Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Autoradiography som en enkel og kraftig metode for visualisering og karakterisering av farmakologiske mål

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

Metoden autoradiography brukes rutinemessig å studere binding av radioligands til vev deler for fastsettelse av kvalitative og kvantitative farmakologi.

Abstract

In vitro autoradiography mål å visualisere anatomiske fordelingen av et protein av interesse i vev fra forsøksdyr som mennesker. Metoden er basert på bestemte binding av en radioligand til biologiske målet. Derfor frossent deler er ruges med radioligand løsning, og bindingen til målet er senere lokalisert ved påvisning av radioaktivitet, for eksempel ved hjelp av fotosensitive film eller fosfor imaging plater. Resulterende digitale autoradiograms vise bemerkelsesverdig romlig oppløsning, som muliggjør kvantifisering og lokalisering av radioligand binding i forskjellige anatomiske strukturer. Videre tillater kvantifisering farmakologiske karakterisering av ligand affinitet med dissosiasjon konstanter (Kd), hemming konstanter (Kjeg) samt tettheten av bindende områder (BMaks) i valgte vev. Dermed gir metoden informasjon om både målet lokalisering og ligand selektivitet. Her, er teknikken eksemplifisert med autoradiographic karakteristikk av høy affinitet γ-hydroxybutyric syre (GHB) bindende områder i pattedyr hjernevev, med spesiell vekt på metodiske hensyn bindende analysen parametere, radioligand og oppdagelsen metoden.

Introduction

Autoradiography er en metode som gir bilder av radioaktivitet. Teknikken brukes rutinemessig å studere vev distribusjon av et protein av interesse i vitro basert på en bestemt farmakologiske interaksjon mellom en radiolabelled sammensatte og målet. Dette gir direkte kunnskap om selektivitet av ligand for målet. In vitro autoradiography kan også brukes for kvantitative fastsettelse av farmakologiske bindingsparameterne av radioligands, som dissosiasjon konstant (Kd) og tetthet av bindende områder (BMaks), samt for å bestemme hemming-konstant (Kjeg) av konkurrerende ligander1,2. Sammenlignet med tradisjonelle homogenate radioligand binding, har autoradiography fordelen av å kunne visualisere romlige anatomi og gi konsis detaljer om regionale uttrykk mønstre3. Metoden autoradiography er derfor et aktuelt alternativ til immunocytochemistry, spesielt i fravær av et valideres antistoff. Autoradiography er lett implementert i et standard radioisotop laboratorium gitt tilgjengeligheten av en egnet radioligand med nødvendige farmakologiske spesifisitet, tilgang til en mikrotomen kryostaten forbereder vev inndelinger og en passende bildebehandling enhet som kan analysere fordelingen av radioaktivitet i delene respektive vev. En viktig utvalgskriterium i radioligand er spesielt begrenset binding til ikke-målområder. Dette kan være andre proteiner, membraner eller materialer som plast eller filtre og er kollektivt referert til som uspesifisert bindende. Vanligvis uspesifisert binding er ikke-saturable men kan være saturable hvis det innebærer et bestemt off-målet protein. Den beste måten å validere ekte bestemt bindingen er å sammenligne vev mangler målet, f.eksgenetisk konstruert (knock-out) vev4.

Her er metodikken illustrert med autoradiographic karakterisering av høy affinitet binding området for γ-hydroxybutyric syre (GHB) i pattedyr hjernen. Forstå farmakologiske samspillet mellom GHB og sin binding området er relevant GHB er både et klinisk nyttig stoff i behandlingen av Narkolepsi og alkoholisme5, men også en naturlig bestanddel av pattedyr hjernen og en rekreasjon narkotika6. Høy affinitet GHB bindende områder ble først beskrevet ved hjelp av [3H] GHB binding til rotte hjernen homogenate7. Gjennom årene, videre autoradiography studier med [3H] GHB og analog [3H] sokkel-382 har vist en høy tetthet av bindende områder i forebrain regioner av rotte8,9,10, musen9 , gris11og monkey/menneskelige hjerne12. Imidlertid har molekylær identitet og nøyaktig funksjonelle relevansen av disse bindende områder vært unnvikende.

Med hensikten å ytterligere karakterisere bindende områder, og å lette studier fysiologiske rollen GHB, flere radioligands omfatter forskjellige isotoper utstyrt med forskjellige interesseområder er utviklet ([3H] GHB, [3 H] sokkel-382 [3H] HOCPCA og [125jeg] BnOPh-GHB)13,14,15,16(omtalt i17) (figur 1). Kombinasjonen av selektiv høy affinitet radioligands og en meget høy vevs tetthet at bindingen nettsteder har tillatt for produksjon av høy kvalitet bilder ved hjelp av fosfor tenkelig teknikk9,11. Sammen med en disposisjon av de praktiske punktene i å sette opp et autoradiographic eksperiment og en illustrasjon formidle detaljer vil under diskusjon understreke i) valg av radionuklidenes, ii) valg av analysen og iii) bruk av fosfor bildebehandling plater versus X-ray film. Det overordnede målet med denne utredningen er å gi teknisk og vitenskapelig og metodologiske detaljer på autoradiography teknikken for å informere om vev distribusjon og farmakologiske analyse av protein mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr behandling ble utført i samsvar med retningslinjer fra den danske dyr eksperimentering Inspectorate.

Merk: Protokollen beskrevet her dekker vev forberedelse (dvs.mus hjernevev), i vitro autoradiographic analysen i tilstrekkelig detalj for å konfigurere metoden i en ny lab, eksponering fosfor imaging plater samt etterfølgende densitometric analyse av autoradiograms (figur 2) med sikte på å lokalisere og kvantifisere radioligand binding i forskjellige anatomiske strukturer. For histologiske sammenligning er en protokoll for cresyl violet flekker inkludert. Videre er fastsettelse av ikke-spesifikk binding med en konkurrerende ligand inkludert i protokollen. En detaljert beskrivelse om hvordan Kd, BMaks eller Kjeg, kan du se forrige publikasjonen4.

1. vev forberedelse av og kryosnitt

  1. Euthanize musen av cervical forvridning og umiddelbart dissekere ut hjernen ved hjelp av saks og tang. Direkte videre til neste trinn å unngå skade på vev.
  2. Snapin-fryse vev ved neddykking i pulverisert tørris, gass CO2 eller isopentane. Direkte overføre til frossent til en kryostaten med temperaturen satt til 20 ° C. Eventuelt lagre vev ved-80 ° C før behandling.
    Merk: Unngå gjentatte tining/fryser for å redusere skade på vev.
  3. La vevet acclimate til 20 ° C i kryostaten for 20 min før videre behandling for å unngå vev knuste.
  4. Dekke vev holderen med innstøpingsmiddel utenfor kryostaten og raskt plassere frossent prøven i ønsket retning mens innebygging mediet er fortsatt flytende. For eksempel Plasser musen hjernen vertikalt på lillehjernen for å oppnå rostral framskaffet. Overføre vev holderen tilbake til kryostaten og utsette innebygging mellomlang til temperaturer under-10 ° C i herding.
    Merk: Skjøre vev prøven bør være belagt i embedding medium i vev formene før montering.
  5. Plasser vev holderen i mikrotomen av kryostaten. Juster retningen av vev å unngå skrånet deler.
  6. Kutte vevet med veiledning av en stereotaxic atlas18 i deler av ønsket tykkelse (12 µm anbefales for [3H] merket ligander). Nøye rett og brette delen med pensel av liten størrelse hvis nødvendig og Tin-mount delen på en microscope skyve. Sekvensielt samle delene fra regionen av interesse for ønsket tekniske replikering (f.eks, 4 deler per lysbilde).
  7. At avsnittene på lysbildene for å air-dry 1t før videre behandling.
    Merk: Tillegg tørkemiddel materiale til lysbildet bokser minimerer fuktighet bygge opp på delene vev. Hente kan pauses her ved å lagre inndelinger langsiktig i lysbildet bokser på-80 ° C.

2. in vitro Autoradiography

FORSIKTIG: radioaktivitet. Innarbeide en sertifisert laboratorium i henhold til lokale forskrifter. Bruk klær. Kast i samsvar med radioaktivitet eller outsource til en sertifisert bedrift.

  1. Tine delene i minst 30 min ved romtemperatur (RT). Merk lysbildene med eksperimentelle forhold. Bruke en blyant fordi lysbildene skal bli badet i etanol under påfølgende fargingen.
  2. Plass lysbildene vannrett i plast skuffer.
    Merk: Posisjonering lysbilder på en opphøyet plattform i plast skuffer gjør deres håndtering.
  3. Pre incubate delene montert på lysbildene i analysebuffer justert mål i spørsmålet (for GHB-protokollen, 50 mM KHPO4 buffer pH 6.0 brukes) ved forsiktig å bruke en passende volumet på lysbildet (700 µL for 3-4 gnager framskaffet).
    Merk: Sørg for at hver seksjon er fullstendig dekket med væske.
    1. Dekke plast skuffen med lokk for å unngå fordampning og pre ruge relevante temperatur (for GHB protokollen pre incubate i 30 min på RT) under konstant mild (20 rpm) rister på en plate shaker.
    2. For bestemmelse av ikke-spesifikk bindende, supplement analysebuffer med relevante konsentrasjon av umerkede sammensatte (for GHB-protokollen, 1 mM GHB).
      Merk: Pre-inkubering kan ikke være nødvendig.
  4. Hell av pre-inkubering væske fra hvert lysbilde og overføre lysbildene tilbake til plast skuffen.
  5. For å unngå dehydration, umiddelbart ruge delene med relevante konsentrasjon av radioligand i analysebuffer under ønsket forhold (for GHB-protokollen, 1 nM [3H] HOCPCA 1t på RT) ved å dekke delene helt med radioligand løsning (700 µL for 3-4 gnager framskaffet).
    1. Inkuber under konstant mild (20 rpm) risting av plast skuffer med lukket lokk.
      Merk: Radioligand konsentrasjonen kan valideres ved å telle en aliquot i en flytende scintillation teller.
  6. Fjerne den inkubasjon løsningen ved å helle av væske og overføre lysbildene i et mikroskop objektglasstativet. Gå rett til det neste trinnet å unngå delen dehydrering.
  7. Vask lysbildene. For GHB-protokollen, vask med iskaldt analysebuffer to ganger i 20 s og deretter skyll to ganger av dipping objektglasstativet i magasinene fylt med iskald destillert vann for å fjerne salter. Plasser lysbildene loddrett i rack for luft-tørking minst 1t på RT eller tørr lysbilder for 5 min med en blåser satt til kald temperatur.
    Merk: Vask må optimaliseres, f.eksomfattende vask kan være nyttig for å redusere ikke-spesifikk bindende.
  8. Overføre lysbilder til en fixator som inneholder paraformaldehyde (PFA) pulver for overnatting fiksering med PFA damper på RT for å beskytte integriteten til ligand mål komplekset.
    FORSIKTIG: PFA er giftig. Positionthe fixator i fume hette og unngå hud/øyekontakt med PFA.
  9. Dagen overføre lysbilder til en desiccator som inneholder silica gel for 3t på RT å eliminere fuktighet.

3. eksponering for fosfor Imaging plater og skanning

  1. Plassere delene i en stråling skjermede tenkelig plate kassett med vevet grossist. For påfølgende kvantifisering av radioligand binding, Inkluder en [3H] Mikroskala i hver kassett. Ordne delene tilfeldig og utsette avsnittene for direkte sammenligning i samme kassetten.
  2. Slette tritium-sensitive fosfor tenkelig plate umiddelbart før bruk for å fjerne akkumulert signaler fra lagring og fjerne bakgrunnen signaler. Derfor laste inn platen i fosfor bildeenhet og føre til synlig/infrarødt lys i henhold til instruksjonene fra produsenten.
  3. Fjerne platen fra fosfor bildeenhet og plasser det straks på avsnittene i kassetten. Kontroller at kassetten er helt lukket. Utsett delene av fosfor tenkelig platen for 3 dager på RT skjermet fra lys.
  4. Fordi lyset sletter signalet fra tenkelig platen, nøye åpne kassetten i mørket og umiddelbart overføre tenkelig platen i mørke-boksen til en fosfor imager eller plassere fosfor imager i et mørkt rom.
    Merk: Pass på å notere romlige ordningen lysbildene under eksponering for å identifisere individuelle prøven på det digitale bildet etter analyse. Derfor vise fosfor tenkelig plater også et hjørne kutt i en tydelig vinkel for å identifisere riktig retning for plate på det digitale bildet.
  5. Skanne platen på den høyeste oppløsningen som er mulig å få et digitalt bilde.

4. tilleggsutstyr: Cresyl Violet farging av vev

  1. Forberede 1% cresyl violet løsning ved å blande 5 g av cresyl violet acetate på 500 mL deionisert vann (dH2O) til oppløst (ca 2 timer). Filtrere gjennom et filter papir med en trakt i en ny 500 mL flaske. Justere pH til 3,5-3.8.
  2. Plasser lysbildet flekker satt under avtrekksvifte. Forbered skuffer med følgende løsninger i hvite polypropylen skuffer (unntatt xylol):
    a. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% etanol
    d. 100% etanol
    e. 100% dH2O
    f. 1% cresyl fiolett
    g. 0,07% eddiksyre (Legg til 175 µL av eddiksyre til 250 mL av dH2O).
    h. 100% xylen i grønn væske-resistent skuffer
    i. 100% xylen i grønn væske-resistent skuffer
  3. Overføre lysbildene til avtrekksvifte og plassere dem i en objektglasstativet.
  4. Oppløse lipider gjennom økende gradert rekke etanol i dH2O til 100% etanol (skuff a-d) av dipping lysbilder for 1 min.
  5. Rehydrate prøver dH2O gjennom synkende konsentrasjoner av etanol (brett en d i omvendt rekkefølge, etterfulgt av skuffen e) av dipping lysbilder for 1 min.
  6. Fordype eksemplarer i cresyl violet løsning for 10 min.
  7. Skyll de i 0,07% eddiksyre ved å løfte lysbilder opp og ned forsiktig for 4-8 s. vask lysbildene av dipping i dH2O for 1 min.
  8. Mister de nedsenking av lysbilder for 30 s i stigende konsentrasjoner av etanol (skuff a-d).
  9. Overføre prøver gjennom to skuffer av 100% xylen brett h og jeg slukke etanol.
  10. Rehydrate prøver dH2O gjennom synkende konsentrasjoner av etanol (brett en d i omvendt rekkefølge, etterfulgt av skuffen e) av dipping lysbilder for 1 min.
  11. Fjern lysbildene fra saltvann med tang. Legg noen dråper organisk løsemiddel montering media per lysbilde og Legg en 24 x 60 mm dekkglassvæske på toppen for å beskytte prøvene. Fjerne luftbobler mellom prøven og dekkglassvæske ved forsiktig å trykke på dekkglassvæske.
    Merk: Holde de resterende lysbildene i xylen under montering å hindre tørking.
  12. Tørr lysbildene overnatting i avtrekksvifte på RT.
  13. Få et bilde av et mikroskop og 1,25 X mål.

5. densitometric analyse av Digital Image

  1. Måler relative optisk tettheter (stenger) på hver kalibrering standard [3H] Mikroskala med en analyseprogramvare.
    1. Velg et område like store for hvert punkt av [3H] Mikroskala bruke et verktøy for oppretting av regionen fra menyelementet regionen besluttsomhet. Knytte et nummer til hvert merkede område ved å klikke på tall under menypunktet etiketten.
    2. Eksportere OD verdier for hvert punkt av kalibrering standard ved filen | E ksporter | 2D regionen rapporten. Overføre ROD verdier til et regneark og normalisere av størrelsen på det merkede området. Utfør lineær regresjon for å få en standardkurven for videre densitometric analyse.
      Merk: Sørg for at de valgte områdene er merket for å identifisere tilsvarende ROD verdier og eksempler.
  2. Utføre kvantifisering av autoradiograms ved hjelp av proprietære tenkelig programvare ved å velge regionen rundt (ROI) bruker en Region etableringen verktøyet i hver seksjon og måle sin ODs. Velg samme region i hver seksjon ved å opprette en mal for området av interesse, som kopieres og manuelt justere mindre variasjoner i hjernen anatomi for hver autoradiogram. Identifisere anatomi av Avkastningen ved sammenligning av autoradiograms med en hjerne atlas18. Når flere behandlinger sammenlignes, utføre analyser blendet og randomiserte for å unngå ensidige valg av ROIs.
  3. Eksporterer ROD verdier og størrelser av utvalgte områder i et regneark ved å klikke filen | E ksporter | 2D regionen rapporten.
  4. Dele målt STANGEN av valgte Avkastningen av sitt område å få tetthet per bestemt område.
  5. Måle STANGEN bakgrunnsfargen på platen og eksportere tilsvarende ROD verdier og størrelsen i et regneark. Trekk gjennomsnittlig bakgrunn signalet fra hver stang verdien av hver avkastning.
  6. Gjennomsnittlig stenger tekniske gjentak, dvs, delen replikerer ved hjelp av vev fra samme dyret.
  7. Bruke standardkurven konvertere stenger i enheter av radioligand binding, dvs., nCi/mg vev ekvivalenter (TE).
    Merk: Begrepet TE brukes fordi standarder blir generert med materialer som simulerer vev.
  8. Uttrykke bindende ved konvertering av nCi/mg til nmol/mg TE i henhold til aktiviteten av radioligand (formel 1).
    Equation(1)
  9. For å oppnå bestemte bindende verdier, trekk uspesifisert binding fra total bindende.
  10. Gjennomsnittlig binding av hver biologiske replikere ved hjelp av gjennomsnittet av tekniske gjentak av hvert dyr (innhentet i trinn 5.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruker beskrevet protokollen, anatomisk fordelingen av høy affinitet GHB bindende områder var visualisert med radiolabelled GHB analog [3H] HOCPCA i musen hjernen, som ble skåret i koronale, sagittal og vannrette delene (Figur 3 ). Høye nivåer av binding ble observert i hippocampus og cortex, lavere i striatum og ingen binding ble oppdaget i lillehjernen tilsvarer tidligere rapporterte uttrykk mønstre av høy affinitet GHB nettsteder9,10, 11,12. Som vist her, anatomiske strukturer kan visualiseres ved hjelp av ulike snitting plan og anatomisk integritet kan støttes av cresyl violet flekker. For GHB høy affinitet bindende områder bekreftet spesielt områder med lav radioligand binding, som lillehjernen med påfølgende farging av vev (Figur 3). Framskaffet finnes oftest i litteratur9,10. De er praktiske for kvantitative formål som et høyere beløp av inndelinger kan fås fra én hjerne. Sagittal og vannrette har fordelen av visualisere bindende gjennom det meste av gnager hjernen i en inndeling gir god oversikt. Figur 4illustrerer evolusjonære bevaring av høy affinitet GHB bindende områder i pattedyr hjernen. [3H] HOCPCA bindende områder ble oppdaget i mus, rotte så vel som gris hjernevev slik at sammenligning av brutto hjernen anatomi mellom artene. Vanligvis evolusjonære bevaring og distribusjon studier kan hjelpe betydelig i karakterisering av et protein av interesse, i dette tilfellet en roman mål, og kan dermed gi indikasjoner om sine fysiologiske funksjon19.

Høy affinitet GHB bindende områder ble undersøkt med GHB radioligands, som viser forskjellige interesseområder for bindende, men sammenlignbare spesifikke aktiviteter (figur 5). [3H] HOCPCA ble tidligere vist å ha en Kd av 74 nM, som er overordnet det kommersielt tilgjengelige radioligand [3H] sokkel-382 med en Kd av 697 nM, både bestemmes ved pH 6.0 av kvantitative autoradiography9. Dermed [3H] HOCPCA er utstyrt med mye høyere følsomhet, fører til en utmerket signal-til-støy-forhold. På grunn av lavere følsomheten av [3H] sokkel-382, høyere radioligand konsentrasjoner må brukes for å få lignende nivåer av binding (sammenligne y-akser i figur 5). Sammenlignet med [3H] GHB, enda høyere radioligand konsentrasjoner (30 nM) er nødvendig for å oppnå sammenlignbare bindende. Dette skyldes hovedsakelig det betydelig lavere affinitet (Kjeg på 4,5 µM) til denne radioligand20. Imidlertid øker høyere radioligand konsentrasjon uspesifisert bindende9,10 med en derfor lavere signal-til-støy-forhold. Dette rekke eksperimenter fremhever viktigheten av å ha en høy affinitet radioligand for å produsere bilder av høy kvalitet.

Fordi høy affinitet GHB nettstedene uttrykkes til så høye nivåer i forebrain regioner (60 pmol/mg17), er bestemmelse av farmakologiske parametere av metning kurvene iboende vanskelig med standard tritium følsom fosfor imaging plater på grunn av risikoen på overmettede bilder. Derfor Kd verdier for [3H] HOCPCA og [3H] sokkel-382 har anskaffet av første bestemme Kjeg verdier av homologe forskyvning kurver og beregning av Kd (figur 6)9. For de fleste radioligands, ville et alternativ være å bruke isotop-fortynning som gjøres rutinemessig på homogenate binding analyser. Videre ha Kd verdier blitt bestemt på ulike pH-verdier. Tydeligvis, høy affinitet GHB nettsteder er mest effektivt merket ved pH 6.0 (figur 6A og figur 6D), siden Endre analysen forhold til pH 7.4 vesentlig innvirkning ligand affinitet. Dermed Kd for [3H] HOCPCA ved pH 7.4 er ca. 30 ganger høyere numerisk enn ved pH 6.0. Øke pH ytterligere resulterer i en høyere grad av ikke-spesifikk bindende, som blir en påminnelse ved [3H] sokkel-382 hvor bare små mengder av bestemte binding kan skaffes ved pH 7.4 (figur 6E). Faktisk fører fastsettelse av farmakologiske parametere med denne radioligand fysiologisk pH9, igjen illustrerer kraften i å ha en radioligand med som høy affinitet som mulig.

Figure 1
Figur 1: strukturer av radioligands målretting høy affinitet GHB bindende områder. [3H] 3-hydroxycyclopent-1-ene karboksylsyre ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - tetrahydro-5-hydroxy-5H- benzocyclohept-6-ylidene-eddiksyre (sokkel-382) ([3H] sokkel-382)15 og [3H] den ble-hydroxybutyric acid ([3H] GHB)16 som tritiated radioligands med tilsvarende aktiviteten (20-40 Ci/mmol), samt [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125jeg] BnOPh-GHB)13 med en estimert molar aktivitet av 2000 Ci/mmol21. GHB strukturelle elementet er uthevet i rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oversikt over protokollen for i vitro autoradiography. (1) dyret er euthanized, vev er dissekert og snapin-frosset på tørris. Vev er deretter delt på en kryostaten, Tin-montert på objektglass og (2) deler er inkubert med radioligand til likevekt bindende. For fastsettelse av ikke-spesifikk bindende, er løsninger supplert med en umerkede displacer av en relaterte men ikke identisk kjemisk struktur. (3) deretter ubundet radioligand fjernes ved vask i analysebuffer og salter fjernes av skylling med destillert H2O. Når delene er tørr, utføres paraformaldehyde (PFA) fiksering permanent etablere ligand-protein samhandlingen. Delene er så utsatt for fosfor imaging plater. (4) etter tilstrekkelig eksponeringstid skannes plater for å få digitale autoradiograms. (5) til slutt bildeanalyser utføres ved hjelp av definisjoner på områder av interesse (ROIs) og bindingen er kvantifisert. I eksemplet vises er optisk tetthet (ODs) illustrert i deler av musen cortex (venstre) og hippocampus (midten). Kvantifisering gjøres ved å utsette delene sammen med en [3H] Mikroskala (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representative autoradiograms 1 nM [3H] HOCPCA bindingen til musen hjernen delene. (A) Radioligand binder til Koronal, sagittal og vannrette vev deler for å illustrere betydningen av at snitteprosessen flyet på synligheten av anatomiske strukturer. (B) Cresyl violet farging av tilsvarende vev å bekrefte anatomiske områder, spesielt områder med lav/fraværende radioligand binding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representative autoradiograms av 1 nM [3H] HOCPCA binding i forskjellige arter. Sammenligning av (A) rotte, (B) mus og (C) gris i vitro autoradiograms for å illustrere evolusjonære bevaring av bindende områder kortikale og hippocampus områder med brutto hjernen anatomi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Kvantifisering av binding til høy affinitet GHB bindende områder med forskjellig følsomhet for GHB radioligands av i vitro autoradiography i hjernen skiver fra musen cortex og hippocampus. Total bindende rapporteres som fmol/mg vev ekvivalenter (TE) for radioligands (A) [3H] HOCPCA (1 nM) og (B) [3H] sokkel-382 (7 nM) og (C) [3H] GHB (30 nM) (lignende bestemte aktiviteter). Non-spesifikke bindingen ble ikke funnet i nærvær av 1 mM GHB eller 1 mM HOCPCA for noen av radioligands (vises ikke). Dataene er presentert som mener ± SD av fire biologiske replikat hver utført i tre tekniske gjentak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Representant resultatene av autoradiographic fastsettelse av Kd og BMaks verdier av homologe konkurransedyktig forskyvning av [3H] HOCPCA og [3H] sokkel-382 i musen kortikale seksjoner pH 6.0 og pH 7.4 for å illustrere påvirker pH affinitet av radioligands. (Kd og BMaks ble beregnet ved hjelp av den samme sammensatt som radioligand og konkurrent, gjennom innledende bestemmelse av Kjeg verdier22). (A) Autoradiograms med optimal signal-til-støy-forhold for 1 nM [3H] HOCPCA bindingen ved pH 6.0. (B) endre buffer pH 7,4 krever en høyere [3H] HOCPCA konsentrasjon (8 nM) å nå betydelig bindende nivåer. (C) noe som resulterte Logg-konsentrasjon bindende kurver; mener ± SEM. (D) 5 nM [3H] sokkel-382 bindende ved pH 6.0 resulterer i lav uspesifisert bindende, mens (E) 40 nM [3H] sokkel-382 er tilstrekkelig til å få bindende ved pH 7.4. (F) noe som resulterte Logg-konsentrasjon bindende kurver; mener ± SEM. Data ble Hentet fra 3-4 biologiske gjentak hver utført i 3-5 tekniske gjentak, bare [3H] sokkel-382 eksperimenter ved pH 7.4 ble utført med bare 2 biologiske gjentak. For begge radioligands, 1 mM GHB ble brukt bestemmelse av ikke-spesifikk bindende. Om analyse og beregning av Kd og BMaks, se9. Dette tallet er tilpasset og forrige publikasjonen9 er gjengitt med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvaliteten på autoradiographic analysen bestemmes oftest følsomheten til radioligand. En viktig medvirkende faktor er den valgte radioisotop, som er gitt av tilgjengeligheten av kjente ligander eller muligheten for spesifikke merking teknikker å gi ligander med aktuelle aktiviteten (dvs., mengden av radioaktivitet per enhet mol et radioligand)23og med begrensede mengder av kjemiske degradering. Mange radioligands av kjente ligander merkes med tritium9,10,24,25,26, som angir flere fordeler. Først er tritium (3H) preget av en lang halveringstid (12.43 år) fremme langsiktig lagring av personlige grupper. Dernest er ligand mål samspillet ikke forvrengt av radionuklidenes som 3H-ligander er biologisk utvisket fra deres overordnede forbindelser. Tritium avgir lavenergi β--partikler som reise bare korte avstander i vev resulterer i høy romlig oppløsning og, senere, større forskjell anatomiske strukturer4. Likevel kan tritium merking bare bli produsert for å gi middels høy spesifikke aktiviteter. Dette er på grunn av at tilgjengelig 3H-kilder er forurenset med ikke-radioaktivt hydrogen. Generelt, jo høyere den bestemte aktiviteten, de mindre radioligand er nødvendig å gi sensitive oppdagelsen23. Videre bør det vurderes at 3H-ligander har muligheten til å gjennomgå hydrogen utveksling med vann avhengig av stabiliteten av 3H-label. For å kompensere for lav uttrykk eller lavt aktiviteten, kan jod-125 brukes som radionuklidenes13. Til maksimal aktiviteten av jod-125 er ca 100 ganger høyere enn tritium. Flere ekstra hensyn må imidlertid gjøres når du arbeider med jod-125. For eksempel, induserer tillegg av jod-125 normalt strukturelle endringer i molekylet som kan påvirke ligand mål interaksjoner. Som jod-125 har en halveringstid på 60 dager, anses korreksjon for daglig forfall for aktiviteten og kvantifisering av ligand mål interaksjoner23. 125 Ligander avgir γ-fotoner og til tross for mye høyere følsomhet, produsere lav oppløsning bilder. Dette skyldes den inverse forholdet mellom oppløsning og maksimal energi av isotopen (som omtalt under). Til slutt, sammenlignet med tritium, økt forsiktighet bør utvises ved håndtering av jod-125 på grunn av høyere energi av radionuklidenes.

Avhengig av Nuklide, kan vev snittykkelsen påvirke oppløsning. Lav-energi β--stråling tritium begrenser dens vev rekkevidde til ca 5 µm på grunn av selv-absorpsjon. Som en konsekvens, er kvantifisering ikke påvirket av vev tykkelse når snittykkelsen overstiger 5 µm27,28. Derimot har radioaktivitet strømkrevende isotoper en større vev penetrasjon, noe som resulterer i lavere bildeoppløsning fordi ligander med en større avstand til gjenkjenning medium også bidra til bildet formasjonen. Følgelig fremme tynnere delene høyere oppløsning for kraftkrevende Radionuklider1.

Etableringen av en autoradiographic protokollen krever kunnskap om optimal bindende betingelser (f.eks, buffer, pH og temperatur) og farmakologiske parametere for radioligand affinitet og kinetics. Hvis du radioligand ikke har vært preget før er utforskende studier nødvendig29. Velge en optimal radioligand konsentrasjon styres både av slektskap av radioligand og overflod av bindende områder. Vanligvis brukes en konsentrasjon som reflekterer 5 - 6 ganger Kd til å sikre at alle bindende områder er mettet30. En annen tilnærming er å gi den høyeste andelen av total-å-ikke-spesifikk bindende ved å velge radioligand konsentrasjoner under Kd31 og lagre radioligand løsning på samme tid. Dette er spesielt nyttig når binding området er svært rikt i undersøkt vevet siden høy radioligand konsentrasjoner ville øke sjansen for oversaturating autoradiograms, som tilfellet er for [3H] HOCPCA og høy affinitet GHB bindende områder9. Videre, for å effektivt etikett hele befolkningen i målrettede protein, radioligand bør ideelt binde til alle mulige mål konformasjonen. Spesielt i reseptoren autoradiography, kan bruk av agonister bare avsløre en delvis antall totale reseptorer siden noen kan være tilstede i lav-affinitet Agonistiske stater. I kontrast, vise nøytral antagonister ofte affinitet for alle reseptor stater26,29.

Videre er bindende eksperimenter vanligvis utføres under binding forhold. Derfor tiden det tar å nå likevekt bindende under ønsket eksperimentelle forhold (fast radioligand konsentrasjon, buffer og temperatur) bør fastsettes i foreningen eksperimenter å sikre likevekt bindende innenfor rammen av den eksperiment4,23,30. Etter radioligand inkubasjon ubundet radioligand vasket av flere incubations med analysebuffer og vanligvis etterfulgt av skylling i destillert H2O. Signal-å-bråk forhold kan optimaliseres ved å justere temperatur og tid avhengig av dissosiasjon antall radioligand26,30,31.

Radioligands kan vise binding til ikke-biologisk materiale, dvs.ikke-spesifikk bindende. Radioligand binding til cellulære komponenter enn det tiltenkte målet er definert som uspesifikke bindende. Bidraget fra uspesifikke binding til den totale mengden radioligand binding vurderes i nærvær av en konkurrerende umerkede ligand mål samme bindende område som i radioligand. Som det ikke radioaktive sammensatt (displacer) angis i 10,000-fold overkant, den er bindende og radioligand kan bare binde til off-målet områder26,31,32. Avgjørende, bør det umerkede sammensatt være en annen kjemiske struktur enn radioligand siden dette reduserer faren for fortrenge begge bestemt samt uspesifisert bindende23. Non-spesifikke binding som oppstår fra binding til membraner kan være et stort problem spesielt i tilfellet ganske lipofile radioligands. I noen tilfeller kan omfattende vask prosedyrer fjerne ikke-reseptor bundet radioligand og derfor forbedre spesifikt bindende prosenter29.

Når du velger en analysebuffer, er det avgjørende å vurdere effekten av ionisk styrke og pH på ligand mål samhandlingen. Spesielt elektrostatisk interaksjoner mellom polar ligander og hydrofile komponenter av bindende områder påvirkes av ionisk styrken i bufferen. Tilskudd med monovalent eller divalent ioner kan derfor påvirke de effektive affinity konstant23,33. Hvis optimal buffer sammensetningen for studerte ligand mål samhandlingen er ukjent, bør ulike felles buffere utforskes i piloten eksperimenter. Buffere kan også suppleres med antioksidanter som askorbinsyre og hemmere av nedverdigende enzymer29,34. Videre ionisering av spesifikke grupper innenfor binding området eller på ligand selv er påvirket av pH og har viktige effekter på likevekt bindende konstant, kinetisk rate konstanter og uspesifikk bindende23,33. For eksempel illustrerer sondering høy affinitet GHB bindende område med forskjellige GHB radioligands pent betydningen av pH på denne bindingen målet (figur 6). Karakterisere optimal pH for ligand-reseptor samspillet kan også gi hint om viktigheten av målet i forhold til sin biologiske relevans.

En annen viktig faktor i digital autoradiography er eksponeringstid, dvs, tiden det tar å oppnå målbare autoradiograms ved å utsette radiolabelled vev delene til fosfor imaging plater. Estimatene er basert på mengden av radioaktivitet i prøven, energi og half-life isotopen samt ønsket signal-til-støy-forhold. Spesielt langvarig eksponering tid resultater i mettede bilder og høye signal. Forhøyet bakgrunn signal kan reduseres ved å lagre kassetter i ledelsen skjermede omgivelser å unngå kosmisk stråling1,4. Likevel, hvis suboptimal autoradiograms er oppnådd, prøven kan bli utsatt flere ganger, såfremt ligand mål komplekset er fast og halveringstiden av radionuklidenes den.

Fosfor imaging plater kan gjenbrukes, og har en lang levetid når håndteres riktig, dvs., bøying bør unngås og plater bør oppbevares i et tørt miljø. Håndtering av fosfor imaging plater styres av deres følsomhet for lys og kosmisk stråling. Dermed er det viktig å slette platen før hver for bruk for å minimere bakgrunn signal. Eksponering for radiolabelled vev deler tenkelig platene er gjort i stråling skjermede kassetter fullstendig blottet for lys. Når du overfører platen til skanneren på slutten av eksponeringstid, bør alle omgivelseslyset også unngås så med korte kontakt med hvitt lys reduserer akkumulert signal. Videre skal platene skannes umiddelbart etter fjerning av å unngå signal falming. En ulempe med å bruke fosfor imaging plater er potensielle fremkomsten av gjenstander og gjenværende "ghost bilder" etter gjentatte forsøk av plater1.

Arbeide med tritium krever imaging plater uten et beskyttende belegg for å tillate lav energi stråling nå fosfor krystaller. Tritium-sensitive fosfor tenkelig platene er derfor mer følsomme for forurensning eller skade som skyldes feil håndtering. Når forurenset, tritium-sensitive plater kan ikke rengjøres og må byttes. Fiksering av ligand mål komplekset med PFA damp reduserer potensielle forurensning av platen, forlenge dens levetid. Videre er dehydrering i vevet etter fiksering et viktig skritt siden tritium følsom platene er sensitiv for fuktighet. Den skjøre naturen bør tritium-sensitive plater ikke brukes for andre isotoper1,4. Derimot platene for kraftkrevende isotoper som jod-125 er mer robust og deres overflate kan også rengjøres ved å tørke med 70% etanol.

Radiosensitive film er tradisjonelt brukt for romlig opptak av radioaktivitet. Mens bilder med høy oppløsning kan oppnås, har filmen autoradiography flere begrensninger. Foruten nødvendigheten av farlige kjemikalier og et mørkerom for utvikling, er X-ray film preget av en smal dynamisk område. Derfor kan det være nødvendig å avsløre radiolabelled seksjoner gjentatte ganger med ulike eksponeringstider for å oppnå målbare ikke-mettet bilder35. Videre har X-ray film begrenset følsomhet resulterer i vedvarende eksponeringstider festeanord merket med lav energi isotoper, dvs. tritium forfall kan kreve flere måneder eksponering. Lav følsomhet kombinert med lite lineær utvalg gjør teknikken svært tidkrevende, særlig når optimal analysen forholdene må være bestemt første1,35.

Med utviklingen av fosfor imaging plater, vært flere av disse begrensningene adressert35,36,37. Tenkelig platene tjene til å lagre bilder av radioaktivitet, som representerer den romlige arrangementet av radioligand i vev prøven. Photostimulable BaFBr:Eu2+ fosfor krystaller brukes til å fange radioaktivt energien som slippes ut av prøven, som høy energi stråling (f.eks røntgenstråler, gammastråling eller beta partikler) resultater i magnetisering av Eu2+ EU3+ og påfølgende fangst av utgitt elektronet i fosforen gitteret4,37. Utsette tenkelig platen i synlig eller infrarød lyset reverserer reaksjonen, dvs. den fangede elektronet er utgitt og under transformasjon av Eu3+ Eu2+ luminescence slippes. Oppdagelsen av en photomultiplier muliggjør opprettelse av en digital autoradiogram37slippes ut lys er proporsjonal med mengden av radioaktivitet. Dette systemet gir en økning i følsomhet ledsaget av en markert nedtrapping på eksponeringstid fra måned til dager3. På toppen av det, er lineær dynamikkområdet betydelig økt, noe som reduserer sjansen for overmettede bilder. Linearitet er gitt innen fire til fem størrelsesordener og er validert gjentatte ganger3,35,36,37,38. Selv om filmen autoradiography fortsatt gir overlegen romlig oppløsning, resulterte innsats i skanning teknologien i forbedring av oppløsning fra 300 til 25 µm (pikselstørrelse), slik at detaljert differensiering mellom anatomiske regioner3. Total, fosfor tenkelig plater er tilrettelegge oppnåelse av digitale autoradiograms både en økt lineær rekkevidde og følsomhet. Redusert eksponeringstid og en forenklet utviklingsteknikk betydelig føre til redusert tid for dataanalyse slik at høyere gjennomstrømming.

Sammenlignet med autoradiography, er nyttig farmakologiske parametere som tilhørighet og tetthet også ofte preget av bruk av radioligands i vev homogenate bindende analyser. Denne metoden har fordelen av å produsere resultater ved å måle β-utsendt radioaktivitet med en flytende scintillation detektor i en effektiv måte2. Slike analyser utføres i en multi godt tilnærming, f.eks i 96-brønnen microtiter plater, og er nyttige for screening av biblioteker av forbindelser og et større antall konsentrasjon-avhengige relasjoner. På toppen av det, gjennomføre metning analyse med dette oppsettet er ofte mer gjennomførbart forhold til autoradiography, som viser en risiko for overmettede bilder med høy radioligand konsentrasjoner. Imidlertid omgår utføre homologe forskyvning av en fast lav radioligand konsentrasjon med ikke-radioaktivt ligander for å få Kd og BMaks problemet overmettede bilder (figur 6)22. Homogenate bindende og autoradiography produserer lignende beregninger for ligand affinitet konstanter mens vevs tetthet av protein av interesse kan være undervurdert i homogenate binding. Derfor har det blitt foreslått at cellemembranen avbrudd samtidig med vev homogenisering kan medføre reseptor eller endret bindende betingelser3,33. Feil i vev disseksjon kan dessuten gi homogenates forurenset med vev fra tilstøtende hjernen regioner. Sammenligning er med komplekse bindende mønstre i små kjerner visualisert og deriverbare på grunn av romlige anatomiske oppløsningen autoradiography3,33.

Immunohistochemistry også visualiserer distribusjon av et protein rundt anatomisk. Metoden er dugelig av produserer bilder med høy anatomiske oppløsning, som diskret vev komponenter kan identifiseres på cellenivå og selv subcellular nivåer ved hjelp av elektronmikroskop. Uttrykket nivåene er vurdert basert på intensiteten av den flekker. Likevel er absolutt kvantifisering av uttrykk vanskelig på grunn av mangel på passende referanse standarder39. Videre er immunohistochemistry avhengig av en selektiv, godt godkjente antistoff som er ofte et problem i reseptor forskning.

Tidligere beslutter på å utføre i vitro autoradiography, må flere hensyn gjøres. Først av alt, kan post mortem vev forberedelse inkludert snitting samt gjentatt frysing og tining påvirke bevaring av bindende områder2. Videre er metoden avhenger av tilgjengeligheten av en tilstrekkelig radioligand, som viser høy affinitet og selektivitet for målet i spørsmål2. Radioligand vise ikke betydelige binding til off-målet områder, og det også vise en gunstig kinetic profil. Dette er nødvendig fordi ligand mål komplekset må holde intakt under omfanget av eksperimentet. Videre, når det passer ikke radioaktiv forbindelser finnes, innføringen av radionuklidenes kan bli en kritisk faktor. Dermed bør molekylet rundt være utstyrt med passende funksjonelle grupper for effektiv radiolabelling, som muliggjør produksjon av radioligands med tilstrekkelig høy aktiviteten og kjemiske stabilitet40. En annen ulempe av i vitro autoradiography er at den bare tillater bruk av et dyr når. Mer elegant er filtypen til i vivo imaging metoder som posisjon utslipp tomografi (PET), som gjør at gjentatt skanning av samme dyr og fastsettelse av bruk og dynamisk binding egenskaper. PET er spesielt verdifull for studiet av høyere pattedyr41 og dose optimalisering i pre kliniske studier 42,43,44.

Flere modifikasjoner av autoradiographic teknikken utvide sine programmer både når det gjelder karakterisering av farmakologiske mål i friske og syke tilstander og medisiner og utvikling. Først av alt, har nylige fremskritt innen bildebehandling ført til utviklingen av sanntids autoradiography. Gass detektorer α/β-partikler obviate behovet for bildebehandling plater eller film av direkte måling av disintegrations, og dermed produsere raske digitale autoradiograms45.

Videre kan i vitro autoradiography studier av funksjonaliteten til G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) på informasjon om anatomiske distribusjonen obduksjon vev. Denne varianten av metoden innebærer inkubasjon vev deler med en radioactively merket analog av guanosine trifosfat (GTP), dvs. [35S] guanosine 5'-den ble-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), sammen med en ikke radioaktiv Agonistiske av GPCR. Når Agonistiske binder og utløser en reaksjon av GPCR, inkorporering av [35S] GTPγS kan lokalisert og kvantifisert via autoradiography, som gjenspeiler bare den aktivert reseptor befolkningen2,46,47 .

Ex vivo autoradiography representerer en annen versjon av teknikken, som vurderer regionale binding av en radioligand etter administrasjon til levende eksperimentelle dyr. Etter ofringen av dyret, og kryosnitt av vev i spørsmålet og autoradiographic eksponering resultere i autoradiograms som gjenspeiler radioligand binding i vivo2. Ex vivo autoradiography er ofte ansatt narkotika og utvikling programmer for å få informasjon om farmakokinetiske profilen av en leder sammensatte, dvs. dens absorpsjon, distribusjon, metabolisme og ekskresjon (ADME) . Spesielt hele kroppen autoradiography gir innsikt om distribusjon til alle organer og vev. Men bestemmelse av ikke-spesifikk bindende og måling er vanskeligere i forhold til i vitro autoradiography mulig metabolisme og nedbrytning av radioligand og ingen måte for å vaske bort ubundet ligand48.

Autoradiography brukes også for innledende testing og karakterisering av PET ligander4. Den kraftkrevende Radionuklider karbon-11 og fluor-18 brukes oftest for PET ligander. PET er en fremtredende, ikke-invasiv program for radioligands fordi kvantifiserbare 3D-bilder av radioligand binding i en levende dyr kan fås11,40,49.

In vitro autoradiography med fosfor imaging plater representerer en verdifull analysen metode for farmakologisk karakterisering av ligand mål interaksjoner. Metoden gir reproduserbar resultater av ansettelse av en relativt rask og enkel protokoll når optimal analysen forhold er etablert. Anatomisk distribusjon av et protein rundt bestemmes i sin innfødt microenvironment, som lar studiet av sine fysiologiske og patologiske og farmakologiske rolle i friske og syke obduksjon vev av forsøksdyr som mennesker2,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av Lundbeck Foundation (Grant R133-A12270) og Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Forfatterne takker Dr. Aleš Marek for levering av [3H] radioligand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

Nevrovitenskap problemet 145 Radioligand radioaktivt autoradiography affinitet uttrykk fosfor bildebehandling HOCPCA γ-hydroxybutyric acid GHB sokkel-382 kvantitativ farmakologi
Autoradiography som en enkel og kraftig metode for visualisering og karakterisering av farmakologiske mål
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter