Summary
ここでは、真菌病原体、炭疽病菌 fioriniae、ガラス coverslips にブルーベリーやクランベリーの花の抽出物の存在下での開発を監視するために設計された生物検定を説明します。水、クロロホルム、およびフィールド雨水-を用いた技術はこの情報を適用する方法への洞察力だけでなく、詳細な花の抽出。
Abstract
開花期間のフェノロジーと病原体の腐敗菌の子実における花の化学的手がかりのダイナミクスを正確に監視、花抽出方法や coverslip 生物検定うり fioriniaeを活用しました。ブルーベリーとクランベリー、開花期間中に感染症の初期の段階での役割の花演劇のため殺菌剤を適用することによって、この病原体を最適制御します。ここで詳細なプロトコル記述方法花抽出物 (FE) 後で対応するガラス coverslip の生物検定で使用水・ クロロホルム ・ フィールド雨水ベースの方法を使用して得られました。情報の異なるセットを提供するために提供しています各 FE: C. fioriniaeの動員の花の化学物質に対する応答キュー (水性)、水の花と果実表面ワックス (クロロホルム ベース)、フィールド ベースの監視の病原体応答生体外で観察を農業の設定に移動、花の雨水を収集しました。FE は広く記述としてどちらか水またはクロロホルム-ベース、これらの 2 つの材料の固有の違いを補うために記載されている適切な生物検定で。花を実行していた雨水は、柔軟性と他の作物のシステムのこのアプローチの適用をほのめかし各作物にユニークなデバイスで収集されました。生物検定は素早く、安価な簡単なさまざまなソースから促進花の化合物の存在に関する時空間およびサイト固有情報を生成する機能を提供しています。この情報最終的により良い通知されます疾患マネジメント戦略、FE は感染症が発生するために必要な時間を短縮、生育期にわたる病原体感染のリスクを変更するのに洞察力を提供します。
Introduction
うり fioriniaeハイブッシュブルーベリー (スノキ corymbosum l.) の大規模なアメリカのクランベリー (対 macrocarpon ・ エイ トン)1,2果実腐敗が発生します。この病原体は、炭疽病種複雑な3,4,5,6から線引きは最近、ブルーベリー炭疽病の病原とクランベリーの果実腐敗のメンバー多数他の植物病気世界中7を引き起こすだけでなく、複雑です。C. fioriniaeは、果実が成熟9の最終段階になるまでない明らかになって花と症状の開発中に発生する感染症と潜在、hemibiotrophic ライフ スタイル8を持っています。ブルーベリー、クランベリー果実腐敗だけ十分に開花期間中に行われた殺菌剤のアプリケーションで制御されます。病原体は休眠ブルーベリー花芽スケール10 overwinters し、花の中に sporulates。分生胞子は雨のしぶきの分散11,12を介してキャノピー全体で移動され、接種材料の蓄積と開花期間13に強く相関しています。花はシトラス ポスト花果実の成分ドロップ (PFD)14としてイチゴ炭疽病15、どちらの場合も原因の重要なホストの花に炭疽病菌の応答はスノキ属に一意ではありません。感受性に病原体。これらすべてのケースは、 C. fioriniaeと花の中に感染する他の病原体の化学的手掛かり花のダイナミクスを評価する効果的な方法の必要性を強調表示します。ここで説明する方法によって与えられる洞察は、ますます貴重になっています。
このプロトコルは花エキス (FE) 調達の方法の詳細し、ガラス coverslip 生物検定15,16を介してc. fioriniae FE に対する評価をガイドします。花の抽出技術は 2 つの主なタイプに分類されます。水ベースの抽出 (アクティブ-FE、パッシブ(パス -FE)、およびフィールド雨水ベース (rw-FE))、およびクロロホルム ベース (ch-FE)17抽出。水ベースの抽出水動員花化学手掛かりの検査を可能にします。これらの動員手がかり FE は大きく感染16、発生する感染に必要な水分を提供することに加えての速度を増加するので感染裁判所の可能性が高い重要部品であります。さらに、彼らは花の刺激は、ブルーベリーと他作物システム14,16以前観測として濡れイベント中にキャノピー全体洗浄することより自然な条件を表します。クロロホルム ベース花抽出 (ch FE) また提供ホストの表面の病原体応答に関する貴重な情報ワックス17,18, 一度影響を受けやすい上に堆積した分生胞子の初期成長段階を解明ホスト器官 (すなわち花、卵巣、発展途上のフルーツ)。病原体応答ホスト表面ワックスの季節的変化には、このプロトコルを使用しても監視できます。したがって、生物検定はこれらの 2 つの材料間違いを軽減する水ベースの FE またはクロロホルム ベースの FE のいずれかの操作に合わせて調整します。
水ベースの抽出がクロロホルム ベース抽出より二次 3量のハイレベルを刺激する生物検定から生成されるデータが明らかに複数の化合物したがって十三決定的な付着器の応答があった、FE の存在。興味深いことに、時花の表面から洗浄することが複数の刺激物質を示す、ブルーベリーとクランベリーの花から実行していた雨水を使用してこれらの生育反応の両方が観察されました。したがって、花の刺激のための監視の農業システムに病原体の成功確率見識を提供します。
このプロトコルの究極の目標は生成花化学手掛かり、に応えて真菌植物病原菌の生物についてはベースライン方法論としてこの花情報の支援を利用できる開始の方法論を提供するために、します。部位特異的疾患の管理と意思決定のプロセス。
Protocol
1. 菌、胞子懸濁液
- 自然感染したホスト19からうり fioriniaeを隔離します。その後、コーンミール寒天 (CMA) 傾斜のきれいな文化を保存します。V8 ジュース寒天培地 (cV8A) を (ミラー 1955 年から変更)、または非明らかに V8 ジュース寒天培地 (V8A)20いずれか明らかに標準的なプラスチック電池文化皿 (直径 9 cm) 含むに (CMA 傾斜) から文化のプラグを配置します。植民地は、感受性を開始するとき別の cV8A または V8A 分生子 (オレンジ色の胞子の固まり) を連勝高密度基部文化を生成する (標準的な滅菌ループ) と細胞培養皿を含んでいます。
注: 菌類のプロトコル手順は fungal 文化や生物検定の汚染の可能性を減らすために層流フードで行わなければなりません。 - 後標準的な滅菌ループを使用して、成長の 7 日間 (胞子の固まりにループを軽く触れる) によって高密度培養から少量の分生胞子を収集、無菌純水 (SDW) 10 ml、15 mL 遠心管にこれをかき混ぜます。渦このサンプル 10 の s、し、標準のピペットを使用して突入、上下何度もさらにミックスするサンプル。
- Vortexed サンプル、検定に一滴を配置し、胞子濃度を推定します。検定のカウント 5-10 フィールド平均を取得し、適切な希釈係数 (すなわち10,000)、平均で乗算 mL SDW あたり胞子濃度を得ること。
- 体積 (V) を使用して/濃度 (C) 式 (V1● [C1] = V2● [C2]) 5 mL 最終巻で SDW の mL あたり 10 の5分生胞子 X 1.0 (SDW) で調整します。これは胞子懸濁液と呼ばれます、いずれかの生物検定で使用する前にすぐに行われます。
2 花抽出の水ベース、アクティブ(アクティブ-FE)15,16 。
注: は、補足図 1、補足図 2、補足図 3、および補足ムービー 1を参照してください。
- 慎重に手収集ブルーベリー (4 月-5 月) とフィールド (補足図 1) で彼らのそれぞれのピークの花の中にクランベリー (6 月-7 月) 花です。着用し、人間の皮膚の油汚染を抑制するだけでなく、花の品種間のクロスコンタミネーション サンプリング場所 (品種/品種/物理的な場所) との間のニトリル手袋を変更します。(100 × 150 mm バッグを記入) ビニール袋に (単一のソース) からブルーベリーやクランベリーの花を配置し、花が収集される 4 ° C ですぐに冷蔵庫で冷やします。
注:アクティブな抽出はレアンドロらから変更されます。(2003 年)16。 - 抽出前に任意の劣化、破損、病気にかかった花を削除し、健康な花を使用してカーブタイプ鉗子 (45 ピンセット) と卵巣、萼片と花柄を削除し、破棄します。アクティブな抽出に残りの器官の (カローラ、汚名、スタイル、雄しべ) を使用します。寒冷紗 (150 x 150 mm) をカット、7 x 7 mm 漏斗内に配置、クリーン 50 mL の遠心管に配置しておきます。
- 1 を組み合わせる部分処理 9 パーツ SDW 花 (1 wt: 9 巻比) モルタル。軽く 30 乳棒で粉をひく s (世話をサンプルを完全に粉砕する)。準備寒冷紗/目標到達プロセスを通じて生成されたパルプをひずみし、遠心分離機管 (50 mL) で収集します。きれいか各 95% エタノール抽出と暖かい流水の間新しい乳鉢/乳棒を使用します。
- 吸引ろ過の装置を準備: Buchner 漏斗、真空フィルター三角フラスコ (容量最大 1,000 mL)、55 ミリメートル円フィルター ペーパーおよび真空ホース/ソースを収集します。適切な大きさで分類されたブフナーにろ紙を追加し、フラスコの上に配置し、水に装置を接続/真空ホースを介してソースを吸引しておきます。
- 8,055 x gで 10 分間の遠心分離でブルーベリーの花の抽出物をさらに明確します。上澄みを離れて注ぎ、準備された真空ろ過装置、真空源オン、培養上清をフィルター処理し、新しい遠心管 (50 mL) 注ぎ、フラスコの内容。95% エタノールで各濾過精度と暖かい流水の間すべての装置コンポーネントをクリーンアップします。注射器をさらにフィルターは、0.22 μ m 孔径の殺菌、アセテート フィルター新しい遠心管 (50 mL) に適応。
- クランベリーの花エキスのための真空だけはフィルター ペーパーを通してフィルター、新しい遠心管 (50 mL) にフラスコの内容を注ぐ。
- 結果として得られる準備をアクティブ- 花エキス (アクティブ -FE) と呼びます。-20 ° c 5-50 ml で実験的に使用されるまですべて水性花エキス (アクティブ、パッシブ雨水のコレクション) を格納します。複製を提供するために複数のサンプル (サンプルの種類ごとに少なくとも 3 抽出) の抽出を繰り返します。
3 花抽出の水ベース、パッシブ(渡す-FE) 16 。
注: は、補足的なムービー 2を参照してください。
- 収集全体ブルーベリーの花 (50 g)、上記のように手、収集した後冷蔵庫で冷やします。抽出、前に任意の劣化、破損、病気の花、そのまま花から花柄だけを取り外します。後述する受動的で抽出システムは、場所まで作製した試料を冷やしなさい。
- 95% エタノール (エタノール) と暖かい流水 (プラスチック製のメッシュ シート、2 つのプラスチック製のメッシュ バスケット、ガラスのパンのパン、ポンプ霧ボトル) の汚染を防ぐために使用する前のすべてのコンポーネントをすすいでください。また各上記の手順で 2.2、抽出、脇の 4 層寒冷紗/漏斗/50 mL 遠心管を準備します。
- ふるいの準備: 1 つのプラスチック製のメッシュ バスケット (114 x 102 mm) に (別名バーのつや消しクリア) プラスチック製のメッシュ シートを配置。第二に、同じメッシュのバスケットを逆さま置き (SDW に座って花を避けるため) にガラスのパン-パン (127 x 229 mm) および場所に (反転) メッシュ シートの上にバスケットを含む。ふるいに準備された花の 50 グラムを追加します。
注: また、[クレンジング] 小さな試験管バスケット使用できます (古い、緑、イチゴのメッシュのパイントのバスケットは、ソースが困難) もともと使用されていたプラスチック メッシュ バスケットの代わりに。 - 均等に 250 ml のポンプを使用して霧花霧ボトル、ガラスのパン-パンの流出をキャプチャします。その後、きれいな遠心管に準備寒冷紗/漏斗を通して濾液を株します。結果として得られる準備をパッシブ- 花エキス (パス -FE); と呼びます上記の (ステップ 2.6) あたりとして格納します。
- 各 95% エタノール抽出と暖かい流水の間のすべてのコンポーネントをクリーンアップします。複製 (少なくともサンプルの種類ごとの 3) を提供するために複数のサンプルの抽出を繰り返します。
4. クロロホルム ベース花エキス (ch FE) 17
- (ステップ 2.1) の上あたりとブルーベリーとクランベリーの花を収集し、抽出 (手順 2.2、寒冷紗/漏斗準備なし) の花を準備します。使用前まで冷蔵の花を準備してください。
- クロロホルムで実行任意の作業は、ヒューム フード安全理由のために実行する必要があります。これは材料の準備が含まれています/ガラス、抽出手順とバイオアッセイ コンダクタンス (ch FE を使用して手順)。
- 95% ですべてのコンポーネントをきれい江藤 2 回、そして二度それぞれの抽出の汚染を防ぐためにクロロホルム: ガラスの培養管、2 ガラス ビーカー、小さなステンレス画面、および [ガラス] 大学院シリンダーをスレッドします。乾燥逆さまに置いておきます。95 で 2 回並んでポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) キャップをリンス %etoh のみ (クロロホルムはキャップの外側の材料を損傷することは) 乾燥しておきます。
- 1 を組み合わせる部分処理 9 パーツ クロロホルムに花 (1 wt: 9 巻比) ビーカーに (花、クロロホルム)、軽く 30 s、および 2 つ目のビーカーにステンレス スクリーンを通して歪みの旋回。ガラス培養管 (10-15 mL) 注ぎ、2 つ目のビーカーから ch 鉄とテフロン キャップを貼る。パラフィルム蒸発を防ぐためにキャップをラップします。
- これで準備はクロロホルム ベースの花エキス (ch FE) です。4 ° C で (光劣化を抑える) 暗闇の中で実験的に使用されるまでサンプルを格納します。複製 (少なくともサンプルの種類ごとの 3) を提供するために複数のサンプルの抽出を繰り返します。
5。 ブルーベリーの花 (BB rw-FE)16からの雨水のコレクション
注: ブルーベリー花雨水収集装置で構成されます接続アダプターと空気スプレーガン使い捨て塗料スプレー カップ (カップ: メネジ、アダプター: 男性へスレッド)、50 mL 遠沈管 (ポリプロピレン)、パラフィルム、およびプラスチック被覆電線 (標準の電話線、個々 の内部のワイヤー繊維の内容)。
- 雨水収集装置を作成する前に花の逃げるブルーベリー ブッシュ内の複数の場所を選択します。直下のブッシュ (クラウン) の非常に基本に花序 (花) が含まれます。レコード選択した地点に、この (1-5 cm に至る) 茎径は、下記のデバイス接続用の穴のサイズによって決定されます。
- 選択した箇所の回収装置を作成します。まずステップ ビットのドリル出版物に接続されている対応する幹直径 (どこへスレッド オープニング カップのカーブ) スプレー カップの下部に穴を開けます。その後、胴体の上部からスプレー カップの口の直線をカットします。スプレー カップの口で (大きさスレッド プラスチック被覆電線)、4 の等距離にある穴をドリルし、無料 1 つの端を残してプラスチック被覆ワイヤの一方の端を接続します。
- 50 mL 遠心分離機キャップ蓋に塗料噴霧器カップ アダプターをスレッド化するのに十分な大きさの穴を開けます。シールの漏れを防ぐためにパラフィルムのアダプター スレッド。遠心分離機キャップと噴霧器カップのねじ部の両方にこのファイルを添付します。嵌合 50 mL 遠心管を接続します。
- 選択した場所、サンプリング場所ごとに 4 つのコレクション デバイスの最小値に従って複数のデバイスを作成する手順 5.3 5.4.
- 茎に収まるように噴霧器カップを屈曲して選択した場所でデバイスを展開します。上向き (花の上を通過する水は、キャプチャを保証するため) に他の茎に付すプラスチック被覆ワイヤーを使用してスプレー カップのカット側に合わせます。パラフィルム雨水をリーク可能性があります任意の開口部に貼付します。(補足図 3図 4 の補足、補足図 5、および補足図 6)。
- ラベル コレクション管配置と日付/時刻します。雨のイベント後削除し、遠心管の底 (チューブ) 部分を置き換える (日付をラベル/コレクションの時間)。内部流出コレクション (ブルーベリー雨水花エキス (BB rw-FE) と呼ばれる) を持参し、真空フィルター (ろ過ステップ 2.4 〜 2.5 で説明されている)。上記の (ステップ 2.6) として店水ベースの生物検定で使用されるまで。
6. クランベリーの花 (CB rw-FE) からの雨水のコレクション
- 7 × 7 cm ポリプロピレン漏斗、50 mL 遠沈管 (ポリプロピレン)、パラフィルム、クランベリーの花雨水回収装置から成り、4 標準、プラスチック被覆結束バンド (接続デバイス数)。
- 最初に、熱は、金属プローブを用いた漏斗の口の周り 8 等距離にある穴 (結束バンドの直径) を穿刺します。4 つの穴に結束バンドを挿入します。その穴の反対の場所にきちんとした交差パターンを形成する他の端部を取り付けます。パラフィルムで目標到達プロセス ダウン幹をラップしておきます。
- ステップ ビット 50 mL 遠心分離機キャップに漏斗を茎を挿入するのに十分な大きさの穴を開けます。遠心分離機キャップに準備された漏斗を挿入します。手順 6.2 6.3 サンプリング場所ごとに 4 つのコレクション デバイスの最小値、複数のデバイスを作成するを繰り返します。
- 選択したクランベリー沼地にラベル (日付/時刻) デバイスを展開します。ちゃんと 2 つ花軸受花序 (アップライトとして知られている) 交差させたプラスチックねじれタイの下を挟みます。クランベリーのキャノピー (補足図 7-8、補足の映画 3) に遠心分離機管の穿孔によってデバイスを垂直方向に配置して。
- 降雨やオーバーヘッド灌漑後を削除し、遠心管の底 (チューブ) 部分を置き換える (日付をラベル/コレクションの時間)。内部流出 (クランベリー雨水花エキス (CB rw-FE) と呼ばれる) を持参し、真空フィルター (ろ過ステップ 2.4 〜 2.5 で説明されている)。上記の (ステップ 2.6) として店水ベースの生物検定で使用されるまで。
7. バイオアッセイ水ベース花エキス15,16 (アクティブ-渡す鉄-鉄、rw FE)
注: は、図 1を参照してください。
- この検定は、層流フードで準備されます。材料の準備: トリプル リンス ガラス coverslips 95% エタノールと空気乾燥、その後、脇に置きます。紙タオル ディスクを標準のプラスチック製細胞培養皿 (9 cm) の内部の直径にカットします。培養皿の中でペーパー ディスクの 2 層を配置し、2 ml の SDW を浸します。
- 脇5分生子 SDW 胞子懸濁液 (C. fioriniae) あたりとして (手順 1.2-1.4)、上記の mL あたり 1.0 × 10 の少なくとも 5 mL を準備します。次に、マイクロ遠心チューブ用 SDW と 2 mL の花のエキスを水ベースの平等なボリュームをミックスします。胞子懸濁液の等量を (SDW プラス FE); 準備 2 mL 遠心チューブに追加します結果として得られる準備を水溶液処理混合物と呼びます。コントロールの鉄の部分を省略し、SDW 胞子濃度の一貫性を維持するに置き換えます。
注: 部分のサイズはレプリケーションとタイム ポイントの数によって異なります。通常、部分は 500 μ L を超えないようにします。分生胞子と鉄を結合生物検定が始まりました、0 h 後接種。 - 細胞培養ディッシュに浸したペーパー タオルの上にあらかじめ洗浄し、ガラス coverslips を置きます。40 μ L 水溶液処理混合物の液滴を coverslip の中央に配置します。コントロールを含む目的の治療を繰り返し、細胞培養ディッシュを閉じます。レプリケーション (少なくとも 3) および時間ポイント (各料理は 1 時点) の別の細胞培養皿で繰り返します。すべてのトリートメントや複製をミックスすると、一度密閉プラスチック容器 (30 × 13 × 7 mm) にすべてレプリケートされた細胞培養皿を配置し、, 暗闇の中 25 ° C で。
- 所定の時点で成長を停止、液滴に葉身綿ブルー (20.0 g フェノール結晶、20.0 mL 2.5% 乳酸、40.0 mL グリセリン、0.05 g 綿ブルー) のような固定液の 10 μ L を追加し、半保存マウント。
- これによりガラス表面に胞子の付着が、胞子の発芽に十分な長さではない、0 h 時間ポイントを収集するために 2 時間を待ちます。他のすべての時間ポイントでは、対応する時に定着剤を追加します。
- 定着剤を追加すると、慎重に顕微鏡検査 (スライドあたり 1 coverslip) を容易にするガラス顕微鏡スライド上を液滴側に配置する、coverslips を反転します。すべて coverslips ガラス顕微鏡スライド上にある、それらを解決する置いたまま 20 分間流フードで部分的に乾燥しています。
- すべて分生子 (合計分生子) をいずれかの 400 倍の倍率 (16 フィールド カウント) を (4 つのフィールドをカウント) X 200 付着器だけでなく、(プライマリ分生子、発芽胞子と新しく形成された二次分生子) coverslip の提示数合計 3.808 ミリメートルのエリア2。 統計分析全体バイオアッセイをレプリケートします。水ベースの FE を使用して試金の分析データ ウォーラーらで説明されているよう201716、通常平均カウント/mm2 (合計分生胞子または付着器) を表示します。
8. バイオアッセイ クロロホルム ベース花エキス (ch FE)17
注: は、図 2を参照してください。
- 材料を準備し、上記の (手順 7.1) あたりとして培養皿の細胞します。さらに、ヒューム フード内ガラス ピペット (1 μ l 単位で 1 mL) と同様、coverslips、ヴァンの黒かび病菌細胞 (バント。 細胞) の数と同じ数 (8 mm 外径 6 mm 内径) リンス (95% で 2 回エタノール、クロロホルムで二回)、脇。
- 層流フードの 2 mL 遠心チューブを使用して 2 つの等しいボリューム (少なくとも 500 μ L 部分) の SDW と胞子懸濁液の 1 ボリュームを追加、脇します。これは ch FE 生物検定のため水溶液処理混合物です。
- 発煙のフード、バントを配置します。準備されたプラスチック製細胞培養ディッシュ内のガラス基板上にセルです。調剤 (ガラス製ピペット) 33 μ L 必要な ch FE のバン t. セルの中心に (、バントの壁を触れないでください。セル;コントロール治療のため追加処女クロロホルム)、乾燥できるようにと。レプリケーション (少なくとも 3) の別の細胞培養皿で繰り返します。
- Ch FE が乾燥したら、99 μ L 標準ピペットと準備された水溶液処理の混合物のバントの中心に分配します。セル、し、閉じるすべては細胞培養皿です。水溶液処理混合物は、乾燥した ch FE 治療接触していますが、一度生物検定が始まりました、0 h 後接種。
- すべてのトリートメントや複製をミックスすると、一度密閉プラスチック容器 (30 × 13 × 7 mm) にすべての (閉じた) 細胞培養皿を配置し、, 暗闇の中 25 ° C で。
- あらかじめ決められた時点で、バントに定着剤 (葉身綿ブルー) の 15 μ L を追加します。セルと十分な真菌染色を保証するために、少なくとも 5 分の座らせて。その時間の後、バントを慎重に取り外します。携帯し、(ステップ 7.5 7.6) の上 coverslip の逆転やデータ取得の手順に従います。データ分析、Gager 201517、通常観察 (3.808 mm2) に数えられる付着器に合計分生胞子の比である付着器形成、としてデータの表示で説明されている方法に従ってください。
9. クランベリー フェノロジー ベース抽出17
- 手は、クランベリーの花を収集 (6 月で 100 g)、未熟な果実 (2 回7 月と 8 月。200 g)、クランベリーの果実収穫を成熟し、(10 月; 200 g)、適切なサイズのビニール袋に、4 ° C でコレクションの直後に冷蔵庫で冷やします。(ステップ 2.1) 上記汚染予防策を使用します。
注: 各時に収集される余分な植物材料があるでしょうが、これらの金額は明らかに真菌感染した卵巣とフルーツ (症状や病気の兆候を示す) の抽出を防ぐ。 - 抽出、前に任意の劣化、破損、病気にかかった花を削除し、のみ健全な花を使用して、カーブタイプ鉗子 (45 ° ピンセット) と萼片、花柄、カローラ、柱頭、スタイルと雄しべを削除卵巣以外のすべてを破棄します。卵巣が収集されると、実行の 1 クロロホルムを用いた抽出 wt: 9 巻比 (卵巣のみを使用しての手順、4.2 4.4 で詳述)。他のすべての抽出が完了するまで、サンプルを保存すなわちバイオアッセイ コンダクタンスまで。
- フルーツ収集、クロロホルムを用いた抽出 (ステップ 4.2 4.4、花の代わりに収集された果実を使用して、実行が、フルーツの 10 g をクロロホルムの 90 mL に追加、一度抽出した、許可 (10 g: 9 mL wt の結果 9 mL を蒸発させるためのソリューション: 巻ソリューション)。
- 7 月、8 月、10 月を収集した後にすぐにフルーツ抽出を行います。上記の (手順 4.4) ごととしてストアをすべて抽出が収集されるまで。最後のクロロホルム ベース フルーツ抽出後クロロホルムに基づくバイオアッセイにこの試金のため収集したすべてのタギク ベースのクロロホルム抽出の対象し、それに応じて分析 (8.1 8.6 のステップ)。
Representative Results
ここに示す結果は、この方法論を使用して実行することができます多くの試金のほんの一例です。図 1は水に基づく FE バイオアッセイに図鑑と FE のクロロホルムに基づくバイオアッセイへ図 2によって補われます。図 3は、両方の水・ クロロホルム ・ ベース生物検定 (に比べ SDW コントロール) で 24 h で、 c. fioriniaeの微視的評価に期待される視覚的なガイドを提供します。図 4詳細はクランベリーのさまざまな 'スティーブンス' ch-FE, 存在下でc. fioriniaeと 24 h 時間コース研究と本研究のインポート結果を視覚的に参照を与える: 鉄減少感染構造を形成するために必要な時間SDW と比較。図 5は、coverslip バイオアッセイ クランベリー花雨水 (CB「花」rw-FE) から収集されたデータの例を示します。図 6は、もう一つの重要な結果を表します: 花卵巣 ch FE だったフルーツ ch-鉄のライフ サイクルにおけるブルームの重要性を示すよりもはるかに刺激c. fioriniae.補足写真やムービーは、抽出・可視化、アクティブ・パッシブの抽出 (映画に加えて花雨水コレクション デバイス/展開、花の重要なビジュアルを提供します。水ベースの) プロセス。
図 1: 花を水ベースの概要を抽出 (FE) バイオアッセイ。この試金はブルーベリーとクランベリーの花と花のエキスを水ベースのため利用された:アクティブ -花抽出 (アクティブ-FE)、受動的で花抽出 (渡す-FE) と花の雨水流出の特性 (rw FE)。-鉄の部分は通常実験/変数の因子を構成します。逆に FE の部分は定数に残ることができるし、時間のポイント/時間後接種を評価できます。好みは、200 倍の倍率で 4 のフィールド分析に向けて行われています。略語: 無菌純水、SDW;A. ビューのフィールド面積この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 花をクロロホルム ベースの概要を抽出 (ch FE) バイオアッセイ。この試金は、ブルーベリーとクランベリー (花、卵巣、フルーツ) の両方に利用されました。水溶液処理混合物の 1 つだけの種類は、この試金、(ch FE 蒸発により一貫性のある胞子濃度を保つため) に 2 つの部分 SDW に 1 部分の胞子懸濁液で使用されました。このアッセイは、複数 ch FE (様々 な植物の表面からワックス)、または単一 ch FE を使用して複数の時間ポイント/時間後接種を比較する使用できます。略語: 無菌純水、SDW;ヴァン ・黒かび病菌 [ガラス] セル、バント。セルです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:うり fioriniae水ベースの FE と ch 鉄存在下での視覚的な比較します。このアッセイ ブルーベリー 'ブルーク ロップ' (アクティブ-FE, 水ベース) (真菌の分離: BB #10) とクランベリー 'スティーブンス' クロロホルム ベース (ch-FE) (真菌の分離: CB PMAP182) 花エキス SDW コントロールと比較しました。SDWアクティブ(コントロール) (A)の存在下で胞子を比較制御するセカンダリ (リング) および付着器形成 (矢印) の劇的な増加が観察された-24 h 後接種で FE (B) 。ただし、セカンダリ 3量明らかにされなかった、ch FE (D); にクロロホルムのバイオアッセイ SDW コントロール(C)を比較するときむしろ、 C. fioriniae成長は付着器形成へシフト。水性抽出の種類ごとに共通の応答が示すように、クロロホルム ベースのホスト/花の種に関係なく記述されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: Ch 鉄存在下でうり fioriniaeと経時的研究 (24 h).このアッセイで、SDW コントロール(A ~ D)とクランベリー 'スティーブンス' ch FE (E ・ F)が 0、6、12、24 h 後接種 (複数の FE を比較する代わりに可変タイム ポイントの例) で視覚的に検査された.付着器形成 (矢印) は ch FE で 6 h から始まり、それ以降の時点で着実に増加します。この結果は、開花期間中に病原体の生物学の重要な要因に見逃されている: 花が感染構造を形成するために必要な時間を短縮します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 生物検定で rw FE を使って収集したデータのグラフィカル表示します。雨水のクランベリーの花 (CB「花」rw-FE) 逃げると単一のぬれイベントに加えて、標準的なアクティブ、クランベリー水ベース花エキス (CBアクティブからクランベリー植物ティッシュ (「グランド」rw-FE) を触れていなかった処女の雨水-FE) (肯定的な制御) SDW (マイナス コントロール) された coverslip の水性生物検定を受けるし、 c. fioriniae成長のための評価。CB「花」rw FE の方が、標準 CB としてアクティブなセカンダリ制御と付着器形成の同じレベル-コレクション デバイス キャプチャ中にリリースされた花の覚醒剤に効果的であったことを示す、予防接種 24 時間後で鉄、濡れイベントです。合計分生胞子は、新しく形成された二次胞子、分生子 (堆積) プライマリで構成されます。文字を示すフィッシャーの最小有意差によるとp < 0.05 で有意差テスト (LSD);大文字、合計分生子;小文字、付着器。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 基づくクランベリーのフェノロジー ch FE バイオアッセイ、目視検査します。腐朽菌は多くの場合フルーツの疾患管理にはブルーム時間殺菌剤アプリケーションが含まれます。ここでは、クランベリー ('・ スティーブンス') の複数の成長段階からクランベリー クロロホルム ベース抽出 (ch FE) は、24 h 後接種でc. fioriniaeの表面ワックスの効果を視覚的に行った。卵巣が 6 月(A)、7 月と 8 月に収集された未熟なフルーツの収集(B, C)、 (D)、10 月に収穫した果実を収集し、SDW コントロール(E)は付着器形成 (矢印) の検査されました。卵巣 ch-FE は、この植物のフェノロジー (ブルーム) がC. fioriniae のライフ サイクルはとても重要であることを示す付着器形成の最大の大きさを持っていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: ブルーベリー花序。ブルーベリーの花は、(表示 'ブルーク ロップ') 満開 (ニュージャージー州、アメリカ合衆国では 4 月-5 月) 中に抽出用に収集されました。補足図 2 (直立したクランベリー) に比べて花序の全体的なアーキテクチャと隣接する花からカローラ/卵巣の重複に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 2: クランベリー直立します。クランベリーの花は、(表示 'スティーブンス') 満開 (ニュージャージー、米国では 6 月-7 月) 中に抽出用に収集されました。(アップライト)、単一のクランベリー花房と、フックに様々 な花の段階、花冠の形を保持する水滴に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 3: ブルーベリー雨水展開 (花).ブルーベリー花雨水回収装置、花房のクラスターの直下に設置を完了しました。デバイスを縦向きに使用される合成樹脂被覆線に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 4: ブルーベリー雨水展開 (幹).完成したブルーベリー花雨水回収装置、花序とブッシュの王冠の間幹下半分の方法を置いた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 5: ブルーベリー雨水展開 (クラウン).ブルーベリー花雨水回収装置、ブッシュ (クラウン) の基地で配置を完了しました。注プラスチック被覆電線は必要に応じて削除できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 6: ブルーベリー雨水展開 (地面).処女雨水回収装置、ブルーベリー薮に隣接して配置を完了します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 7: クランベリー雨水展開 (接写).ちゃんと交差したワイヤーつながりの下に隠れて 2 つのアップライトとクランベリーの花雨水収集装置を完成しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 8: クランベリー雨水展開します。複数は、クランベリーの花雨水デバイス沼地に展開を完了しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足映画 1: アクティブ、水ベースの花エキス (アクティブ -FE).手順 2.3 2.5.1 補足ビデオをサポートします。ブルーベリー 'ブルーク ロップ' 花が使用されました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
補足映画 2:パッシブ、水ベースの花エキス (渡す-FE).3.3 3.4、補足のビデオ サポート次を手順します。ブルーベリー 'ブルーク ロップ' 花が使用されました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
補足映画 3: クランベリーの花雨水収集装置の展開。6.4 と補足のビデオ サポートの次をステップします。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
Discussion
C. fioriniae花エキス (FEs) レスポンスを検出生物検定は腐 pathosystems ブルーベリーとクランベリーの果実のため開発が他の園芸作物に容易に適応することができます。上記の詳細なプロトコルなど、多くの重要なデータ セットを取得するのに貴重なされましたが、これらに限定されない: 多数の病原体、様々 なフェスの存在下での真菌の成長段階に係る時間コース情報の複数の分離に及ぼす FE抽出法の比較、 c. fioriniaeの生長と分化、個々 の花の器官の評価に個々 の化学物質の検査を抽出、 C. fioriniae前で FE、効果に及ぼす温度の影響フェノロジー依存ワックス抽出および花雨水の効果。これらの技術を使用して生成されたデータはまたc. fioriniae生活のより明確に理解の段階、部分的に開花期間が多く果実腐敗の病原体の制御に非常に重要な理由を解明します。
最初に、すべての花が同じ、アクティブに処理された-FE, しかし、抽出プロセスが全体の花を使用してに向かって移動します。花の解剖時間がかかり、結果 FEs の生体活性に非常に小さな効果をあった。ただし、個々 の花器できがされてリリースされたの結果可能性があります評価を使用してこのプロトコルが細心の注意は、これとして (補足ムービー 12.3 の手順で詳細な注意事項)、花の組織を完全に漬け込むに取られなければなりません。菌類-毒性/静的微視的評価をゆがめる可能性のある鉄に化合物。以下のパスなど侵襲的な抽出 FE (補足の映画 2) rw FE、今より有利な買収の容易にするため。さらに、これらの抽出技術は真空ろ過のみ生物活性花化学手掛かりを取得するを必要があります。
すべて抽出利用花通常 0 - 3 冷却していた抽出準備日前。このプロトコルの挑戦は、FE の転換 (抽出物のストレージを使用してフィールド コレクション) の時間管理です。これは、複数のソースおよび日付から多数のサンプルでさらに悪化しました。冷凍花評価されていない任意の実際の範囲に劣化や変色した解凍花が表示されます。ただし、一度凍結を繰り返す水ベース フェスの準備が、融解を示している効果に、生物検定準備 (実行可能な 3 歳 FE) の後は鉄、FE として限り生物活性は凍結迅速に。
クロロホルムを用いた抽出では、病原体応答ガラス coverslips に ch FE 蒸発によって二次元で三次元の花/果実表面ワックスの調査を実行できます。しかし、ch FE から作製したワックスの実際の結晶構造が元が収集された表面に同一であるそうです。真菌の応答特定のワックス構造体内の調査の主な焦点は、する場合、意味、補足的な技術を実装する必要があります。抽出液のクロロホルム ベースでは、水ベースの抽出よりもストレージ メンテナンスを必要があります。暗闇の中で ch FE 抽出物を保つこと、に加えて PTFE ライニング細胞培養チューブ キャップとパラフィルム蒸発漏れを定期的にチェックする必要はラップをシールと必要に応じて交換してください。
花の雨水流出の特性を監視の概念は、サイト固有の病気の監視ツールを進める考えに根ざしています。雨水収集装置は、コレクション デバイス キャプチャ雨水が花から実行した限り、他の多くの植物のアーキテクチャに合わせることができます。この方法では、かどうか花刺激が任意の時点で、フィールドで存在しシーズンを通して監視することができますについて説明します。また、収集装置はどれ花キュー洗浄されている任意の中に濡れイベントを決定する複数のおおい場所に展開できます。将来的に実験、殺菌剤のアプリケーションが開始する必要があり、無事に終了することができますと rw FE が決まります。また、フェノロジー依存ワックス抽出 (プロトコル セクション 9) を監視することによって病原体の生物学を開花期間の重要性がさらに明らかになっています。そのセクションは一時的に分離されているホストの表面ワックスのサイド ・ バイ ・ サイド比較を可能にするメソッドを提供する、これらの生物検定の柔軟性を示すにも含まれていた。花の抽出技術と生物検定を使用して生成されるデータは、病原体の刺激、病原体の生物学、および将来制御戦略のためのターゲットに重要な特定の化学の授業の具体的な指標を表します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
サポート、ウィリアム s. ヘインズ、シニア恵まれているクランベリー研究基金とニュージャージー州ブルーベリーとクランベリー研究会に感謝します。またジェニファー Vaiciunas (指導及び花の準備)、クリスティン Constantelos (真菌文化と花の準備)、デヴィッド ・ ジョーンズ (花の準備と抽出)、ラングレー子 (花の準備、撮影/写真撮影)、ジェシーに感謝します。リンチ (花の準備)、ロクサーヌ Tumnalis (一般的なサポート)、および多数の学生/夏インターン。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | - | - | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | - | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | - | - | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Fume hood | Hamilton | - | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | - | - | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | - | - | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | - | - | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | - | - | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | - | - | Equipment, FE preparation |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | - | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | - | - | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | - | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | - | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
- Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167 (2016).
- Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
- Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
- Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
- Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
- Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
- Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
- Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
- Milholland, R. D. Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).
- DeMarsay, A. Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).
- Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
- Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
- Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86 (2002).
- MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
- Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
- Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
- Gager, J. The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).
- Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
- Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
- Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).
