Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

オートラジオグラフィー法は質的または量的薬理学による組織切片にイメージングに関する基礎的バインディングを研究する使用します。

Abstract

体外放射線写真法は、実験動物として人間から組織の興味の蛋白質の解剖学的分布を可視化を目指しています。メソッドは、その生物学的対象放射性リガンドの特定の結合に基づいています。したがって、凍結するティッシュ セクションはリガンド溶液で培養した、ターゲットへのバインドはその後ローカライズ放射性崩壊の検出によってたとえば、感光性フィルムまたは蛍光イメージング プレートを使用しています。結果として得られるデジタル autoradiograms は、定量化と明確な解剖学的構造の放射性リガンドの結合の局在化を可能にする顕著な空間分解能を表示します。また、定量化できます親和性リガンドの薬理学的解析による結合部位 (B最大) 選択した組織の密度と同様、酸解離定数 (Kd)、阻害定数 (K私)。したがって、メソッドは、ターゲットの局在と性についての情報を提供します。高親和性 γ-ヒドロキシ酪酸 (GHB) 結合の試金に関する方法論的考察に特別な重点を置いて、哺乳類の脳組織内のサイトを結合のオートラジオ グラフの特性と技術を例示するここでは、パラメーター、リガンドと検出方法の選択。

Introduction

放射線は、放射性崩壊の画像を提供する方法です。テクニックは、日常的に関心体外に基づく放射性標識化合物とそのターゲットの特定の薬理学的相互作用の蛋白質の組織分布を調査する使用されます。これは、ターゲットのリガンドの選択性について直接的な情報を提供します。体外放射線写真法は、決定するだけでなく、解離定数 (Kd) などの結合部位 (B最大)、密度イメージングに関する基礎的薬理学的バインディング パラメーターの定量のためにまた使用されるかもしれません競合するリガンド1,2の阻害定数 (Ki) です。オートラジオグラフィーによる伝統的な磨砕液放射性リガンド結合と比較して、空間の解剖学を視覚化することができるという、地域性の表現パターン3の簡潔な詳細を与えることの利点があります。したがって、放射線写真法のメソッドは検証された抗体の有無を中心に、各種の関連する代替です。ミクロトーム クライオスタット切片、および適切なイメージングを準備するために、必要な薬理学的特異性と適切なリガンドの可用性を与えられる標準的なラジオ アイソトープ実験室の放射線写真法を簡単に実装します。それぞれティッシュ セクションの放射能の分布を分析することができるデバイス。特に、リガンドの重要な選択基準は、非ターゲット サイトへのバインドの限られた量です。これは他の蛋白質、膜やプラスチックやフィルターなどの材料にすることができ、総称して非固有のバインドと呼びます。通常非特異的結合非飽和ですが特定のオフのターゲット蛋白質を含む場合は飽和することができます。True 特定のバインドを検証する最良の方法は、組織の遺伝子、例えばターゲットを欠けていると比較する設計 (ノックアウト) 組織4です。

ここでは、方法論は、γ-ヒドロキシ酪酸 (GHB) 哺乳類の脳の高親和性結合部位のオートラジオ グラフの特性で示されています。GHB は両方臨床的に有用な薬剤アルコール依存症5ナルコレプシーの治療だけでなく、哺乳類の脳とレクリエーションの天然成分で、関連性は GHB とその結合部位の薬理学的相互作用を理解すること薬6。高親和性 GHB 結合部位は、ラット脳ホモジネート7[3H] GHB のバインディングを使用して記述されていた最初。年間、[3H] を用いたオートラジオグラフィーによる研究をさらに GHB とアナログ [3H] NCS 382 結合ラット8,9,10, マウスの9の領域を脳の部位の高密度を示しました、11、猿と人間の脳の12の豚。ただし、分子のアイデンティティおよびこれらの結合部位の機能的関連性正確なは、とらえどころのない残っています。

異なる親和性に恵まれている異なる同位体を組み込んだ複数イメージングに関する基礎的、さらに結合部位を特徴付けると生理的ガンマヒドロキシ酪酸の役割に関する研究を容易にする意図で開発されている ([3H] GHB、[3H] NCS-382、[3H] HOCPCA および [125私] BnOPh GHB)13,14,15,16(文献17) (図 1)。選択的な高親和性イメージングに関する基礎的およびイメージング技術9,11蛍光体を用いた高品質画像の生産のためのサイトが認められているバインディングの非常に高い組織密度の組み合わせ。オートラジオグラフィーによる実験とイラストの設定詳細を実証するための実践的なポイントの概要、と一緒にディスカッション セクション i) 放射性核種の選択、ii) アッセイ条件の選択および iii) 蛍光体の使用を強調します。対 x 線フィルム イメージング プレート。本稿の全体的な目標は、組織分布と標的タンパク質の薬理学的解析について知らせるためオートラジオグラフィー技術に関する技術、方法論的、科学的な詳細を提供することです。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

デンマーク動物実験の検査官からのガイドラインに準拠したすべての動物取扱を行った。

注: ここで説明したプロトコルをカバー ティッシュの準備 (すなわちマウス脳組織)、新しいラボ内のメソッド、蛍光イメージング プレートへの露出を設定するための十分な詳細で体外オートラジオグラフィーによるアッセイと同様その後デンシトメトリー分析 autoradiograms (図 2) のローカライズおよび明確な解剖学的構造の放射性リガンドの結合の定量化を目的と。病理組織学的比較クレシル バイオレットの汚損のためのプロトコルが含まれます。また、競合するリガンド非特異的結合の決定はプロトコルの中で含まれています。B最大Kdまたは K は私を確認する方法の詳細については、前の文書4を参照してください。

1. 組織作製セクショニング

  1. 頚部転位によってマウスを安楽死させるし、すぐにハサミ、鉗子を使用して脳を解剖します。直接組織の損傷を避けるために次の手順に進みます。
  2. スナップ-凍結組織による粉末ドライアイス、ガスの CO2イソペンタン。クライオスタットに-20 ° C 設定温度、凍結するティッシュを直接転送します。また、処理まで-80 ° C で組織を格納します。
    注: 組織の損傷を減らすために繰り返し融解/冷凍は避けて下さい。
  3. 組織を粉砕しないように処理をさらに-20 ° C 20 分用クライオスタットに慣らして組織ができます。
  4. クリオスタット外埋め込み中ティッシュ ホルダーをカバーし、すばやく希望する方向で埋め込む媒体はまだ液体凍結組織標本を配置します。例えば、吻側のコロナ セクションを達成するために小脳の上に垂直方向にマウスの脳を配置します。ティッシュ ホルダーをクリオスタットに転送し、硬化の-10 ° C の温度下に埋め込む媒体を公開します。
    注: 壊れやすい組織標本は、取り付ける前に組織金型内でメディアを埋め込みでコーティングする必要があります。
  5. クリオスタット ミクロトームのティッシュ ホルダーを配置します。傾斜セクションを避けるために組織の方向を調整します。
  6. 所望の厚さのセクションで定位アトラス18の指導と組織をカット (12 μ m [3H] の推奨配位子のラベル)。慎重にまっすぐと必要であれば小さいサイズのブラシでセクションを展開、雪解け-マウント顕微鏡スライド上にセクション。技術的なレプリケーションの目的 (例えば、4 セクションごとにスライド) 興味の地域からセクションを順番に収集します。
  7. 処理する前に 1 時間風乾するスライド上のセクションを許可します。
    注: スライド ボックスに乾燥剤の物質の添加は, 切片中の水分蓄積を最小限に抑えます。プロトコルは-80 ° C でスライド ボックスで長期のセクションを格納することによってここで一時停止できます。

2体外放射線写真法。

注意: 放射能。現地の規則に従って認定研究室で作業します。防護服を着用します。産業廃棄物放射性崩壊または認定会社に委託します。

  1. 部屋の温度 (RT) で少なくとも 30 分のセクションを解凍します。実験条件とスライドのラベルを付けます。鉛筆は使用スライド エタノールその後染色中に浴びることに。
  2. プラスチック トレーのスライドを水平方向に配置します。
    注: プラスチック トレー内高架のプラットフォームにスライドを配置の取り扱いが容易になります。
  3. 事前 incubate アッセイバッファーでスライドに取付けたセクション用に調整問題のターゲットに (GHB プロトコル、50 mM KHPO4バッファー pH 6.0 を使用すると) (3-4 齧歯動物のコロナ セクションの 700 μ L) のスライドに適切なボリュームを慎重に適用することによって。
    注: すべてのセクションが液体で完全に覆われていることを確認します。
    1. 蒸発を避けるために、事前プレート シェーカーで振って一定の穏やかな (20 rpm) の下 (常温 30 分事前 incubate GHB のプロトコル) の関連する温孵化するためにふた付きプラスチック トレーをカバーします。
    2. 非特異的結合の決定 (GHB プロトコル、1 mM GHB) のラベルのない化合物の濃度が関連するアッセイバッファーを補足します。
      注: 前培養は必要ない場合があります。
  4. 各スライドの前培養液を注ぐし、スライドをプラスチック製のトレイに転送します。
  5. 脱水症状を避けるためには、すぐにアッセイバッファー目的条件下で放射性リガンドの濃度の関連するセクションを孵化させなさい (GHB プロトコル、1 nM [3H] 常温 1 時間 HOCPCA) リガンドと完全にセクションをカバーでソリューション (3-4 齧歯動物のコロナ セクションの 700 μ L)。
    1. 穏やかな定数 (20 rpm) 揺れ閉じた蓋付きプラスチック トレーの下の下でインキュベートします。
      注: 放射性リガンド濃度は液体シンチレーション カウンターの因数を数えることで検証できます。
  6. 液体を注ぐことによって孵化ソリューションを取り外し、顕微鏡スライド ラックにスライド。すぐにセクション脱水症状を避けるために次のステップに進みます。
  7. スライドを洗います。GHB プロトコルの塩を削除する冷たい蒸留水を満たしたトレイにスライド ラックを浸すことによって二度 20 の s と、すすぎの 2 回冷たいアッセイバッファーで洗浄します。RT で少なくとも 1 時間常温乾燥用ラックに垂直にスライドを配置または乾燥送風機で 5 分用のスライドを低温に設定します。
    注: 洗濯を最適化する必要があります、例えば、広範な洗浄は、非特異的結合を減少させるため役に立つかもしれません。
  8. スライドをターゲット リガンド複合体の整合性を保護するために RT で PFA 蒸気で一晩固定用パラホルムアルデヒド (PFA) 粉末を含む創固定器に転送します。
    注意: PFA は有毒です。ポジションを創固定器ドラフトチャンバーし、PFA と皮膚/眼との接触を避けます。
  9. 次の日は、スライドを含む水分を除去するために RT で 3 h 用シリカゲル デシケータ ボックスに転送します。

3. 蛍光イメージング プレートとスキャンへの暴露

  1. 放射線シールド イメージング プレート カセット上を向いてティッシュでセクションに配置します。放射性リガンドの結合の後の定量化, すべてのカセットに [3H] マイクロを含めます。セクションをランダムに配置し、同じカセットに直接の比較のためのセクションを公開します。
  2. 蓄積された信号をストレージから削除するために、バック グラウンド信号を除去するために使用の直前にプレートをイメージング トリチウム敏感な蛍光体を消去します。したがって、蛍光イメージング マシンにプレートを読み込み、可視光・赤外光の製造元の指示に従ってを公開します。
  3. 蛍光イメージング マシンからプレートを削除し、すぐにカセットの各セクションに配置します。カセットが完全に閉じていることを確認します。光からシールド RT で 3 日間の蛍光イメージング プレートにセクションを公開します。
  4. 光イメージング プレートからの信号を消去、ので慎重に暗闇の中でカセットを開きます。 すぐに蛍光イメージャの暗いボックスにイメージング プレートを転送や暗い部屋で蛍光イメージャを配置します。
    注: 解析後のデジタル画像を個々 の標本を識別するために露光中にスライドの空間的配置を記録しておきます。したがって、蛍光イメージング プレートは、デジタル画像のプレートの正しい方向を識別するために異なる角度でカット 1 つのコーナーを表示もできます。
  5. 最高解像度のデジタル画像を得ることが可能でプレートをスキャンします。

4. 省略可能: クレシル バイオレット染色組織切片

  1. 500 mL の脱イオン水 (dH2O) 酢酸クレシル バイオレットの 5 g を混合することによって 1% クレシル バイオレット溶液を準備 (約 2 h) を溶解するまで。新しい 500 mL ペットボトルに漏斗を使用してフィルター ペーパーを通してフィルターします。3.5 3.8 に pH を調整します。
  2. ヒューム フードの下でスライド染色の位置を設定します。トレイ (キシレン) を除いて白色ポリプロピレン トレイに以下のソリューションを準備します。
    a. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% エタノール
    + 100% エタノール
    e. 100% dH2O
    f. 1% クレシル バイオレット
    g. 0.07% 酢酸 (dH2O の 250 mL に酢酸の 175 μ L を追加)。
    h. 100% キシレン耐溶剤性緑色のトレイ
    i. 100% キシレン耐溶剤性緑色のトレイ
  3. ヒューム フードにスライドを転送し、スライド ラックに配置します。
  4. 100% エタノール (トレイ a ~ d) dH2O 中のエタノールの増加の傾斜シリーズを通して脂質 1 分のスライドを浸すことによって溶解します。
  5. DH2O エタノール (トレイの a ~ d トレイ e が続く逆の順序) の濃度を 1 分間スライドを浸すことによって降順で標本を水分補給します。
  6. クレシル バイオレット溶液中 10 分間で標本を浸します。
  7. DH2O に 1 分浸漬による 4-8 米洗う優しく上下スライド スライドを持ち上げることによって 0.07% 酢酸で標本をすすいでください。
  8. 30 のスライドの浸漬による試料を脱水エタノール (トレイ a ~ d) の濃度を昇順で s。
  9. キシレン 100% エタノールをクエンチする (トレイ h と私) の 2 つのトレイを標本を転送します。
  10. DH2O エタノール (トレイの a ~ d トレイ e が続く逆の順序) の濃度を 1 分間スライドを浸すことによって降順で標本を水分補給します。
  11. 生理食塩水からピンセットでスライドを削除します。有機溶剤のスライドあたりのメディアのマウントを数滴、供試体を保護するために上に 24 × 60 mm coverslip を追加します。優しく、coverslip の上に押すことによって標本と coverslip の間の空気の泡を削除します。
    注: は、乾燥を防ぐために実装時キシレンで残りのスライドを保持します。
  12. ドライ スライドは、室温の発煙のフードの一夜します。
  13. 顕微鏡と 1.25 × 対物標本の画像を取得します。

5 デジタル画像のデンシトメトリーの分析

  1. 各校正画像解析ソフトウェアの [3H] ミクロ スケールから標準的な相対密度 (棒) を測定します。
    1. メニュー項目の領域決定から地域を作成するためのツールを使用して [3H] マイクロ スケールの各ポイントのための同じサイズの領域を選択します。メニュー アイテムのラベルの下の番号をクリック、各選択範囲に番号を割り当てます。
    2. クリックして標準の校正の各ポイントの OD 値をエクスポートファイル |Export | 2D リージョン レポート。ロッド値をスプレッドシートに転送し、選択した領域のサイズによって正規化します。さらに薄層クロマトグラフィー分析の標準曲線を取得する線形回帰を実行します。
      注: 選択した領域は一致するロッド値およびサンプルを識別するためにラベル付けされていることを確認します。
  2. 独自の地域を選択してイメージング ソフトウェアを使用して autoradiograms の定量化を行うの利益 (率 ROI)地域作成ツールを使用して各セクションとその ODs を測定します。コピーして手動で調整し各ゲノムスキャニングの脳の解剖学のマイナーな変化の関心の領域のテンプレートを作成してすべてのセクションで同じ領域を選択します。脳アトラス18と autoradiograms の比較による ROI の解剖学を識別します。複数の治療法を比較すると、盲目し、Roi の偏った選択を避けるためにランダム化された分析を実行します。
  3. ロッド値と選択した領域のサイズをクリックしてスプレッドシートにエクスポートファイル |Export | 2D リージョン レポート。
  4. その地域で特定の面積あたりの密度を得るための選択した投資収益率の測定棒を分割します。
  5. プレートの背景の棒を測定し、対応するロッド値と領域のサイズをスプレッドシートにエクスポートします。それぞれの投資収益率のすべてのロッドの値から平均バック グラウンド信号を減算します。
  6. 平均技術的複製、すなわちセクションの棒は、同じ動物からのティッシュを使用してレプリケートします。
  7. 標準曲線を使用して棒をリガンド結合、すなわち単位に変換します。、nCi/mg 組織同等物 (TE)。
    注: 標準材料組織をシミュレートすることで生成されるため長期テが使用されます。
  8. リガンド (式 1) の特定の活動に応じて nCi/mg の nmol/mg TE への変換によってバインディングを表現します。
    Equation(1)
  9. 特定のバインディング値を取得するには、非特異的合計バインディングからバインディングを減算します。
  10. 平均 (ステップ 5.6 で得られた) それぞれの動物の技術的な平均を使用して、すべての生物の複製のバインドをレプリケートします。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

記述のプロトコルを使用して、高親和性 GHB 結合部位の解剖学的分布は放射性標識された GHB アナログ [3H] 可視化したマウスの脳は、コロナ、矢状面、水平方向のセクション (図 3 にカットされた HOCPCA).バインドの高レベルは、海馬と皮質で観察された、線条体下部のバインドとバインドがありませんが小脳で検出された高親和性 GHB サイト9,10、前回の報告式のパターンに対応します。 11,12。別の断面平面を使用して、下図のように、解剖学的構造を視覚化が可能し、クレシル バイオレット染色による解剖学的整合性をサポート可能性があります。GHB の高親和性結合部位、組織 (図 3) のそれに続く染色と特に小脳などの低放射性リガンド結合領域を確認しています。コロナ セクション最も頻繁に文献9,10であります。彼らは、一つの脳から得られる多量のセクションの定量的な目的のための実用的。矢状面と水平方向のセクションには、このように偉大な概要を提供する 1 つのセクション内にある齧歯動物の脳の大半を通じてバインドを可視化する利点があります。図 4は、高親和性の GHB 結合部位が哺乳類の脳の進化的保存を示しています。[3H]HOCPCA 結合部位に検出されたマウス、ラットにもブタの脳組織総脳解剖学種の間の比較を有効にするように。通常、進化的保存と地域分布研究新規ターゲットこの場合は興味の蛋白質の特性に大きく役立つ可能性があります、したがってその生理機能19についての指示を与える可能性があります。

高親和性 GHB の結合部位は、GHB イメージングに関する基礎的、異なる親和性結合部位が匹敵する特定活動 (図 5) を表示するとプローブしました。[3H]HOCPCA 以前の 74 Kdを持っていることが示された市販の放射性リガンド [3H] 優れている nM 697 の Kdと NCS 382 nM、両方は pH 6.0 定量的オートラジオグラフィー9に決定します。したがって、[3H] HOCPCA は優れた信号対雑音比につながる多くの感受性に恵まれています。[3H] NCS 382、高い放射性リガンドの低感度のため濃度をバインディングの同じようなレベルを得るために使用する必要があります (図 5の y 軸を比較)。[3H] と比較されたとき GHB、さらに高い放射性リガンド濃度 (30 nM) 匹敵するバインドのレベルを達成するために必要な。これは主に有意に低い親和性 (K私4.5 μ m) このリガンド20のため。ただし、放射性リガンド濃度が高いほどはまたその結果低い信号対雑音比と非特異的結合9,10のレベルを増加します。この一連の実験は、高品質の画像を生成するための高親和性リガンドを持つことの重要性を強調します。

飽和曲線による薬理学的パラメーターの測定は標準的なトリチウム高感度蛍光イメージングを使用して本質的に困難な高親和性 GHB サイトは領域を脳 (60 pmol/mg17) で非常に高いレベルに表される、ので過飽和画像のリスクのための板。したがって、Kd値 [3H] HOCPCA、[3H] 相同変位曲線、そして Kd (図 6)9の計算に最初決定 K私の値に基づいて得られた NCS 382。ほとんどイメージングに関する基礎的の代替は同位体希釈乳剤の結合の試金で日常的に行われるようにを使うことでしょう。さらに、K のd値は異なる pH 値で決定されています。明らかに、高親和性の GHB のサイトは最も効率的に pH 6.0 (図 6Aおよび図 6) でラベル付け、pH 7.4 に条件を大幅にアッセイを変更するのでリガンド親和性に影響を与えます。[3H] の Kdしたがって、pH 7.4 で HOCPCA 約 30 回 pH 6.0 の数値より高いです。[3H] を使用するときの注意点をなる非特異的結合の高度の結果さらに pH の増加 NCS 382 ph 7.4 (図 6 e) 特定のバインドの少量だけを取得できます。これは実際には生理学的 pH9、再びとして可能な限り高い親和性を持つリガンドを持っていることの力を示すこの放射性リガンドを用いた薬理学的パラメーターの決定を妨げています。

Figure 1
図 1: 高親和性 GHB 結合部位をターゲットとイメージングに関する基礎的構造。[3H] 3-hydroxycyclopent-1-エン カルボン酸 ([3H] HOCPCA)14、[3H] (E、RS) - 6,7,8,9 - テトラヒドロ-5-ヒドロキシ-5H- benzocyclohept-6-イリデン酢酸 (NCS-382) ([3H] NCS 382)15、[3H] γ-ヒドロキシ酪酸 ([3H] GHB) [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([と同様に匹敵する特定のアクティビティ (20-40 Ci/モル)、トリチウム イメージングに関する基礎的として16125私] BnOPh GHB)13 2000年の推定モル活動 Ci/モル21。GHB の構造要素は、赤色でハイライトされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:体外放射線写真法のプロトコルの概要。(1) 動物を安楽死させ、組織が切り裂かれたとドライアイスでスナップ凍結します。組織の顕微鏡スライド マウント雪解け、クライオスタットの断面、および (2) セクションは平衡バインディングまで放射性リガンドと孵化させます。非特異的結合の決定、関連ですが同一ではない化学構造のラベルのないディスプレーサとソリューションを補完しています。(3) その後、非連結のリガンドはアッセイバッファーで洗濯によって削除され、塩が蒸留 H2o. と洗浄によって除去セクションは、乾燥、パラホルムアルデヒド (PFA) の固定が完全にリガンド-蛋白質相互作用を確立する実行されます。セクションは、蛍光イメージング プレートに公開されます。(4) 十分な露光時間後プレートをスキャンして、デジタル autoradiograms を取得します。(5) 最終的に、興味 (ROIs) の領域の定義を使用して画像解析を実行し、バインドを定量化します。示されている例では光学密度 (ODs) は (左) マウス皮質および海馬 (中央) のセクションに示します。数量は、[3H] マイクロ スケール (右) と共にセクションを公開することによって行われます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: マウスに 1 nM [3H] HOCPCA バインディングの代表的な autoradiograms の脳のセクション。(A) 放射性リガンド解剖学的構造の表示を矢状面と水平切片は、断面の重要性を説明するために平面をコロナにバインドする。解剖学的領域、特に地域低/リガンド結合欠席を確認する (B) クレシル バイオレット染色組織切片を対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 別の種で 1 nM [3H] HOCPCA バインディングの代表的な autoradiograms。(A) ラット, マウスの (B) および (C) の比較総脳の解剖学と大脳皮質および海馬領域に結合部位の進化的保存を説明するために autoradiogramsの in vitroの豚。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: マウス皮質と海馬から脳内体外放射線写真法によって GHB イメージングに関する基礎的に異なる感度を持つ高親和性 GHB の結合部位に結合の定量化をスライスします。合計バインディングが fmol/mg 組織と等価 (TE) イメージングに関する基礎的 [3H] (A) として報告された HOCPCA (1 nM) と (B) [3H] NCS-382 (7 nM) および (C) [3H] GHB (30 nM) (同じような具体的な活動)。1 mM GHB または 1 mM (表示されていません) イメージングに関する基礎的のいずれかの HOCPCA の存在下で非特異的結合が検出されませんでした。データは、実行されるごとに 3 つの技術的な複製に 4 つの生物学的複製の ± SD を意味表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: オートラジオグラフィーによる Kdと B [3H] の相同の競争力のある変位による最大値の代表の結果 HOCPCA、[3H] pH 6.0 とするため pH 7.4 でマウス大脳皮質のセクションで NCS 382イメージングに関する基礎的親和性に及ぼす pH の影響を示してください。(Kdと Bmaxをリガンドとのライバルとして同じ化合物を使用して算出した、22K を初期値)。(A) Autoradiograms pH 6.0 の 1 nM [3H] HOCPCA バインディングに対して最適な信号対雑音比。(B) [3H] HOCPCA 濃度が高いバッファー pH を 7.4 に変更する必要があります (8 nM) バインドの重要なレベルに到達します。(C) 結果ログ濃度結合曲線;± SEM. 5 (D) を意味するのに対し低非特異的結合における ph 6.0 nM [3H] NCS 382 結合が結果 (E) 40 nM [3H] NCS 382 は pH 7.4 でバインディングを取得するための十分な。(F) 結果ログ濃度結合曲線;± 3-4 生物学的複製が実行されるごとに 3 - 5 のみ 2 生物学的複製技術的な複製、pH 7.4 でのみ [3H] NCS 382 実験を行ったから取得した SEM. データを意味します。両方イメージングに関する基礎的、GHB は非特異的結合の決定のために使用された 1 mM。Kdと B最大の計測と計算の詳細については、9を参照してください。この図は、適応し、前文書9からエルゼビアから許可を得て転載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

オートラジオグラフィーによるアッセイの品質よく、リガンドの感度によって決定されます。主要な貢献の要因は適切な特定活動 (すなわち放射能の量を持つ配位子を生成する知られている配位子の可用性または特定のラベリング技術の可能性に与えられる選択したラジオ アイソトープ放射性リガンドの単位モル) あたり23と化学的な劣化の限られた量。イメージングに関する基礎的知られている配位子の数が多いは、トリチウム9,10,24,25,26, いくつかの利点を推論するとラベル付けされます。まず、トリチウム (3H) は、長い半減期 (12.43 年) 各バッチの長期保管を促進が特徴です。第二に、 3H 配位子がその親化合物生物学的区別リガンド ターゲット相互作用は放射性核種によって歪められていません。トリチウム放出低エネルギー β--粒子、高空間分解能で、その結果組織にだけ短い距離を移動して、その後、大きい区別の解剖学的構造の4。それにもかかわらず、トリチウム ラベルのみ生成できます適度に高い特定の活動を行う。これは、利用可能な3H ソースが非放射性の水素で汚染されたためにです。通常より高いの特定のアクティビティは、以下のリガンドは、高感度検出23に屈する必要です。さらに、それは、 3が考慮されるべき H 配位子3H ラベルの安定性によって水と水素交換を受ける可能性があります。低式または低すぎるの特定の活動を補うためにヨウ素 125 は放射性核種13として使用できます。ヨウ素 125 の最大の特定のアクティビティはトリチウムのそれよりも高い約 100 です。ただし、いくつか追加の考慮事項は、ヨウ素 125 を操作するときに行われなければなりません。例えば、ヨウ素 125 の追加は通常配位子ターゲット相互作用に影響を与える分子の構造変化を誘導します。ヨウ素 125 は、60 日間の半減期は、毎日減衰の補正は特定の活動及び配位子ターゲット相互作用23定量化の見なす必要があります。125リガンドは γ 光子を生成し、多くの感受性にもかかわらず低解像度画像を生成します。これは解像度と同位体 (後述) としての最大のエネルギーの逆の関係です。最後に、トリチウムと比較して、増加する放射性核種の高エネルギーによりヨウ素 125 を処理するとき。

組織切片厚は、核種によって解決に影響可能性があります。低エネルギー β--トリチウムの放射線は約 5 μ m の自己吸収のためにその組織の範囲を制限します。結果として、切片厚が 5 μ m27,28を超えたら、その定量化は組織厚によっては影響されません。それとは対照的に、高エネルギーの同位体の放射性崩壊は検出媒体に大きい距離と配位子はまたイメージの形成に寄与するため、イメージの解像度に終って大きい組織浸透です。その結果、薄いセクションは高エネルギーの放射性核種1のより高い解像度を促進します。

オートラジオグラフィーによるプロトコルの確立には、最適な結合条件 (例えばバッファー、pH、温度) の知識と親和性と速度の面で放射性リガンドの薬理学的パラメーターが必要です。場合は前に、探索的研究が必要な29リガンドを特徴づけられているないです。導かれる最適なリガンド濃度を選択するリガンドの親和性と結合部位の豊かさの両方。通常、5-6 回 Kdを反映して濃度は、すべての結合部位が飽和30であることを確認する使用されます。別のアプローチは、合計から非-特有 Kd31以下放射性リガンド濃度を選択して同時に放射性リガンド ソリューションを保存バインドの最も高い歩留まりを目指しています。このアプローチは、高放射性リガンド濃度だろう [3H] のケース HOCPCA と高親和性 GHB として autoradiograms を飽和のチャンスを高めるので結合部位は検査された組織に極めて富んで特に便利サイト9をバインドします。さらに、標的蛋白質の全体の人口を効率的にラベルするためにリガンド理想的にすべての可能なターゲット構造にバインドする必要があります。特に受容体オートラジオグラフィ アゴニストの使用可能性がありますのみ明らかに総受容器の部分数いくつかは低親和性アゴニストの状態で存在する可能性がありますので。対照的に、中立的な拮抗薬は最もよく全受容体状態26,29の親和性を表示します。

また、バインディング実験は平衡結合条件の下で一般に実施されます。(固定リガンド濃度、バッファーおよび温度) 目的の実験条件下での平衡結合に到達するために必要な時間が連想実験にしたがって、確定すべきかの範囲内での平衡結合を確保するため、4,23,30を試してみてください。バインドされていない放射性リガンドをアッセイバッファーでいくつか孵化によって洗浄され、通常蒸留 H2o. の信号対雑音の比は温度と時間によって調整することによって最適化することで洗浄が続いて放射性リガンドのインキュベーション後、放射性リガンド26,30,31の解離率。

イメージングに関する基礎的非生物材料、すなわちへのバインドが表示非固有のバインド。標的以外の細胞成分にリガンド結合は、不明確な結合として定義されます。リガンド結合の総量に不明確な結合の寄与は、リガンドとして同じ結合部位を対象とする競合するラベルのない配位子の存在下で評価されます。10,000 倍過剰に非放射性化合物 (移送) を指定すると、結合部位を占めて、リガンドはオフのターゲット サイト26,31,32にのみバインドできます。重大に、これは両方の非特異的と同様、特定のバインディングの23を変位のリスクを低下させるので、ラベルのない化合物はリガンドとは異なる化学構造のする必要があります。膜に結合から生じる非特異的結合はかなり脂溶性イメージングに関する基礎的の場合は特に大きな問題をすることができます。いくつかのケースで広範な手洗い方法可能性があります非受容体結合リガンドを削除し、したがって特定のバインド比29を改善します。

アッセイ バッファーを選択すると、それはリガンド ターゲット相互作用に及ぼすイオン強度や pH を考慮する重要です。特に静電相互作用極の配位子との結合部位の親水性の成分はバッファーのイオン強度の影響を受けます。したがって、一価または二価のイオンの補充は、効果的な親和定数23,33に影響があります。勉強リガンド ターゲット相互作用の最適なバッファー組成が既知の場合、異なる共通バッファーはパイロット実験で検討されるべき。バッファーは、アスコルビン酸や酵素29,34を分解の阻害剤など抗酸化物質を補うことができます。また、バインディング サイト内またはリガンド自体に特定のグループのイオン化は pH による影響は、平衡結合定数、速度論的速度定数および非固有のバインド23,33に重要な影響を及ぼします。たとえば、高親和性 GHB をプローブ結合と異なる GHB イメージングに関する基礎的サイト素敵な pH がこのバインディング ターゲット (図 6) の重要性を示しています。Ligand 受容器の相互作用のための最適な pH の特性もその生物学的妥当性に関連してターゲットの重要性についての手がかりを与える可能性があります。

デジタル放射線写真法のもう一つの重要な要因は、曝露時間、すなわち、蛍光イメージング プレートに放射性標識されたティッシュ セクションを公開することによって定量化可能な autoradiograms を達成するために必要な時間です。見積もりはサンプル、エネルギーと希望信号対雑音比と同様、同位元素の半減期の放射能の量に基づいています。特に、露出時間の結果の飽和画像、高いバック グラウンド信号を延長しました。高いバック グラウンド信号は、宇宙放射線1,4を避けるために鉛シールド環境内でカセットを保存することにより削減できます。それにもかかわらず、最適な autoradiograms が実現された場合、標本公開できます複数回ターゲット リガンド複合体は固定で、放射性核種の半減期で許可されます。

蛍光イメージング プレートは再利用できるし、長い寿命を持って、正しく処理、すなわち、曲げは避ける必要があります、板は乾燥した環境で保存する必要があります。蛍光イメージング プレートの取扱いは、光と宇宙放射線の感度によって導かれます。したがって、バック グラウンド信号を最小限にするためにすべての使用する前にプレートを消去することが重要です。イメージング プレートに放射性標識されたティッシュ セクションの露出は、光を完全に欠いている放射線シールド カセットで行われます。スキャナーにプレートを転送する、露出時間の終わりに、すると、白色光とも短い接触が蓄積された信号を減らすのと同様、周囲の任意の光も避けなければなりません。さらに、信号の衰退を避けるため試験片を除去した後すぐにプレートをスキャンする必要があります。蛍光イメージング プレートを使用しての欠点は、板1の繰り返し使用後の工芸品と残留 'ゴースト' の潜在的な外観です。

イメージング プレート蛍光体結晶に到達する低エネルギー放射線を許可する保護コーティングなしトリチウムの操作が必要です。トリチウム高感度蛍光イメージング プレート、したがって汚染や誤った取り扱いによる損傷に敏感。汚染、トリチウムに敏感な板クリーニングできないし、置き換える必要があります。PFA 蒸気と配位子ターゲット複合体の固定は、その寿命を延長板の潜在的な汚染を低減します。また、固定後の組織の脱水はトリチウム敏感な板が湿気に敏感なので重要なステップであります。その繊細な性質上、トリチウムに敏感なプレートを他の同位体1,4の使用しないでください。対照的に、ヨウ素 125 など高エネルギーの同位体のプレートは堅牢、70% エタノールで拭くことによって彼らの表面を洗浄もことができます。

従来、放射線感受性フィルムは放射性崩壊の空間録音のために使用されています。高解像度の画像が得られ、フィルム オートラジオグラフィーはいくつかの制限を持っています。ほかに有害化学物質や暗室の開発の必要性、ダイナミック レンジの狭い x 線フィルムが特徴です。したがって、定量化可能な非飽和画像35を達成するために異なる露光時間で繰り返し放射性セクションを公開する必要があります。また、x 線フィルムは限られた感受性結果的に付けられて低エネルギー同位体、すなわち供試体の持続的な露出時間を表わします。トリチウムの崩壊は露出の数ヶ月を必要があります。小さい線形範囲と組み合わせて低感度は最適な測定条件が決められた最初1,35でなければならないと非常に時間がかかり、技術をなります。

イメージング プレート蛍光体の開発、これらの制限のいくつかは対処35,36,37をされています。イメージング プレートは、放射性崩壊、組織標本の放射性リガンドの空間的配置を表す画像を一時的に保存するのに役立ちます。輝尽 BaFBr:Eu2+蛍光体結晶を Eu2の励起高エネルギー放射 (例えば、 x 線、ガンマ線やベータ粒子) 結果として、サンプルによって放出された放射性のエネルギーをキャプチャする使用 +4,37を格子3+と蛍光体でリリースされた電子の結果としてトラップが Eu へ。反応を反転表示または赤外光イメージング プレートを公開すること、すなわち、閉じ込められた電子が解放され、発光の放出 Eu3+ Eu2+の変形の間に。放射光は、放射能の量に比例し、光電子増倍管での検出により、デジタル ゲノムスキャニング37の作成。このシステムは、日3月から露出時間のマーク付きの減少を伴う感度の増加を提供します。その上で、線形ダイナミック レンジが大幅に増加、過飽和画像の可能性を軽減します。直線性が 4 ~ 5 桁内で与えられ、繰り返し検証されている3,35,36,37,38。オートラジオグラフィー フィルムはまだ優れた空間分解能を提供するスキャン技術で努力した結果が 300 から 25 μ m (ピクセル サイズ) に解像度の詳細な解剖学的領域3区別をできるように改善。全体的に、蛍光イメージング プレートは両方増加する線形範囲と感度のためのデジタル autoradiograms の習得を促進します。縮小露光時間と簡略化された開発手法は大幅の高スループット データ分析時間の削減に します。

放射線写真法と比較して、親和性や密度など有用な薬理学的パラメーターもよく結合アッセイ組織ホモジネートのイメージングに関する基礎的アプリケーションによって特徴付けられます。この方法には、効率的な方法2で液体シンチレーション検出器を用いた β 放出放射性崩壊を測定することによって結果を生成の利点があります。例えば、 96 ウェル マイクロ プレートのウェル アプローチで行われているこのような試金が化合物ライブラリのスクリーニングおよび濃度依存関係の数が多く便利です。その上で、この設定で彩度を分析は多くの場合実現可能なに比べて放射線リスク高いリガンド濃度と過飽和の画像が表示されます。ただし、Kdと B の最大を得るために非放射性リガンドの固定低放射性リガンド濃度の相同の変位を実行する過飽和画像 (図 6)22の問題を回避できます。ホモジネート バインディングおよびオートラジオグラフィーによる興味の蛋白質の組織密度ホモジネート バインディングでは過小評価に対し配位子親和定数の同様の見積もりを生成します。したがって、組織の均質化併用セル膜の中断が受容体が失われる可能性がありますまたは条件3,33をバインドを変更が提案されています。また、組織郭清のエラー ホモジネート隣接する脳部位からの組織と汚染が生じる。比較では、小さな核にも複雑なバインドのパターン、可視化、放射線写真法3,33空間の解剖学的分解能による微分可能。

免疫組織化学は、また解剖学的興味の蛋白質の分布を可視化します。メソッドは、離散組織を細胞レベルおよび電子顕微鏡を使用しても細胞レベルで識別できる、解剖学的な高解像度の画像を作り出すことができます。表現のレベルは、染色の強度に基づいて評価されます。それにもかかわらず、表現のレベルの絶対定量は適切な参照基準39の不足のため困難であります。さらに、免疫組織化学は受容体研究の問題は、しばしば選択的なよく検証された抗体の可用性に依存しています。

体外放射線写真法を実行する前に、いくつかの考慮事項が行われる必要があります。まず、凍結、融解を繰り返すだけでなく、断面を含む事後のティッシュの準備にサイト2をバインディングの保全に影響を与えます。さらに、メソッドは、質問2で親和性が高く、ターゲットの選択を表示する適切な放射性リガンドの可用性に依存します。リガンドがオフのターゲット サイトへの重要なバインドを表示しない、それはまた有利な速度プロファイルを示す必要があります。これは、リガンド ターゲット複雑なする必要があります実験のスコープの中にそのまま滞在するために必要です。また、適切な非放射性化合物が存在する場合は、放射性核種の導入は重要な要因になります。したがって、興味の分子を搭載するべき効率的な radiolabelling のための適切な機能グループ特定の活動が十分に高いと化学的安定性40イメージングに関する基礎的生産を可能にします。体外放射線写真法の別の欠点は、メソッドだけを使用できます動物一度.詳細は、エレガントな生体内でイメージ投射同じ動物および占有と動的バインディング特性の定量の繰り返しスキャンを可能にする位置放射断層撮影 (PET) などの方法に拡張です。ペットはより高い哺乳類41の研究と前臨床研究42,43,44線量最適化のために、特に貴重なものです。

オートラジオグラフィー技術のいくつかの変更は、両方の健康と病気の状態だけでなく、創薬と開発における薬理学的ターゲットの特性面での応用を拡張します。まず、イメージング技術の最近の進歩は、リアルタイム放射線写真法の開発につながっています。Α/β-粒子のガス検知器により高速デジタル autoradiograms45の生産の崩壊の直接測定によるイメージング プレートまたはフィルムの必要性を未然に防ぐ。

また、体外放射線写真法の G タンパク質共役受容体 (Gpcr) 事後組織で、解剖学的分布の情報の上に機能の研究が可能。 にします。メソッドのこの亜種は、グアノシン三リン酸 (GTP)、すなわち、 [35S] グアノシン 5'-γ-thiotriphosphate の放射能標識アナログ組織切片の培養 ([35S] GTPγS) と一緒に、GPCR の非放射性のアゴニスト。アゴニストが結合し、GPCR、[35S] 定款の応答を誘発する GTPγS がローカライズできのみ活性化受容体人口2,46,47 を反映する放射線写真法による定量化.

前のヴィヴォ放射線写真法は、生きている実験動物への投与後、放射性リガンドの地域の結合を評価する手法の別バージョンを表します。次の動物の犠牲、問題の組織と autoradiograms のオートラジオグラフィーによる露出結果のセクショニング体内の2を結合するリガンドを反映します。薬の発見と開発プログラム内で、吸収、分布、代謝、排泄 (ADME)、鉛化合物、すなわちの薬物動態学的プロファイルに関する情報を得るために前のヴィヴォオートラジオグラフィーを一般的採用します。.特に全身オートラジオグラフィーは、すべての臓器や組織への薬剤配布についての洞察を提供します。しかし、非固有のバインドと定量化の決定は難しく可能な代謝とリガンドの劣化による体外放射線写真法と比較して、洗い流すための手段は、配位子48をバインドされていません。

放射線写真法も、予備試験と PET リガンドの4の評価に使用されます。高エネルギーの放射性核種炭素 11、フッ素 18 は PET リガンドでよく使用されます。生きている動物の結合リガンドの定量化が可能な 3 D 画像は11,40,49を得ることができるので、ペットは著名な非侵襲的イメージングに関する基礎的申請です。

体外放射線蛍光イメージング プレートを用いたリガンド ターゲット相互作用の薬理学的評価のための貴重な測定法を表します。メソッドは、最適な測定条件を確立されて比較的高速かつ単純なプロトコルの雇用によって再現性のある結果を生成します。興味の蛋白質の解剖学的分布は実験動物の健康と病気の死後体内の生理学的、薬理学的および病理学的役割の研究を可能にするそのネイティブの微小環境の内で決定と同様人間2,47。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgments

仕事は、ルンドベック財団 (グラント R133 A12270) とノボ ノルディスク財団 (グラント NNF0C0028664) によって支持されました。著者は、[3H] 放射性リガンドの供給のための博士 Aleš マレクをありがとうございます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

神経科学、問題 145、リガンド、放射能、放射線写真法、親和性、表現、蛍光イメージング、HOCPCA、γ-ヒドロキシ酪酸、GHB、NCS-382 定量薬理学
シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter