonderlijke batches. Ten tweede is de doelsoort zijn ligand interactie niet wordt verstoord door de radionuclide als 3H-liganden zijn biologisch te onderscheiden van hun bovenliggende verbindingen. Tritium stoot energiezuinige β--deeltjes, die slechts korte in weefsel afstanden, wat resulteert in hoge ruimtelijke resolutie en, vervolgens, meer onderscheid tussen anatomische structuren4. Niettemin, tritium etikettering kan alleen worden geproduceerd om te matig hoge specifieke activiteiten opleveren. Dit is vanwege het feit dat beschikbaar 3H-bronnen zijn verontreinigd met niet-radioactieve waterstof. In het algemeen, hoe hoger de specifieke activiteit, de minder radioligand is nodig om de opbrengst van gevoelige detectie23. Bovendien, dit moet worden beschouwd dat 3H-liganden hebben de mogelijkheid om te ondergaan waterstof uitwisseling met water afhankelijk van de stabiliteit van de 3H-label. Om te compenseren voor de lage expressie of te laag specifieke activiteit, kan jodium-125 worden gebruikt als de radionuclide13. De maximale specifieke activiteit van jodium-125 is hoger dan die van tritium ca. 100-fold. Echter moeten diverse aanvullende overwegingen plaatsvinden bij het werken met jodium-125. Bijvoorbeeld, induceert de toevoeging van jodium-125 normaal structurele veranderingen in de molecule die mogelijk van invloed op de doelsoort zijn ligand interacties. Als jodium-125 een halfwaardetijd van 60 dagen heeft, moet de correctie voor dagelijkse verval worden overwogen voor specifieke activiteit en kwantificering van de doelsoort zijn ligand interacties23. 125 Liganden uitstoten γ-fotonen en ondanks de veel hogere gevoeligheid, lagere resolutie beelden veroorzaken. Dit is te wijten aan de inverse relatie tussen de resolutie en de maximale energie van de isotoop (zoals hieronder wordt besproken). Tot slot, in vergelijking met tritium, verhoogde zorg moet worden genomen bij de behandeling van jodium-125 als gevolg van de hogere energie van de radionuclide.
Afhankelijk van de isotopen, weefsel sectie dikte invloed kan zijn op resolutie. De lage-energie-β--straling tritium beperkt zijn weefsel bereik tot ca. 5 µm te wijten aan zelfabsorptie. Dientengevolge, wordt kwantificering niet beïnvloed door de dikte van het weefsel wanneer de sectie dikte groter is dan 5 µm27,28. Radioactief verval van hoog-energetische isotopen heeft daarentegen een grotere penetratie van weefsel, wat resulteert in lagere beeldresolutie omdat liganden met een grotere afstand naar het detectie-medium ook aan de beeldvorming bijdragen. Bijgevolg, dunner secties bevorderen hogere resolutie voor hoog-energetische radionucliden1.
De oprichting van een autoradiografie protocol vereist kennis van optimale bindende voorwaarden (bijvoorbeeld, buffer, pH en temperatuur) en farmacologische parameters van de radioligand in termen van affiniteit en kinetiek. Als de radioligand niet gekenmerkt voordat, verkennende studies zijn nodig29. Het kiezen van een optimale radioligand concentratie wordt geleid door de affiniteit van de radioligand en de overvloed van bindende sites. Een concentratie als gevolg van 5 - 6 keer Kd wordt normaal gesproken gebruikt om ervoor te zorgen dat alle bandplaatsen verzadigde30 zijn. Een andere benadering is gericht op de opbrengst van het hoogste percentage van totaal-te-aspecifieke bindend door selecteren radioligand concentraties beneden Kd31 en opslaan van radioligand oplossing op hetzelfde moment. Deze aanpak is vooral handig wanneer de bindende site zeer overvloedig in het onderzochte weefsel is omdat hoge radioligand concentraties de kans verhogen zou op oversaturating autoradiograms, als de zaak is voor [3H] HOCPCA en de hoge-affiniteit GHB bindende sites9. Bovendien, om efficiënt label de gehele bevolking van de gerichte proteïne, de radioligand moet idealiter binden aan alle potentiële richtwaarde conformaties. Vooral in receptor autoradiografie, kan het gebruik van agonisten slechts een gedeeltelijke aantal totale receptoren onthullen aangezien sommigen misschien wel aanwezig in lage-affiniteit agonist Staten. In tegenstelling, weergeven neutrale antagonisten meestal affiniteit voor alle receptor Staten-26,29
Bovendien zijn algemeen bindende experimenten uitgevoerd onder evenwicht bindende voorwaarden. Daarom, de tijd die nodig is om te bereiken evenwicht bindend onder de gewenste proefomstandigheden (vaste radioligand concentratie, buffer en temperatuur) moet worden bepaald in vereniging experimenten om evenwicht bindend binnen de werkingssfeer van de 4,23,30te experimenteren. Na een incubatieperiode van radioligand, niet-afhankelijke radioligand is door verschillende incubations met assay buffer afgewassen en meestal gevolgd door spoelen in gedestilleerd H2O. Signal-to-noise verhouding kunnen worden geoptimaliseerd door aanpassing van temperatuur en tijd afhankelijk van de Dissociatie tarief van de radioligand26,30,31.
Radioligands bindende kan weergeven op niet-biologische materialen, dat wil zeggen, niet-specifieke binding. Radioligand binding met cellulaire componenten dan het beoogde doel wordt gedefinieerd als aspecifieke bindend. De bijdrage van aspecifieke binding aan het totale bedrag van radioligand binding wordt beoordeeld in het bijzijn van een concurrerende ligand die zich richt op dezelfde site als de radioligand binding. Als de niet-radioactieve stof (verdringer) wordt geleverd in 10,000-fold overmaat, neemt de bindende site en de radioligand kunt alleen binden aan sites26,31,32uit doelsoort. Cruciaal, moet het samengestelde worden van een andere chemische structuur dan de radioligand omdat dit het risico verlaagt van zowel specifieke evenals aspecifieke bindende23verdringt. Niet-specifieke binding voortvloeien uit binden aan membranen kunnen een groot probleem, vooral in het geval van vrij lipofiele radioligands. In sommige gevallen kunnen uitgebreide wassen procedures verwijderen niet-receptor gebonden radioligand en daarom verbeteren de specifieke bindende verhoudingen29.
Bij het kiezen van een buffer assay, is het van cruciaal belang dat het effect van Ionische sterkte en pH op de doelsoort zijn ligand interactie. Vooral Elektrostatische interacties tussen polaire liganden en hydrofiele bestanddelen van bindende sites worden beïnvloed door de Ionische sterkte van de buffer. Daarom, suppletie met monovalent of divalente ionen kan gevolgen hebben voor de effectieve affiniteit constante23,33. Als de samenstelling van de optimale buffer voor de interactie van de bestudeerde ligand-target niet bekend is, moeten de verschillende gemeenschappelijke buffers in proefprojecten worden onderzocht. Buffers kunnen ook worden aangevuld met anti-oxidanten zoals ascorbinezuur en remmers van vernederende enzymen29,34. Bovendien, de ionisatie van specifieke groepen binnen de bindende site of op de ligand zelf wordt beïnvloed door pH en kritische effecten heeft op de constante evenwicht bindend, de kinetische snelheidsconstanten en niet-specifieke binding23,33. Bijvoorbeeld, illustreert de hoge-affiniteit GHB indringende bindende site met verschillende GHB radioligands mooi het belang van pH op deze bindende doelstelling (Figuur 6). Karakterisering van de optimale pH voor de ligand-receptor interactie kan ook geven aanwijzingen over het belang van de doelstelling met betrekking tot de biologische relevantie.
Een andere essentiële factor in digitale autoradiografie is de belichtingstijd, dat wil zeggen, de tijd die nodig zijn om meetbare autoradiograms door de hoeveelheid radioactief gemerkte weefselsecties aan fosfor imaging platen bloot te leggen. Schattingen zijn gebaseerd op de hoeveelheid radioactiviteit in het monster, de energie en de halfwaardetijd van de isotoop, evenals de gewenste signal-to-noise verhouding. In het bijzonder langdurige blootstelling tijd resultaten in verzadigde afbeeldingen en hoge achtergrond signaal. Verhoogde achtergrond signaal kan worden verminderd door de opslag van cassettes binnen lood-afgeschermd omgevingen om te voorkomen dat kosmische straling1,4. Niettemin, als suboptimaal autoradiograms resultaat wordt bereikt, het model kan worden blootgesteld meerdere keren, mits het complex ligand-target is vastgesteld en de halfwaardetijd van de radionuclide toelaat.
Fosfor imaging platen kunnen worden hergebruikt en hebben een lange levensduur wanneer correct behandeld, dat wil zeggen, buigen moet worden vermeden en platen moeten worden opgeslagen in een droge omgeving. De behandeling van fosfor imaging platen wordt geleid door hun gevoeligheid voor licht en kosmische straling. Het is dus belangrijk om te wissen de plaat vóór elk gebruik om te minimaliseren van achtergrond signaal. Gasbedwelming met behulp van radioactief gelabelde weefselsecties de imaging platen gebeurt in straling-afgeschermd cassettes volledig verstoken van licht. Bij het overbrengen van de plaat naar de scanner aan het einde van de blootstellingstijd, moet elke omgevingslicht ook worden vermeden aangezien zelfs korte contact met wit licht geaccumuleerde signaal vermindert. Bovendien moeten de platen onmiddellijk na de verwijdering van het model om te vermijden vervagen van het signaal worden gescand. Een nadeel van het gebruik van fosfor imaging platen is de potentiële verschijning van artefacten en resterende 'ghost images' na herhaalde gebruik van de platen-1.
Werken met tritium vereist imaging platen zonder een beschermende laag om de straling van de lage energie te bereiken de fosfor-kristallen. Tritium-gevoelige fosfor imaging platen zijn dan ook gevoeliger voor verontreiniging of schade als gevolg van de onjuiste afhandeling. Eenmaal besmet, tritium-gevoelige platen kunnen niet worden gereinigd en moeten worden vervangen. Fixatie van het ligand-target complex met PFA damp vermindert potentiële verontreiniging van de plaat, verlenging van de levensduur. Bovendien, uitdroging van het weefsel na fixatie is een cruciale stap aangezien tritium gevoelige platen gevoelig voor vocht zijn. Vanwege de gevoelige aard, mag tritium-gevoelige platen niet dienen voor andere isotopen1,4. In tegenstelling, de platen voor hoog-energetische isotopen zoals jodium-125 zijn robuuster en hun oppervlak kan zelfs worden gereinigd door te vegen met 70% ethanol.
Traditioneel, is radiosensitive film gebruikt voor de ruimtelijke registratie van radioactief verval. Terwijl beelden met hoge resolutie kunnen worden verkregen, heeft film autoradiografie verscheidene beperkingen. Naast de noodzaak van gevaarlijke chemische stoffen en een donkere kamer voor ontwikkeling, wordt X-ray film gekenmerkt door een smalle dynamisch bereik. Daarom, kan nodig zijn om radioactief gelabelde secties herhaaldelijk met verschillende belichtingstijden verwezenlijking van kwantificeerbare niet-verzadigde afbeeldingen35bloot te stellen. Bovendien vertoont X-ray film beperkte gevoeligheid resulterend in langdurige blootstelling tijden voor specimen voorzien van energiezuinige isotopen, dwz. tritium verval wellicht enkele maanden van blootstelling. Lage gevoeligheid gecombineerd met kleine lineaire reeks maakt de techniek zeer tijdrovend, temeer daar optimale assay voorwaarden moeten vastberaden eerste1,35.
Met de ontwikkeling van fosfor imaging platen, zijn verschillende van deze beperkingen geadresseerd35,36,,37. De imaging platen dienen om beelden van radioactief verval, vertegenwoordigen de ruimtelijke rangschikking van radioligand in het weefsel model tijdelijk op te slaan. Photostimulable BaFBr:Eu2+ fosfor kristallen worden gebruikt om vast te leggen van de radioactieve energie wordt uitgestraald door het monster als energierijke straling (bijvoorbeeld, x-stralen, gamma stralen of beta-deeltjes) resultaten in de excitatie van Eu2+ tot Eu3+ en de daaruit voortvloeiende overlapping van het vrijgegeven elektron in de fosfor rooster4,37. De imaging plaat aan het zichtbaar of infrarood licht bloot de reactie keert, dat wil zeggen, het gevangen elektron is vrijgegeven en tijdens de transformatie van Eu3+ van Eu2+ luminescentie wordt uitgestoten. Het uitgestraalde licht is evenredig aan de hoeveelheid radioactiviteit en de detectie van een fotomultiplicator maakt het creëren van een digitale autoradiogram37. Dit systeem biedt een verhoging in gevoeligheid vergezeld van een duidelijke vermindering in het blootstellingstijd tussen maand dagen3. Op de top van dat, is het lineaire dynamische bereik aanzienlijk toegenomen, dat vermindert de kans op oververzadigde afbeeldingen. Lineariteit wordt uitgebracht binnen vier tot vijf Ordes van grootte en herhaaldelijk heeft gevalideerd3,35,,36,,37,38. Maar film autoradiografie nog superieure ruimtelijke resolutie biedt, resulteerde inspanningen in scanning technologie in de verbetering van de resolutie van 300 tot 25 µm (pixelgrootte), waardoor de gedetailleerde differentiatie tussen anatomische gebieden3. Globaal, fosfor imaging platen zijn het vergemakkelijken van de verwerving van digitale autoradiograms zowel als gevolg van een verhoogde lineaire bereik en gevoeligheid. Verminderde blootstellingstijd en een Vereenvoudigde ontwikkeling techniek aanzienlijk leiden tot minder tijd voor gegevensanalyse, zodat hogere doorvoer.
Vergeleken met autoradiografie, worden nuttige farmacologische parameters zoals affiniteit en dichtheid ook vaak gekenmerkt door de toepassing van radioligands in weefsel homogenaat bindend testen. Deze methode heeft het voordeel van de overlegging van de resultaten van de β-uitgestoten radioactief verval meten met een vloeibare scintillatietelling detector in een efficiënte manier2. Wordt uitgevoerd in een multi goed benadering, bijvoorbeeld in 96-wells microtiterplaat platen, zijn deze gehaltebepalingen nuttig voor screening van bibliotheken van verbindingen en voor een groter aantal concentratie-afhankelijke relaties. Op de top van dat, het uitvoeren van verzadiging analyse met deze opstelling is vaak meer haalbaar in vergelijking met autoradiografie, waarin een risico van oververzadigde afbeeldingen met hoge radioligand concentraties. Uitvoeren van homologe verplaatsing van een vaste lage radioligand concentratie met niet-radioactieve liganden verkrijgen Kd en Bmax omzeilt echter het probleem van de oververzadigde afbeeldingen (Figuur 6)22. Homogenaat bindende en autoradiografie produceren soortgelijke ramingen voor ligand affiniteit constanten overwegende dat weefsel dichtheid van de proteïne van belang in homogenaat bindend kan worden onderschat. Dus wordt er geopperd dat de verstoring van de celmembraan gelijktijdige met weefsel homogenisering in verlies van de receptor resulteren kan of gewijzigd bindende voorwaarden3,33. Bovendien, kunnen fouten in weefsel dissectie homogenates besmet met weefsel van aangrenzende hersengebieden opleveren. In vergelijking zijn zelfs complexe bindende patronen in kleine kernen gevisualiseerde en differentieerbare als gevolg van de ruimtelijke anatomische resolutie in autoradiografie3,33.
Immunohistochemistry visualiseert anatomisch ook de verdeling van een proteïne van belang. De methode is geschikt voor het produceren van beelden met hoge resolutie van anatomische, zoals discrete weefsel componenten kunnen worden geïdentificeerd op cellulair niveau en zelfs subcellular niveau met behulp van elektronenmicroscopie. Expressie niveaus zijn beoordeeld op basis van de intensiteit van de kleuring. Absolute kwantificering van expressie niveaus is echter moeilijk te wijten aan het gebrek aan geschikte referentiestoffen normen39. Immunohistochemistry is bovendien afhankelijk van de beschikbaarheid van een selectieve, goed gevalideerde antilichaam dat vaak een probleem in het onderzoek van de receptor is.
Alvorens te besluiten over het uitvoeren van in vitro autoradiografie, moeten verschillende overwegingen worden gemaakt. Eerst en vooral, post mortem weefsel preparaat, met inbegrip van afdelen en herhaalde bevriezen en ontdooien invloed kan zijn op het behoud van bindende sites2. De methode is bovendien afhankelijk van de beschikbaarheid van een voldoende radioligand, waarin hoge affiniteit en selectiviteit voor de doelstelling in vraag2. De radioligand moet aanzienlijke binding met af-target sites niet weergegeven, en het moet ook blijk geven van een gunstige kinetische profiel. Dit is nodig omdat het ligand-target complex intact tijdens de reikwijdte van het experiment blijven moet. Bovendien, als geschikte niet-radioactieve stoffen bestaan, kan de invoering van de radionuclide een kritieke factor worden. Dus, de molecule van belang moet worden uitgerust met geschikte functionele groepen voor efficiënte radioactieve labeling, waarmee de productie van radioligands met een voldoende hoge specifieke activiteit en chemische stabiliteit40. Een ander nadeel van in vitro autoradiografie is dat de methode alleen het gebruik van een dier eenmaal. maakt Meer elegant is de uitbreiding in vivo imaging methoden zoals positie emissie tomografie (PET), waardoor herhaalde scannen van hetzelfde dier en bepaling van bezetting en dynamische binding kenmerken. Het huisdier is vooral waardevol voor de studie van hogere zoogdieren41 en voor de optimalisering van de dosis in pre-klinische studies 42,43,44.
Diverse wijzigingen van de autoradiografie techniek uitbreiden haar toepassing zowel in termen van de karakterisering van farmacologische doelen in gezonde en zieke Staten alsook in Geneesmiddelenontwikkeling. Allereerst, recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnieken hebben geleid tot de ontwikkeling van real-time autoradiografie. Gas detectoren van α/β-deeltjes overbodig imaging platen of film door de rechtstreekse meting van disintegrations, waardoor het produceren van snelle digitale autoradiograms45.
Bovendien, in vitro autoradiografie kunt onderzoeken naar de functionaliteit van G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) op de top van informatie over hun anatomische distributie in post mortem weefsels. Deze variant van de methode omvat incubatie van weefselsecties met een radioactief gelabelde analogon van Guanosinetrifosfaat (GTP), dat wil zeggen, [35S] calciumguanosine 5'-γ-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), samen met een niet-radioactieve agonist van de GPCR. Wanneer de agonist bindt en lokt een reactie van de GPCR, de opneming van [35S] GTPγS kan worden gelokaliseerd en gekwantificeerd via autoradiografie, waarin alleen de geactiveerde receptor bevolking2,46,47 .
Ex vivo autoradiografie vertegenwoordigt een andere versie van de techniek, die de regionale binding van een radioligand na toediening aan een levend dier voor experimentele beoordeelt. Na het offer van het dier, cryosectioning van het weefsel in kwestie, en autoradiografie blootstelling resultaat in autoradiograms die weerspiegelen de radioligand binding in vivo2. Ex vivo autoradiografie is vaak werkzaam binnen drug discovery- en ontwikkelingsprogramma's om te krijgen informatie over het farmacokinetische profiel van een voorsprong samengestelde, dat wil zeggen, de absorptie, de distributie, het metabolisme en de uitscheiding (ADME) . Met name hele lichaam autoradiografie geeft inzicht over de drug distributie naar alle organen en weefsels. Bepaling van niet-specifieke binding en kwantificering is moeilijker in vergelijking met in vitro autoradiografie als gevolg van mogelijke metabolisme en aantasting van de radioligand echter en geen middelen voor het wegwassen van de niet-afhankelijke ligand48.
Autoradiografie wordt ook gebruikt voor voorbereidende tests en karakterisering van PET liganden4. De hoog-energetische radionucliden koolstof-11 en fluor-18 worden meestal gebruikt voor PET-liganden. Het huisdier is een prominente niet-invasieve toepassing voor radioligands omdat kwantificeerbare 3D-beelden van de radioligand binding in een levend dier kunnen worden verkregen van11,40,49.
In vitro autoradiografie met behulp van fosfor imaging platen vertegenwoordigt een waardevolle assay-methode voor de farmacologische karakterisering van de doelsoort zijn ligand interacties. De methode levert reproduceerbare resultaten door de tewerkstelling van een relatief snelle en eenvoudige protocol zodra optimale assay voorwaarden zijn vastgesteld. Anatomische distributie van een proteïne van belang wordt bepaald binnen zijn eigen communicatie, waarmee de studie van de fysiologische en pathologische en farmacologische rol in gezonde en zieke post mortem weefsel van proefdieren, evenals mens2,47.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Het werk werd gesteund door de Lundbeck Foundation (Grant R133-A12270) en de Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). De auteurs bedanken Dr. Aleš Marek voor de levering van [3H] radioligand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Merck Millipore | 107017 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BAS-TR2040 Imaging Plate | GE Healthcare Life Science | 28956481 | 20x40 cm - Sensitive to tritium |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) | Merck Millipore | 100579 | |
| O.C.T. Compound, 12 x 125 mL | Sakura | 4583 | Tissue-Tek |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 631-9483 | microscope slides |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura Finetek Denmark ApS | 4451 | |
| Tritium Standard on Glas | American Radiolabeld Chemicals, Inc. | ART 0123 | |
| Xylene substitute | Sigma-Aldrich | A5597 |
References
- Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
- Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
- Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
- Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
- Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
- Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
- Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
- Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
- Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
- Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
- Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
- Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
- Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
- Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
- Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
- Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
- Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
- Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
- Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
- Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
- DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
- Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
- Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
- Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
- López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
- Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
- Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
- Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
- Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
- Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
- Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
- Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
- Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
- Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
- Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
- Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
- Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
- Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
- Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
- Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
- Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
- Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
- Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
- Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
- Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).
