Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Авторадиографии как простой и мощный метод для визуализации и характеристика фармакологического целей

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

Методом авторадиографии обычно используется для изучения привязки radioligands в разделах ткани для определения качественных или количественных фармакологии.

Abstract

В vitro авторадиографии стремится визуализации анатомического распределения протеин интереса в ткани экспериментальных животных, а также людей. Метод основан на конкретной привязки лиганд своей биологической цели. Таким образом замороженные ткани секции инкубируют с решением лиганд, и привязки к целевому впоследствии локализуется путем обнаружения радиоактивного распада, например, с помощью светочувствительной пленки или фосфора изображений пластины. Результате цифровой autoradiograms отображения замечательные пространственного разрешения, который позволяет количественной и локализации лиганд привязки в различных анатомических структур. Кроме того количественная оценка позволяет фармакологическая характеристика сродство лиганда с помощью константы диссоциации (dK), константы ингибирования (Kя), а также плотность сайтов связывания (BМакс) в отдельных тканях. Таким образом метод предоставляет сведения о локализации целевого и лигандом избирательности. Здесь техника проявляется с autoradiographic характеристика высокоспецифичные гамма-оксимасляная кислота (ГОМК) привязки сайтов в ткани мозга млекопитающих, с особым упором на методологические соображения относительно привязки пробирного параметры, выбор лиганд и метод обнаружения.

Introduction

Авторадиографии — это метод, который предоставляет изображения радиоактивного распада. Метод обычно используется для изучения распределения ткани протеина интереса в vitro на основе конкретных фармакологических взаимодействия между радиоизотопами соединения и его цель. Это обеспечивает прямую информацию о избирательность лигандом для целевого объекта. Радиоавтографией в пробирке может также использоваться для количественного определения фармакологических привязки параметров radioligands, таких как Константа диссоциации (dK) и плотности сайтов связывания (BМакс), а также для определения Ингибирование константа (iK) конкурирующих лигандов1,2. По сравнению с традиционными огневки лиганд привязки, радиоавтография имеет преимущество возможность визуализировать пространственных анатомии и кратким указанием региональных выражение модели3. Методом авторадиографии является поэтому соответствующие альтернативы immunocytochemistry, особенно в отсутствие проверенных антитела. Авторадиографии легко реализуется в стандартной радиоизотопной лаборатории, при условии наличия подходящего лиганд с необходимые фармакологических специфичность, доступ к микротом криостат для подготовки разделов ткани и подходящих изображений устройство, которое имеет возможность анализа распределения радиоактивности в разделах соответствующие ткани. В частности важным критерием отбора для лиганд является ограниченное количество привязки на сайты, не являющиеся объектом. Это может быть другие белки, мембраны или такие материалы, как пластик или фильтры и коллективно называется неспецифичный привязки. Обычно неспецифичный привязки не конденсаторе, но может быть конденсаторе, если она включает в себя конкретные-целевого белка. Лучший способ проверки истинный конкретной привязки является для сравнения тканей, генетически не хватает целевого объекта, например, инженерии тканей (нокаут)4.

Здесь методология иллюстрируется с autoradiographic характеристика высокоспецифичные связывающие сайта для γ-оксимасляная кислота (ГОМК) в мозге млекопитающих. Понимание фармакологических взаимодействия между ГОМК и его привязки сайта имеет значение как ГОМК снадобье как клинически полезным в лечении нарколепсии и алкоголизма5, но также природных составляющих млекопитающих мозга и отдыха наркотиками6. Высокоспецифичные ГОМК привязки сайтов впервые были описаны с помощью [3H] ГОМК привязки для мозга крысы огневки7. С годами, дальнейших исследований авторадиографии с [3H] ГОМК и аналог [3H] NCS-382 показал высокую плотность привязки сайтов в регионах мозга крысы8,9,10, мыши9 , свинья11и обезьяна/человеческий мозг12. Однако молекулярной идентификации и точное функциональные актуальность этих сайтов связывания остаются недостижимой.

С намерением для дальнейшей характеризации привязки сайтов и для облегчения исследования о физиологической роли ГОМК, были разработаны несколько radioligands включения различных изотопов, наделенных различными сходство ([3H] ГОМК, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA и [125я] BnOPh-GHB)13,14,,1516(обзор в17) (рис . 1). Сочетание выборочного высокоспецифичные radioligands и ткани очень высокой плотности привязки сайтов, позволили для производства высококачественных изображений с использованием люминофора, изображений техники9,11. Наряду с изложение практических точек в создании эксперимент autoradiographic и иллюстрации иллюстрируют детали в разделе обсуждения особое внимание будет уделяться i) выбор радионуклидов, ii) выбор условий пробирного и iii) использование фосфора визуализации пластины по сравнению с рентгеновской пленки. Общая цель этого документа заключается в том, предоставлять технических, методологических и научных сведений по технике авторадиографии для информирования о распределении ткани и фармакологические анализа белковых мишеней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные обработка была выполнена в соответствии с руководящими принципами датского инспекции экспериментов животных.

Примечание: Протокол, описанные здесь охватывает Подготовка тканей (т.е., ткани мозга мыши), в пробирке autoradiographic assay достаточно подробно для создания метода в новой лаборатории, воздействие фосфора изображений пластины, а также последующие денситометрических анализ autoradiograms (рис. 2) с целью локализации и количественного определения привязки лиганд в различных анатомических структур. Для гистологической сравнения включен протокол для количество кресил фиолетовое окрашивание. Кроме того определение неспецифической привязки с конкурирующего лиганд включен в протокол. Подробное описание о том, как определить Kd, BМакс или Kяпредыдущие публикации4см.

1. Подготовка тканей, Cryosectioning

  1. Усыпить мыши, вывих шейного и немедленно вскрыть из мозга, используя ножницы и пинцет. Непосредственно перейти к следующему шагу, чтобы избежать повреждения тканей.
  2. Snap замораживание ткани погружение в порошок сухого льда, газообразных CO2 или изопентан. Напрямую передавать замороженные ткани криостат с температурой, набор до-20 ° C. Кроме того магазин тканей в-80 ° C до обработки.
    Примечание: Избегайте повторных оттаивания/замораживания для уменьшения повреждения тканей.
  3. Пусть акклиматизироваться до-20 ° C в криостат для 20 минут перед дальнейшей обработкой чтобы избежать сокрушительное ткани ткани.
  4. Обложка держатель ткани с внедрения средой за пределами криостат и быстро место замороженные ткани образец в желаемой ориентации, в то время как средство вложения до сих пор жидкости. Например место мозга мыши вертикально на мозжечке достижения ростральной коронковой части. Передать криостата держатель ткани и разоблачить внедрения средних температур ниже-10 ° C для упрочнения.
    Примечание: Образец хрупкой ткани следует покрытием в встраивание среднего в ткани плесени до монтажа.
  5. Расположите держатель ткани в микротом криостата. Отрегулируйте ориентацию ткани, чтобы избежать наклонной секции.
  6. Вырезать ткань с руководством стереотаксического Атлас18 в разделах требуемой толщины (12 мкм, рекомендуется для [3H] помечены лигандами). Тщательно выпрямить и разворачиваться раздел с помощью кисти небольшого размера, в случае необходимости и оттепель Маунт раздел на слайд микроскопа. Последовательно Соберите разделы из региона интерес для требуемой технической репликации (например, 4 секции на слайд).
  7. Разрешить разделы на слайдах высохнуть за 1 ч до дальнейшей обработки.
    Примечание: Добавление осушитель материала слайд коробки минимизирует накопление влаги на разделах ткани. Протокол может быть приостановлена здесь путем хранения секции долгосрочный в слайд коробки-80 ° c.

2. радиоавтографией в пробирке

Предупреждение: радиоактивность. Работа в сертифицированной лаборатории согласно местным нормативам. Носите защитную одежду. Распоряжаться в соответствии с радиоактивного распада или аутсорсинг сертифицированной компании.

  1. Оттепель в разделах по крайней мере 30 минут при комнатной температуре (RT). Ярлык слайды с экспериментальных условий. Используйте карандаш, потому что слайды будет купались в этиловом спирте в течение последующего окрашивания.
  2. Место слайды по горизонтали в лотки.
    Примечание: Позиционирование слайды на повышенных платформа в лотки облегчает их обработки.
  3. Предварительно incubate разделы, установленный на слайды в assay buffer регулируется целевой вопрос (для используется протокол ГОМК, 50 мм KHPO4 буфера рН 6,0) тщательно применения соответствующего тома на слайд (700 мкл для грызунов коронковой части 3-4).
    Примечание: Убедитесь, что каждый раздел полностью покрыта жидкостью.
    1. Обложка пластиковые поддоны с крышкой, чтобы избежать испарения и предварительной инкубации при соответствующих температуре под постоянным нежный (20 мин) встряхивания на тарелку шейкер (для протокола ГОМК, предварительно incubate на 30 мин в RT).
    2. Для определения привязки неспецифической дополнение пробирного буфер с соответствующей концентрации комплекса немаркированных (для протокола ГОМК, 1 мм ГОМК).
      Примечание: Предварительной инкубации не может быть необходимым.
  4. Слейте жидкость предварительной инкубации из каждого слайда и передать пластиковый лоток слайды.
  5. Чтобы избежать обезвоживания, немедленно инкубировать секции с соответствующей концентрации лиганд в assay buffer желаемых условиях (для протокола ГОМК, 1 Нм [3H] HOCPCA за 1 час на RT), покрывая секций полностью с лиганд решение (700 мкл для грызунов коронковой части 3-4).
    1. Инкубируйте под под постоянным нежный (20 мин) пожимая пластиковых лотков с закрытой крышкой.
      Примечание: Концентрация лиганд может быть проверен путем подсчета Алиготе в жидких сцинтилляционный счетчик.
  6. Удаление решения инкубации, поливая жидкости и передавать слайды в стойку слайд микроскопа. Немедленно приступить к следующему шагу, чтобы избежать обезвоживания секции.
  7. Вымойте слайды. Для протокола ГОМК мыть с ледяной пробирного буфер дважды для 20 s и затем промойте дважды погружением слайд стойку в лотки с ледяной дистиллированной водой для удаления солей. Расположите слайды вертикально в стойки для воздушной сушки для по крайней мере 1 час на RT или сухой слайды для 5 мин с вентилятором значение холодной температуры.
    Примечание: Стиральная должны быть оптимизированы, например, обширные Стиральная может быть полезным для уменьшения неспецифической привязки.
  8. Передавать слайды фиксатором, содержащие порошок параформальдегида (PFA) для фиксации ночь с парами ПФА в RT для того, чтобы защитить целостность комплекса лиганд цели.
    Предупреждение: PFA является токсичным. Positionthe фиксатором в дыма капот и Избегайте контакта кожи глаз с PFA.
  9. Следующий день, передавать слайды в эксикатор окно, содержащее силикагель для 3 h на RT для ликвидации влаги.

3. воздействие фосфора изображений пластины и сканирование

  1. Поместите эти разделы в кассету излучения экранированный изображений пластины с ткани, обращенной вверх. Для последующих количественного определения привязки лиганд включают микромасштабной [3H] в каждую кассету. Случайным образом организовать разделы и разоблачить разделы для прямого сравнения в том же кассету.
  2. Стереть трития чувствительных светомассы изображений пластины непосредственно перед использованием для удаления накопленных сигналы от хранения и ликвидации фон сигналов. Таким образом загрузить пластину в люминофор изображения машины и подвергнуть его видимый/инфракрасный свет согласно инструкциям производителя.
  3. Снять пластину из люминофора изображений машины и сразу же поместить его на разделы в кассету. Убедитесь, что кассета закрыт полностью. Разоблачить разделы светомассы изображений пластины для 3 дней на RT, защищены от света.
  4. Потому что свет стирает сигнал от изображений знака, тщательно открыть кассету в темноте и немедленно передачи изображений пластины в темной коробке тепловизор фосфора или место тепловизор фосфора в темной комнате.
    Примечание: Убедитесь, что для обозначения пространственное расположение слайды во время экспозиции для выявления отдельных образцов на цифровое изображение после анализа. Таким образом фосфора изображений пластины также отображать один угол, сократить в собственный угол для того, чтобы определить правильную ориентацию пластину на цифровой фотографии.
  5. Сканировать пластину с высоким разрешением можно получить цифровое изображение.

4. Дополнительно: Количество кресил фиолетовое окрашивание участков ткани

  1. Приготовляют раствор 1% количество кресил фиолетовый путем смешивания 5 g количество кресил фиолетовый ацетата в 500 мл деонизированной воды (dH2O) пока растворится (около 2 ч). Фильтрация через фильтровальную бумагу, используя воронку в новая бутылка 500 мл. Отрегулируйте пэ-аш до 3,5-3,8.
  2. Положение слайд пятнать устанавливается под зонт. Подготовьте лотки с указанными ниже решениями в белые полипропиленовые лотки (за исключением ксилол):
    а. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% этанола
    d. 100% этанола
    е. 100% dH2O
    f. 1% количество кресил фиолетовый
    g. 0,07% уксусной кислоты (мкл 175 уксусной кислоты 250 мл dH2O).
    h. 100% ксилола в зеленых растворителя устойчивые поддоны
    i. 100% ксилола в зеленых растворителя устойчивые поддоны
  3. Перенести слайды для Зонта и поместить их в шкаф слайд.
  4. Растворяются липиды путем увеличения градуированных серии этанола в dH2O в 100% этанола (лоток a-d), опуская слайды за 1 мин.
  5. Увлажняет образцов для dH2O по убыванию концентрации этанола (лоток a-d в обратном порядке, следуют e лоток), опуская слайды за 1 мин.
  6. Погружайте образцов в растворе количество кресил фиолетовый за 10 мин.
  7. Промывайте образцы в 0,07% уксусная кислота, подняв слайды вверх и вниз осторожно для 4-8 s. мыть слайды путем погружения в dH2O за 1 мин.
  8. Обезвоживает образцы путем погружения слайды для 30 s в порядке возрастания концентрации этанола (лоток a-d).
  9. Передача образцов через два лотка 100% ксилола (лоток h и i), чтобы утолить этанола.
  10. Увлажняет образцов для dH2O по убыванию концентрации этанола (лоток a-d в обратном порядке, следуют e лоток), опуская слайды за 1 мин.
  11. Удалите слайды из солевых пинцетом. Добавить несколько капель органического растворителя монтажа СМИ на слайд и добавить coverslip 24 x 60 мм сверху защищать образцов. Удаление пузырьков воздуха между образцом и coverslip, осторожно нажав на coverslip.
    Примечание: Держите остальные слайды в ксилоле во время монтажа для предотвращения высыхания.
  12. Сухой слайды на ночь в Зонта на RT.
  13. Получите изображение образца с микроскопом и 1,25 X цели.

5. денситометрических анализ цифровых изображений

  1. Измерить относительную оптических плотностей (стержни) каждой калибровки стандартных от микромасштабной [3H] с помощью программного обеспечения анализа изображения.
    1. Выберите область одинакового размера для каждой точки микромасштабной [3H], с помощью инструмента для создания региона от элемента меню региона решимость. Присвойте номер каждой выбранной области, нажав на номер пункта меню метки.
    2. Экспортировать ОД значения для каждой точки калибровки стандартных, нажав файл | E xport | 2D региона доклад. Передача значения стержня в электронную таблицу и нормализовать по размеру выбранной области. Линейной регрессии для получения калибровочной кривой для дальнейшего денситометрических анализа.
      Примечание: Убедитесь, что выбранные области маркированы с целью выявления соответствия значения стержня и образцы.
  2. Выполняют количественной оценки autoradiograms, используя собственные изображения программное обеспечение, выбрав региона интерес (ROI) с помощью инструмента региона создание в каждой секции и измерения его ОРВ. Выберите того же региона в каждом разделе, создав шаблон для региона интерес, который копируется и вручную скорректирована с незначительными изменениями в анатомии мозга для каждого autoradiogram. Идентифицировать Анатомия ROI сравнение autoradiograms с мозга Атлас18. При сравнении нескольких лечения, анализ ослепил и рандомизированных избежание предвзятым выбор ROIs.
  3. Экспорт стержень ценностей и размеров отдельных районов в электронную таблицу, нажав файл | E xport | 2D региона доклад.
  4. Разделите измеренных стержень выбранного ROI по своей площади для получения плотность в конкретной области.
  5. Измерить стержень фоне пластины и экспорта соответствующие значения стержня и размер области в электронную таблицу. Вычитание среднего фонового сигнала от каждого стержня значения каждого ROI.
  6. Среднем стержней технических реплицирует, т.е., раздел реплицирует, используя ткани от же животное.
  7. Использование стандартной кривой для преобразования стержней в единиц лиганд привязки, т.е., nCi/мг ткани эквиваленты (TE).
    Примечание: TE термин используется потому, что стандарты создаются с материалами, имитируя ткани.
  8. Экспресс привязки путем преобразования nCi/мг нмоль/мг TE согласно удельная активность лиганд (уравнение 1).
    Equation(1)
  9. Для получения конкретной привязки значений, вычтите неспецифической привязки из всего привязки.
  10. Средняя привязки каждого биологического реплицировать с помощью среднего технического реплицирует каждого животного (полученное в шаге 5.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С помощью описанных протокола, анатомические распределение сайтов связывания ГОМК высокоспецифичные был визуализирован с радиоизотопами ГОМК аналог [3H] HOCPCA в мозг мыши, который был сокращен на корональных, сагиттальной и горизонтальные секции (рис. 3 ). Высокий уровень привязки наблюдались в гиппокампе и коры, Нижняя привязки в полосатом теле и не был обнаружен в мозжечке, соответствующих предыдущих моделей сообщил выражение высокоспецифичные ГОМК сайты9,10, 11,12. Как показано здесь, анатомические структуры могут быть визуализированы с помощью различных секущей плоскости и анатомической целостности может поддерживаться количество кресил фиолетовое окрашивание. ГОМК высокоспецифичные связывающие сайтов особенно в регионах с низкой лиганд привязки, например мозжечка, подтверждаются с последующей окраски ткани (рис. 3). Корональные секции чаще всего встречаются в литературе9,10. Они практичны для количественных целей, как большее количество секций может быть получена от одного мозга. Сагиттальной и горизонтальные секции имеют преимущество визуализации привязки на протяжении большей части грызунов мозга в пределах одного раздела, обеспечивая тем самым большой обзор. Рисунок 4иллюстрирует эволюционной сохранения сайтов связывания высокоспецифичные ГОМК в мозге млекопитающих. [3H] HOCPCA привязки сайтов были обнаружены в мыши, крысы, также как и Включение сопоставлений валового мозга анатомии между видами ткани мозга свиньи. Как правило эволюционной сохранения и исследования регионального распределения может помочь значительно в характеристике протеин интереса, в данном случае Роман цели и таким образом может дать показания о его физиологические функции19.

Высокоспецифичные ГОМК привязки сайтов были зондируемой с GHB radioligands, который отображает различные сродства для привязки сайтов но сопоставимых конкретных мероприятий (рис. 5). [3H] HOCPCA ранее было показано, что Kd 74 Нм, который превосходит имеющиеся лиганд [3H] NCS-382 с Kd 697 Нм, оба определяется при pH 6.0 количественных авторадиографии9. Таким образом [3H] HOCPCA обладает гораздо более высокой чувствительности, приводит к отличным соотношением сигнал шум. Из-за более низкую чувствительность [3H] NCS-382, выше лиганд концентрации должны использоваться для получения аналогичного уровня привязки (сравнить оси y на рис. 5). По сравнению с [3H] ГОМК, даже более высокие концентрации лиганд (30 Нм) являются необходимыми для достижения сопоставимых привязки уровней. Это главным образом объясняется значительно ниже сродство (Kя 4,5 мкм) это лиганд20. Однако концентрация лиганд также увеличивает уровень неспецифической привязки9,10 с соответственно меньше отношение сигнал шум. Эта серия экспериментов подчеркивает важность наличия высокоспецифичные лиганд для производства высококачественных изображений.

Потому что сайты ГОМК высокоспецифичные выражаются так высокие уровни в регионах мозга (60 пмоль/mg17), определение фармакологических параметров насыщения кривых изначально трудно, с использованием стандартных трития чувствительных светомассы визуализации плиты из-за риска перенасыщенного изображения. Таким образом, значения Kd [3H] HOCPCA и [3H] NCS-382 были получены первые определяющим Kя значений кривых гомологичных перемещения, а затем вычисление Kd (рис. 6)9. Для большинства radioligands альтернативой мог бы стать использование изотопа разрежения, как это обычно делается в огневки привязки анализов. Кроме того были определены значенияd K на различных рН. Очевидно высокоспецифичных ГОМК сайты помечены наиболее эффективно при pH 6.0 (рис. 6A и рис. 6 d), поскольку изменения анализа условий к рН 7,4 существенно влияют сродство лиганда. Таким образом, Kd [3H] HOCPCA на рН 7,4 примерно в 30 раз превышает численно при pH 6.0. Увеличение pH далее приводит к более высокой степени неспецифической привязки, которая становится предостережение при использовании [3H] NCS-382, где только небольшое количество конкретной привязки могут быть получены при рН 7,4 (Рисунок 6E). Это на самом деле препятствует определение фармакологических параметров, с помощью этой лиганд в физиологических рН9, снова иллюстрирующие мощности в том лиганд с как высокое сродство как можно.

Figure 1
Рисунок 1: структуры radioligands ориентации сайтов связывания ГОМК высокоспецифичные. [3H] 3-hydroxycyclopent-1-ен карбоновые кислоты ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - тетрагидро-5-гидрокси-5H- benzocyclohept-6-ylidene уксусной кислоты (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 и гамма-оксимасляная кислота [3H] ([3H] ГОМК)16 как третируют radioligands с сопоставимыми удельная активность (20-40 Ci/ммоль), а также [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125я] BnOPh-GHB)13 с оценкам Молярная деятельности 2000 года Ci/ммоль21. ГОМК структурный элемент будет выделен красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Схематичный обзор протокола в vitro авторадиографии. (1) умерщвлены животное, ткань расчлененных и оснастки замороженные на сухой лед. Ткани затем секционного на криостат, оттепель смонтированы на скольжениях микроскопа и (2) секции инкубируют с лиганд до привязки равновесия. Для определения привязки неспецифической решения дополняются немаркированных буйка смежных, но не идентичных химической структуры. (3) впоследствии несвязанных лиганд удаляется промывкой в assay buffer и соли устраняются путем полоскания с дистиллированной H2O. Когда секции сухой, параформальдегид (PFA) фиксации выполняется окончательно установить взаимодействие лиганд белка. Разделы затем подвергается светомассы изображений пластины. (4) после достаточное время экспозиции плиты проверяются для получения цифровых autoradiograms. (5) в конечном итоге анализ изображений выполняется с помощью определения областей, представляющих интерес (ROI), и количественно привязки. В этом примере показано оптических плотностей (СОД) приведены в разделах мыши коры (слева) и гиппокампа (средний). Количественная оценка делается путем разоблачения разделов вместе с [3H] микромасштабной (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Представитель autoradiograms 1 Нм [3H] HOCPCA привязки мыши мозга секций. (A) лиганд привязки к корональный, разделов сагиттальной и горизонтальной ткани, чтобы проиллюстрировать важность секционирование самолет на видимость анатомических структур. (B) количество кресил фиолетовое окрашивание соответствующих разделов ткани для проверки анатомических областей, особенно в регионах с низким/отсутствует привязка лиганд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Представитель autoradiograms 1 Нм [3H] HOCPCA привязки в разных видов. Сравнения (A) крыса, мышь (B) и (C) свиней в пробирке autoradiograms для того чтобы проиллюстрировать эволюционной сохранения привязки сайтов коры головного мозга и гиппокампе регионы наряду с валовой мозга анатомии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Количественная оценка привязки сайтов связывания ГОМК высокоспецифичные с разной чувствительностью к GHB radioligands радиоавтографией в пробирке в мозге кусочки от мыши коры головного мозга и гиппокампе. Общая привязка сообщается как эквиваленты фмоль/мг ткани (TE) для radioligands (A) [3H] HOCPCA (1 Нм) и (B) [3H] NCS-382 (7 Нм) и (C) [3H] ГОМК (30 Нм) (аналогичные конкретные мероприятия). Неспецифическая привязки не был обнаружен в присутствии 1 ГОМК или 1 мм HOCPCA для любого из radioligands (не показан). Данные представлены как означает ± SD четыре биологических реплицирует, выполненных друг в трех технических реплицирует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Представитель результаты autoradiographic определения Kd и Bмаксимальные значения гомологичных конкурентные Перемещение [3H] HOCPCA и [3H] NCS-382 в мыши корковых секциях в pH 6.0 и рН 7,4, с тем чтобы иллюстрируют влияние рН на близость radioligands. (Kd и BМакс были рассчитаны с использованием же соединения как лиганд и конкурент, через первоначальное определение Kя значений22). (A) Autoradiograms с оптимальным соотношением сигнал шум 1 Нм [3H] HOCPCA привязки при pH 6.0. (B) изменение буфера рН 7,4 требует более высокую концентрацию HOCPCA [3H] (8 Нм) для достижения значительных привязки уровней. (C) результирующая концентрация журнала привязки кривых; Средний ± SEM. (D) 5 Нм [3H] NCS-382 привязки при pH 6.0 приводит к низкой неспецифической привязки, тогда как (E) 40 Нм [3H] NCS-382 является недостаточным для получения привязки при рН 7,4. (F) результирующая концентрация журнала привязки кривых; Средний ± SEM. данных был получен от 3-4 биологические реплицирует, выполненных друг в 3-5, выполненных технических реплицирует, только [3H] NCS-382 эксперименты на рН 7,4 с только 2 биологических реплицирует. Для обоих radioligands, 1 мм, ГОМК был использован для определения привязки неспецифические. Подробности на анализ и расчет Kd и BМакс9см. Эта цифра адаптированы и перепечатано из предыдущей публикации9 с разрешения Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Качество autoradiographic assay чаще всего определяется чувствительность лиганд. Важным фактором является выбранный радиоизотопных, которая дается путем наличия известных лигандами или осуществимость конкретных методов маркировки приносить лигандов с соответствующей удельной активностью (то есть, количество радиоактивности на единицу моль лиганд)23и с ограниченным количеством химической деградации. Большое количество radioligands известных лигандов помечены с тритием9,10,24,25,26, который выводит несколько преимуществ. Во-первых тритий (3H) характеризуется долго half-life (12,43 лет) поощрение долгосрочного хранения отдельных пакетов. Во-вторых взаимодействие лиганд цель не искажаются радионуклида как 3H-лигандов биологически неотличимы от их исходных соединений. Тритий излучает низкие энергии β–-частицы, которые короткие расстояния в ткани, что приводит к высокой пространственной разрешающей способностью и, впоследствии, большее различие между анатомические структуры4. Тем не менее тритий маркировки может производиться только приносить умеренно высокой конкретных мероприятий. Это связано с тем, что доступны 3H-источники загрязнены нерадиоактивные водорода. Как правило чем выше удельная активность, меньше лиганд необходима поддаваться обнаружению чувствительных23. Кроме того, следует ли считать, что 3H-лигандов имеют возможность проходить обмен водорода с водой в зависимости от стабильности 3H-лейбл. Для компенсации низкой выражение или слишком низкой удельной активностью, йод-125 может использоваться как радионуклидов13. Максимальная удельная активность йод-125 приблизительно 100-кратного выше, чем у трития. Однако несколько дополнительных соображений должны быть сделаны при работе с йод-125. Например добавление йода-125 обычно вызывает структурные изменения в молекула, которая может повлиять на взаимодействие лиганд цели. Как йод-125 имеет период полураспада 60 дней, коррекция для ежедневной упадок должны рассматриваться для конкретных видов деятельности и количественной оценки лиганд целевого взаимодействия23. 125 Лигандов излучают гамма-фотонов и несмотря на гораздо более высокой чувствительности, производят изображения с меньшим разрешением. Это обусловлено обратная связь между разрешением и максимальная энергия изотопа (как описано ниже). Наконец по сравнению с тритием, увеличение следует позаботиться при обработке йод-125 из-за более высокой энергии радионуклидов.

В зависимости от нуклидов толщина среза ткани могут влиять резолюции. Низкоэнергетические β–-излучения трития ограничивает ее ткани добраться до 5 мкм благодаря эгоцентризма. Как следствие количественной оценки не зависит от толщины ткани, когда толщина среза превышает 5 мкм27,28. В отличие от радиоактивного распада высокоэнергетических изотопов имеет большего проникновения ткани, что приводит к низким разрешением изображения, потому что лигандов с большего расстояния обнаружения носитель также внести вклад в формирование имиджа. Следовательно тоньше секции содействия высокое разрешение для высоких энергий радионуклидов1.

Создание autoradiographic протокола требует знания условий оптимального привязки (например, буфер, рН и температуры) и фармакологические параметры лиганд с точки зрения соответствия и кинетики. Если раньше не было охарактеризовано лиганд, предварительные исследования являются необходимыми29. Выбор оптимального лиганд концентрация руководствуется как близость лиганд и обилие сайты связывания. Обычно концентрация, отражающие 5 - 6 раз Kd используется чтобы убедиться, что все привязки сайтов насыщенных30. Другой подход призван принести высокий коэффициент всего к неспецифические привязки, выбрав лиганд концентрации ниже Kd31 и сохранение лиганд решение в то же время. Этот подход особенно полезен, когда сайт связывания очень обильные в исследуемых тканей, поскольку концентрации высокой лиганд повысит вероятность oversaturating autoradiograms, как дела [3H] HOCPCA и ГОМК высокоспецифичные Связывание сайтов9. Кроме того для того, чтобы эффективно маркировать все население целевых белков, лиганд идеально следует связать всех возможных целевых конформации. Особенно в рецептор авторадиографии использование агонистов только может выявить частичное количество всего рецепторов, поскольку некоторые могут присутствовать в государствах низкого сродства агонист. В противоположность этому нейтральные антагонисты наиболее часто отображения сродство для всех рецепторов государств26,-29.

Кроме того эксперименты привязки обычно выполняются в условиях равновесия привязки. Таким образом, время, необходимое для достижения равновесия привязки в желаемой экспериментальных условиях (фиксированная лиганд концентрации, буфера и температуры) должны определяться в экспериментах ассоциация для обеспечения равновесия привязки в сферу эксперимент4,23,30. После инкубации лиганд, несвязанных лиганд смывается несколько инкубаций с аналитического буфера и обычно следуют промывка в дистиллированной H2O. сигнал шум соотношения могут быть оптимизированы, регулируя температуру и время, в зависимости от диссоциации лиганд26,30,31.

Radioligands может отображать привязки-биологические материалы, то есть, без конкретной привязки. Лиганд привязки в клетчатых компонентов за исключением намеченной цели определяется как неспецифическим привязки. При наличии конкурирующих немаркированных лиганд, ориентированном на том же сайте привязки лиганд оценивать вклад неспецифических привязки на общую сумму лиганд привязки. Нерадиоактивные соединения (буек) поставляется в 10,000-fold избыток, он занимает сайт связывания и лиганд может только привязать к сайты26,,3132-целевой. Самое главное немаркированных соединение должно быть различной химической структуры чем лиганд так как это снижает риск перемещения как конкретных, а также неспецифические привязки23. Неспецифическая привязки, возникающих из привязки к мембранам может быть серьезной проблемой, особенно в случае довольно липофильных radioligands. В некоторых случаях обширные Стиральная процедуры может удалить связанный лиганд-рецептор и таким образом улучшить конкретные привязки соотношения29.

При выборе аналитического буфера, важно учитывать влияние ионной силы и pH на взаимодействие лиганд цели. Особенно электростатического взаимодействия полярных лигандов и гидрофильных компонентов привязки сайтов находятся под влиянием ионной силы буфера. Таким образом добавки с моновалентная или двухвалентной ионов может повлиять эффективного соответствия постоянной23,33. Если состав оптимального буфера для изученных лиганд целевого взаимодействия неизвестен, различные общие буфера следует изучить в пилотных экспериментов. Буферы могут быть дополнены антиоксиданты например аскорбиновой кислоты и ингибиторы унижающего достоинство ферменты29,34. Кроме того ионизации отдельных групп в пределах привязки сайта или на себя лиганд зависит от рН и имеет критические последствия на константу равновесия привязки, кинетическая скорость константы и неспецифической привязки23,33. Например зондирование высокоспецифичные ГОМК привязки сайта с различными ГОМК radioligands прекрасно иллюстрирует важность pH на этой цели привязки (рис. 6). Характеризуя оптимальный рН для взаимодействия лигандов рецепторов может также дать подсказки о важности цели по отношению к его биологическое значение.

Еще одним важнейшим фактором в цифровой авторадиографии является время экспозиции, то есть, время, необходимое для достижения поддающихся количественной оценке autoradiograms, подвергая разделов радиоизотопами ткани для фосфора изображений пластины. Оценки основаны на количество радиоактивности в образце, энергии и полувыведения изотопа, а также нужное соотношение сигнал шум. В частности длительное время результаты воздействия в насыщенных образов и высокий фоновый сигнал. Повышенный фон сигнала может быть уменьшена хранения кассет в средах свинца экранированный чтобы избежать космическое излучение в1,4. Тем не менее если достигаются оптимальным autoradiograms, образца могут быть представлены несколько раз, условии, что фиксируется комплекс лиганд цель и период полураспада радионуклида позволяет это.

Люминофор изображений пластины могут быть повторно использованы и имеют долгий срок службы когда обрабатываются правильно, то есть, следует избегать сгибания и плиты должны храниться в сухом помещении. Обработки светомассы изображений пластины руководствуются их чувствительность света и космического излучения. Таким образом важно стереть пластину перед каждым использованием с целью минимизации фонового сигнала. Подверженности радиоизотопами ткани секций изображений плит делается в излучения экранированный кассеты полностью лишенный свет. При передаче пластину сканера в конце времени экспозиции, любой освещенности также следует избегать как даже короткий контакт с белым светом уменьшает накопленные сигнала. Кроме того плиты должны быть отсканированы сразу же после удаления образца чтобы избежать затухания сигнала. Недостаток фосфора изображений пластины является потенциальным появление артефактов и остаточного «призрак изображений» после повторного использования плит1.

Работа с тритием требует воображения пластин без защитного покрытия, чтобы позволить низкой энергии излучения для достижения фосфора кристаллы. Таким образом, тритий чувствительных светомассы изображений пластины более чувствительны к загрязнения или повреждения вследствие неправильной обработкой. После того, как загрязненные, тритий чувствительных пластины не могут быть очищены и должны быть заменены. Фиксация комплекса лиганд цели с PFA паров уменьшает потенциальное загрязнение пластины, удлинение срок его службы. Кроме того обезвоживания тканей после фиксации представляет собой решающий шаг, поскольку трития чувствительных пластины чувствительны к влаге. Из-за деликатного характера тритий чувствительных пластины не должен использоваться для другие изотопы1,4. В отличие от пластины для высоких энергий изотопов, таких, как йод-125 являются более надежными и их поверхности даже могут быть очищены вытирая с 70% этиловом спирте.

Традиционно радиочувствительным пленка используется для пространственной записи радиоактивного распада. В то время как можно получить изображения с высоким разрешением, радиоавтография фильм имеет ряд ограничений. Помимо необходимости опасных химических веществ и фотолаборатории для развития рентгеновской пленки характеризуется узкий динамический диапазон. Таким образом это может быть необходимо подвергать радиоизотопами разделы неоднократно с различным временем экспозиции для достижения количественно-насыщенных образов35. Кроме того рентгеновской пленки обладает ограниченной чувствительности, что приводит к постоянной экспозиции раз для образца, помечены с изотопами низкой энергии, т.е. распад трития может потребоваться несколько месяцев воздействия. Низкая чувствительность, в сочетании с небольшой диапазона линейной делает технику очень много времени, особенно когда оптимальный пробирного условия должны быть определены первые1,35.

С развитием светомассы изображений пластины некоторые из этих ограничений были рассмотрены35,,36-37. Визуализации пластины служат для временного хранения изображения радиоактивного распада, представляющий пространственное расположение лиганд в образец ткани. 2+ Photostimulable BaFBr:Eu фосфора кристаллы используются для захвата радиоактивного энергии, излучаемой образца, как высоких энергий излучения (например, рентген, гамма или бета-частицы) приводит к возбуждению ЕС2+ ЕС3+ и последующего треппинг выпустила электрона в люминофор решетки4,37. Разоблачение пластины изображений в видимом или ИК свет меняет реакцию, т.е., захваченных электрон освобождается и во время преобразования ЕС3+ + ЕС2люминесценция раздается. Испускаемого света пропорциональна количество радиоактивности и его обнаружения на фотоумножителе позволяет создавать цифровые autoradiogram37. Эта система обеспечивает увеличение чувствительности, сопровождается заметное сокращение время экспозиции от месяца до3дней. Кроме того линейный динамический диапазон значительно увеличивается, что снижает вероятность перенасыщенного изображения. Линейность дается в течение четырех-пяти порядков и неоднократно проверено3,,3536,,3738. Хотя фильм авторадиографии по-прежнему обеспечивает улучшенный пространственным разрешением, усилия в технология сканирования привели к улучшению резолюции от 300 до 25 мкм (размер пикселя), позволяя подробно дифференциация между анатомических областей3. В целом фосфора изображений пластины способствуют приобретение цифровой autoradiograms как за счет расширения диапазона линейной и чувствительность. Время сокращение воздействия и упрощения разработки техники значительно приводят к снижению времени для анализа данных, позволяя более высокую пропускную способность.

По сравнению с авторадиографии, полезных фармакологических параметров, таких как близость и плотности, также часто характеризуются применения radioligands в ткани огневки обязательных анализов. Этот метод имеет преимущество производства результаты путем измерения испускаемого β радиоактивного распада с жидким Сцинтилляционный детектор в эффективным образом2. Выполняется в нескольких хорошо подход, например, в 96-луночных микротитровальных плит, такие анализы являются полезными для скрининга библиотек соединений и большее количество концентрации зависимых отношений. Кроме того, проведение анализа насыщенность с этой установки зачастую является более осуществимым по сравнению с авторадиографии, который отображает риск перенасыщенного изображения с высоким лиганд концентрации. Однако выполняя гомологичных перемещения лиганд фиксированной низкой концентрации с нерадиоактивные лигандов для получения Kd и BМакс обходит проблему перенасыщенного изображения (рис. 6)22. Гомогенат трутневых привязки и авторадиографии производить аналогичные оценки для констант сродство лиганда в то время как плотность ткани протеина интереса может быть недооценена в привязке огневки. Таким образом было предложено, что нарушения клеточной мембраны сочетанной с гомогенизации ткани может привести к потере рецепторов или изменены обязательных условий3,33. Кроме того ошибки в рассечение тканей может производить гомогенатах загрязненных тканей мозга прилегающих регионов. В сравнении даже сложные привязку шаблонов в небольших ядер, визуализировать и дифференцируемыми вследствие анатомических разрешением авторадиографии3,33.

Иммуногистохимия также анатомически визуализирует распределение протеина интереса. Этот метод способен производить изображения с высоким разрешением анатомические, как дискретные ткани компоненты могут быть определены на клеточном уровне и даже субклеточном уровнях с помощью электронной микроскопии. Уровни выражения оцениваются на основе интенсивности окрашивания. Тем не менее абсолютное количественная оценка уровня выражения трудно из-за отсутствия соответствующих справочных стандартов39. Кроме того иммуногистохимия зависит от наличия селективный, хорошо проверенные антитела, который часто является проблемой в исследованиях рецепторов.

Прежде чем принять решение о выполнении в vitro авторадиографии, несколько соображений должны быть сделаны. Во-первых подготовка посмертные тканей, включая вырезание а также повторного замораживания и оттаивания может повлиять на сохранение привязки сайтов2. Кроме того метод зависит от наличия адекватных лиганд, которая показывает высокое сродство и избирательности для целевого объекта в вопрос2. Лиганд не следует отображать значительные привязки сайтов-цели, и он также должен продемонстрировать благоприятные кинетическая профиль. Это необходимо, потому что комплекса лиганд цели должны оставаться нетронутыми в рамках эксперимента. Кроме того когда существуют подходящие нерадиоактивные соединений, введение радионуклида могут стать решающим фактором. Таким образом молекулы интереса должны быть оборудованы подходящие функциональные группы для эффективного radiolabelling, который обеспечивает производство radioligands с достаточно высокой удельной активности и химическая стабильность40. Еще одним недостатком в vitro авторадиографии является, что метод только позволяет использовать животного однажды. Более элегантно является расширение в vivo imaging методы, такие как позиции эмиссионная томография (ПЭТ), что позволяет повторное сканирование же животных и определение размещение и характеристики динамической привязки. PET особенно ценно для изучения высших млекопитающих41 и оптимизации дозы в доклинические исследования 42,,4344.

Несколько модификаций autoradiographic техники расширить его применение, как с точки зрения характеристик фармакологических задач в государствах здоровых и больных, а также обнаружения наркотиков и развития. Во-первых последние достижения в технологии визуализации привели к развитию реального времени авторадиографии. Детекторы газа α/β-частиц устраняет потребность в визуализации пластин или фильм путем прямого измерения распады, тем самым производить быстрый цифровой autoradiograms45.

Кроме того в пробирке авторадиографии позволяет исследования функциональности G белка-рецепторы (GPCR) поверх информацию о их анатомических распределение в тканях трупа. Этот вариант предполагает инкубации разделов ткани с радиоактивно меченных аналог гуанозинтрифосфатом (GTP), т.е. [35S] гуанозина 5'-γ-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), вместе с Нерадиоактивные агонист GPCR. Когда агонист связывает и вызывает ответ GPCR, включение [35S] GTPγS могут быть локализованы и количественно через авторадиографии, который отражает только активированные рецептор населения2,46,47 .

Ex vivo авторадиографии представляет другую версию метода, которая оценивает региональные привязки лиганд после администрации живой экспериментальных животных. После жертвоприношения животных, cryosectioning ткани в вопрос, и результат autoradiographic воздействия в autoradiograms, которые отражают лиганд привязки в vivo2. Ex vivo авторадиографии обычно используются в рамках открытия и разработки программ наркотиков для того, чтобы получить информацию о фармакокинетические характеристики свинца соединения, то есть, его поглощения, распределение, метаболизм и выведение (ADME) . Авторадиографии особенно всего тела обеспечивает представление о распределение лекарств для всех органов и тканей. Однако определение привязки неспецифической и количественной оценки является более сложным по сравнению с в vitro авторадиографии из-за возможных метаболизм и деградации лиганд и никаких средств для вымывания несвязанные лигандом48.

Авторадиографии также используется для предварительного тестирования и характеристика ПЭТ лигандов4. Высокоэнергетические радионуклидов углерода-11 и фтора-18 наиболее часто используются для PET лигандами. PET это видно, неинвазивная приложение для radioligands, потому что количественно 3D изображения лиганд, привязки в живых животных могут быть получены11,40,49.

В vitro авторадиографии с использованием люминофора, визуализации пластины представляет ценные пробирного метод для фармакологическая характеристика лиганд целевого взаимодействия. Метод создает воспроизводимые результаты по занятости сравнительно быстрой и простой протокол после того, как будут созданы условия для оптимального пробирного. Анатомического распределения протеина интереса определяется в пределах своей родной микроокружения, который позволяет изучение физиологических, фармакологические и патологических роль здорового и больного посмертные ткани экспериментальных животных, а также люди2,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Acknowledgments

Работа была поддержана Фондом компании «Лундбек» (Грант R133-A12270) и Ново Нордиск Foundation (Grant NNF0C0028664). Авторы благодарят доктор Aleš Marek на поставку лиганд [3H].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

Нейробиологии выпуск 145 лиганд радиоактивные радиоавтография соответствие выражение фосфора изображений HOCPCA гамма-оксимасляная кислота ГОМК НК-382 количественные фармакологии
Авторадиографии как простой и мощный метод для визуализации и характеристика фармакологического целей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter