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कोलेटोट्राइचुम फिओरिनिआ पानी और क्लोरोफॉर्म आधारित ब्लूबेरी और क्रैनबेरी पुष्प निष्कर्षों में विकास

Published: April 12, 2019 doi: 10.3791/58880
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Plant Biology, P. E. Marucci Center for Blueberry and Cranberry Research and Extension, Rutgers University

Summary

यहां, bioassays एक कवक रोगज़नक़ के विकास पर नजर रखने के लिए डिज़ाइन किया गया, Colletotrichum फिओरिनी, ब्लूबेरी या क्रैनबेरी पुष्प निष्कर्षों की उपस्थिति में कांच coverslips पर वर्णित हैं । पानी, क्लोरोफॉर्म, और क्षेत्र वर्षा जल आधारित पुष्प निष्कर्षण तकनीकों कैसे इस जानकारी को लागू किया जा सकता है में के रूप में अच्छी तरह से अंतर्दृष्टि के रूप में विस्तृत कर रहे हैं ।

Abstract

सही ढंग से खिलने की अवधि के फ़ीनोलॉजी और कवक फल सड़ रोगजनकों, पुष्प निष्कर्षण विधियों और coverslip bioassays पर पुष्प रासायनिक cues के लौकिक गतिशीलता की निगरानी करने के लिए colletotrichum फियोरिनीका उपयोग विकसित किया गया । ब्लूबेरी और क्रैनबेरी में, इस रोगज़नक़ की वजह से भूमिका फूल संक्रमण के प्रारंभिक चरणों में खेलने के ब्लूम अवधि के दौरान कवकरोधकों को लागू करने से बेहतर नियंत्रित किया जाता है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे पुष्प अर्क (FE) पानी का उपयोग कर प्राप्त किया गया, क्लोरोफॉर्म, और क्षेत्र वर्षा जल आधारित इसी ग्लास coverslip bioassays में बाद में उपयोग के लिए तरीके । प्रत्येक फे की जानकारी का एक अलग सेट प्रदान करने के लिए सेवा: सी fioriniae की प्रतिक्रिया पानी में पुष्प रासायनिक cues (जल आधारित), फूल और फलों की सतह waxes के लिए रोगज़नक़ प्रतिक्रिया (क्लोरोफॉर्म आधारित), और क्षेत्र आधारित निगरानी के लिए जुटाए एकत्र पुष्प वर्षा का पानी, एक कृषि सेटिंग के लिए विट्रो टिप्पणियों में बढ़ रहा है । FE मोटे तौर पर या तो पानी के रूप में वर्णित है या chloroform आधारित, एक उपयुक्त जैव आमापन के साथ इन दो सामग्रियों के बीच अंतर्निहित मतभेदों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए वर्णित है । वर्षा का पानी है कि फूलों से चला था प्रत्येक फसल के लिए अद्वितीय उपकरणों में एकत्र किया गया था, लचीलापन और अंय फसल प्रणालियों के लिए इस दृष्टिकोण के आवेदन के लिए alluding । Bioassays जल्दी, सस्ती, सरल कर रहे हैं, और विभिंन स्रोतों से उत्तेजक पुष्प यौगिकों की उपस्थिति के बारे में spatioलौकिक और साइट विशिष्ट जानकारी उत्पंन करने की क्षमता प्रदान करते हैं । यह जानकारी अंततः बेहतर रोग प्रबंधन रणनीतियों को सूचित करेंगे, के रूप में FE संक्रमण के लिए आवश्यक समय में कमी, इस प्रकार बढ़ती मौसम पर रोगज़नक़ संक्रमण के लिए जोखिम को बदलने में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

Introduction

कोलेटोट्राइकम फिओरिनिआ दोनों highbush ब्लूबेरी (vaccinium कोरिम्बोसम एल) और बड़े अमेरिकी क्रैनबेरी (वी. मैक्रोकार्पन ऐटन)1,2के एक फल सड़ांध का कारण बनता है । इस रोगज़नक़ हाल ही में C. acutatum प्रजातियों परिसर3,4,5,6 से चित्रित किया गया था और ब्लूबेरी एंथ्रेक्नोस और क्रैनबेरी फल सड़ांध के एक सदस्य का एक कारण एजेंट है जटिल, दुनिया भर में कई अंय पौधों की बीमारियों के कारण के अलावा7। C. फिओरिनी एक अव्यक्त, hemibiotrophic जीवन शैली8, खिले और लक्षण विकास के दौरान होने वाले संक्रमण के साथ जब तक फल परिपक्वता के अंतिम चरण में है नहीं बन रहा है9। ब्लूबेरी और क्रैनबेरी में, फल सड़ांध केवल पर्याप्त रूप से खिल अवधि के दौरान किए गए फंजीसाइड अनुप्रयोगों के साथ नियंत्रित किया जाता है । सुप्त ब्लूबेरी पुष्प कली में रोगज़नक़ के साथ10 तराजू और खिले के दौरान sporulates । Conidia बारिश के माध्यम से चंदवा में स्थानांतरित कर रहे है-छप संवितरण11,12 और संरोप buildup दृढ़ता से खिल अवधि13को सहसंबद्ध किया गया है । फूलों की मेजबानी के लिए Colletotrichum प्रजातियों की प्रतिक्रिया vacciniumकरने के लिए अद्वितीय नहीं है, फूल के रूप में खट्टे पोस्ट ब्लूम फल ड्रॉप (pfd)14 के रूप में अच्छी तरह से स्ट्रॉबेरी एंथ्रेक्नोज15के महत्वपूर्ण घटक हैं, दोनों मामलों में कारण जीवाणु को बीजाणुजन के लिए । इन सभी मामलों के प्रभावी तरीकों के लिए की जरूरत है पर प्रकाश डाला पुष्प रासायनिक cues के सी fioriniae और अंय रोगजनकों कि खिल के दौरान संक्रमित पर अस्थाई गतिशीलता का मूल्यांकन । यहां वर्णित विधियों द्वारा प्रदान की गई अंतर्दृष्टि तेजी से अधिक मूल्यवान होती जा रही हैं ।

इस प्रोटोकॉल पुष्प उद्धरण (fe) खरीद के तरीकों और गाइड सी fioriniae के मूल्यांकन के लिए fe प्रतिक्रियाओं ग्लास coverslip bioassays15,16के माध्यम से । पुष्प निष्कर्षण तकनीकों दो मुख्य प्रकार में टूट रहे हैं; पानी आधारित extractions (सक्रिय-fe, निष्क्रिय (पास-fe), और क्षेत्र वर्षा जल आधारित (rw-fe)), और क्लोरोफॉर्म आधारित (ch-fe)17 extractions । जल-आधारित निष्कर्षण जल के निरीक्षण के लिए पुष्प रासायनिक संकेतों की अनुमति देता है । ये जुटाए cues संक्रमण अदालत के संभावित महत्वपूर्ण घटक हैं, के बाद से FE संक्रमण के लिए आवश्यक नमी प्रदान करने के लिए इसके अलावा16, इंफेक्शन की गति बहुत बढ़ जाती है । इसके अतिरिक्त, वे पुष्प उत्तेजना के रूप में एक और अधिक प्राकृतिक स्थिति का प्रतिनिधित्व wetting के दौरान चंदवा भर धोया जा सकता है-घटनाओं के रूप में पहले ब्लूबेरी और अंय फसल प्रणालियों14,16में मनाया । क्लोरोफॉर्म आधारित पुष्प निष्कर्षण (ch-FE) भी बहुमूल्य जानकारी प्रदान करने के लिए रोगज़नक़ प्रतिक्रिया से संबंधित की मेजबानी की सतह17,18, कोनिडिया के प्रारंभिक विकास चरणों को स्पष्ट एक बार अतिसंवेदनशील पर जमा मेजबान अंगों (यानी फूल, अंडाशय और फल का विकास) । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए मेजबान सतह के वैक्स में मौसमी परिवर्तनों के लिए रोगज़नक़ प्रतिक्रिया की निगरानी भी की जा सकती है । तदनुसार, bioassays या तो पानी आधारित FE या chloroform आधारित FE के साथ काम करने के लिए इन दो सामग्रियों के बीच अंतर्निहित मतभेदों को कम करने के लिए सिलवाया रहे हैं ।

Bioassays से उत्पंन आंकड़ों से पता चला कि पानी आधारित extractions क्लोरोफॉर्म आधारित extractions जहां एक निश्चित appressorial प्रतिक्रिया थी, इसलिए कई यौगिकों फंसाते से माध्यमिक conidiation के उच्च स्तर को उत्तेजित FE में मौजूद है । दिलचस्प है, इन विकास प्रतिक्रियाओं के दोनों देखा जब वर्षा का पानी है कि ब्लूबेरी और क्रैनबेरी फूलों के बंद चला था, कई उत्तेजक यौगिकों का संकेत फूल की सतह से धोया जा सकता है । इस प्रकार, पुष्प उत्तेजना के लिए निगरानी एक कृषि प्रणाली में रोगज़नक़ सफलता की संभावना में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा ।

इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य पुष्प रासायनिक cues के जवाब में कवक संयंत्र रोगजनकों पर आधारभूत जैविक जानकारी पैदा करने के लिए एक पद्धति प्रदान करने के लिए है, साथ ही तरीके है कि इस पुष्प जानकारी का उपयोग करने में सहायता कर सकते है शुरुआत के रूप में साइट विशिष्ट रोग प्रबंधन और निर्णय लेने की प्रक्रिया ।

Protocol

1. कवक आइसोलेट्स और बीजाणु निलंबन

  1. एक स्वाभाविक रूप से संक्रमित मेजबान19से कोलेटोट्राइकम फिओरिनिआ को अलग । फिर, मकई भोजन आगर (सीएमए) slants पर स्वच्छ संस्कृतियों की दुकान । प्लेस संस्कृति के प्लग (CMA तिरछाड़ से) एक मानक प्लास्टिक सेल संस्कृति डिश पर (9 सेमी व्यास) युक्त या तो स्पष्ट किया V8 रस आगर (cV8A) (मिलर १९५५ से संशोधित), या गैर-स्पष्ट V8 रस आगर (V8A)20। जब कालोनियों sporulate के लिए शुरू, लकीर कोनिडिया (नारंगी कोनिडिया आम जनता) पर एक और cV8A या V8A युक्त कोशिका संस्कृति पकवान (एक मानक बाँझ पाश के साथ) एक उच्च घनत्व sporulate उत्पादन के लिए संस्कृति.
    नोट: कवक संस्कृतियों और/या bioassays को दूषित करने की संभावना को कम करने के लिए एक laminar प्रवाह हुड में कवक के साथ किसी भी प्रोटोकॉल कदम किया जाना चाहिए ।
  2. विकास के 7 दिनों के बाद, एक मानक बाँझ पाश का उपयोग कर उच्च घनत्व संस्कृति से कोनिडिया की एक छोटी राशि इकट्ठा (हल्के से कोनिडिया द्रव्यमान के लिए पाश छू द्वारा) और एक 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इस हलचल के साथ 10 मिलीलीटर बाँझ विआयनीकृत पानी (sdw). भंवर 10 एस के लिए यह नमूना है, तो एक मानक पिपेट का उपयोग कर नीचे और कई बार नीचे डुबकी नमूना मिश्रण ।
  3. फिर, hemocytometer पर vortexed नमूना की एक बूंद जगह और बीजाणु सांद्रता का अनुमान है । Hemocytometer पर 5-10 क्षेत्रों की गणना, औसत प्राप्त है, और औसत गुणा उचित कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा (यानी १०,०००), इस प्रकार प्रति मिलीलीटर sdw conidial एकाग्रता प्राप्त.
  4. फिर एक खंड का उपयोग कर (v)/एकाग्रता (c) समीकरण (v1● [c1] = v2● [c2]) समायोजित (sdw के साथ) के लिए १.० X 105 एक 5 मिलीलीटर अंतिम मात्रा के साथ sdw के प्रति एमएल कोनिडिया. यह बीजाणु निलंबन के रूप में संदर्भित किया जाता है और केवल तुरंत बनाया है या तो bioassay में उपयोग करने से पहले ।

2. सक्रिय, जल आधारित पुष्प अर्क (active -FE)15,16

नोट: पूरक चित्रा 1, पूरक चित्रा 2, पूरक चित्रा 3, और पूरक फिल्म 1देखें.

  1. ध्यान से हाथ-लीजिए ब्लूबेरी (अप्रैल-मई) और क्रैनबेरी (जून-जुलाई) फूल क्षेत्र में अपने संबंधित पीक खिलता के दौरान (पूरक चित्रा 1) । मानव त्वचा के तेल संदूषण के साथ-साथ पुष्प किस्मों के बीच क्रॉस संदूषण को बाधित करने के लिए नमूनाकरण स्थानों (किस्मों/भौतिक स्थानों) के बीच नाइट्रिले दस्ताने पहनें और बदलें । जगह या तो ब्लूबेरी या क्रैनबेरी फूल (एक ही स्रोत से) प्लास्टिक की थैलियों में (एक १०० x १५० mm बैग भरें) और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर सर्द एक बार फूल एकत्र कर रहे हैं ।
    नोट: सक्रिय- निष्कर्षण Leandro एट अलसे संशोधित किया गया है । (२००३) 16.
  2. निष्कर्षण से पहले, किसी भी बिगड़ा, क्षतिग्रस्त, रोगग्रस्त फूलों को हटा दें, तो स्वस्थ फूलों का उपयोग अंडाशय, sepals और घुमावदार संदंश (४५ ° चिमटी) और त्यागने के साथ पेडुलस हटा दें । सक्रिय- extractions के लिए केवल शेष अंगों (कोरोला, कलंक, शैली और stamen) का उपयोग करें । कट जाली (१५० x १५० मिमी) और एक 7 x 7 मिमी कीप के भीतर जगह है, एक साफ ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जगह है, और अलग सेट ।
  3. एक मोर्टार में 9 भागों SDW (1 wt: 9 vol अनुपात) के लिए 1 भाग संसाधित फूलों का मिश्रण । धीरे से 30 एस के लिए एक मूसल के साथ पीस (पूरी तरह से नमूनों को चूर नहीं करने के लिए ध्यान रखना) । उत्पन्न विकृति जिसके परिणामस्वरूप लुगदी तैयार जाली/कीप के माध्यम से और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (५० मिलीलीटर) में एकत्रित होता है । स्वच्छ या ९५% EtOH और गर्म चल रहे पानी के साथ प्रत्येक निष्कर्षण के बीच नए मोर्टार/
  4. एक वैक्यूम निस्पंदन उपकरण तैयार करें: बुचनेर कीप, वैक्यूम फिल्टर एरलेम्येर फ्लास्क (१,००० मिलीलीटर क्षमता तक), ५५ मिमी सर्किल फिल्टर पेपर, और निर्वात नली को इकट्ठा/ एक उचित आकार के लिए फिल्टर पेपर जोड़ें कीप और फ्लास्क के ऊपर जगह है, तो निर्वात नली के माध्यम से एक पानी/
  5. इसके अलावा ८,०५५ एक्स जीपर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा ब्लूबेरी पुष्प निष्कर्षों को स्पष्ट तैयार वैक्यूम फिल्टर उपकरण में बंद supernatant डालो, वैक्यूम स्रोत पर बारी, फिल्टर supernatant, तो एक नया सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (५० मिलीलीटर) में कुप्पी सामग्री डालो । ९५% EtOH और गर्म चल रहे पानी के साथ प्रत्येक निस्पंदन के बीच सभी उपकरण घटकों को साफ । एक ०.२२ μm ताकना आकार, एसीटेट स्टरलाइज़िंग के साथ अनुकूलित एक सिरिंज के माध्यम से आगे फिल्टर, एक नया अपकेंद्री ट्यूब (५० मिलीलीटर) में फिल्टर ।
    1. क्रैनबेरी पुष्प निष्कर्षों के लिए, फिल्टर कागज के माध्यम से केवल वैक्यूम फिल्टर और एक नया अपकेंद्रक ट्यूब (५० मिलीलीटर) में कुप्पी सामग्री डालना ।
  6. परिणामस्वरूप तैयारी सक्रिय-पुष्प निकालने (सक्रिय-FE) के रूप में संदर्भित किया जाता है । सभी जल आधारित पुष्प अर्क (सक्रिय, निष्क्रिय, वर्षा का पानी संग्रह) में-20 डिग्री सेल्सियस पर 5-50 मिलीलीटर aliquots में प्रयोगात्मक उपयोग तक स्टोर । प्रतिकृति प्रदान करने के लिए एकाधिक नमूनों (प्रति नमूना प्रकार कम से कम 3 extractions) के साथ extractions दोहराएं ।

3. निष्क्रिय , जल आधारित पुष्प अर्क ( पास -FE) 16

नोट: पूरक मूवी 2देखें ।

  1. हाथ पूरे ब्लूबेरी फूल (ऊपर के रूप में ५० g) इकट्ठा, और इकट्ठा करने के बाद सर्द । निष्कर्षण से पहले, किसी भी खराब, क्षतिग्रस्त, रोगग्रस्त फूलों को हटा दें और केवल बरकरार फूल से पेड़लों को हटा दें । सर्द तैयार नमूनों जब तक निष्क्रिय निष्कर्षण प्रणाली, नीचे वर्णित है, जगह में है ।
  2. कुल्ला सभी घटकों के साथ प्रयोग करने से पहले ९५% इथेनॉल (EtOH) और गर्म पानी चल रहा है संदूषण को रोकने के लिए (प्लास्टिक मेष चादर, दो प्लास्टिक की टोकरी, ग्लास रोटी पैन, और पंप धुंध बोतल) । इसके अलावा (चरण २.२ में) ऊपर वर्णित के रूप में प्रत्येक निष्कर्षण के लिए एक 4 परत जाली/कीप/50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार, और अलग सेट ।
  3. छलनी तैयार करें: एक प्लास्टिक मेष टोकरी (११४ x १०२ मिमी) में एक प्लास्टिक मेष शीट (उर्फ स्पष्ट पट्टी मैट) प्लेस । एक गिलास रोटी-पैन (१२७ x २२९ मिमी) में एक दूसरे, समान, मेष टोकरी उल्टा (औंधा) प्लेस (SDW में बैठे फूलों से बचने के लिए) और जगह जाल टोकरी ऊपर बास्केट युक्त चादर । छलनी में तैयार फूलों की ५० ग्राम जोड़ें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, छोटे परीक्षण ट्यूब [सफाई] टोकरी मूल रूप से इस्तेमाल प्लास्टिक मेष टोकरी के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है (पुराने, हरे, स्ट्रॉबेरी मेष पिंट टोकरी अक्सर स्रोत के लिए मुश्किल हैं) ।
  4. समान रूप से २५० मिलीलीटर के साथ धुंध फूल एक पंप धुंध बोतल का उपयोग और कांच रोटी-पैन में अपवाह पर कब्जा । इसके बाद तैयार जाली/कीप के माध्यम से साफ अपकेंद्रितनली में छलनी को छानना । परिणामस्वरूप तैयारी निष्क्रिय-पुष्प निकालने (पास-FE) के रूप में संदर्भित किया जाता है; ऊपर (चरण २.६) के अनुसार स्टोर ।
  5. ९५% EtOH और गर्म चल रहे पानी के साथ प्रत्येक निष्कर्षण के बीच सभी घटकों को साफ । दोहराने extractions एकाधिक नमूनों के साथ प्रतिकृति प्रदान करने के लिए (कम 3 प्रति नमूना प्रकार) ।

4. क्लोरोफॉर्म आधारित पुष्प अर्क (ch-FE) 17

  1. ऊपर (कदम २.१) के अनुसार ब्लूबेरी और क्रैनबेरी फूल लीजिए, और निष्कर्षण के लिए फूल तैयार (कदम २.२, बिना जाली/कीप तैयारी) । तैयार फूल का उपयोग करने से पहले जब तक प्रसर्पित रखें ।
    1. किसी भी क्लोरोफॉर्म के साथ किया काम सुरक्षा कारणों के लिए एक धूआं हुड में किया जाना चाहिए । इस सामग्री की तैयारी शामिल है/कांच के बने पदार्थ, निष्कर्षण प्रक्रियाओं, और जैव आमापन चालकता (ch-FE का उपयोग कर कदम) ।
  2. साफ सभी घटकों के साथ ९५% EtOH दो बार, तो क्लोरोफॉर्म के साथ दो बार प्रत्येक निष्कर्षण के लिए संदूषण को रोकने के लिए: लड़ी पिरोया ग्लास संस्कृति ट्यूबों, 2 ग्लास यूरिन, छोटे स्टेनलेस स्टील स्क्रीन, और एक [ग्लास] स्नातक सिलेंडर । अलग सेट ऊपर से नीचे सूखी । कुल्ला पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (PTFE) ९५% EtOH केवल (क्लोरोफॉर्म टोपी की बाहरी सामग्री को नुकसान होगा) के साथ दो बार लाइन में खड़ा है और सूखी करने के लिए अलग सेट ।
  3. मिश्रण 1 भाग संसाधित फूल 9 भागों क्लोरोफॉर्म (1 wt: 9 vol अनुपात) एक बीकर में (फूल तो क्लोरोफॉर्म), धीरे 30 एस के लिए चक्कर आना, और दूसरे बीकर में एक स्टेनलेस स्टील स्क्रीन के माध्यम से तनाव । कांच संस्कृति ट्यूब (10-15 मिलीलीटर) में दूसरा बीकर से ch-fe डालो और ptfe टोपी निलिखत । वाष्पीकरण को रोकने के लिए कैप को पैराफीक् शन से लपेटें ।
  4. यह तैयारी क्लोरोफॉर्म आधारित पुष्प उद्धरण (ch-FE) है । अंधेरे में स्टोर नमूना (प्रकाश क्षरण को कम करने के लिए) 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगात्मक उपयोग तक. दोहराने extractions एकाधिक नमूनों के साथ प्रतिकृति प्रदान करने के लिए (कम 3 प्रति नमूना प्रकार) ।

5. ब्लूबेरी फूलों से वर्षा का पानी का संग्रह (बी आर डब्ल्यू-FE)16

नोट: ब्लूबेरी पुष्प वर्षा जल संग्रह डिवाइस कनेक्शन एडाप्टर के साथ एक एयर स्प्रे गन डिस्पोजेबल पेंट स्प्रे कप के होते हैं (कप: महिला धागा, एडाप्टर: पुरुष धागा पुरुष के लिए), ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (polypropylene), parafilm, और प्लास्टिक लेपित तारों ( मानक टेलीफ़ोन वायर, व्यक्तिगत आंतरिक वायर किनारा सामग्री) ।

  1. एक ब्लूबेरी झाड़ी के भीतर एकाधिक स्थानों का चयन करें वर्षा जल संग्रह उपकरणों बनाने से पहले फूलों के बंद चलाने पर कब्जा करने के लिए । ये सीधे पुष्पक्रम (फूल) के तहत बुश के बहुत आधार (मुकुट) में शामिल हैं । यह नीचे वर्णित डिवाइस अनुलग्नक के लिए इस्तेमाल किया छेद के आकार हुक्म होगा, के रूप में, के रूप में चयनित स्थानों पर उपजा (1-5 सेमी से लेकर) के रिकॉर्ड व्यास ।
  2. प्रत्येक चयनित स्थान के लिए एक संग्रह डिवाइस बनाएं । पहले एक स्प्रे कप के तल पर एक छेद ड्रिल (जहां लड़ी पिरोया खोलने की ओर कप घटता) इसी स्टेम व्यास के लिए, एक कदम के साथ एक ड्रिल प्रेस से जुड़ी बिट । फिर, थिहोल के ऊपर से एक सीधी रेखा को स्प्रे कप के मुँह में काट लें । ड्रिल 4 समान दूरी छेद (काफी बड़ा प्लास्टिक लेपित तार धागा करने के लिए), स्प्रे कप के मुहाने पर, और प्लास्टिक लेपित तारों के एक छोर एक छोर मुक्त छोड़ देते हैं ।
  3. एक ५० एमएल सेंट्रीफ्यूज टोपी ढक्कन में पेंट स्प्रेयर कप एडाप्टर धागा करने के लिए काफी बड़ा छेद ड्रिल । रिसाव को रोकने के लिए parafilm के साथ एडाप्टर थ्रेड सील करें । यह दोनों सेंट्रीफ्यूज टोपी और स्प्रेयर कप के भाग लड़ी पिरोया करने के लिए देते हैं । Mated ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब संलग्न करें ।
  4. दोहराएं चरण 5.3-5.4 चयनित स्थानों के अनुसार एक से अधिक उपकरणों को बनाने के लिए, प्रति नमूनाकरण स्थान की एक ंयूनतम 4 संग्रह डिवाइस ।
  5. उपजी पर फिट करने के लिए ठोके स्प्रेयर कप द्वारा चयनित स्थानों पर उपकरणों का परिनियोजन । स्प्रे कप के किनारे की कटौती की ओर ओरिएंट प्लास्टिक लेपित अंय उपजी से जुड़े तारों का उपयोग कर (फूलों पर गुजर पानी बीमा करने के लिए कब्जा कर लिया है) । एक प्रकार का फल जो वर्षा जल को लीक कर सकता है । (पूरक चित्रा 3, पूरक चित्रा 4, पूरक चित्रा 5, और पूरक चित्रा 6).
  6. लेबल संग्रह ट्यूबों परिनियोजन दिनांक/समय के साथ । एक बारिश के बाद घटना, हटाने और नीचे (ट्यूब) सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के हिस्से की जगह (लेबल तारीख/ (ब्लूबेरी वर्षा जल पुष्प निकालने (बी आर डब्ल्यू-FE)) अंदर और वैक्यूम फिल्टर (चरण 2.4-2.5 में वर्णित निस्पंदन) के रूप में संदर्भित संग्रह ले आओ । ऊपर के रूप में स्टोर (२.६ कदम), जब तक एक पानी में इस्तेमाल किया bioassay आधारित है ।

6. क्रैनबेरी फूलों से वर्षा के पानी का संग्रह (सीबी आरडब्ल्यू-FE)

  1. क्रैनबेरी में पुष्प वर्षा जल संग्रह डिवाइस एक 7 X 7 सेमी polypropylene कीप, ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (polypropylene), parafilm, और 4 मानक, प्लास्टिक लेपित मोड़ संबंधों (प्रति डिवाइस) के होते हैं ।
  2. सबसे पहले, हीट पंचर 8 एक धातु जांच का उपयोग कर कीप के मुंह के चारों ओर (मोड़ संबंधों का व्यास) छेद । 4 छेद में ट्विस्ट संबंधों डालें । एक साफ पार पैटर्न बनाने कि ' छेद विपरीत स्थान के लिए दूसरे छोर देते हैं । लपेटें कीप नीचे-स्टेम parafilm के साथ और अलग सेट ।
  3. एक छेद के लिए काफी बड़ा ड्रिल नीचे डालने के लिए एक कदम-बिट के साथ एक ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज कैप में नीचे स्टेम । तैयार कीप को सेंट्रीफ्यूज कैप में डालें. कई उपकरणों, नमूना स्थान प्रति 4 संग्रह उपकरणों की एक ंयूनतम बनाने के लिए 6.2-6.3 चरणों को दोहराएं ।
  4. चयनित क्रैनबेरी bogs में लेबल (दिनांक/ बड़े करीने से टक दो फूल असर पुष्पक्रम (के रूप में जाना जाता है) पार प्लास्टिक मोड़ संबंधों के तहत । तो खड़ी क्रेनबेरी चंदवा में अपकेंद्री ट्यूब (पूरक आंकड़े 7-8, पूरक फिल्म 3) भेदी द्वारा डिवाइस ओरिएंट ।
  5. वर्षा या उपरि सिंचाई के बाद हटाने और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के नीचे (ट्यूब) भाग की जगह (संग्रह के लेबल की तारीख/ (क्रैनबेरी वर्षा जल पुष्प निकालने (सीबी आरडब्ल्यू-FE)) के अंदर और वैक्यूम फिल्टर (चरण 2.4-2.5 में वर्णित निस्पंदन) के रूप में संदर्भित () के लिए अपवाह लाओ । ऊपर के रूप में स्टोर (२.६ कदम), जब तक एक पानी में इस्तेमाल किया bioassay आधारित है ।

7. bioassay पानी आधारित पुष्प निष्कर्षों का उपयोग15,16 (सक्रिय-fe, दर्रा-fe, rw-fe)

नोट: चित्र 1देखें ।

  1. इस जैव आमापन एक laminar फ्लो हुड में तैयार है । तैयार सामग्री: ट्रिपल कुल्ला गिलास ९५% EtOH और हवा सूखी के साथ coverslips, तो एक तरफ रख दिया । एक मानक प्लास्टिक सेल संस्कृति व्यंजन (9 सेमी) के आंतरिक व्यास के लिए कागज तौलिया डिस्क कट । प्लेस 2 कागज डिस्क के संस्कृति व्यंजन के भीतर परतों और 2 मिलीलीटर SDW के साथ लेना ।
  2. उपरोक्त (स्टेप 1.2-1.4) के अनुसार, एसडीडब्ल्यू स्पोरे सस्पेंशन (सी. फिओरिनिआ) के १.० X 105 कोनिडिया प्रति मिलीलीटर की कम से 5 मिलीलीटर तैयार करें, अलग से सेट करें । इसके बाद, 2 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में SDW और जल-आधारित पुष्प निकालने के बराबर मात्रा मिलाएं । फिर, तैयार 2 मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्री ट्यूबों (एसडीडब्ल्यू प्लस FE) के लिए बीजाणु निलंबन की एक बराबर मात्रा में जोड़ें; परिणामस्वरूप तैयारी एक जलीय उपचार मिश्रण के रूप में संदर्भित किया जाता है । नियंत्रण के लिए, FE हिस्सा चूकना और sdw के साथ बदलें, conidial सांद्रता अनुरूप रखने के लिए ।
    नोट: भाग आकार प्रतिकृति और समय-बिंदुओं की संख्या पर निर्भर है । सामान्यतया, भाग ५०० μL से अधिक नहीं है । एक बार कोनिडिया और FE जैव आमापन संयुक्त शुरू हो गया है, 0 एच पोस्ट टीका ।
  3. सेल कल्चर डिश के भीतर भिगोए हुए कागज तौलिए के ऊपर पहले से साफ कांच के कूवरहोंठ लगाएं । एक coverslip के केंद्र पर जलीय उपचार मिश्रण की एक ४० μL छोटी बूंद प्लेस । नियंत्रण सहित वांछित उपचार के लिए दोहराएं, सेल संस्कृति पकवान बंद करो । Replications के लिए अलग सेल संस्कृति व्यंजन में दोहराएं (कम से 3) और समय अंक (प्रत्येक डिश 1 समय बिंदु के लिए है) । एक बार सभी उपचार और प्रतिकृति किया गया है, एक सील प्लास्टिक कंटेनर (30 x 13 x 7 मिमी) और अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते में सभी प्रतिरूपित कोशिका संस्कृति व्यंजन जगह तिरस्कृत ।
  4. पूर्वनिर्धारित समय-बिंदुओं पर, lactophenol कॉटन-ब्लू (२०.० g phenol क्रिस्टल, २०.० मिलीलीटर २.५% लैक्टिक एसिड, ४०.० मिलीलीटर ग्लिसरोल, ०.०५ ग्राम कपास नीला) की तरह एक फिक्सेटिव के 10 μL जोड़ें बूंदों के लिए, वृद्धि को रोकने और अर्द्ध माउंट के संरक्षण ।
    1. रुको 2 ज 0 एच समय बिंदु इकट्ठा के रूप में इस कांच की सतह के लिए conidial आसंजन की अनुमति देता है, लेकिन लंबे समय तक conidial अंकुरण के लिए पर्याप्त नहीं है । अंय सभी समय बिंदुओं के लिए, संगत समय में जुड़वा जोड़ें ।
  5. एक बार एक लगानेवाला जोड़ा गया है, ध्यान से coverslips उलटा, उंहें एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नीचे की ओर रखने के लिए सूक्ष्म परीक्षा (प्रति स्लाइड 1 coverslips) की सुविधा । जब सभी coverslips कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर हैं, उंहें बसने के लिए और आंशिक रूप से 20 मिनट के लिए प्रवाह हुड में सूखी छोड़ दें ।
  6. Coverslip (प्राथमिक कोनिडिया, अंकुरित कोनिडिया, और नवगठित माध्यमिक कोनिडिया) पर मौजूद सभी कोनिडिया (कुल कोनिडिया) के रूप में अच्छी तरह के रूप में या तो 400x आवर्धन (16 क्षेत्रों की गिनती) या 200x (गणना 4 क्षेत्रों), ३.८०८ मिमी के एक क्षेत्र कुल पर appressoria गणना 2. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पूरी जैव आमापन नकल । पानी आधारित FE का उपयोग कर assays के लिए, Waller एट अल में वर्णित के रूप में डेटा का विश्लेषण । २०१७16, आमतौर पर माध्य गणना/mm2 (कुल कोनिडिया या appressoria) के रूप में प्रदर्शित कर रहा है ।

8. Bioassay क्लोरोफॉर्म आधारित पुष्प अर्क (ch-FE)17 का उपयोग

नोट: चित्र 2देखें ।

  1. ऊपर के अनुसार सामग्री और सेल संस्कृति व्यंजन तैयार (कदम ७.१) । इसके अतिरिक्त, वैन Tieghem कोशिकाओं (VanT. कोशिकाओं) (8 मिमी आयुध डिपो, 6 मिमी आईडी) के बराबर संख्या कुल्ला करने के लिए, साथ ही एक गिलास पिपेट (1 μl वृद्धि के साथ 1 मिलीलीटर) एक धूआं हुड के भीतर, (दो बार के साथ ९५% EtOH तो दो बार क्लोरोफॉर्म के साथ), और अलग सेट ।
  2. लैबिनार फ्लो हुड में, एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब का उपयोग कर दो बराबर मात्रा में जोड़ें (न्यूनतम ५०० μL भागों) SDW के और 1 मात्रा बीजाणु निलंबन, तो अलग सेट. यह ch-FE bioassays के लिए जलीय उपचार मिश्रण है ।
  3. एक धूआं हुड में, एक VanT जगह है । तैयार प्लास्टिक सेल संस्कृति डिश के भीतर एक गिलास coverslip पर सेल । वैन टी सेल के केंद्र में वांछित ch-FE के ३३ μL (ग्लास पिपेट के साथ) बांटना (VanT की दीवारों को छूने नहीं है । सेल नियंत्रण उपचार के लिए, वर्जिन क्लोरोफॉर्म जोड़ें), और सूखी करने के लिए अनुमति देतेहैं । Replications के लिए अलग सेल संस्कृति व्यंजन में दोहराएं (कम से 3) ।
  4. एक बार ch-FE सूखगया है, vant के केंद्र में एक मानक पिपेट के साथ तैयार जलीय उपचार मिश्रण के ९९ μl बांटना । सेल, तो सभी सेल संस्कृति व्यंजन बंद करो । एक बार जलीय उपचार मिश्रण सूख ch-FE उपचार के साथ संपर्क में आ गया है, जैव आमापन शुरू हो गया है, 0 एच पोस्ट टीका ।
  5. एक बार सभी उपचार और प्रतिकृति दिया गया है, सभी जगह (बंद) एक सील प्लास्टिक कंटेनर (30 x 13 x 7 मिमी) और अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते में सेल संस्कृति व्यंजन ।
  6. पूर्व निर्धारित समय-बिंदुओं पर, एक फिक्टिव के 15 μL जोड़ें (lactophenol कपास-नीला) VanT करने के लिए. सेल और कम से 5 मिनट के लिए बैठने के लिए पर्याप्त कवक धुंधला बीमा । उस समय के बाद सावधानी से वांट को हटा दें । सेल और पालन coverslip उलटा और डेटा अधिग्रहण ऊपर कदम (कदम 7.5-7.6) । डेटा विश्लेषण के लिए, gager २०१५17में वर्णित विधियों का पालन करें, आम तौर पर appressorium गठनके रूप में डेटा प्रदर्शित, जो कुल कोनिडिया के क्षेत्र में गिना appressorium के अनुपात है मनाया (३.८०८ mm2) ।

9. क्रैनबेरी Phenology आधारित Extractions17

  1. हाथ लीजिए क्रैनबेरी फूल (जून में, १०० ग्राम), अपरिपक्व फल (दो बार; जुलाई और अगस्त; २०० जी), और परिपक्व फसल में क्रैनबेरी फल (अक्टूबर, २०० ग्राम), उचित आकार के प्लास्टिक की थैलियों में जगह और 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत संग्रह के बाद सर्द । ऊपर उल्लिखित संदूषण सावधानियों का उपयोग करें (चरण २.१) ।
    नोट: एक अतिरिक्त संयंत्र सामग्री हर समय पर एकत्र किया जाएगा, लेकिन ये मात्रा स्पष्ट रूप से कवक संक्रमित अंडाशय और फल निकालने के खिलाफ गार्ड (लक्षण और रोग के लक्षण दिखा रहा है) ।
  2. निष्कर्षण से पहले, किसी भी बिगड़ा, क्षतिग्रस्त, रोगग्रस्त फूलों को हटा दें, तो केवल स्वस्थ फूलों का उपयोग कर, sepals, पेडुकल्स, corollas, stigmas, शैलियों और घुमावदार संदंश (४५ ° चिमटी) के साथ पुंकेसर हटाने और सभी लेकिन अंडाशय त्याग । एक बार अंडाशय एकत्र कर रहे हैं, एक 1 wt पर क्लोरोफॉर्म आधारित निष्कर्षण प्रदर्शन: 9 vol अनुपात (चरण 4.2-4.4 में विस्तृत, केवल अंडाशय का उपयोग). स्टोर के नमूने जब तक अंय सभी extractions, अर्थात् जब तक जैव आमापन conductance पूरा कर रहे हैं ।
  3. एक बार फल एकत्र कर रहे हैं, एक क्लोरोफॉर्म आधारित निष्कर्षण प्रदर्शन (4.2 कदम, फूल के बजाय एकत्र फल का उपयोग), लेकिन के लिए फल की 10 ग्राम क्लोरोफॉर्म के ९० मिलीलीटर में जोड़ें और एक बार निकाले, समाधान की अनुमति 9 मिलीलीटर के लिए लुप्त हो जाना (एक 10 जी में जिसके परिणामस्वरूप: 9 मिलीलीटर wt : vol solution) ।
  4. फल निकालने के तुरंत जुलाई, अगस्त, और अक्टूबर में इकट्ठा करने के बाद । ऊपर के अनुसार स्टोर (चरण ४.४) जब तक सभी extractions एकत्र कर रहे हैं । पिछले क्लोरोफॉर्म आधारित फल निष्कर्षण के बाद, विषय सभी penology आधारित क्लोरोफॉर्म क्लोरोफॉर्म आधारित जैव आमापन के लिए इस परख के लिए एकत्र निष्कर्षों और तदनुसार विश्लेषण (कदम 8.1-8.6) ।

Representative Results

यहां प्रस्तुत परिणाम कई assays कि इस पद्धति का उपयोग किया जा सकता है के कुछ उदाहरण हैं । चित्रा 1 पानी के लिए एक सचित्र गाइड-fe bioassay आधारित है, और 2 चित्रा जो क्लोरोफॉर्म आधारित fe bioassay पर इस प्रकार से पूरक है । चित्रा 3 एक दृश्य गाइड प्रदान करता है क्या की सूक्ष्म मूल्यांकन पर उंमीद की जा सकती है सी fioriniae के 24 एच, दोनों में पानी और क्लोरोफॉर्म आधारित BIOASSAYS (sdw नियंत्रण की तुलना में) । चित्रा 4 एक 24 एच समय-क्रैनबेरी किस्म ' स्टीवंस ' CH-FE की उपस्थिति में सी fioriniae के साथ पाठ्यक्रम अध्ययन, और इस अनुसंधान के एक आयात परिणाम के लिए दृश्य संदर्भ देता है: FE संक्रमण संरचनाओं फार्म की जरूरत समय कम SDW की तुलना में । चित्रा 5 एक coverslip जैव आमापन क्रैनबेरी पुष्प वर्षा का पानी अपवाह (सीबी "फूल" आरडब्ल्यू-FE) का उपयोग करने से एकत्र आंकड़ों का एक उदाहरण प्रदान करता है । चित्रा 6 एक और महत्वपूर्ण परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है: पुष्प अंडाशय CH-fe फल CH-fe से ज्यादा उत्तेजक था, सी fioriniae के जीवनचक्र में खिल के महत्व का संकेत । पूरक तस्वीरें और फिल्में सक्रिय- और निष्क्रिय- निष्कर्षण कल्पना है कि फिल्मों के अलावा extractions और पुष्प वर्षा का पानी संग्रह उपकरणों में इस्तेमाल किया फूलों के महत्वपूर्ण दृश्यों प्रदान/ जल आधारित) प्रक्रियाएं ।

Figure 1
चित्रा 1 : जल आधारित पुष्प उद्धरण (FE) bioassay के सामांय सिंहावलोकन । इस परख पानी के लिए उपयोग किया गया था दोनों ब्लूबेरी और क्रैनबेरी फूल के साथ पुष्प निष्कर्षों पर आधारित: सक्रिय-पुष्प अर्क (सक्रिय-fe), निष्क्रिय-पुष्प अर्क (पास-fe) और पुष्प वर्षा जल अपवाह (rw-fe) । -FE भाग आमतौर पर प्रयोगात्मक/ इसके विपरीत-FE भाग स्थिर रह सकते है और समय अंक/inoculation के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है । प्राथमिकता 200X आवर्धन पर 4 क्षेत्र विश्लेषण के लिए किया गया है । Abbreviations: बाँझ विआयनीकृत पानी, sdw; दृश्य के क्षेत्र प्रति फ़ील्ड, A. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : क्लोरोफॉर्म आधारित पुष्प उद्धरण (ch-FE) bioassay के सामांय सिंहावलोकन । यह परख दोनों ब्लूबेरी और क्रैनबेरी (फूल, अंडाशय और फल) के लिए उपयोग किया गया था । इस परख में केवल एक ही प्रकार के जलीय उपचार मिश्रण का प्रयोग किया गया था, 2 भागों SDW के लिए 1 भाग बीजाणु सस्पेंशन (कोनिडियल एकाग्रता ch-FE वाष्पीकरण के कारण संगत रखने के लिए) । यह परख एकाधिक ch-FE की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (विभिंन संयंत्र सतहों से waxes), या एकाधिक समय अंक/ Abbreviations: बाँझ विआयनीकृत पानी, sdw; वान तिएघेम [ग्] प्रकोष्, वांत । सेल. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : पानी आधारित fe और ch-fe की उपस्थिति में कोलेटोट्राइकम फिओरिनिआ की दृश्य तुलना । इस परख ब्लूबेरी में ' Bluecrop ' (सक्रिय-FE, जल आधारित) (कवक अलग: BB # 10) और क्रैनबेरी ' स्टीवंस ' क्लोरोफॉर्म आधारित (CH-FE) (कवक अलग: CB-PMAP182) पुष्प निष्कर्षों sdw नियंत्रण की तुलना में थे । माध्यमिक conidiation (अंगूठियां) और appressorium गठन (आरोह) में एक नाटकीय वृद्धि देखी गई जब conidiation की उपस्थिति में sdw (नियंत्रण) (A) करने के लिए सक्रिय-FE (B) 24घंटे पोस्ट-inoculation में की तुलना । हालांकि, द्वितीयक conidiation के रूप में स्पष्ट नहीं था जब क्लोरोफॉर्म जैव आमापन sdw नियंत्रण (ग) से ch-FE (D)की तुलना; बल्कि, सी. फिओरिनिआ ग्रोथ appressorial गठन की ओर खिसक गई. दिखाया प्रत्येक निष्कर्षण प्रकार के लिए एक आम प्रतिक्रिया है, पानी आधारित और क्लोरोफॉर्म आधारित, मेजबान की परवाह किए बिना/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : Ch-FE की उपस्थिति में कोलेटोट्राइकम फिओरिनिआ के साथ टाइम-कोर्स स्टडी (24 एच) । इस परख में, एक SDW नियंत्रण (ए-डी) और क्रैनबेरी ' स्टीवंस ' CH-FE (ई एफ) नेत्रहीन 0, 6, 12 पर निरीक्षण किया, और 24 एच के बाद inoculation (चर समय अंक का एक उदाहरण के बजाय एकाधिक FE की तुलना) थे । Appressorium गठन (ऐरोहेड) ch-FE में 6 एच में शुरू हुआ और लगातार बाद के समय अंक भर में वृद्धि हुई । यह परिणाम खिल अवधि के दौरान रोगज़नक़ जीव विज्ञान के एक महत्वपूर्ण कारक को eludes: फूल संक्रमण संरचनाओं फार्म की जरूरत समय कम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : एक bioassay में आरडब्ल्यू-FE का उपयोग कर एकत्र आंकड़ों के चित्रमय प्रदर्शन । वर्षा का पानी क्रैनबेरी फूल (सीबी "फूल" rw-FE) और कुंवारी वर्षा जल कि किसी भी क्रैनबेरी संयंत्र के ऊतकों को छुआ नहीं था ("जमीन" आरडब्ल्यू-FE) से एक ही गीला-घटना प्लस एक मानक सक्रिय, क्रैनबेरी जल आधारित पुष्प निकालने (सीबी सक्रिय -FE) (सकारात्मक नियंत्रण) और sdw (नकारात्मक नियंत्रण) एक पानी आधारित coverslip जैव आमापन के अधीन थे और सी के लिए मूल्यांकन किया फिओरिनिआ वृद्धि । सीबी "फूल" आरडब्ल्यू-FE मानक सीबी सक्रियके रूप में माध्यमिक conidiation और appressorium गठन के एक ही स्तर पर था 24 एच पोस्ट-टीका, यह दर्शाता है कि संग्रह उपकरण पुष्प उत्तेजक पर कब्जा करने में प्रभावी थे एक के दौरान जारी wetting-घटना । टोटल कोनिडिया में प्राइमरी (डिपोजिट), कोनिडिया और नवगठित सेकेंडरी कोनिडिया शामिल है । पत्र के अनुसार पी < ०.०५ में महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है फिशर कम महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण (lsd); अपरकेस, कुल कोनिडिया; लोअरकेस, अपप्रेसोरिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 : क्रैनबेरी फ़ीनोलॉजी आधारित ch-FE bioassay, दृश्य निरीक्षण । फल सड़ कवक के लिए रोग प्रबंधन अक्सर खिल समय फंजीसाइड आवेदन शामिल है । यहाँ क्रैनबेरी क्लोरोफॉर्म आधारित अर्क (ch-FE) के कई विकास चरणों से क्रैन्बेरी (' स्टीवंस ') का नेत्रहीन मूल्यांकन किया गया, जो कि 24 एच पोस्ट-इनओकुलेशन पर सी. फियोरिनिआ पर सतही वेक्स के प्रभाव के लिए है । अंडाशय जून में एकत्र (क), अपरिपक्व फल जुलाई और अगस्त में एकत्र ( बी, सी), काटा फल अक्टूबर में एकत्र (डी), और एक sdw नियंत्रण (ई) appressorial गठन (आरोह) के लिए निरीक्षण किया गया. अंडाशय ch-FE का सबसे बड़ा परिमाण था, यह दर्शाता है कि यह पादप फीनोलॉजी (ब्लूम) सी-फियोरिनिआ केजीवनचक्र के लिए महत्वपूर्ण है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: ब्लूबेरी पुष्पक्रम. ब्लूबेरी फूल पूर्ण ब्लूम के दौरान extractions के लिए एकत्र (ंयू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका में अप्रैल-मई) थे (' Bluecrop ' दिखाया गया है) । नोट संनिकट फूलों से corollas/अंडाशय की ओवरलैप और पूरक चित्रा 2 (क्रैनबेरी ईमानदार) की तुलना में पुष्पक्रम की समग्र वास्तुकला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 2
पूरक चित्रा 2: क्रैनबेरी ईमानदार । क्रैनबेरी फूल पूर्ण ब्लूम के दौरान (जून जुलाई ंयू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका) में extractions के लिए एकत्र किए गए (' दिखाया ' स्टीवंस ') । एक एकल क्रैनबेरी पुष्पक्रम (ईमानदार), और झुका, पानी की छोटी बूंद कोरोला के आकार को बनाए रखने पर विविध फूल चरणों ध्यान दें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 3
पूरक चित्रा 3: ब्लूबेरी वर्षा जल की तैनाती (फूल) । ब्लूबेरी पुष्प वर्षा जल संग्रह डिवाइस, inflorescences के एक समूह के तहत सीधे रखा पूरा किया । उपकरण को ऊर्ध्व ओरिएंट करने के लिए प्रयुक्त प्लास्टिक लेपित तार को नोट करें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 4
पूरक चित्रा 4: ब्लूबेरी वर्षा जल की तैनाती (स्टेम) । पूरा ब्लूबेरी पुष्प वर्षा जल संग्रह उपकरण, एक पुष्पक्रम और झाड़ी के मुकुट के बीच स्टेम नीचे आधा रास्ता रखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 5
पूरक चित्रा 5: ब्लूबेरी वर्षा जल की तैनाती (मुकुट) । ब्लूबेरी पुष्प वर्षा जल संग्रह डिवाइस, झाड़ी (मुकुट) के आधार पर रखा पूरा किया । नोट प्लास्टिक लेपित तारों यदि आवश्यक नहीं हटाया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 6
पूरक चित्रा 6: ब्लूबेरी वर्षा जल की तैनाती (जमीन) । पूरा वर्जिन वर्षा जल संग्रह युक्ति, ब्लूबेरी झाड़ियों के निकट रखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 7
पूरक चित्रा 7: क्रैनबेरी वर्षा जल परिनियोजन (क्लोज़ अप) । पूरे बड़े करीने से तार संबंधों के तहत tucked दो के साथ क्रैनबेरी पुष्प वर्षा जल संग्रह डिवाइस, पूरा हो गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 8
पूरक चित्रा 8: क्रैनबेरी वर्षा जल तैनाती । एकाधिक पूरा क्रैनबेरी पुष्प वर्षा का पानी एक दलदल में तैनात उपकरणों । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Movie 1
पूरक फिल्म 1: सक्रिय, जल आधारित पुष्प अर्क (सक्रिय-FE) । पूरक वीडियो समर्थन 2.3-2.5.1 चरणों का पालन करें । ब्लूबेरी ' Bluecrop ' फूलों का इस्तेमाल किया गया । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Supplemental Movie 2
पूरक फिल्म 2: निष्क्रिय, जल आधारित पुष्प अर्क (पास-FE) । अनुपूरक वीडियो समर्थन चरणों का पालन 3.3-3.4 । ब्लूबेरी ' Bluecrop ' फूलों का इस्तेमाल किया गया । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Supplemental Movie 3
पूरक फिल्म 3: क्रैनबेरी पुष्प वर्षा जल संग्रह उपकरणों की तैनाती। पूरक वीडियो समर्थन निम्न चरण ६.४. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

Bioassays का पता लगाने के सी fioriniae पुष्प अर्क (FEs) के लिए प्रतिक्रिया ब्लूबेरी और क्रैनबेरी फल सड़ांध pathosystems के लिए विकसित किया गया था, लेकिन आसानी से अंय बागवानी फसलों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल सहित कई महत्वपूर्ण डेटा सेट प्राप्त करने में मूल्यवान है, लेकिन सीमित नहीं: कई रोगजनकों के कई आइसोलेट्स पर FE प्रभाव, समय-पाठ्यक्रम विभिंन FEs की उपस्थिति में कवक विकास चरणों से संबंधित जानकारी, निष्कर्षण तकनीकों की तुलना, सी. फिओरिनिआ वृद्धि और विभेद पर व्यक्तिगत रसायनों का निरीक्षण, व्यक्तिगत पुष्प अंग निष्कर्षों का मूल्यांकन, सी. फिओरिनिआ पर तापमान के प्रभाव जबकि FE, प्रभाव की उपस्थिति में के फ़ीनोलॉजी निर्भर मोम extractions, और पुष्प वर्षा का पानी प्रभाव । इन तकनीकों के उपयोग के माध्यम से उत्पन्न आंकड़ों ने भी सी. फियोरिनिआ जीवन चरणों की एक बहुत स्पष्ट समझ प्रदान की है और आंशिक रूप से क्यों ब्लूम अवधि के कई फल सड़ रोगजनकों के नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है ।

प्रारंभ में, सभी फूलों को सक्रिय-FE पर हूबहू संसाधित किया गया, लेकिन निष्कर्षण प्रक्रिया पूरे फूलों के उपयोग की ओर बढ़ गई है । पुष्प विच्छेदन समय लगता था और परिणामस्वरूप FEs के bioactivity पर बहुत कम प्रभाव था । हालांकि, व्यक्तिगत पुष्प अंगों कर सकते है और इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है, लेकिन महान देखभाल के लिए पूरी तरह से पुष्प ऊतकों (पूरक फिल्म 1, कदम २.३ में विस्तृत सावधानियों के साथ) macerate नहीं लिया जाना चाहिए, के रूप में यह जारी में परिणाम हो सकता है कवक-विषाक्त/स्थैतिक यौगिकों जो सूक्ष्म मूल्यावलनों को विकृत कर सकता है । इस तरह के पास के रूप में कम आक्रामक extractions -Fe (पूरक फिल्म 2) और आरडब्ल्यू-fe अब अधिक अधिग्रहण की अपनी आसानी के कारण अनुकूल हैं । इसके अतिरिक्त, इन निष्कर्षण तकनीकों केवल वैक्यूम निस्पंदन biologically सक्रिय पुष्प रासायनिक cues प्राप्त करने की आवश्यकता है ।

सभी extractions में उपयोग फूल आम तौर पर 0-3 दिन पहले तैयारी निकालने के लिए प्रशीतित थे । इस प्रोटोकॉल की एक चुनौती (अर्क के भंडारण के माध्यम से फील्ड संग्रह) FE कारोबार का समय प्रबंधन है । यह कई स्रोतों और तारीखों से कई नमूनों द्वारा exacerbated किया गया था । जमे हुए फूल किसी भी वास्तविक सीमा तक मूल्यांकन नहीं किया गया है, के रूप में गल फूल बिगड़ा और फीका पड़ा हुआ दिखाई देते हैं । हालांकि, एक बार पानी आधारित FEs तैयार किया गया है, दोहराया ठंड और विगलन fe के bioactivity पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया गया है, तो जब तक fe जल्दी bioactivity तैयारी के बाद refrozen है (व्यवहार्य 3 साल पुराने FE) ।

क्लोरोफॉर्म-आधारित निष्कर्षण कांच के coverslips पर ch-FE वाष्पीकरण के माध्यम से एक द्वि-आयामी विमान में तीन आयामी पुष्प/फलों की सतह waxes के लिए रोगज़नक़ प्रतिक्रियाओं की जांच में सक्षम बनाता है । हालांकि, यह संभावना नहीं है कि ch-FE से जमा किए गए waxes की वास्तविक क्रिस्टलीय संरचनाएं उस सतह के समान होती है जहां से वे एकत्रित की गई थीं । अर्थ, पूरक तकनीकों अगर vivo में विशिष्ट मोम संरचनाओं के लिए कवक प्रतिक्रिया लागू किया जाना चाहिए जांच का मुख्य ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । क्लोरोफार्म आधारित अर्क पानी आधारित extractions की तुलना में अधिक भंडारण रखरखाव की जरूरत है । Ch-FE के अर्क अंधेरे में रखने के अलावा, PTFE पंक्तिवाला सेल संस्कृति ट्यूब टोपी और parafilm सील लपेटो को नियमित रूप से वाष्पशील लीक के लिए जांच की जरूरत है और के रूप में आवश्यक जगह ।

पुष्प वर्षा जल अपवाह निगरानी की अवधारणा साइट विशेष रोग निगरानी उपकरणों को आगे बढ़ाने के विचार में निहित है । वर्षा जल संग्रह उपकरणों कई अंय संयंत्र architectures के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, तो संग्रह युक्ति वर्षा का पानी है कि फूलों से दूर चला गया है के रूप में लंबे समय । इस दृष्टिकोण के बारे में जानकारी प्रदान करता है या नहीं पुष्प उत्तेजना किसी भी समय पर क्षेत्र में मौजूद है और मौसम भर में नजर रखी जा सकती है । वैकल्पिक रूप से, संग्रह उपकरणों कई चंदवा स्थानों पर तैनात किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए कितनी दूर पुष्प cues किसी भी गीला घटना के दौरान धोया गया है । भविष्य में प्रयोगों में, rw-FE जब फंजीसाइड अनुप्रयोगों शुरू करना चाहिए और वे सुरक्षित रूप से समाप्त कर सकते हैं जब हुक्म होगा. इसके अतिरिक्त, फ़ीनोलॉजी निर्भर मोम extractions (प्रोटोकॉल खंड 9) की निगरानी करके, रोगज़नक़ जीव विज्ञान के लिए खिल अवधि के महत्व और भी स्पष्ट हो गया है । यह खंड भी इन bioassays के लचीलेपन को प्रदर्शित करने के लिए, विधियों कि अस्थाई रूप से अलग कर रहे है मेजबान सतह waxes के साथ-साथ तुलना के लिए अनुमति प्रदान करने के लिए शामिल किया गया था । डेटा पुष्प निष्कर्षण तकनीकों और bioassays का उपयोग कर उत्पंन रोगज़नक़ उत्तेजना, विशिष्ट रासायनिक रोगज़नक़ जीव विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण वर्गों के ठोस संकेतकों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और भविष्य के नियंत्रण रणनीतियों के लिए लक्ष्य ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम विलियम एस Haines, सीनियर संपंन क्रैनबेरी अनुसंधान कोष और ंयू जर्सी ब्लूबेरी और क्रैनबेरी अनुसंधान परिषद, समर्थन के लिए इंक धंयवाद । हम भी जेनिफर वैसियूनस (मार्गदर्शन और पुष्प तैयारी), क्रिस्टीन Constantelos (कवक संस्कृति और पुष्प तैयारी), डेविड जोंस (पुष्प तैयारी और extractions), Langley Oudemans (पुष्प तैयारी, फिल्मांकन/ लिंच (पुष्प तैयारी), रौक्सैन Tumnalis (सामान्य सहायता), और कई छात्र/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter VWR 101102-280 Blueberry floral extract (FE) clarification 
200-1000 µl pipette with tips - - Equipment, any make within range will be adequate
40-200 µl pipette with tips - - Equipment, any make within range will be adequate
5-40 µl pipette with tips - - Equipment, any make within range will be adequate
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter  Harbor Freight 97098 Blueberry rainwater (rw-)FE collection
Autoclave Amsco 3011 Equipment, media preparation
Bar mesh matting (plastic mesh sheet) Winco BL-240 Passive (pass)-FE collection
Benchtop timer Fisher Scientific 06-662-47 Equipment, FE preparation
Black pressure/vacuum hose VWR 62994-795 Vacuum filter component
Buchner funnel Coors USA 60240 Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks
Bunsen burner   - - Equipment
Calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Media component
Centrifuge Sorvall  RC 5B Plus Equipment
Centrifuge tubes (15 ml) Fisher Scientific 05-527-90 Equipment
Centrifuge tubes (50 ml) VWR 10025-694 Equipment, rw-FE collection
Cheesecloth (grade 50) Fisher Scientific AS240 Equipment, FE preparation
Chloroform VWR JT9175-3 Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free
Corn Meal Agar (CMA) Fisher Scientific B11132  Pre-mix media, isolate storage on slants
Cotton-blue stain Sigma-Aldrich 61335 Lactophenol cotton-blue stain
Difco Agar VWR 90004-032 Media component
Drill-press Delta - Equipment, rw-FE collection
EASYpure LF Ultrapure water Barnstead D738 Equipment, deionized water source
Ethanol (95%) - - Chemical
Filter flask (500 ml) Pyrex No. 5340 Vacuum filter component
Fume hood Hamilton - Equipment, chloroform usage
Funnel (7 X 7 cm)  VWR 60820-110 Cranberry rw-FE collection, FE preparation
Generic glass slide  Fisher Scientific 22-038-101 Bioassay conductance
Generic plastic pump spray bottle VWR 16126-454 pass-FE collection, at least 250 ml capacity
Glass cell culture tubes - - Storage of ch-FE
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B Bioassay conductance
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) - - Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)
Glass-pipette (1-100 µl) Hamilton Co. Inc. #710 ch-FE bioassay
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Lactophenol cotton-blue stain
Hemocytometer Bright-Line 5971R10 Equipment
Lactic acid Sigma-Aldrich W261106 Lactophenol cotton-blue stain
Laminar flow hood Labconco 3730400 Equipment, sterile work environment
Metal probe (generic)  - - Equipment 
Microcentrifuge tubes (2 ml) Fisher Scientific 05-408-138 Aqueous treatment mixture storage and preparation
Microscope, Leica DMLB Leica 020-519.010 Equipment
Mortar (ceramic) Coors USA 60313 Vacuum filter component
Nitrile gloves  Fisher Scientific 19-130-1597D Flower collection
Paper disks (cut paper towels) Office Basics KCC01510 humidity control in bioassay
Parafilm Bemis PM-996 Plastic paraffin film 
Pestle (ceramic) Coors USA 60314 Vacuum filter component
Phenol crystals Fisher Scientific A92-100 Lactophenol cotton-blue stain
Plastic bags (~100 mm X 152 mm) Uline S1294 Equipment, flower refrigeration
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)  Fisher Scientific FB0875712 (Petri dish), bioassay conductance
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps  VWR 60927-228 Storage of ch-FE
Pyrex beakers (100 ml) Pyrex No. 1000 Preparation of ch-FE
Pyrex bread-pan - - pass-FE collection
Pyrex graduated cylinder - - Equipment, FE preparation
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)  - - Bioassay conductance
Sharp-pointed dissecting scissors Fisher Scientific 8940 Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks
Stainless steel mesh strainer VWR 470149-756 Preparation of ch-FE
Step drill bit (step-bit) Dewalt - Equipment, rw-FE collection
Sterile loop (combi-loop) Fisher Scientific 22-363-602  Culture preparation
Telephone wire (internal wires) - - Blueberry rw-FE collection
Test tube basket  VWR 470137-792 Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket 
V8 Juice Campbell's Soup Company - Fungal media component
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets Donation - pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)
Vortex Genie (Vortex) Fisher Scientific 12-812 Spore suspension preparation
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles Whatman 1001-055 Vacuum filter component
White plastic twist ties (100 mm) Uline S-566W Cranberry rw-FE collection

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References

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पर्यावरण विज्ञान मुद्दा १४६ Colletotrichum रोगज़नक़ जीव विज्ञान पुष्प उत्तेजना पुष्प निष्कर्षों खिले क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण coverslip bioassay वर्षा जल की निगरानी भूतल waxes माध्यमिक conidiation appressoria निर्णय लेने के उपकरण
<em>कोलेटोट्राइचुम फिओरिनिआ</em> पानी और क्लोरोफॉर्म आधारित ब्लूबेरी और क्रैनबेरी पुष्प निष्कर्षों में विकास
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Waller, T. J., Gager, J. D.,… More

Waller, T. J., Gager, J. D., Oudemans, P. V. Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts. J. Vis. Exp. (146), e58880, doi:10.3791/58880 (2019).

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