Summary
Il metodo di autoradiografia è ordinariamente utilizzato per studiare l'associazione di radioligands per sezioni di tessuto per la determinazione qualitativa o quantitativa farmacologia.
Abstract
In vitro l'autoradiografia ha lo scopo di visualizzare la distribuzione anatomica di una proteina di interesse nel tessuto da animali da esperimento come pure gli esseri umani. Il metodo si basa sul legame specifico di un radioligand al suo target biologico. Pertanto, le sezioni di tessuto congelato sono incubate con radioligandi soluzione e l'associazione alla destinazione è successivamente localizzata tramite la rilevazione del decadimento radioattivo, ad esempio, utilizzando la pellicola fotosensibile o fosforo piastre di imaging. Autoradiogrammi digitale risultante visualizzare notevole risoluzione spaziale, che consente la quantificazione e la localizzazione di radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Inoltre, quantificazione consente la caratterizzazione farmacologica di affinità ligando mediante costanti di dissociazione (Kd), costanti di inibizione (Kio) così come la densità di siti di legame (Bmax) in determinati tessuti. Così, il metodo fornisce informazioni sulla localizzazione di destinazione sia selettività ligando. Qui, la tecnica è esemplificata con autoradiografico caratterizzazione dell'acido ad alta affinità γ-idrossibutirrico (GHB) siti nel tessuto di cervello dei mammiferi, con speciale enfasi su considerazioni metodologiche per quanto riguarda l'analisi obbligatoria di legame parametri, la scelta del radioligand e il metodo di rilevamento.
Introduction
Autoradiografia è un metodo che fornisce immagini di decadimento radioattivo. La tecnica è usata ordinariamente per studiare la distribuzione tissutale di una proteina di interesse in vitro basato su una specifica interazione farmacologica tra un composto radiomarcato e l'obiettivo. Questo fornisce informazioni dirette circa la selettività del ligando per la destinazione. Autoradiografia in vitro può essere utilizzato anche per la determinazione quantitativa di parametri di associazione farmacologica di radioligands, come la costante di dissociazione (Kd) e densità di siti di legame (Bmax), nonché per la determinazione la costante di inibizione (Ki) delle concorrenti ligandi1,2. Rispetto al tradizionale omogeneato radioligand binding, autoradiografia ha il vantaggio di essere in grado di visualizzare anatomia spaziale e con l'indicazione succinte della espressione regionale modelli3. Il metodo di autoradiografia è quindi un'alternativa pertinente per immunocitochimica, soprattutto in assenza di un anticorpo convalidato. Autoradiografia viene implementata facilmente in un laboratorio del radioisotopo standard dato la disponibilità di un radioligand adatto con la necessaria specificità farmacologica, ad un criostato microtomo per la preparazione di sezioni di tessuto e un imaging adatto dispositivo che è in grado di analizzare la distribuzione della radioattività nelle sezioni rispettive del tessuto. In particolare, un importante criterio di selezione per il radioligando è una quantità limitata di associazione ai siti non-bersaglio. Questo può essere ad altre proteine, membrane o materiali quali plastica o filtri ed è collettivamente come legame non specifico. Solitamente, il legame non specifico è non saturabile ma può essere saturabile se si tratta di una specifica proteina fuori bersaglio. Il modo migliore di convalida vero legame specifico è da confrontare con tessuti manca il bersaglio, per esempio, geneticamente ingegnerizzati (knock-out) del tessuto4.
Qui, la metodologia è illustrata con la caratterizzazione autoradiografica del sito di legame ad alta affinità per l'acido γ-idrossibutirrico (GHB) nel cervello dei mammiferi. Comprendere l'interazione farmacologica tra GHB e il suo sito di legame è di pertinenza come GHB è una droga sia clinicamente utile nel trattamento della narcolessia e alcolismo5, ma anche un costituente naturale del cervello dei mammiferi e un'area di divertimento droga6. Siti di legame ad alta affinità GHB in primo luogo sono stati descritti utilizzando [3H] associazione di GHB a ratto cervello omogeneato7. Nel corso degli anni, ulteriori studi di autoradiografia con [3H] GHB e l'analogo [3H] NCS-382 ha mostrato un'alta densità di siti nelle regioni del forebrain del ratto8,9,10, mouse9 di legame ,11e scimmia/umano cervello12del maiale. Tuttavia, l'identità molecolare ed esatta rilevanza funzionale di questi siti di legame sono rimasti sfuggente.
Con l'intenzione di caratterizzare ulteriormente i siti di legame e per facilitare gli studi sul ruolo fisiologico di GHB, sono state sviluppate più radioligands incorporando isotopi diversi dotati di diverse affinità ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA e [125I] BnOPh-GHB)13,14,15,16(rivisto in17) (Figura 1). La combinazione di selettivo ad alta affinità radioligands e una densità molto elevata del tessuto dell'associazione siti hanno permesso per la produzione di immagini di alta qualità utilizzando il fosforo imaging tecnica9,11. Insieme con un contorno dei punti pratici nella creazione di un esperimento autoradiografico e un'illustrazione per esemplificare i dettagli, la sezione di discussione metterà in risalto i) la scelta di radionuclide, ii) la scelta delle condizioni di dosaggio e iii) l'uso del fosforo Imaging piastre contro pellicola di raggi x. L'obiettivo generale di questa carta è quello di fornire dettagli tecnici, metodologici e scientifici sulla tecnica autoradiografia per informare sulla distribuzione tissutale e analisi farmacologica di bersagli proteici.
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Protocol
Tutti gli animali gestione è stata eseguita in conformità con le linee guida da The ispettorato danese di sperimentazione animale.
Nota: Il protocollo descritto qui copre (cioè, tessuto di cervello di topo), preparazione di tessuti in vitro autoradiografico dosaggio in modo sufficientemente dettagliato per l'impostazione del metodo in un nuovo laboratorio, l'esposizione al fosforo piastre di imaging come pure successiva analisi densitometrica di autoradiogrammi (Figura 2) con lo scopo di localizzare e quantificare radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Per il confronto istologico, un protocollo per la macchiatura di cresyl violet è incluso. Inoltre, la determinazione del legame non specifico con un ligando concorrente è inclusa all'interno del protocollo. Per una descrizione dettagliata su come determinare Kd, Bmax o Kio, vedere precedente pubblicazione4.
1. preparazione di Cryosectioning
- Eutanasia il mouse di dislocazione cervicale e scomporre immediatamente fuori il cervello con delle forbici, pinze. Procedere direttamente al passaggio successivo per evitare danni ai tessuti.
- Snap-congelare il tessuto da immersione in ghiaccio secco in polvere, gassosi CO2 o isopentano. Trasferire direttamente il tessuto congelato per un criostato con temperatura impostata a-20 ° C. In alternativa, è possibile memorizzare il tessuto a-80 ° C fino al trattamento.
Nota: Evitare lo scongelamento/congelamento ripetuto per ridurre il danno tissutale. - Lasciare che il tessuto acclimatare a-20 ° C a criostato per 20 min prima del successivo trattamento per evitare la rottura del tessuto.
- Coprire il Portarotolo con mezzo di inclusione di fuori del criostato e posizionare rapidamente il campione di tessuto congelato l'orientamento desiderato, mentre il mezzo di inclusione è ancora liquido. Per esempio, mettere il cervello di topo verticalmente sul cervelletto al fine di ottenere sezioni coronali rostrale. Trasferire il portarotolo del criostato ed esporre il mezzo di inclusione a temperature inferiori a-10 ° C per l'indurimento.
Nota: Esemplare Fragile tessuto deve essere spalmati in mezzo all'interno degli stampi di tessuto prima del montaggio di inclusione. - Posizionare il supporto di tessuto nel microtomo del criostato. Regolare l'orientamento del tessuto per evitare tratti inclinati.
- Tagliare il tessuto con la Guida di un Atlante stereotassiche18 nelle sezioni di spessore desiderato (12 µm consigliato per [3H] etichettati ligandi). Attentamente raddrizzare e aprire la sezione con un pennello di piccole dimensioni, se necessario e disgelo-Monte la sezione su un vetrino da microscopio. Raccogliere in sequenza le sezioni dalla regione di interesse per replica tecnica desiderato (ad esempio, 4 sezioni per ogni diapositiva).
- Consentire le sezioni sui vetrini asciugare all'aria per 1 h prima di ulteriore gestione.
Nota: Aggiunta di materiale essiccante per scatole di diapositiva riduce al minimo l'umidità accumulo su sezioni di tessuto. Procotol può essere messo in pausa qui memorizzando sezioni a lungo termine nelle caselle di diapositiva a-80 ° C.
2. in vitro autoradiografia
Attenzione: radioattività. Lavorare in un laboratorio certificato secondo le normative locali. Indossare indumenti protettivi. Smaltire secondo decadimento radioattivo o in outsourcing ad una società certificata.
- Scongelare le sezioni per almeno 30 min a temperatura ambiente (TA). Marcare i vetrini con condizioni sperimentali. Utilizzare una matita perché le diapositive verranno essere inondate di etanolo durante la successiva colorazione.
- Porre i vetrini in posizione orizzontale in vassoi di plastica.
Nota: Posizionamento di diapositive su una piattaforma elevata all'interno di vassoi in plastica facilita la loro manipolazione. - Pre-incubate le sezioni montate su slitte nel tampone adeguato al target in questione (per il protocollo di GHB, tampone 50 mM a pH 6.0 KHPO4 è usato) applicando accuratamente un volume adeguato sulla diapositiva (700 µ l per 3-4 sezioni coronali roditore).
Nota: Assicurarsi che ogni sezione è coperto completamente di liquido.- Coprire i vassoi in plastica con un coperchio per evitare l'evaporazione e pre-Incubare a temperatura rilevanti (per protocollo GHB pre-incubata per 30 min a RT) sotto costante brezza (20 giri) agitazione su un agitatore per piastre.
- Per la determinazione del legame non specifico, supplemento di tampone con concentrazione rilevante di adenoida composto (per protocollo di GHB, 1mm GHB).
Nota: Pre-incubazione può non essere necessario.
- Versare liquido di pre-incubazione da ogni diapositiva e trasferire le diapositive indietro il vassoio di plastica.
- Per evitare la disidratazione, immediatamente Incubare le sezioni con concentrazione rilevante di radioligand nel tampone sotto condizioni desiderate (per il protocollo GHB, 1 nM [3H] HOCPCA per 1h a RT) coprendo le sezioni completamente con il radioligando soluzione (700 µ l per 3-4 sezioni coronali roditore).
- Incubare sotto sotto agitazione costante brezza (20 giri) di vassoi in plastica con coperchio chiuso.
Nota: La concentrazione radioligand può essere convalidata da contando un'aliquota in un contatore a scintillazione liquida.
- Incubare sotto sotto agitazione costante brezza (20 giri) di vassoi in plastica con coperchio chiuso.
- Rimuovere la soluzione di incubazione versando il liquido e trasferire i vetrini in un rack di vetrino del microscopio. Procedere immediatamente alla fase successiva per evitare la disidratazione di sezione.
- Lavare i vetrini. Per il protocollo GHB, lavare con tampone ghiacciata due volte per 20 s e poi risciacquare due volte immergendo il portavetrini nei vassoi riempiti con acqua ghiacciata distillata per rimuovere sali. Posizionare i vetrini verticalmente in rack per essiccamento all'aria per almeno 1 h a RT o asciugare i vetrini per 5 min con un soffiatore impostato su temperatura fredda.
Nota: Il lavaggio deve essere ottimizzato, ad esempio, vasto lavaggio può essere utile per diminuire il legame non specifico. - Trasferire i vetrini di un fixator contenenti polvere di paraformaldeide (PFA) per la fissazione durante la notte con vapori PFA a RT al fine di proteggere l'integrità del complesso ligando-target.
Attenzione: PFA è tossico. Sene fixator nel cappuccio del vapore ed evitare il contatto con pelle e occhi con PFA. - Il giorno seguente, trasferire i vetrini in una scatola di un essiccatore contenente gel di silice per 3 h a RT per eliminare l'umidità.
3. esposizione al fosforo Imaging piastre e scansione
- Inserire le sezioni in una schermatura radiazioni imaging Piastra mangianastri con il tessuto rivolto verso l'alto. Per la successiva quantificazione del grippaggio radioligand, includono un Microscala [3H] in ogni cassetta. Organizzare le sezioni in modo casuale ed esporre le sezioni per confronto diretto nella stessa cassetta.
- Cancellare il fosforo di trizio-sensibile imaging piastra immediatamente prima dell'uso, al fine di rimuovere segnali accumulati dal deposito e per eliminare i segnali di sfondo. Pertanto, la piastra di carico in macchina imaging fosforo ed esporlo visibile/infrarosso luce secondo le istruzioni del produttore.
- Rimuovere la piastra dalla macchina imaging fosforo e posizionatelo immediatamente sopra le sezioni nella cassetta. Assicurarsi che la cassetta è chiusa completamente. Esporre le sezioni per la piastra di imaging di fosforo per 3 giorni a temperatura ambiente al riparo da luce.
- Perché luce Cancella segnale dalla piastra di imaging, attentamente aprire la cassetta al buio e immediatamente trasferire la piastra imaging nella casella scura di un imager di fosforo o posizionare il dispositivo di imaging di fosforo in una stanza buia.
Nota: Assicurarsi di annotare la disposizione spaziale delle diapositive durante l'esposizione al fine di identificare singoli esemplare sull'immagine digitale dopo l'analisi. Pertanto, imaging piastre al fosforo visualizzano anche un angolo tagliato in un angolo di distinto al fine di individuare il corretto orientamento della piastra sull'immagine digitale. - Scansione la piastra alla massima risoluzione possibile ottenere un'immagine digitale.
4. facoltativo: Cresile viola colorazione di sezioni di tessuto
- Preparare 1% cresyl violet soluzione miscelando 5 g di cresile viola in 500 mL di acqua deionizzata (dH2O) fino a completa dissoluzione (circa 2 h). Filtrare attraverso un filtro di carta utilizzando un imbuto in una nuova bottiglia di 500 mL. Regolare il pH a 3.5-3.8.
- La colorazione del vetrino e arretrata sotto cappa. Preparare i vassoi con le seguenti soluzioni in vassoi in polipropilene bianchi (ad eccezione di xilene):
a. 50% ethanol/50% dH2O
b. 70% ethanol/30% dH2O
c. 100% etanolo
d. 100% etanolo
e. 100% dH2O
f. viola di cresyl 1%
g. 0.07% di acido acetico (aggiungere 175 µ l di acido acetico in 250 mL di dH2O).
h. 100% xilene in verde vassoi resistenti ai solventi
i. 100% xilene in verde vassoi resistenti ai solventi - Trasferire i vetrini per la cappa e metterli in un portavetrini.
- Sciogliere i lipidi attraverso la serie graduata crescente di etanolo in dH2O in etanolo al 100% (vassoio a-d) immergendo i vetrini per 1 min.
- Reidratare gli esemplari di dH2O attraverso decrescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d in ordine inverso, seguita dalla vaschetta e) immergendo i vetrini per 1 min.
- Immergere gli esemplari in soluzione di cresile viola per 10 min.
- Sciacquare gli esemplari in 0.07% di acido acetico sollevando le diapositive su e giù dolcemente per 4-8 s. lavare i vetrini mediante immersione in dH2O per 1 min.
- Disidratare gli esemplari per immersione delle diapositive per 30 s in crescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d).
- Trasferire gli esemplari attraverso due vassoi di xilene 100% (vassoio h e i) per placare l'etanolo.
- Reidratare gli esemplari di dH2O attraverso decrescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d in ordine inverso, seguita dalla vaschetta e) immergendo i vetrini per 1 min.
- Rimuovere le diapositive da saline con le pinzette. Aggiungere poche gocce di solvente organico montaggio supporti per ogni diapositiva e un vetrino coprioggetto 24 x 60 mm sulla parte superiore per proteggere gli esemplari. Rimuovere le bolle d'aria tra il campione e il vetrino coprioggetti premendo delicatamente sul vetrino coprioggetti.
Nota: Tenere le rimanenti diapositive in xilene durante il montaggio per evitare l'essiccazione. - A secco le diapositive durante la notte in una cappa a TA.
- Ottenere una foto del campione con un microscopio e 1,25 X obiettivo.
5. densitometrica analisi di immagine digitale
- Misurare la relativa densità ottica (barre) di ogni standard da Microscala [3H] con un software di analisi di immagine di calibrazione.
- Selezionare un'area di dimensioni uguali per ogni punto di Microscala [3H] utilizzando un tool per la creazione della regione dalla voce di menu determinazione regione. Assegnare un numero ad ogni area selezionata cliccando sul numero sotto la voce di menu Label.
- Esportare valori OD per ogni punto standard di calibrazione facendo clic File | E sporta | relazione regione 2D. Trasferire i valori ROD in un foglio di calcolo e normalizzare dalla dimensione dell'area selezionata. Eseguire la regressione lineare per ottenere una curva standard per ulteriore analisi densitometrica.
Nota: Assicurarsi che le aree selezionate siano etichettate al fine di identificare i corrispondenti valori ROD e campioni.
- Eseguire la quantificazione di autoradiogrammi utilizzando i propri software di imaging selezionando la regione di interesse (ROI) utilizzando uno strumento di creazione della regione in ogni sezione e misura relativo ODs. Selezionare la regione stessa in ogni sezione creando un modello per la regione di interesse, che viene copiato e regolata manualmente variazioni minori nell'anatomia del cervello per ogni autoradiogram. Identificare l'anatomia del ROI di confronto di autoradiogrammi con un cervello Atlante18. Quando vengono confrontati i trattamenti multipli, eseguire l'analisi in cieco e randomizzato al fine di evitare la selezione parziale di ROIs.
- Esportare valori ROD e delle dimensioni delle aree selezionate in un foglio di calcolo facendo clic File | E sporta | relazione regione 2D.
- Dividere l'asta di misura del ROI selezionato dalla relativa zona per ottenere la densità per l'area specifica.
- Misurare l'asta dello sfondo della piastra ed esportare i valori corrispondenti di ROD e dimensioni dell'area in un foglio di calcolo. Sottrarre il segnale di fondo medio da ogni valore ROD di ogni ROI.
- Media le aste dei replicati tecnici, vale a dire, sezione replica usando il tessuto dall'animale stesso.
- Utilizzare la curva standard per convertire canne in unità di radioligand binding, vale a dire., equivalenti di nCi/mg del tessuto (TE).
Nota: Il termine TE viene utilizzato perché gli standard sono generati con materiali che simula il tessuto. - Rapidi di associazione di conversione di nCi/mg di nmol/mg TE secondo l'attività specifica del radioligand (equazione 1).
(1) - Per ottenere valori di legame specifico, sottrarre il legame non specifico dall'associazione totale.
- Media il legame di ogni replica biologico utilizzando la media del tecnico replica di ogni animale (ottenuto nel passo 5.6).
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Representative Results
Utilizzando il protocollo descritto, la distribuzione anatomica di siti di legame ad alta affinità GHB è stata visualizzata con l'analogo GHB radiomarcato [3H] HOCPCA nel cervello di topo, che è stato tagliato in sezioni coronale, sagittali e orizzontale (Figura 3 ). Alti livelli di associazione sono stati osservati nell'ippocampo e nella corteccia, inferiore nel corpo striato e l'associazione non è state rilevate nel cervelletto, corrispondenti ai precedenti modelli di espressione segnalati di alto-affinità GHB siti9,10, 11,12. Come illustrato di seguito, le strutture anatomiche possono essere visualizzate utilizzando diversi piani di sezionamento e integrità anatomica può essere sostenuto dalla macchiatura cresile viola. Per siti di legame ad alta affinità GHB, soprattutto regioni con bassa radioligand associazione, come il cervelletto, sono confermate con conseguente colorazione del tessuto (Figura 3). Sezioni coronali si trovano più spesso nella letteratura9,10. Sono pratici per scopi quantitativi, una maggiore quantità di sezioni possono essere ottenute da un cervello. Sezioni sagittali e orizzontali hanno il vantaggio di visualizzare associazione durante la maggior parte del cervello del roditore all'interno di una sezione fornendo così ottima panoramica. La figura 4illustra la conservazione evolutiva dei siti di legame ad alta affinità GHB nel cervello dei mammiferi. [3H] Siti di legame di HOCPCA sono stati rilevati nel topo, ratto, così come nel tessuto di cervello di maiale che consente il confronto di anatomia del cervello lordo tra specie. In genere, conservazione evolutiva e gli studi di distribuzione regionale possono aiutare notevolmente nella caratterizzazione di una proteina di interesse, in questo caso un nuovo bersaglio e così possono dare indicazioni sulla sua funzione fisiologica19.
I siti di legame ad alta affinità GHB sono stati sondati con GHB radioligands, che presentano diverse affinità per i siti di legame ma comparabili attività specifiche (Figura 5). [3H] HOCPCA precedentemente è stato indicato per avere un Kd di 74 nM, che è superiore al radioligando commercialmente disponibile [3H] NCS-382 con Kd di 697 nM, entrambi determinati a pH 6.0 da autoradiografia quantitativa9. Così, [3H] HOCPCA è dotato di sensibilità molto più elevata, che conduce a un ottimo rapporto segnale-rumore. Dovuto la sensibilità più bassa del radioligand NCS-382, maggiore [3H] concentrazioni devono essere utilizzate al fine di ottenere simili livelli di associazione (confrontare y nella Figura 5). Quando rispetto a [3H] GHB, anche le più alte concentrazioni radioligand (30 nM) sono necessari per raggiungere i livelli comparabili di associazione. Questo è principalmente dovuto l'affinità significativamente più basso (Kho di 4,5 µM) di questo radioligand20. Tuttavia, la maggiore concentrazione radioligand aumenta anche il livello di legame non specifico9,10 con un rapporto segnale-rumore di conseguenza inferiore. Questa serie di esperimenti evidenzia l'importanza di avere un radioligand ad alta affinità per la produzione di immagini di alta qualità.
Perché i siti GHB ad alta affinità sono espressi a livelli così elevati nelle regioni del forebrain (60 pmol/mg17), la determinazione dei parametri farmacologici di curve di saturazione è intrinsecamente difficile usando la formazione immagine di fosforo sensibili standard trizio piastre a causa del rischio di immagini troppo saturi. Di conseguenza, Kd valori per [3H] HOCPCA e [3H] NCS-382 sono stati ottenuti da primo determinante Ki valori di spostamento omologa curve e poi calcolo di Kd (Figura 6)9. Per la maggior parte dei radioligands, un'alternativa sarebbe quella di utilizzare la diluizione dell'isotopo come solitamente accade in omogeneato analisi obbligatorie. Inoltre, sono stati determinati valorid K a valori di pH diversi. Evidentemente, i siti GHB ad alta affinità sono etichettati in modo più efficiente a pH 6.0 (Figura 6A e Figura 6), poiché cambiando dosaggio Condizioni a pH 7,4 sostanzialmente impatto affinità ligando. Così, la Kd per [3H] HOCPCA a pH 7.4 è circa 30 volte superiore numericamente a quello a pH 6.0. Aumentando ulteriormente il pH si traduce in un elevato grado di legame non specifico, che diventa un avvertimento quando si utilizza [3H] NCS-382 dove solo gli importi bassi di grippaggio specifico possono essere ottenuti a pH 7,4 (Figura 6E). Questo ostacola infatti la determinazione dei parametri farmacologici utilizzando questo radioligand a pH fisiologico9, illustrando ancora una volta il potere nell'avere un radioligando con come alta affinità come possibile.
Figura 1: strutture di radioligands targeting per i siti di legame ad alta affinità GHB. Acido carbossilico di [3H] 3-hydroxycyclopent-1-ene ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - tetrahydro-5-idrossi-5H- benzocyclohept-6-ylidene acetico acido (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 e acido γ-idrossibutirrico [3H] ([3H] GHB)16 come radioligands contenente tritio con attività specifica comparabili (20-40 Ci/mmol), come pure [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125io] BnOPh-GHB)13 con un'attività stimata molare del 2000 Ci/mmol21. L'elemento strutturale di GHB è evidenziato in rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Lo schema del protocollo di in vitro autoradiografia. (1) l'animale è eutanasia, il tessuto è dissecato e snap-congelato il ghiaccio secco. Tessuto è poi sezionato un criostato, disgelo-montato su vetrini da microscopio e (2) sezioni vengono incubate con radioligandi fino al associazione di equilibrio. Per la determinazione del legame non specifico, soluzioni sono completati con un dislocatore adenoide di una struttura chimica correlata ma non identica. (3) successivamente, radioligand non legato viene rimosso mediante lavaggio in tampone e sali sono eliminati risciacquando con acqua distillata H2O. Quando sezioni sono asciutti, la fissazione del paraformaldeide (PFA) viene eseguita per stabilire definitivamente l'interazione ligando-proteina. Sezioni vengono quindi esposte al fosforo piastre di imaging. (4) dopo sufficiente tempo di esposizione, piastre vengono analizzati per ottenere autoradiogrammi digitale. (5) Infine, analisi dell'immagine viene eseguita utilizzando le definizioni delle regioni di interesse (ROI) e l'associazione viene quantificata. Nell'esempio illustrato, le densità ottiche (ODs) sono illustrate nelle sezioni della corteccia del mouse (a sinistra) e l'ippocampo (al centro). Quantificazione avviene esponendo sezioni insieme un Microscala [3H] (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sezioni del cervello autoradiogrammi rappresentativi di 1 associazione di HOCPCA nM [3H] a mouse. (A) Radioligand associazione a coronale, sezioni di tessuto sagittale e orizzontale per illustrare l'importanza del sezionamento aereo sulla visibilità delle strutture anatomiche. (B) Cresyl violet macchiatura delle corrispondenti sezioni del tessuto per verificare le regioni anatomiche, in particolare regioni con bassa/assente radioligand binding. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Autoradiogrammi rappresentativi dell'associazione di HOCPCA nM [3H] 1 in specie diverse. Confronto di ratto (A), mouse (B) e (C) maiale autoradiogrammi in vitro al fine di illustrare la conservazione evolutiva di siti di legame per regioni corticali e ippocampali insieme anatomia lorda del cervello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Quantificazione dell'associazione per i siti di legame ad alta affinità GHB con diversa sensibilità per GHB radioligands mediante autoradiografia in vitro nel cervello affetta da mouse corteccia e nell'ippocampo. Associazione totale viene segnalato come equivalenti di tessuto fmol/mg (TE) per il radioligands (A) [3H] HOCPCA (1 nM) e (B) [3H] NCS-382 (7 nM) e (C) [3H] GHB (30 nM) (simili attività specifiche). Legame non specifico non è stata rilevata in presenza di 1 GHB o 1 mM HOCPCA per uno qualsiasi dei radioligands (non mostrato). Dati sono presentati come media ± deviazione standard di quattro repliche biologiche ciascuno eseguito in tre replicati tecnici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati rappresentativi di autoradiografico determinazione di Kd e B valorimax da spostamento omologo competitivo [3H] HOCPCA e [3H] NCS-382 in sezioni corticali di topo a pH 6.0 e pH 7.4 al fine di illustrare l'influenza del pH sulla affinità di radioligands. (Kd e Bmax sono stati calcolati utilizzando lo stesso composto come radioligando e concorrente, attraverso la determinazione iniziale di Kho valori22). (A) autoradiogrammi con rapporto segnale / rumore ottimale per l'associazione di HOCPCA nM [3H] 1 a pH 6.0. (B) cambiare il tampone a pH 7.4 richiede un' più alta concentrazione di HOCPCA [3H] (8 nM) per raggiungere livelli di associazione significativa. Curve di associazione registro-concentrazione risultante (C); media ± SEM. (D) 5 associazione NCS-382 nM [3H] a pH 6.0 risulta in basso legame non specifico, mentre (E) 40 nM [3H] NCS-382 è sufficiente ad ottenere l'associazione a pH 7,4. Curve di associazione registro-concentrazione risultante (F); media ± SEM. dati sono stati ottenuti da 3-4 repliche biologiche ciascuno eseguito in 3-5 replicati tecnici, solo [3H] NCS-382 esperimenti a pH 7.4 sono stati effettuati con solo 2 repliche biologiche. Per entrambi radioligands, 1mm che GHB è stato utilizzato per la determinazione del legame non specifico. Per ulteriori informazioni sull'analisi e calcolo di Kd e Bmax, vedere9. Questa figura è stata adattata e ristampata da precedente pubblicazione9 con il permesso da Elsevier. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La qualità di un'analisi autoradiografica viene determinata dalla sensibilità del radioligand. Un fattore di contributo importante è il radioisotopo selezionato, che è dato dalla disponibilità di ligandi noti o dalla fattibilità di specifiche tecniche di etichettatura per produrre ligandi con appropriata attività specifica (cioè, la quantità di radioattività per mole unità un radioligando)23e con limitate quantità di degradazione chimica. Un gran numero di radioligands di ligandi noti è etichettato con trizio9,10,24,25,26, che deduce diversi vantaggi. In primo luogo, trizio (3H) è caratterizzata da una lunga emivita (12,43 anni) promuovere la conservazione a lungo termine dei singoli lotti. In secondo luogo, l'interazione ligando-target non distorce il radionuclide come 3H-ligandi sono biologicamente indistinguibili da loro composti. Trizio emette energia bassa β–-particelle, che solo brevi spostamenti in tessuto con conseguente elevata risoluzione spaziale e, successivamente, una maggiore distinzione tra anatomico strutture4. Tuttavia, etichettatura di trizio può essere prodotto solo per produrre moderatamente alta attività specifiche. Questo è dovuto al fatto che disponibili 3H-fonti sono contaminati con idrogeno non radioattivo. Generalmente, maggiore è l'attività specifica, la meno radioligand è necessaria resa sensibile rilevamento23. Inoltre, dovrebbe essere considerato che 3H-ligandi hanno la possibilità di sottoporsi a cambio di idrogeno con acqua a seconda della stabilità delle 3H-etichetta. Per compensare la bassa espressione o troppo debole attività specifica, iodio-125 può essere utilizzato come il radionuclide13. L'attività specifica massima di iodio-125 è circa 100 volte superiore a quella del trizio. Tuttavia, parecchie considerazioni aggiuntive devono essere fatto quando si lavora con iodio-125. Per esempio, l'aggiunta di iodio-125 normalmente induce alterazioni strutturali della molecola che possono influenzare le interazioni ligando-target. Come iodio-125 ha un'emivita di 60 giorni, correzione per decadimento quotidiano dovrebbe essere considerata per specifiche attività e quantificazione di ligando-target interazioni23. 125 Ligandi emettono fotoni γ e nonostante la sensibilità molto più elevata, producono immagini a bassa risoluzione. Ciò è dovuto la relazione inversa tra la risoluzione e l'energia massima dell'isotopo (come discusso di seguito). Infine, rispetto al trizio, aumento dovrebbe prestare attenzione quando si maneggia iodio-125 a causa della maggiore energia del radionuclide.
A seconda il nuclide, spessore di sezione del tessuto può influenzare la risoluzione. Il basso consumo energetico β–-radiazione di trizio limita la sua portata di tessuto di circa 5 µm a causa di autoreferenzialità. Di conseguenza, quantificazione non è influenzata da spessore del tessuto quando supera lo spessore di sezione 5 µm27,28. Al contrario, il decadimento radioattivo di isotopi ad alta energia ha una maggiore penetrazione del tessuto, con conseguente bassa risoluzione di immagine perché ligandi con una distanza maggiore per il mezzo di rilevazione anche contribuiranno alla formazione dell'immagine. Di conseguenza, più sottili sezioni promuovono maggiore risoluzione per radionuclidi ad alta energia1.
L'istituzione di un protocollo autoradiografico richiede la conoscenza delle condizioni ottimali di legame (ad es., tampone, pH e temperatura) e parametri farmacologici del radioligand in termini di affinità e cinetica. Se non è stato caratterizzato il radioligando prima, studi esplorativi sono necessarie29. Scegliendo una concentrazione ottimale radioligand è guidato sia per l'affinità dei radioligand e l'abbondanza di siti di legame. Normalmente, una concentrazione che riflette 5 - 6 volte Kd viene utilizzata per assicurarsi che tutti i siti di legame sono saturi30. Un altro approccio mira a produrre il più alto rapporto di totale-per-non-specifici associazione selezionando radioligand concentrazioni sotto Kd31 e radioligand soluzione di risparmio allo stesso tempo. Questo approccio è particolarmente utile quando il sito di legame è molto abbondante nel tessuto esaminato poiché radioligand alte concentrazioni aumenterebbe la probabilità di oversaturating autoradiogrammi, come il caso per [3H] HOCPCA e il GHB di alto-affinità Associazione siti9. Inoltre, al fine di etichettare in modo efficiente l'intera popolazione della proteina mirata, il radioligando dovrebbe idealmente legano a tutte le conformazioni possibili target. Soprattutto in autoradiografia del ricevitore, l'uso di agonisti può rivelare solo un parziale numero di recettori totali dato che alcuni potrebbero essere presenti negli Stati di bassa affinità dell'agonista. Al contrario, gli antagonisti neutri visualizzano più spesso affinità per tutti i recettori stati26,29.
Inoltre, esperimenti di binding vengono effettuati principalmente in condizioni di equilibrio associazione. Di conseguenza, il tempo necessario a raggiungere associazione equilibrio nelle circostanze sperimentali desiderate (concentrazione radioligand fisso, buffer e temperatura) dovrebbe essere determinato in esperimenti di associazione per assicurare l'associazione equilibrio nell'ambito della esperimento4,23,30. Dopo incubazione radioligand radioligand non legato è lavato via da diverse incubazioni con tampone e in genere seguito da un risciacquo in acqua distillata H2O. Signal-to-noise rapporti possono essere ottimizzati regolando temperatura e tempo a seconda della tasso di dissociazione del radioligand26,30,31.
Radioligands potrebbe visualizzare associazione ai materiali non biologici, cioè, legame non specifico. Radioligand associazione a componenti cellulari diversi dalla destinazione desiderata viene definita come associazione aspecifici. Il contributo dell'associazione non specifico per l'importo totale del radioligand binding viene valutato in presenza di un ligando non etichettato concorrente destinato stesso sito associazione del radioligand. Come il composto non radioattivo (dislocatore) viene fornito in 10,000-fold eccesso, che occupa il sito di legame e la radioligand può essere associato solo a siti26,31,32fuori bersaglio. Fondamentalmente, il composto non etichettato dovrebbe essere di una struttura chimica differente rispetto la radioligand poiché questo riduce il rischio di spostamento entrambi associazione specifica come non specifico23. Legame aspecifico derivanti dall'associazione delle membrane può essere un grave problema soprattutto nel caso di radioligands abbastanza lipofilo. In alcuni casi, procedure di lavaggio estesa possono rimuovere non-recettore associato radioligand e quindi migliorare le specifiche vincolanti rapporti29.
Quando si sceglie un tampone del saggio, è fondamentale considerare l'effetto della forza ionica e pH dell'interazione ligando-target. Soprattutto elettrostatiche interazioni tra polar ligandi e componenti idrofili di siti di legame sono influenzate dalla forza ionica del buffer. Di conseguenza, il completamento con ioni monovalenti o bivalenti può influire l'affinità efficace costante23,33. Se la composizione ottimale di buffer per l'interazione ligando-target studiato è sconosciuta, diversi buffer comuni dovrebbe essere esplorato in esperimenti pilota. Buffer può essere completata anche con anti-ossidanti come l'acido ascorbico e gli inibitori di enzimi29,34di degradante. Inoltre, l'ionizzazione di gruppi specifici all'interno del sito dell'associazione o il ligando stesso è influenzata dal pH ed ha effetti critici sulla costante di associazione equilibrio, le costanti di velocità cinetica e legame non specifico23,33. Ad esempio, sondando il GHB di alto-affinità vincolante sito con diversi GHB radioligands ben illustra l'importanza del pH su questo obiettivo vincolante (Figura 6). Che caratterizzano il pH ottimale per l'interazione ligando-recettore può anche dare indizi circa l'importanza dell'obiettivo in relazione alla sua rilevanza biologica.
Un altro fattore critico in autoradiografia digitale è il tempo di esposizione, vale a dire, il tempo necessario per raggiungere quantificabili autoradiogrammi esponendo le sezioni di tessuto radiomarcato a fosforo piastre di imaging. Le stime si basano sulla quantità di radioattività nel campione, l'energia e tempo di dimezzamento dell'isotopo come pure il desiderato rapporto segnale-rumore. In particolare, prolungata esposizione tempo risultati in immagini sature e segnale di alta priorità bassa. Segnale di fondo elevato può essere ridotto mediante l'archiviazione cassette all'interno di ambienti conduttore schermato per evitare radiazioni cosmiche1,4. Tuttavia,: se autoradiogrammi non ottimali sono raggiunti, il campione può essere esposto più volte, purché il complesso ligando-target è fisso e l'emivita del radionuclide lo permette.
Fosforo piastre di imaging possono essere riutilizzato e hanno una lunga durata quando maneggiate correttamente, cioè, la flessione dovrebbe essere evitato e piastre devono essere conservati in un ambiente asciutto. La gestione del fosforo piastre di imaging è guidata dalla loro sensibilità alla radiazione cosmica e luce. Pertanto, è importante cancellare la piastra prima di ogni utilizzo al fine di ridurre al minimo segnale di fondo. L'esposizione delle sezioni del tessuto radiomarcato alle piastre imaging avviene in cassette schermato radiazione completamente privo di luce. Quando si trasferisce la piastra per lo scanner alla fine del tempo di posa, qualsiasi luce ambientale dovrebbe essere evitato anche come anche breve contatto con luce bianca riduce il segnale accumulato. Inoltre, piastre devono essere analizzati immediatamente dopo la rimozione del campione per evitare segnale dissolvenza. Uno svantaggio dell'utilizzo di fosforo piastre di imaging è la potenziale comparsa di manufatti e residuo 'immagini fantasma' dopo l'uso ripetuto di piastre1.
Lavorare con trizio richiede piatti senza un rivestimento protettivo per consentire la radiazione a bassa energia raggiungere i cristalli di fosforo di imaging. Sensibili al trizio fosforo imaging piastre quindi sono più sensibili alla contaminazione o danni dovuti a uso improprio. Una volta contaminati, piastre di trizio sensibili non possono essere puliti e devono essere sostituiti. Fissazione del complesso ligando-target con vapori PFA riduce la contaminazione potenziale della piastra, allungando la durata di vita. Inoltre, la disidratazione del tessuto a seguito di fissazione è un passo cruciale poiché lastre sensibili trizio sono sensibili all'umidità. Grazie alla sua natura delicata, piastre sensibili al trizio non dovrebbero essere utilizzati per altri isotopi1,4. Al contrario, le piastre per isotopi ad alta energia come iodio-125 sono più robuste e la loro superficie può anche essere pulita strofinando con etanolo al 70%.
Tradizionalmente, la pellicola radiosensibile è stato utilizzato per la registrazione spaziale del decadimento radioattivo. Mentre possono essere ottenute immagini ad alta risoluzione, autoradiografia film presenta diverse limitazioni. Oltre la necessità di prodotti chimici pericolosi e una camera oscura per lo sviluppo, pellicola di raggi x è caratterizzato da una stretta gamma dinamica. Di conseguenza, può essere necessario esporre radiomarcati sezioni ripetutamente con diversi tempi di esposizione per ottenere foto di insaturi quantificabili35. Inoltre, pellicola di raggi x presenta sensibilità limitata conseguente tempi di esposizione prolungata per esemplare etichettati con isotopi di bassa energia, vale a dire. decadimento del trizio può richiedere diversi mesi di esposizione. Bassa sensibilità combinata con piccola gamma lineare rende la tecnica estremamente che richiede tempo, soprattutto quando condizioni di dosaggio ottimale devono essere determinata prima1,35.
Con lo sviluppo di fosforo piastre di imaging, diverse di queste limitazioni sono state indirizzate35,36,37. Le piastre di imaging servono per memorizzare temporaneamente immagini di decadimento radioattivo, che rappresenta la disposizione spaziale del radioligand nell'esemplare del tessuto. Photostimulable BaFBr:Eu2+ cristalli di fosforo sono utilizzati per catturare l'energia radioattiva emessa dal campione, come risultati di radiazione (per esempio, i raggi x, raggi gamma o beta particelle) ad alta energia nella eccitazione di UE2+ UE3+ e conseguente intrappolamento dell'elettrone liberato in fosforo della grata4,37. L'esposizione della targa imaging alla luce visibile o infrarossa inverte la reazione, cioè, l'elettrone intrappolato viene rilasciato e durante la trasformazione dell'UE3+ a Eu2+ luminescenza è emessa. La luce emessa è proporzionale alla quantità di radioattività e il rilevamento di un fotomoltiplicatore consente la creazione di un autoradiogram digitale37. Questo sistema fornisce un aumento nella sensibilità accompagnata da una profonda riduzione del tempo di esposizione da mese a giorni3. In cima a quello, la gamma dinamica lineare è considerevolmente aumentata, che riduce la possibilità di immagini troppo saturi. Linearità entro quattro o cinque ordini di grandezza ed è stato validato ripetutamente3,35,36,37,38. Anche se autoradiografia pellicola fornisce ancora superiore risoluzione spaziale, gli sforzi in tecnologia di scansione ha provocato il miglioramento della risoluzione da 300 a 25 µm (dimensioni in pixel), che permette la differenziazione dettagliata tra regioni anatomiche3. Nel complesso, imaging piastre al fosforo stanno agevolando l'acquisizione di autoradiogrammi digitale sia a causa di un aumento della gamma lineare e sensibilità. Tempo di esposizione ridotto e una tecnica di sviluppo semplificato significativamente condurre a tempo in diminuzione per l'analisi dei dati consentendo un throughput più elevato.
Rispetto ad autoradiografia, utili parametri farmacologici quali affinità e densità sono anche comunemente caratterizzati dall'applicazione di radioligands negli omogenati di tessuto associazione dosaggi. Questo metodo ha il vantaggio di produrre risultati misurando il decadimento radioattivo di β-emessa con un rivelatore a scintillazione liquida in un modo efficiente2. Viene eseguita in un approccio multi-pozzetto, ad esempio, in piastre microtiter a 96 pozzetti, tali dosaggi sono utili per screening di librerie di composti e per un numero maggiore di relazioni di concentrazione-dipendente. In cima a quello, lo svolgimento di analisi di saturazione con questa configurazione è spesso più fattibile rispetto ad autoradiografia, che visualizza un rischio di immagini troppo saturi con radioligand alte concentrazioni. Tuttavia, eseguire omologo spostamento fisso basso radioligand con ligandi non radioattivo, una concentrazione al fine di ottenere Kd e Bmax elude il problema di immagini troppo saturi (Figura 6)22. Autoradiografia e omogeneato associazione produrre stime simili per le costanti di affinità ligando considerando che la densità del tessuto della proteina di interesse può essere sottovalutato in omogeneato associazione. Così, è stato proposto che la rottura della membrana cellulare concomitante con omogeneizzazione del tessuto potrebbe provocare la perdita del recettore o alterato vincolanti condizioni3,33. Inoltre, errori nella dissezione del tessuto potrebbero produrre omogeneati contaminati con tessuto dalle regioni adiacenti del cervello. In confronto, i modelli di binding anche complessi in piccoli nuclei sono visualizzati e differenziabile a causa della risoluzione spaziale anatomica in autoradiografia3,33.
Immunohistochemistry Visualizza anche la distribuzione di una proteina di interesse anatomicamente. Il metodo è in grado di produrre immagini con alta risoluzione anatomica, come componenti discreti del tessuto possono essere identificati a livello cellulare e subcellulari anche livelli usando la microscopia elettronica. Livelli di espressione sono valutati in base all'intensità della colorazione. Ciò nonostante, quantificazione assoluta dei livelli di espressione è difficile a causa della mancanza di norme di riferimento appropriato39. Inoltre, immunohistochemistry è dipende dalla disponibilità di un anticorpo selettiva, e validato, che è spesso un problema nella ricerca del ricevitore.
Prima di decidere sull'esecuzione in vitro autoradiografia, diverse considerazioni devono essere effettuate. Prima di tutto, preparazione di tessuti post mortem tra cui sezionamento oltre a cicli ripetuti di congelamento e scongelamento possa influenzare la conservazione dell'associazione siti2. Inoltre, il metodo dipende dalla disponibilità di un'adeguata radioligand, che consente di visualizzare ad alta affinità e selettività per il target in questione2. Il radioligando non deve essere visualizzate associazione significativa da siti fuori bersaglio, e dovrebbe anche dimostrare un favorevole profilo cinetico. Ciò è necessario perché il complesso ligando-target deve rimanere intatto durante l'ambito dell'esperimento. Inoltre, in presenza di composti non-radioattivi adatti, l'introduzione del radionuclide potrebbe diventare un fattore critico. Così, la molecola di interesse dovrebbe essere equipaggiata con gruppi funzionali adatti per radiomarcatura efficiente, che consente la produzione di radioligands con sufficientemente elevata attività specifica e stabilità chimica40. Un altro svantaggio di autoradiografia in vitro è che il metodo consente solo l'utilizzo di un animale una volta. Più elegantemente è l'estensione in vivo imaging metodi quali tomografia a emissione di posizione (PET), che consente la scansione ripetuta dello stesso animale e determinazione delle caratteristiche di associazione dinamica e l'occupazione. PET è particolarmente prezioso per lo studio di più alti mammiferi41 e per ottimizzazione della dose in studi pre-clinici 42,43,44.
Parecchie modifiche della tecnica autoradiografica prorogarne l'applicazione sia in termini di caratterizzazione di bersagli farmacologici negli stati sani e malati, nonché nello sviluppo e nella scoperta della droga. Prima di tutto, gli avanzamenti recenti nella tecnologia di imaging hanno portato allo sviluppo di autoradiografia in tempo reale. Rilevatori di gas di particelle α/β ovviare alla necessità di piastre o pellicola di imaging tramite la misura diretta di disintegrazioni, producendo in tal modo digitale veloce autoradiogrammi45.
Inoltre, in vitro autoradiografia permette studi della funzionalità di recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sulla cima di informazioni sulla loro distribuzione anatomica in tessuti post-mortem. Questa variante del metodo coinvolge incubazione delle sezioni del tessuto con un analogo radioattivamente guanosintrifosfato (GTP), vale a dire [35S] guanosina 5'-γ-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), insieme con un non radioattivo agonista dei GPCR. Quando l'agonista si lega e suscita una risposta dei GPCR, l'incorporazione di [35S] GTPγS può essere localizzato e quantificati tramite autoradiografia, che riflette solo i recettori attivati popolazione2,46,47 .
Ex vivo autoradiografia rappresenta un'altra versione della tecnica, che valuta l'associazione regionale di un radioligand dopo amministrazione di un animale vivo sperimentale. Dopo il sacrificio dell'animale, cryosectioning del tessuto in questione e risultato di esposizione autoradiografici in autoradiogrammi che riflettono il radioligand binding in vivo2. Ex vivo l'autoradiografia è comunemente impiegato all'interno di programmi di ricerca e sviluppo di droga al fine di ottenere informazioni sul profilo farmacocinetico di un piombo composto, cioè, suo assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME) . Autoradiografia particolarmente tutto il corpo fornisce la comprensione circa la distribuzione di droga a tutti gli organi e tessuti. Tuttavia, determinazione del legame non specifico e la quantificazione è più difficile rispetto ad autoradiografia in vitro a causa di possibile metabolismo e degrado del radioligand e nessun mezzo per dilavamento non associati ligando48.
Autoradiografia è utilizzato anche per test preliminari e caratterizzazione di PET ligandi4. I radionuclidi ad alta energia carbon-11 e fluoro-18 sono più spesso utilizzati per ligandi di PET. PET è un'applicazione prominente, non-invasivo per radioligands perché quantificabili immagini 3D del radioligand binding in un animale vivente può essere ottenuto11,40,49.
Autoradiografia in vitro utilizzando fosforo piastre di imaging rappresenta un metodo di dosaggio prezioso per la caratterizzazione farmacologica delle interazioni ligando-target. Il metodo produce risultati riproducibili dall'occupazione di un protocollo relativamente semplice e veloce una volta che sono state stabilite condizioni di dosaggio ottimale. Distribuzione anatomica di una proteina di interesse è determinato nel suo microambiente nativo, che consente lo studio del suo ruolo fisiologico, farmacologico e patologico nel tessuto sano e malato post-mortem degli animali da esperimento come pure gli esseri umani2,47.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il lavoro è stato supportato dalla Fondazione Lundbeck (Grant R133-A12270) e la Fondazione di Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Gli autori ringraziano il Dr. Aleš Marek per la fornitura di radioligand [3H].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Merck Millipore | 107017 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BAS-TR2040 Imaging Plate | GE Healthcare Life Science | 28956481 | 20x40 cm - Sensitive to tritium |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) | Merck Millipore | 100579 | |
| O.C.T. Compound, 12 x 125 mL | Sakura | 4583 | Tissue-Tek |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 631-9483 | microscope slides |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura Finetek Denmark ApS | 4451 | |
| Tritium Standard on Glas | American Radiolabeld Chemicals, Inc. | ART 0123 | |
| Xylene substitute | Sigma-Aldrich | A5597 |
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