Summary
בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.
Abstract
מיקום הגרעין בתוך התאים חשוב עבור תהליכים תאיים מרובים בהתפתחות והתחדשות. הדוגמה הכי מסקרן של מיצוב גרעיני מתרחשת במהלך התמיינות שרירי השלד. סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שהוקמה על ידי היתוך גרעיני של תאי קודמן שריר (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול. מיקום הגרעין הנכונה בתוך myofibers נדרש עבור התחדשות השרירים תקין והתפקוד. ההליך נפוצות להערכת בידול myoblast היווצרות myofiber מסתמך על תאים קבוע נותחו על ידי immunofluorescence, אשר פוגעת המחקר של תנועה גרעינית והתנהגות תא לאורך זמן. כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח של בידול myoblast היווצרות myofiber על ידי הדמיה תא חי. אנו מספקים תוכנה למעקב גרעיני אוטומטית להשיג תפוקה גבוהה אפיון כמותי של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast (קרי, את המסלול) במהלך התמיינות ופיוז'ן.
Introduction
שרירי השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף האדם, בהיקף של 35% - 40% של מסת גוף1. תאי לוויין הם תאי גזע שריר, המאופיינת אנטומית את עמדתם (juxtaposed כדי קרום פלזמה, מתחת הנדן הבזליים של סיבי שריר), כי להצמיח myoblasts מתרבים (myogenic ובתאים), אשר בסופו של דבר להבדיל להשתלב myofibers הקיימים ו/או הפתיל טופס חדש myofibers2,3,4. הגילוי שלהם ואת ההתקדמות בחקר הביולוגיה שלהם הוביל תובנות משמעותיות שריר התפתחות והתחדשות.
פרוטוקולים לבודד, להבדיל myoblasts לתוך myotubes פותחו לפני שנים רבות, נמצאים בשימוש נרחב עדיין ללמוד שרירי השלד בידול5,6,7. עם זאת, רוב השיטות האלה מייצגים סטטי שגרות אשר מסתמכים על הניתוח של תאים קבוע, כתוצאה מכך, תאפשר למדענים לחקור תהליכים מאוד דינמי, כגון myoblast פיוז'ן וההתבגרות myofiber באופן מלא. הדוגמה הבולט ביותר היא מיקום הגרעין, אשר הוא, עם גרעינים בתחילה במרכז myofiber, והיא, לאחר מכן, הממוקמים בפריפריה אחרי myofiber ההבשלה8,9. הדמיה חיה היא הטכניקה המתאימה ביותר כדי להשיג עוד תובנות תופעה מוזרה שכזו.
כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מדענים להקליט בידול myoblast היווצרות myotube על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות, כדי לבצע ניתוח כמותי החל מעקב אוטומטי של גרעינים myoblast. שיטה זו מספקת תפוקה גבוהה כמותיים אפיון של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast במהלך התמיינות ופיוז'ן. הפרוטוקול מחולק לארבעה חלקים שונים, כלומר (1) אוסף של השרירים hindlimbs של עכברים, (2) בידודו של ראשי myoblasts המורכבת עיכול אנזימטי ועל מכניים, התפשטות (3) myoblast, בידול ו (4) חיים הדמיה כדי לעקוב אחר גרעינים בתוך ה 16 הראשונה של בידול myoblast.
בהליך הבא, myoblasts מבודד ויזת עבודה H2B-GFP עכברים, שטופלו µg 1/mL דוקסילין לזירוז ביטוי ויזת עבודה H2B-GFP, כפי שתואר קודם לכן10. לחלופין, זה אפשרי כדי לבודד את myoblasts של אחרים העכברים הטרנסגניים המבטאים החלבון הניאון בגרעין או כדי transfect את התאים מבודד פראי-סוג עכברים להביע את החלבון הניאון בגרעין, כפי שתואר על ידי פימנטל ואח. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי סן רפאלה אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה.
1. ניתוח של השרירים hindlimb העכבר
- לחטא פינצטה ומספריים (שני ישרים ועקומים) על ידי autoclaving.
- להכין ולסנן (0.22 מיקרומטר) בכל אמצעי התקשורת (חסימה בינוני, בינוני עיכול, מתרבים בינוני, המבדילים בינוני) לפני תחילת הניסוי (ראה טבלה של חומרים).
- לשים 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) 35 מ מ פטרי לאוסף שריר.
- להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם או באמצעות CO2 , לחטא את העור עם אתנול. הסר את העור hindlimbs ואת הגפיים העליונות באמצעות מספריים, פינצטה, כדי להקל את ניתוקה של השרירים.
הערה: השרירים יכול להיות מבודד עכברים neonatal או למבוגרים. עכברים neonatal יש עלייה במספר תאי לוויין לעומת עכברים בוגרים. עם זאת, המספר הכולל של תאי לוויין זה יכול להיות מבודד למבוגרים עכבר אחת מספיקה לבצע את הניסוי המתואר להלן. - לבודד השוקתי הסוליה, השריר פושט האצבעות הארוך (EDL), הסובך, הארבע ראשי, התלת, לשים אותם בצלחת פטרי המכילות PBS. לעזוב את המנה על קרח. הסר בזהירות גידים ושומן עם פינצטה ומספריים מעוקר.
2. בידוד של myoblasts הראשי
הערה: כל נהלי תרבית תאים נעשים בתנאים סטריליים.
- הסר את השרירים, טוב, מגניב. לחתוך, מינצ השרירים, באמצעות מספריים מעוגלים סטרילי, עד מסה אחידה, מתקבל. לשים את השרירים החלקים לתוך צינור 50 מ.
- להוסיף 10 מ של המדיום עיכול החלקים שריר, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עצבנות חזקה (250 דקות-1) באמבט מים, לעכל enzymatically את השרירים.
- להוסיף 10 מיליליטר של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (DMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS), גלוטמין 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו גנטמיצין 1% (חסימה בינוני) כדי לעצור את העיכול.
- צנטריפוגה ב x 40 g למשך 5 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע בשפופרת 50 מ. שמור את צניפה על קרח.
הערה: לאחר צנטריפוגה, תגובת שיקוע מכיל כמה תאים הלוויין, תאי דם, תאי אנדותל ו fibroblasts, בעוד בגדר מכיל חתיכות מעוכל משרירים ורקמות. כדי להגדיל את מספר תאים בודדים, בגדר חייב להיות נתון שלבים נוספים של מערכת העיכול, כפי שמתואר להלן. - Centrifuge תגובת שיקוע ב x 650 גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS. שמור בגדר resuspended על הקרח.
- חזור על שלבים 2 x למשך שארית בגדר שהושג בשלב 2.4 2.2 – 2.5 ולהוסיף את כדורי resuspended לאחר מכן בגדר resuspended הראשון והתפאורה על קרח.
- עוברים את כדורי resuspended דרך מסנן מיקרומטר 70 ואז דרך פילטר מיקרומטר 40. להוסיף 15 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, צנטריפוגה ב x 650 גרם במשך 5 דקות.
- Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של מאגר פירוק של תאי הדם האדומים כדי לרוקן את תאי הדם האדומים. תקופת דגירה זה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 40 מ של PBS להפסיק את פירוק של כדוריות דם אדומות, ואת צנטריפוגה ב 650 x גרם במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של DMEM עם 10% FBS.
- בשלב preplating, לוחית רישוי התאים 20 מ של התפשטות בינוני בצלחת פטרי 150 מ מ ללא ציפוי. לאחר h 1 של דגירה ב חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2), לאסוף את המדיום.
הערה: Fibroblasts, הצמדת לצלחת, ואז מתבטלים, בעוד תאי לוויין להישאר ההשעיה. - חזור על שלב 2.9 3 x ו, בשלב preplating האחרונה, לאסוף את המדיום המכיל תאי לוויין ההשעיה.
- צנטריפוגה ב x 650 גרם במשך 5 דקות.
- בעוד התאים הם צריך שתוציאו, מעיל שתי צלחות פטרי 150 מ מ עם קולגן (10 מ"ל של פתרון 0.1% ב- 0.1 M חומצת חומץ). כדי לעשות זאת, לשים הקולגן בצלחת, תקופת דגירה של 5 דקות, ולהסיר אותו. תן את הצלחת יבש למשך 30 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע שהושג בשלב 2.11, resuspend בגדר תא ב- 40 מ של התפשטות בינוני (טבלה של חומרים). צלחת את התאים על שתי צלחות פטרי מצופים קולגן 150 מ מ (20 מ"ל לכל מנה) ולשמור התאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 5% O2) התפשטות בינוני במשך 2-3 ימים עם 1 µg/mL דוקסילין לזירוז ביטוי ויזת עבודה H2B-GFP.
הערה: שלב זה מאפשר ההתפשטות של myoblasts כדי לקבל מספר גדול יותר של תאים עבור עוד מבחני. תא צפיפות נשמר נמוך מאוד כדי למנוע הבחנה ספונטנית של myoblasts לתוך myotubes.
3. מבחני התפשטות ובידול Myoblast
הערה: כאשר myoblast צפיפות גבוהה, כמה תאים ליזום התארכות ולאחר מכן, יש צורך לפצל את התאים. באופן כללי, זה אפשרי לפצל תאים 2 x x-3 מבלי להשפיע על פנוטיפ שלהם.
- למחוק את המדיום, לשטוף את התאים עם 5 מ של PBS, להוסיף 2 מ של טריפסין (1 x), דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה תא עבור 5 דק הסימון תחת המיקרוסקופ ואת, כאשר תאים עגולים לנתק, הוסף 5 מ של DMEM עם 10% FBS כדי להשבית את טריפסין. לספור את מספר תאים (בדרך כלל זה ניתן לקבל כ עונה 1 פרק 106 תאים/עכבר...).
הערה: הדגירה עם טריפסין עבור 5 דקות בדרך כלל מספיק לנתק את myoblasts proliferating. - נושא את התאים לאחד מבחני המתוארים להלן.
-
התפשטות assay
- צלחת 50,000 תאים/טוב 1 מ"ל/טוב של התפשטות במדיום צלחת 12-ובכן מצופים קולגן, דגירה מצופים בתאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). לתקן ולספור את התאים 24, 48 או 72 h.
הערה: המדיום מוחלף כל 48 שעות כדי למנוע תשישות התזונתי.
- צלחת 50,000 תאים/טוב 1 מ"ל/טוב של התפשטות במדיום צלחת 12-ובכן מצופים קולגן, דגירה מצופים בתאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). לתקן ולספור את התאים 24, 48 או 72 h.
-
בידול assay
- מעיל צלחת 12-ובכן עם 350 µL של בידול בינוני המכיל קרום המרתף מטריקס (1: 100). דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהסיר את המדיום.
- צלחת 200,000 תאים/היטב במדיום בידול בצלחת מצופים מטריצה. דגירה התאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 5% O2) עד הם דבקים לצלחת (2 h הם בדרך כלל מספיק עבור התאים לדבוק וכדי להתחיל בידול).
- כדי להעריך בידול, לבצע צביעת שרשרת כבדה צולבות הקישור חוטים שרירן, גרעינים כמו שתואר לעיל11. לחלופין, לבצע ניתוח הדמיה לחיות כפי שמתואר להלן.
-
התפשטות assay
4. Live-הדמיה של בידול myoblast ומעקב גרעינית
- עבור תא חי הדמיה, לשים את התאים, שהתקבל בסעיף 3.2.2, מצופה של צלחת 12-ובכן, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, מאובזר עם מערכת דגירה כדי לשמור על התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
- השתמש מטרה יבש 20 x (0.7 NA) כדי לקבל מבט שדות עם מאות תאים, מספיק כדי לעקוב אחר היווצרות myofiber. ויזת עבודה H2B-GFP תאים יכולים לדימות עם לייזר בעוצמה נמוכה 488 ננומטר ארגון.
הערה: חריר פתוח מבטיח כי עומק התמונה (~ 10 מיקרומטר) מכיל את עובי התא כך תאים נשמרים בפוקוס לאורך כל הניסוי. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אמנם יתרון, שכן היא משפרת את יחס אות לרעש של התמונות, מיקרוסקופיית שדה רחב יכול לשמש גם. היווצרות Myofiber ניתן לנטר דרך ערוץ שידור. - לרכוש תמונות של 16 סיביות ו 1,024 x 1,024 פיקסלים לכל מסגרת כל 6 דקות עבור 16 h. לכל תפקיד הנרכש, ליצור קובץ multiframe.tif (ראה לדוגמה את הקבצים המשלימים).
הערה: בפרוטוקול הנוכחי, תוכנה מסחרית הקשורים עם המיקרוסקופ (טבלה של חומרים) שימש; השתמש התוכנה המתאימה כדי להשיג את אותה המטרה, כאשר באמצעות מיקרוסקופים אחרים. - להוריד את התוכנה המצורפת. zip קובץ משלים.
הערה: רוטינות הם קבצי script שיש להפעיל ב- MATLAB. התוכנה היא עיבוד של התוכנה שפורסמו12 אופטימיזציה עבור המעקב של הגרעינים במהלך היווצרות myotube. תוכנה זו מחולקת לשני חלקים: הראשון זיהוי הגרעינים בכל מסגרת לפי הממיין אותם, בעוד השני יוצר "מסלולים" (מסלולים) תנועת גרעינים. הקוד המלא עבור פילוח גרעיני ומעקב ומדריך צעד אחר צעד על תחילת העבודה ניתנים הקבצים המשלימים. - לחלץ את קובץ ה-zip, לשמור אותו בנתיב הרצוי על המחשב האישי (PC) בשימוש. לבצע את כל להלן קטעים במחשב עם התוכנה הדרושה מותקן כבר. שימו לב כי קובץ ה-zip מורכב שלוש תיקיות כאמור להלן.
הערה: פילוח רוטינות מכיל את הפונקציות להפעלה פילוח. מעקב אחר רוטינות, במקום זאת, מכיל את הפונקציות הדרושות עבור המעקב. מעקב אחר פילוח דוגמה מספק סקריפטים בסיסיים של קבצים כדי להכיר את המערכת. התוכנה פילוח והוא מעקב של הגרעינים פועל כהלכה ב- MATLAB, R2015a או גירסאות מאוחרות יותר. - כדי לחלק את הגרעינים מהקובץ. tif, שם הקובץ, לדוגמה, NameFile.tif.
- פתח את תיקיית מעקב פילוח דוגמה ולחץ על DoSegmentation.m. פעולה זו תפתח חלון הפקודה ב- MATLAB.
- בדוק את חלון התיקייה הנוכחית בצד שמאל כדי לראות את כל האלמנטים בתיקיה דוגמה של פילוח מעקב . לחץ פעמיים על DoSegmentation.m.
הערה: ניתן למצוא מידע מפורט על השינויים צריכים להיעשות בקובץ ה-script בקובץ StepbyStep.txt. זה הכרחי כדי לשנות את ה-script כך משתנה filenameinput היא NameFile.tif והיא folderinput התיקיה שבה נכלל בקובץ. tif - להריץ את הסקריפט (על ידי לחיצה על הירוק לחצן הפעל ). התוצאה של פילוח יישמרו של file.mat (SegmentedNameFile.mat), ואילו פילוח של הגרעינים, ניתן לאבחן באיור פלט.
הערה: פרמטרים עבור פילוח, תיאר בקובץ ה-script, יכול להיות שונה אם יש צורך. איכות פילוח ניתן לבדוק באמצעות קובץ ה-script CheckSegmentation.m (ראה קובץ StepbyStep.txt). בהתבסס על זה, אם האיכות של פילוח עניים (רק כמה גרעינים זוהה), להתאים את הפרמטרים של פילוח, בבירור שצוין בקובץ ה-script DoSegmentation.m , וחזור על ההליך.
- כדי להפיק את הרצועות (קרי, מסלולים של כל האטומים בזמן), באמצעות תנוחות גרעיני להשיג פילוח, להריץ את הסקריפט GenerateTracks.m לעבוד באותה תיקיה. הקפד להוסיף את הקובץ המתאים פילוח כקלט, שהושג בעבר (ראה הקובץ StepbyStep.txt למידע נוסף).
הערה: כפלט, המשתמש יהיה להשיג קובץ TrackedNameFile.mat, עם מטריצה עבור הקואורדינטות x ובמטריצה עבור הקואורדינטות-y של המסילה שנוצר. - להעריך את איכות המסילות CheckTracking.m (ראה את הקובץ StepbyStep.txt למידע נוסף). להשתמש את דמותו פלט של קטע זה האחרון כדי להמחיש לכל תפקיד רב-קוטבי בזמן. בדוק בצד השמאל של צלבים ירוק המציינים כל גרעין מקוטע. כדי לבחור גרעין אחד ספציפי, השתמש בפס הגלילה נמוכה יותר. שימו לב כי הקיף את הגרעין שנבחר באדום, ואילו בצד ימין, המסלול של התא שנבחר ניתן בעקבות בזמן (באמצעות הגלילה העליון).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לעקוב באופן אוטומטי של גרעיני התנועה במהלך התמיינות myoblast בתחום ההדמיה בשידור חי, הגרעינים יש מעדיפים fluorescently לתייג. חשוב לציין כי באמצעות מולקולות DNA-intercalating הוא לא ריאלי כי מולקולות אלה להפריע התפשטות ובידול של ראשי myoblasts13. לדוגמה, התפשטות ובידול יש כבר ניתחו ב ראשי myoblasts תרבותי עם או בלי Hoechst (איור 1). זה מתבטא התפשטות (איור 1 א', ב') ובידול (איור 1C, בחלונית האמצעית) לקויי חזקה ב- myoblasts תרבותי עם Hoechst 33342. לעומת זאת, myoblasts מבודד ויזת עבודה H2B-GFP עכברים ותרבותית עם דוקסיציקלין יש גרעינים עם פלורסצנטיות ירוק, להבדיל באופן דומה כדי myoblasts מבודד פראי-סוג עכברים (איור 1C, ימינה ושמאלה לוחות, בהתאמה).
תא חי הדמיה עם myoblasts הראשית המבטאת את החלבון ויזת עבודה H2B-GFP מאפשר את המעקב אחר גרעינים במהלך התמיינות (איור 2 , 1 וידאו משלימים). מיזוג תמונות של שידור ערוצי ה-GFP הראשונית (איור 2 א), בפעם האחרונה נקודות (איור 2B) במהלך הבידול של ויזת עבודה H2B-GFP myoblasts מאפשרות לזהות myotubes, וכתוצאה מכך גרעינים זה בסופו של דבר שילוב myotube (למשל, הגרעין בעיגול כחול) או גרעינים זה לא הפתיל לתוך myotube (למשל, הגרעין בעיגול אדום).
כדי לחלץ מידע על תנועות תא גרעינים מתוך נתוני הדמיה תא חי, זה אפשרי להשתמש בתוכנה שסופק לאתר של מסלולים של הגרעינים. התוכנה משתמשת בתמונה מערוץ ויזת עבודה H2B-GFP (הגרעינים; איור 3A) ליצירת מסיכה, כדי לחלק הגרעינים בכל מסגרת. עבור פילוח גרעינית בתוך מסגרת, סף "שמרנית" מסומנת באמצעות השיטה של אוטסו על התמונה לאחר Gaussian סינון14. בשלב הבא, חפצים הם בערך מקוטע; כדי להגיע פילוח עדינה יותר, כל אובייקט מוסווה שוב באמצעות סף בהתבסס על הממוצע של התיבה התוחמת שלו. המרה קו פרשת המים משמש לאחר מכן כדי להפריד (איור 3B) לאובייקטים סמוכים. בידיים שלנו, המרה קו פרשת המים אחת לא הייתה אפשרות להפרדת הגרעינים הסמוכים ביותר (איור 3B, * שיבוץ). לפיכך, היינו באזור בחר אובייקטים גדולים יותר בתמונה, להחיל שינוי צורה חדשה קו פרשת המים (איור 3B, * * שיבוץ), שבו הוא מסוגל להפריד נוספים בקרבת מקום רב-קוטבי. מתוך תפיסה זו, רוב האטומים מזוהים בתמונה (איור 3C).
כדי לעקוב אחר הגרעינים, שיפרנו את השגרה על-ידי שילוב של רוטינות מעקב שפרסם Tinevez15. בקיצור, האלגוריתם מעקב קישורים גרעינים זוהה במסגרות רצופים עם המטרה של הפחתת סכום המרחקים בין המיקום של כל גרעין בתוך מסגרת ואת המיקום של אותו גרעין בהפקה הבאה, באמצעות "האלגוריתם ההונגרית". וצמצום16. הצעד הוא חזר כדי לקשר הגרעינים אינם מקושרים שנמצאות עד מספר מרבי מסוימים של מסגרות משם. סף עבור המרחק המרבי בין המיקום של אובייקט בתוך מסגרת, והבא הוא גם הקים. עבור הנתונים שהוצגו כאן, מספר מרבי של חמישה מסגרות מרחק מירבי של 20 פיקסלים לכל שלב נותן מספר רב של מסלולי הנכונים (דמות תלת-ממד). חשוב לציין, אנו יכולים להשתמש רוטינות אלה כדי לבדוק את האיכות של המעקב. אפשרי גם להשתמש ב- script כדי למצוא תאים בעלי התנהגות נתונה, לדוגמה ויוצרים (או לא) myofiber, לאחר מכן ולנתח את תכונות דינמיות של קבוצת תאים עניין.
יישומי התוכנה יוצרת המסילה עם x ו- y-הקואורדינטות - עבור כל תא במסגרת n, 
, מאות תאים (דמות תלת-ממד). אנחנו יכולים להשתמש במידע כדי לחלץ מידע על תנועה רב-קוטבי. לדוגמה, העקירה הכולל בין המסגרת הראשונית (n = 0) ואת המסגרת הסופית N מוגדר כדלקמן.
תזוזה של מסלול = || 
||
כאן, "|| · ||" מייצג את הנורמה של וקטור (איור 4A).
המהירות של כל גרעין בתוך מסגרת n הוא כדלקמן.
לאחר מכן, אנו יכולים להגדיר את אורך מסלול תא נתון כדלקמן.
אורך המסלול =
בתור דוגמא איך הפרמטרים האלה פשוט כבר יכול לתת מידע רלוונטי, חושבו אורך מסלולים גרעינים של myoblasts מודגרות עם או בלי Hoechst. נראה כי האורך הכולל של מסלולים הוא מעט גבוה יותר עבור תאים מוכתם Hoechst, למרות ההבדל הוא לא משמעותי (איור 4B). עם זאת, כאשר חושבו העקירה סה כ במהלך זמן לשגות, הבחנו כי העקירה הכולל של תאים מוכתם Hoechst היתה הקטנה משמעותית מזה של תאים וללא רבב (איור 4C). אפשרות זו מציינת כי התנועה של תאים מוכתם יש כיוון התחתון. כדי לחזק את ההשערה הזו, אנחנו לכמת. הכיוון של התנועה של תא על-ידי חישוב הזווית של המהירות בכל מסגרת (איור 4A).
אנחנו גם לכמת את הווריאציה של הזווית בין מסגרות.
ניתן להגדיר את הווריאציה זווית הכולל לאורך מסלול כדלקמן אז.
סה כ וריאציה זווית =
כפי שחזיתי וריאציית זווית הכולל עבור התאים מוכתם באופן משמעותי קטן יותר בהשוואה תאים מוכתם Hoechst (איור 4D). לפיכך, אמצעי פשוט זה של כיוון, שהתקבלו מחישוב פשוט, מציין כי myoblasts מוכתם Hoechst נוטים פחות לשמור על הכיוון של עקירה שלהם, אשר משקף את יכולתם לקוי ויוצרים myotubes (איור 1).
בקיצור, נתונים הדמיה תא חי שנוצר כפי שמתואר כאן מספקים קישור כמותית בין דינמיקה הגרעין ואת היכולת טופס myotubes והוא יכול לשמש כקלט עבור תפוקה גבוהה אפיון כמותי של דינמיקה גרעינית ו- myoblast התנהגות במהלך התמיינות ופיוז'ן.
איור 1: הדגירה עם Hoechst משבשת התפשטות ובידול של myoblasts. (א) תמונות נציג של myoblasts הראשית מוכתם Hoechst לאחר 24 שעות הפצת בינוני (פאנל שמאלי) או תרבותי במשך 24 שעות ביממה התפשטות בינוני עם Hoechst (לוח נכון) ו- (B) כימות היחסי. נתונים הן זאת אומרת ± SEM, מובהקות סטטיסטית הוערכה עם הסטודנט t-מבחן. P < 0.05. (ג) להחליפן בתמונות של ראשי myoblasts פראי-סוג, תרבותי במשך 24 שעות ביממה ב המבדילים בינונית ללא (פאנל שמאלי) או עם Hoechst (לוח האמצעי), ועל myoblasts ויזת עבודה H2B-GFP תרבותי במשך 24 שעות ביממה ב המבדילים בינוני (לוח נכון), צבעונית עם Hoechst (כחול), נוגדן אנטי צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC; אדום). פסי בקנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לחיות הדמיה של ויזת עבודה H2B-GFP myoblasts במהלך התמיינות. התמונות הממוזגות של שידור, GFP ערוצי-(A) הראשונית (t = 0 h) ונקודות בפעם האחרונה (B) (t = 16 h) במהלך הבידול של ויזת עבודה H2B-GFP myoblasts (20 x המטרה). כמה דוגמאות של myotubes מודגשים עם חצים שחורים בחלונית B. פסי בקנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) Magnified מנוקד של אזורים לוחות A ו- B שבו הוא ניתן לזהות גרעין יחיד שמסיים שילוב myotube (בצבע כחול) או לא (באדום) ב- t = 0 h, t = 8 שעות, ו- t < / c12 > = 16 h. פסי בקנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: פילוח של ויזת עבודה H2B-GFP myoblasts מעקב במהלך התמיינות. (א) דוגמה מסגרת של הכשלים הזמן מציג את הגרעינים של תאים כ- 400. (B) דוגמה של גרעינים מיסוך, פילוח. אובייקטים מוארים הם מחולקים באמצעות גלובלית והן סף מקומיים, שינוי קו פרשת המים מוחל להפרדת בקרבת מקום רב-קוטבי. הגרעינים הסמוכים. עלול להתקשות קטע (* שיבוץ), כך פילוח המבוסס על קו פרשת המים השני מתבצע על אובייקטים של שטחים גדולים כדי לחלק מספר גבוה יותר של גרעינים (* * שיבוץ). (ג) זיהה עמדות גרעינית (צלבים אדומים), מתקדמים המשמשים האלגוריתם מעקב. (ד) מסלולים שנוצר באמצעות האלגוריתם מעקב זה ממזער את סכום המרחקים בין המיקום של כל אובייקט שתי מסגרות רצופים. ערך מרבי אפשרי של מרחק כזה עבור כל אובייקט מסופק כקלט המאפשר מדענים לקשר גרעינים מופרדים על ידי מסגרת אחת. פסי בקנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: כמותני של גרעינים dynamics לחשוף את היכולת הלקוי של myoblasts מודגרות עם Hoechst כדי לשמור על כיוון תא. (א) תיאור של פרמטר מדידות. זה אפשרי להגדיר את המהירות של גרעין על-ידי שוקל העמדה שתי מסגרות רצופים. הזווית מסלול, וריאציית זווית ניתן אז בקלות לחשב את העמדות כמצוין בתוכנית. (B) הפצה של אורך מסלולים, תזוזה מוחלטת (ג), (ד) וריאציה של זווית מסלולים myoblasts מתפשט בלי Hoechst (קו ירוק) או עם Hoechst (קו כחול). שתי ההפצות אינם שונים באופן משמעותי, בעוד המנוע הכולל גבוה משמעותית, וריאציה של הזווית הינה נמוכה באופן משמעותי עבור תאים וללא רבב (מבחן קולמוגורוב-סמירנוב חד צדדית, * 0.05 <p ו * *p < 0.005). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
1 וידאו משלימים: לחיות הדמיה של ויזת עבודה H2B-GFP myoblasts במהלך התמיינות. הדמיה של ויזת עבודה H2B-GFP myoblasts תרבותי ב המבדילים בינוני הראשונית (t = 0 h) לנקודות בפעם האחרונה (t = 16 h) באמצעות שידור ערוצי ה-GFP (20 x המטרה). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שנוצרו על ידי היתוך גרעיני של תאי שריר מבשרי (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול2,3, 4. כדי להעריך myoblast בידול, ההליך משותף מורכב culturing myoblasts המבדילים בינוני ותיקון התאים בנקודות זמן שונות כדי לבצע immunofluorescence מכתים עבור MyHC, סמן של בידול, כתמים גרעינים עם DNA-intercalating מולקולות (למשל, Hoechst)5. שיטה זו שימושית להעריך את הבידול myoblast על ידי מדידת פרמטרים שונים, כגון מדד בידול (מספר חיובי MyHC תאים/סה כ תא מס) או מדד פיוז'ן (מספר של myotubes עם מספר הטלפון הנייד לפחות שני גרעינים/סה כ) . עם זאת, myoblast פיוז'ן ויצירת myotube הן תהליכים דינמי מאוד לסמוך על תנועתיות גרעינים8. אכן, מיקום הגרעין בתוך myofibers נדרש עבור התחדשות שריר נכון, הפונקציה17. הניידות של myoblasts ושל בגרעין עלול להתברר פרמטר קריטי כדי להעריך את הבידול myoblast, שמתוכננות לגלות פגמים הרומן בהפרעות שרירים. . מכאן, זה חיוני כדי לפתח נוהלי הרומן ללמוד בהתנהגות התא והתנועה הגרעין במהלך myoblast בידול ויצירת myofiber.
כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מדענים בעקבות היווצרות הבידול והיתרון myotube myoblast תא חי הדמיה כדי לבצע כמותני מתוך מעקב אוטומטי של גרעין האטום. היתרון של שיטה זו היא האפשרות לעקוב במהלך הבידול של פלורסנט הגרעינים של myoblasts, מבודד עכברים ויזת עבודה H2B-GFP, ללא תאים תקנים או צביעת נוספים. ויזת עבודה H2B-GFP עכברים הם זמינים מסחרית, וכתוצאה מכך נגיש בקלות. לחלופין, ניתן לבודד את myoblasts של אחרים העכברים הטרנסגניים המבטאים החלבון הניאון בגרעין או כדי transfect את התאים מבודד פראי-סוג עכברים להביע את החלבון הניאון בגרעין, כפי שתואר לעיל9 . אלו אפשרויות שונות נוספות להרחיב על יישומים אפשריים של השיטה המוצגת כאן.
בפרוטוקול הנוכחי מתבסס על התרבות של myoblasts הראשית, כתוצאה מכך, השתנות גבוהה יכול להיות שנצפו בהליכים הבאים ניסיוני, גם בשל נוכחותם פוטנציאלי של תאים nonmyogenic לאחר הבידוד של השרירים18 . כדי להתגבר על מגבלה זו, זה אפשרי לבודד myoblasts על ידי התא מיון כפי שתואר לעיל19. עוד נקודה קריטית בשיטה המתוארת כאן הוא הקושי להפיק מעקב מושלם של גרעינים כאשר התאים הם קרובים אחד לשני, כמו במהלך היווצרות myotube. עם זאת, רוטינות התוכנה שנדונו כאן מאפשרות למדענים לבחון באופן חזותי את האיכות של המעקב ואם יש צורך לבחור תת-קבוצה של תאים עניין עבור ניתוח עוקבות. שיפור נוסף של התוכנה נדרש לספק אפיון מלא של דינמיקה הגרעין במהלך היווצרות myofiber.
לסיכום, שיטה זו שימושית לספק תובנות כמותיים גרעינים dynamics במהלך התמיינות myoblast על-ידי השוואת תנאים שונים, כפי דיווחנו עם Hoechst הדגירה. דוגמה זו ממחישה את היכולת לחלץ נתונים דינמיים בעלי משמעות ניסויים זמן לשגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי AFM-מופע ההתרמה כדי E.V. (#21545) ועל ידי המענק זרע Ospedale סן רפאלה (OSR) כדי ש ז (ZAMBRA5X1000). ד ר ז'אן-איב Tinevez מהרכזת ניתוח תמונה של מכון פסטר הוא הודה לשיתוף פומבי הרגלים "פשוטה אירועי הכיבוי" MATLAB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
- Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
