Summary
الهيكل العظمى والعضلات والتفريق هو عملية ديناميكية للغاية، التي تعتمد خاصة على المواقع النووية. وهنا يصف لنا طريقة لتعقب تحركات الأنوية بتصوير الخلية الحية أثناء تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست والقيام بوصف كمي لديناميات الأنوية باستخراج المعلومات من التعقب التلقائي.
Abstract
المواقع النووية داخل الخلايا مهم للعمليات الخلوية متعددة في مجال التنمية والتجدد. المثال الأكثر إثارة للاهتمام لتحديد المواقع النووية يحدث أثناء تمايز الهيكل العظمى والعضلات. ألياف العضلات (ميوفيبيرس) هي خلايا مولتينوكليتيد التي شكلتها انصهار خلايا السلائف العضلات (myoblasts) المستمدة من الخلايا الجذعية العضلية (خلايا الأقمار الصناعية) التي يخضع لها الانتشار والتفرقة. المواقع النووية الصحيح داخل ميوفيبيرس مطلوب من أجل تجديد العضلات السليمة والدالة. إجراءات مشتركة لتقييم تشكيل التمايز وميوفيبير ميوبلاست يعتمد على الخلايا الثابتة تحليلها بواسطة الفلورة، مما يعوق دراسة سلوك الحركة وخلية نووية على مر الزمن. هنا، نحن تصف أسلوباً لتحليل تشكيل التمايز وميوفيبير وميوبلاست بتصوير الخلايا الحية. نحن نقدم برنامج لتعقب النووي الآلي للحصول على وصف كمي الفائق ديناميات النووية والسلوك ميوبلاست (أي المسار) خلال التمايز والانصهار.
Introduction
الهيكل العظمى والعضلات من الأنسجة أكبر في الجسم البشري، وبلغ مجموعها 35-40 ٪ من كتلة الجسم1. الخلايا الأقمار الصناعية هي الخلايا الجذعية العضلية، تشريحيا تتميز بموقفهم (محاذياً لغشاء البلازما، تحت الصفيحة القاعدية لألياف العضلات)، التي تؤدي إلى تكاثر myoblasts (الخلايا السلف شذوذ)، وفي نهاية المطاف يفرق ودمج ميوفيبيرس القائمة و/أو الصمامات بشكل جديد ميوفيبيرس2،،من34. اكتشافهم والتقدم المحرز في دراسة تلك الأحياء أدى إلى أفكاراً هامة في تنمية العضلات والتجدد.
بروتوكولات لعزل وتفرق ميوبلاستس في ميوتوبيس قد وضعت منذ سنوات عديدة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيكل العظمى والعضلات التمايز5،،من67. بيد أن معظم هذه الطرق تمثل الإجراءات الثابتة التي تعتمد على تحليل الخلايا الثابتة، ونتيجة لذلك، عدم السماح للعلماء بالكامل استكشاف عمليات ديناميكية للغاية، مثل ميوبلاست الانصهار والنضج ميوفيبير. المثال الأكثر إثارة للدهشة هو تحديد المواقع النووية، التي محكم التنظيم، مع الأنوية في البداية في مركز ميوفيبير، وثم، تقع في المحيط بعد نضوج ميوفيبير8،9. تصوير الحية هو الأسلوب الأكثر ملاءمة الحصول على المزيد من الأفكار في هذه ظاهرة غريبة.
هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للعلماء لتسجيل تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست بالوقت الفاصل بين الفحص المجهري وإجراء تحليلات كمية من التعقب التلقائي لنواة ميوبلاست. يوفر هذا الأسلوب الفائق وصف كمية للسلوك وديناميات وميوبلاست النووية خلال التمايز والانصهار. البروتوكول وينقسم إلى أربعة أجزاء مختلفة، وهي: (1) جمع عضلات من هيندليمبس الفئران، (2) عزل myoblasts الأولية التي تتكون في الهضم الميكانيكي والانزيميه، وانتشار (3) ميوبلاست والتفريق (4) ويعيش التصوير لتعقب الأنوية داخل ح 16 الأولى من التمايز ميوبلاست.
في الإجراء التالي، وتعزل من الفئران H2B-التجارة والنقل ميوبلاستس وتعامل مع 1 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين للحث على التعبير H2B-التجارة والنقل، كما هو موضح سابقا10. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن لعزل ميوبلاستس من الفئران المحورة وراثيا الأخرى التي تعبر عن بروتين فلوري في النواة أو ترانسفيكت الخلايا المعزولة من الفئران البرية من نوع للتعبير عن بروتين فلوري في النواة، كما هو موضح بيمنتل et al. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان في سان رافائيل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.
1-تشريح العضلات اللكتات الماوس
- تعقيم الملقط ومقص (مستقيمة ومنحنية) بالتعقيم.
- إعداد وتصفية جميع وسائل الإعلام (حظر المتوسطة، متوسطة الهضم، تنتشر المتوسطة، والتفريق بين المتوسطة) (0.22 ميكرومتر) قبل بدء التجربة (انظر الجدول للمواد).
- ضع 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) في 35 مم طبق بيتري لمجموعة العضلات.
- التضحية الماوس بخلع عنق الرحم أو بواسطة استخدام CO2 وتعقيم الجلد مع الإيثانول. إزالة الجلد من هيندليمبس واطرافهم العليا باستخدام مقص وملاقط، تيسيرا لعزل العضلات.
ملاحظة: يمكن العضلات معزولة من الفئران حديثي الولادة أو للبالغين. الفئران حديثي الولادة بزيادة عدد الخلايا الأقمار الصناعية مقارنة بالفئران الكبار. العدد الإجمالي للخلايا الأقمار الصناعية التي يمكن أن تكون معزولة عن ماوس الكبار واحدة غير كافية لإجراء التجربة المبينة أدناه. - عزل الظنبوبي، سولاس، باسطة أصابع طويلة (مؤسسة كهرباء لبنان)، والساق، والفخذ، وثلاثية الرؤوس، ووضعها في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني. ترك الطبق على الجليد. بعناية إزالة الأوتار والدهون مع مقص معقم وملاقط.
2-عزل ميوبلاستس الابتدائي
ملاحظة: تتم جميع الإجراءات المتعلقة بزراعة الخلايا في ظروف معقمة.
- إزالة العضلات من برنامج تلفزيوني. قص وفرم العضلات، باستخدام مقص منحنى العقيمة، حتى يتم الحصول على كتلة موحدة. وضع القطع العضلات في أنبوب 50 مل.
- إضافة 10 مل متوسط الهضم إلى قطع العضلات واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت الانفعالات قوية (250 دقيقة-1) في حمام مائي، لهضم انزيماتيكالي العضلات.
- قم بإضافة 10 مل دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (دميم) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، الجلوتامين 1%، 1% البنسلين/ستربتوميسين والجنتاميسين 1% (حظر المتوسطة) لوقف عملية الهضم.
- الطرد المركزي في 40 س ز لمدة 5 دقائق وجمع المادة طافية في أنبوب 50 مل. حفظ بيليه على الجليد.
ملاحظة: بعد الطرد المركزي، المادة طافية تحتوي على بعض الخلايا الأقمار الصناعية وخلايا الدم، وخلايا بطانية والليفية، بينما بيليه يحتوي على قطع من عسر الهضم العضلات والنسيج الضام. لزيادة عدد الخلايا المعزولة، يجب أن تخضع بيليه إلى اتخاذ خطوات إضافية الهضم كما هو موضح أدناه. - الطرد المركزي المادة طافية على 650 x ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS. تبقى بيليه ريسوسبينديد على الجليد.
- كرر الخطوات من 2، 2 – 2.5 x 2 لبقية بيليه التي تم الحصول عليها في الخطوة 2، 4 وإضافة الكريات ريسوسبينديد في وقت لاحق إلى بيليه ريسوسبينديد الأولى يحافظ على الجليد.
- تمر الكريات ريسوسبينديد من خلال عامل تصفية 70 ميكرومتر، ومن ثم من خلال عامل تصفية 40 ميكرومتر. إضافة 15 مل دميم مع 10% FBS، وأجهزة الطرد المركزي في 650 x ز لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء إلى استنزاف خلايا الدم الحمراء. تبني عليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 40 مل من برنامج تلفزيوني إيقاف تحلل لخلايا الدم الحمراء، والطرد المركزي في 650 x ز لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 5 مل دميم مع 10% FBS.
- كخطوة بريبلاتينج، لوحة الخلايا في 20 مل متوسط الانتشار في طبق بتري 150 مم غير مصقول. بعد 1 ساعة للاحتضان في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2)، جمع المتوسطة.
ملاحظة: الليفية، إرفاق إلى اللوحة، ثم سيتم تجاهلها، بينما تبقى الخلايا الأقمار الصناعية في التعليق. - كرر الخطوة 2.9 3 x، وفي آخر خطوة بريبلاتينج، وجمع المتوسطة التي تحتوي على الخلايا الأقمار الصناعية في التعليق.
- أجهزة الطرد المركزي في 650 x ز لمدة 5 دقائق.
- في حين يتم سينتريفوجينج الخلايا، معطف اثنان أطباق بيتري 150 مم مع الكولاجين (10 مل حل 0.1% في حمض الخليك 0.1 M). للقيام بذلك، وضع الكولاجين على اللوحة واحتضان لمدة 5 دقائق وإزالته. تسمح لوحة الجاف لمدة 30 دقيقة.
- تجاهل المادة طافية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.11 وريسوسبيند بيليه الخلية في 40 مل من انتشار المتوسطة (جدول المواد). لوحة الخلايا في أطباق بتري المغلفة بالكولاجين 150 مم اثنين (20 مل في الطبق) وإبقاء الخلايا في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، 5% O2) في انتشار المتوسطة لمدة 2-3 أيام مع 1 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين للحث على التعبير H2B-التجارة والنقل.
ملاحظة: هذه الخطوة يتيح انتشار ميوبلاستس للحصول على عدد أكبر من الخلايا لفحوصات إضافية. يتم الحفاظ على كثافة الخلية منخفضة جداً لتجنب تفريق عفوية من ميوبلاستس إلى ميوتوبيس.
3-ميوبلاست فحوصات الانتشار والتمايز
ملاحظة: عند ارتفاع الكثافة ميوبلاست، تبدأ بعض الخلايا استطالة، وثم، من الضروري لانقسام الخلايا. وبصفة عامة، فمن الممكن لتقسيم الخلايا 2 x x-3 دون أن يؤثر ذلك على النمط الظاهري.
- تجاهل المتوسطة وتغسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، إضافة 2 مل التربسين (س 1)، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة خلية للحد الأدنى 5 الاختيار تحت المجهر و، عند فصل خلايا الجولة، إضافة 5 مل دميم مع 10% FBS لإلغاء تنشيط التربسين. حساب عدد الخلايا (عادة من الممكن الحصول على حوالي 1 × 106 خلايا/الماوس).
ملاحظة: الاحتضان مع التربسين لمدة 5 دقائق يتم عادة ما يكفي لفصل myoblasts المتكاثرة. - تخضع الخلايا لأحد الاختبارات الموصوفة أدناه.
-
تحليل انتشار
- لوحة 50,000 الخلايا/جيدا في 1 مل/جيد من متوسط الانتشار في صفيحة 12-جيدا المغلفة بالكولاجين واحتضان خلايا مطلي حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2). إصلاح، وحساب عدد الخلايا في 24 أو 48 أو 72 ح.
ملاحظة: يتم استبدال المتوسطة كل 48 ساعة لتجنب استنفاد المغذيات.
- لوحة 50,000 الخلايا/جيدا في 1 مل/جيد من متوسط الانتشار في صفيحة 12-جيدا المغلفة بالكولاجين واحتضان خلايا مطلي حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2). إصلاح، وحساب عدد الخلايا في 24 أو 48 أو 72 ح.
-
تحليل التمايز
- معطف صفيحة 12-جيدا مع 350 ميليلتر من التمايز المتوسطة تحتوي على مصفوفة الغشاء (1: 100). احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإزالة المتوسطة.
- لوحة 200,000 الخلايا/بئر في الأجلين المتوسط والتمايز في لوحة المغلفة بالمصفوفة. احتضان الخلايا في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2، 5% O2) حتى أنها تلتزم باللوحة (ح 2 عموما ما يكفي للخلايا على الالتزام ويبدأ التمايز).
- لتقييم التمايز، نفذ تلطيخ للسلسلة الثقيلة الميوسين ونوى كما هو موضح سابقا11. وبدلاً من ذلك، إجراء تحليلات العيش-التصوير كما هو موضح أدناه.
-
تحليل انتشار
4-لايف-تصوير ميوبلاست التمايز وتعقب النووي
- للخلية الحية التصوير ووضع الخلايا، والتي تم الحصول عليها في قسم 3.2.2 ومطلي في لوحة 12-حسنا، تحت مجهر [كنفوكل]، مجهزة بنظام لحضانة للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
- استخدم هدفا جافة 20 x (0.7 غ) للحصول على عرض للحقول مع مئات خلايا، ما يكفي لرصد تشكيل ميوفيبير. يمكن تصويرها الخلايا H2B-التجارة والنقل مع ليزر أرجون منخفضة كثافة 488 نانومتر.
ملاحظة: ثقب مفتوحة يضمن أن عمق الصورة (~ 10 ميكرومتر) يحتوي على سمك الخلية حيث أن الخلايا التي يتم الاحتفاظ بها في التركيز طوال التجربة. استخدام مجهر [كنفوكل] مفيد حيث أنه يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء الصور، على الرغم من أن يمكن أيضا استخدام مجهر واسع المجال. تشكيل ميوفيبير يمكن رصدها من خلال قناة الإرسال. - الحصول على الصور من 16-بت و 1,024 x 1,024 بكسل كل إطار كل دقيقة 6 ح 16. لكل موقف المكتسبة، إنشاء ملف multiframe.tif (راجع المثال في الملفات التكميلية).
ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمت البرمجيات التجارية المرتبطة بالمجهر (جدول المواد)؛ استخدام البرامج المناسبة لتحقيق نفس الهدف عند استخدام المجاهر الأخرى. - تنزيل البرامج المتوفرة.zip ملف تكميلي.
ملاحظة: هي الإجراءات البرامج النصية التي يجب تشغيلها في MATLAB. البرنامج تكييف البرامج المنشورة12 الأمثل لتتبع الأنوية أثناء تشكيل ميوتوبي. وينقسم هذا البرنامج إلى جزأين: الأول يحدد الأنوية في كل إطار بتجزئة لهم، بينما يولد ثانية واحدة "المسارات" (مسارات) حركة الأنوية. يتم توفير التعليمات البرمجية الكاملة لتجزئة النووية والتعقب ودليل خطوة بخطوة للشروع في العمل في الملفات التكميلية. - استخراج ملف مضغوط وحفظه في مسار المطلوب على الكمبيوتر الشخصي (PC) باستخدام. تنفيذ كافة أدناه المقاطع على جهاز كمبيوتر مع البرامج الضرورية مثبتة بالفعل. لاحظ أن ملف.zip يتكون من ثلاثة مجلدات كما هو مذكور أدناه.
ملاحظة: يتضمن إجراءات تجزئة المهام ليتم تشغيلها للتجزئة. بدلاً من ذلك، يتضمن إجراءات تتبع، والمهام المطلوبة للتتبع. ويقدم المثال تجزئة تتبع الملفات التعرف على النظام والبرامج النصية الأساسية،. البرمجيات المستخدمة لتجزئة وتتبع الأنوية يعمل بشكل صحيح في MATLAB، R2015a أو الإصدارات الأحدث. - لتجزئة الأنوية من ملف.tif، اسم الملف، على سبيل المثال، NameFile.tif.
- افتح المجلد تتبع المثال تجزئة ، وانقر فوق DoSegmentation.m. سيؤدي هذا إلى فتح إطار الأوامر في MATLAB.
- تحقق من إطار المجلد الحالي على اليسار لمشاهدة كافة العناصر الموجودة في المجلد المثال تتبع تجزئة . انقر نقراً مزدوجاً فوق DoSegmentation.m.
ملاحظة: يمكن الاطلاع على معلومات مفصلة بشأن التعديلات التي يتعين القيام به في البرنامج النصي في ملف StepbyStep.txt. وملزمة تعديل البرنامج النصي بحيث المتغير فيلينامينبوت NameFile.tif و فولديرينبوت هو المجلد حيث يرد ملف.tif. - تشغيل البرنامج النصي (بواسطة النقر فوق على الأخضر زر تشغيل ). سيتم حفظ نتيجة للتجزئة file.mat (SegmentedNameFile.mat)، في حين يمكن تصور تجزئة الأنوية في الشكل الناتج.
ملاحظة: يمكن تعديل المعلمات للتجزئة، المبينة في البرنامج النصي، إذا لزم الأمر. يمكن التحقق من نوعية التجزئة باستخدام البرنامج النصي CheckSegmentation.m (راجع الملف StepbyStep.txt). وبناء على ذلك، وإذا كانت جودة التجزئة الفقراء (فقط بضع أنوية الكشف)، ضبط معلمات التجزئة، بوضوح في البرنامج النصي DoSegmentation.m ، وكرر الإجراء.
- لإنشاء المسارات (أي مسارات كل من الأنوية في الوقت المناسب)، استخدام المواقع النووية التي تم الحصول عليها في التجزئة، تشغيل البرنامج النصي GenerateTracks.m في نفس مجلد العمل. تأكد من إضافة ملف تجزئة السليم كمدخل، التي تم الحصول عليها من قبل (انظر الملف StepbyStep.txt للحصول على مزيد من المعلومات).
ملاحظة: كناتج، المستخدم سيتم الحصول على ملف TrackedNameFile.mat، مع مصفوفة لإحداثيات س ومصفوفة أخرى لإحداثيات ص من المسارات التي تم إنشاؤها. - تقييم نوعية المسارات باستخدام CheckTracking.m (راجع الملف StepbyStep.txt للحصول على مزيد من المعلومات). استخدم الرقم الناتج من هذا المقطع الأخير للمساعدة في تصور كل موقف النوى في الوقت المناسب. تحقق من على الجانب الأيمن للصلبان الخضراء التي تشير إلى كل نواة مجزأة. لتحديد أحد نواة محددة، استخدم شريط التمرير السفلي. ملاحظة أن سوف يكون دائريا نواة المحدد باللون الأحمر، بينما على اليمين، مسار الخلية المحددة يمكن اتباعها في الوقت المناسب (باستخدام شريط التمرير العلوي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تلقائياً اتباع حركة النووية خلال التمايز ميوبلاست في تصوير حية، الأنوية ينبغي أن ترتبط بشكل تفضيلي يكون فلوريسسينتلي المسمى. من المهم ملاحظة أن استخدام جزيئات الحمض النووي إينتيركالاتينج ليس ممكناً لأن هذه الجزيئات تتداخل مع انتشار والتفريق بين myoblasts الابتدائية13. على سبيل مثال، قد تم تحليلها الانتشار والتمايز في الابتدائي myoblasts مثقف مع أو بدون هويشت (الشكل 1). من الواضح أن انتشار (الشكل 1 أ، ب) والتمايز (الشكل 1، الفريق الأوسط) هي ضعف بشدة في myoblasts مثقف مع هويشت 33342. على العكس من ذلك، ميوبلاستس المعزولة من الفئران H2B-التجارة والنقل ومثقف مع الدوكسي الأنوية مع الفلورية الخضراء والتفريق بين المثل إلى ميوبلاستس معزولة من الفئران البرية من نوع (الشكل 1، اليمين واليسار لوحات، على التوالي).
يسمح التصوير خلية يعيش مع myoblasts الأولية معربا عن البروتين H2B-التجارة والنقل تتبع الأنوية خلال التمايز (الشكل 2 و التكميلي فيديو 1). دمج الصور من انتقال العدوى وقنوات التجارة والنقل في الأولى (الشكل 2A) والوقت النهائي النقاط (الشكل 2) أثناء التفريق بين myoblasts H2B-التجارة والنقل السماح للعلماء بتحديد ميوتوبيس، ومن ثم نوى أن ينتهي إدماج في ميوتوبي (مثلاً، النواة في دائرة زرقاء) أو نوى أن الصمامات لا في ميوتوبي (مثلاً، النواة في دائرة حمراء).
لاستخراج معلومات عن تحركات النوى/خلية من بيانات التصوير الخلية الحية، من الممكن استخدام البرامج المتوفرة لتتبع مسارات الأنوية. يستخدم البرنامج الصورة من القناة H2B-التجارة والنقل (الأنوية؛ الشكل 3 ألف) لإنشاء قناع وللجزء الأنوية في كل إطار. لتجزئة النووية في إطار، يتم تحديد عتبة "المحافظين" استخدام الأسلوب في أوتسو على الصورة بعد تصفية14الضبابي. المقبل، بالكائنات تقريبا مجزأة؛ للحصول على تجزئة الدقيقة، هو حجب كل كائن مرة أخرى باستخدام عتبة استناداً إلى المتوسط في المربع المحيط به. ثم يتم استخدام تحويل مستجمعات المياه لفصل الكائنات (الشكل 3B) القريبة. في أيدينا، كان أحد مستجمعات المياه التحويل غير قادر على فصل معظم الأنوية القريبة (الشكل 3B، * اقحم). وهكذا، كنا المنطقة لتحديد كائنات أكبر في الصورة، وتطبيق تحويل مستجمعات المياه جديدة (الشكل 3B، * * اقحم)، التي هي قادرة على فصل إضافي قريب الأنوية. مع هذا النهج، يتم تحديد معظم الأنوية في الصورة (الشكل 3).
لتعقب الأنوية، قمنا بتحسين الإجراءات من خلال دمج إجراءات تتبع نشرتها تينيفيز15. وباختصار، يربط الخوارزمية تتبع نوى اكتشفت في إطارات متتالية بهدف التقليل من مجموع المسافات بين موقف كل نواة في إطار ووضع نواة نفسه في المرحلة التالية، باستخدام "الخوارزمية الهنغارية" لمثل هذه 16من التقليل إلى أدنى حد. يتم تكرار الخطوة بغية الربط بين الأنوية غير المرتبطة التي تصل إلى الحد أقصى عدد معين من الإطارات بعيداً. كما يتم تأسيس عتبة للمسافة القصوى بين موقف كائن في إطار، والمرحلة التالية. للبيانات المقدمة هنا، الحد أقصى لعدد الإطارات الخمسة ومسافة أقصاها 20 بكسل لكل خطوة تعطي عدد كبير من المسارات الصحيحة (3D الشكل). الأهم من ذلك، يمكننا استخدام هذه الإجراءات للتحقق من جودة التتبع. من الممكن أيضا استخدام هذا البرنامج النصي للبحث عن الخلايا التي تحتوي على سلوك معين، على سبيل المثال تشكيل (أو لا) ميوفيبير، وبعد تحليل الميزات الديناميكية من مجموعة الخلايا للفائدة.
البرمجيات التطبيقية يولد المسارات مع إحداثيات س وص-لكل خلية في الإطار ن، 
، لمئات خلايا (الشكل 3D). ونحن نستخدم هذه المعلومات لاستخراج معلومات حول حركة الأنوية. على سبيل مثال، تشريد مجموع بين الإطار الأولى (n = 0)، وفيما يلي تعريف الإطار النهائي ن .
تشرد مسار = || 
||
وهنا، "|| · ||" لتقف على القاعدة لمكافحة ناقلات (الشكل 4 أ).
سرعة كل نواة في الإطار ن على النحو التالي.
وبعد ذلك، يمكننا تعريف طول مسار لخلية معينة كما يلي.
طول المسار =
كمثال عن كيفية هذه المعلمات بسيطة يمكن أن تعطي الفعل المعلومات ذات الصلة، ونحن حسابها طول مسارات نوى myoblasts المحتضنة مع أو بدون هويشت. ويبدو أن الطول الإجمالي للمسارات أعلى بصورة طفيفة للخلايا ملطخة هويشت، على الرغم من أن الفرق ليس كبيرا (الشكل 4 باء). ومع ذلك، عندما نحن يحسب إجمالي حمولتها أثناء الفاصل الزمني، نحن لاحظت أن تشريد مجموع الخلايا ملطخة هويشت أصغر بكثير من أن الخلايا أونستينيد (الشكل 4). وهذا يشير إلى أن حركة الخلايا ملطخة اتجاه أقل. لزيادة تعزيز هذه الفرضية، نحن كمياً اتجاهية للاقتراح بخلية بحساب زاوية السرعة في كل إطار (الشكل 4 أ).
ونحن أيضا كمياً اختلاف الزاوية بين الإطارات.
ثم يمكن تعريف التباين مجموع زاوية على طول مسار كما يلي.
مجموع زاوية الاختلاف =
كما كان متوقعا، تباين الزاوية الإجمالية للخلايا أونستينيد هو إلى حد كبير أصغر بالمقارنة مع الخلايا ملطخة هويشت (الشكل 4). ومن ثم فهذا قدر بسيط من اتجاهية، التي تم الحصول عليها من عملية حسابية بسيطة، ويشير إلى أن myoblasts ملطخة هويشت أقل عرضه للحفاظ على اتجاه النزوح، مما يعكس قدرتها البصر في تشكيل ميوتوبيس (الشكل 1).
وباختصار، خلية حية تصوير البيانات الناتجة كما هو موضح هنا بتوفير ارتباط كمية بين ديناميات النووية والقدرة على ميوتوبيس النموذج ويمكن استخدامها كمدخلات لوصف كمي الفائق لديناميات النووية وميوبلاست السلوك خلال التمايز والانصهار.
رقم 1: حضانة مع هويشت يتداخل مع انتشار والتفريق بين ميوبلاستس- (أ) صور الممثل myoblasts الابتدائي ملطخة هويشت بعد 24 ساعة في انتشار المتوسطة (اللوحة اليمنى) أو مثقف عن 24 ساعة في المتوسط الانتشار مع هويشت (اللوحة اليمنى)، و (ب) التحديد الكمي النسبي. البيانات هي يعني ± ووزارة شؤون المرأة، وتم تقييم الدلالة الإحصائية مع الطالب t-اختبار. ف < 0.05. (ج) صور الممثل من الابتدائي البرية من نوع myoblasts، مثقف ح 24 في التفريق بين المتوسطة دون (اللوحة اليمنى) أو مع هويشت (الفريق الأوسط)، ومن ميوبلاستس H2B-بروتينات فلورية خضراء مثقف ح 24 في التفريق بين المتوسطة (اللوحة اليمنى) والملون مع هويشت (أزرق) وجسم سلسلة ثقيلة المضادة الميوسين (ميك؛ الأحمر). أشرطة مقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: يعيش تصوير myoblasts H2B-التجارة والنقل خلال التمايز. القنوات الصور المدمجة للنقل والتجارة والنقل في (أ) الأولى (t = 0 ح) والنقاط الزمنية النهائية (ب) (t = ح 16) أثناء التفريق بين myoblasts H2B-التجارة والنقل (20 x الهدف). يتم تمييز بعض الأمثلة عن ميوتوبيس بالسهام السوداء في الفريق ب. أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر-(ج) ماجنيفيد منقط مجالات من الألواح أ و ب التي من الممكن التعرف على نواة واحدة التي ينتهي بها المطاف إدماج ميوتوبي (باللون الأزرق) أو لا (باللون الأحمر) عند t = 0 h, t = ح 8، و t = ح 16. أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تجزئة myoblasts H2B-التجارة والنقل التي تتبع خلال التمايز. (أ) مثال للإطار من هفوات وقت عرض نويات الخلايا حوالي 400. (ب) مثال نوى إخفاء وتجزئة. الأجسام الساطعة هي مجزأة باستخدام عالمية ومحلية لعتبة، ويطبق تحولاً فاصلاً لفصل القريبة الأنوية. نوى القريبة قد يكون من الصعب على الجزء (* اقحم)، بحيث يتم تجزئة ثانية على أساس مستجمعات المياه في كائنات مساحات كبيرة لتقسيم ارتفاع عدد الأنوية (* * اقحم). (ج) الكشف عن المواقف النووية (الصلبان الحمراء)، التي الأحدث المستخدمة في خوارزمية التتبع. (د) المسارات التي تم إنشاؤها باستخدام خوارزمية التتبع أن يقلل من مجموع المسافات بين موقف كل كائن في إطارين متتاليين. الإمكان الحد أقصى لقيمة هذه المسافة لكل كائن يتم توفيرها كمدخل يسمح للعلماء لربط نوى مفصولة بإطار واحد أو أكثر. أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التحليلات الكمية لديناميات نويات كشف ضعف قدرة myoblasts المحتضنة مع هويشت للحفاظ على اتجاه الخلية. (أ) وصف للقياسات المعلمة. فمن الممكن لتحديد سرعة نواة بالنظر في الموقف في إطارين متتاليين. المسار الزاوية واختلاف زاوية يمكن ثم سهولة حساب من المواقع كما هو مبين في المخطط. (ب) توزيع طول المسارات والتشريد (ج) المجموع، والاختلاف (د) من زاوية مسارات myoblasts المحتضنة دون هويشت (الخط الأخضر) أو مع هويشت (الخط الأزرق). توزيعات اثنين لا تختلف اختلافاً كبيرا، بينما تشرد مجموع أعلى بكثير، واختلاف الزاوية أقل بكثير للخلايا أونستينيد (اختبار كولموغوروف-سميرنوف أحادية الجانب، *ف < 0.05 و * *ف < 0.005). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلي فيديو 1: يعيش تصوير myoblasts H2B-التجارة والنقل خلال التمايز. التصوير من myoblasts H2B-بروتينات فلورية خضراء مثقف في التمييز بين المتوسطة الأولى (t = 0 ح) للنقاط الزمنية النهائية (t = ح 16) استخدام الإرسال وقنوات التجارة والنقل (20 x الهدف). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ألياف العضلات (ميوفيبيرس) هي خلايا مولتينوكليتيد التي يتم تشكيلها من قبل دمج خلايا السلائف العضلات (myoblasts) المستمدة من الخلايا الجذعية العضلية (خلايا الأقمار الصناعية) التي يخضع لها الانتشار والتمايز2،3، 4. تقييم التمايز ميوبلاست، الإجراء المشترك الذي يتكون من استزراع myoblasts في التفريق بين المتوسطة وتحديد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة لأداء الفلورة تلطيخ ميك، علامة على التمايز، وتلطيخ من نوى مع الحمض النووي إينتيركالاتينج جزيئات (مثل هويشت)5. يعد هذا الأسلوب مفيداً لتقييم التمايز ميوبلاست بقياس البارامترات المختلفة، مثل مؤشر التمايز (عدد ميك-إيجابية الخلايا/إجمالي عدد الخلايا) أو مؤشر الانصهار (رقم ميوتوبيس مع اثنين على الأقل من عدد الخلايا نويات/مجموع) . ومع ذلك، الانصهار ميوبلاست وتشكيل ميوتوبي هي العمليات الدينامية العالية التي تعتمد على حركية نويات8. والواقع أن المواقع النووية داخل ميوفيبيرس مطلوب لتجديد العضلات السليمة ووظيفة17. تنقل ميوبلاستس ونوى بهم قد تتحول إلى أن تكون معلمة حاسمة لتقييم التمايز ميوبلاست وكشف العيوب الرواية في الاضطرابات العضلية. ومن ثم فمن الضروري وضع إجراءات جديدة لدراسة سلوك الخلية والحركة النووية خلال التمايز ميوبلاست وتشكيل ميوفيبير.
هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للعلماء لمتابعة تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست تصوير الخلايا الحية والقيام بتحليلات كمية من التعقب التلقائي للنوى. وميزة هذا الأسلوب هو إمكانية تتبع أثناء التفريق بين فلوري نويات myoblasts، معزولة عن الفئران H2B-التجارة والنقل، دون أي تعداء الخلايا أو تلطيخ إضافية. الفئران H2B-التجارة والنقل متاحة تجارياً، ومن ثم الوصول إليها بسهولة. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن لعزل ميوبلاستس من الفئران المحورة وراثيا الأخرى التي تعبر عن بروتين فلوري في النواة أو ترانسفيكت الخلايا المعزولة من الفئران البرية من نوع للتعبير عن بروتين فلوري في النواة، كما هو موضح سابقا9 . هذه الخيارات المختلفة كذلك توسيع التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة المعروضة هنا.
يعتمد البروتوكول الحالي على ثقافة ميوبلاستس الأولية، ونتيجة لذلك، قد لاحظ التقلبات عالية في الإجراءات التجريبية التالية، وأيضا بسبب احتمال وجود خلايا نونميوجينيك بعد العزلة من العضلات18 . للتغلب على هذا القيد، من الممكن عزل myoblasts بالخلية الفرز كما هو موضح سابقا19. آخر نقطة حرجة في الأسلوب الموصوفة هنا هو صعوبة توليد تعقب الكمال نويات عندما تكون الخلايا قريبة من بعضها البعض، كما هو الحال خلال تشكيل ميوتوبي. إلا أن الإجراءات البرمجية التي تناقش هنا السماح للعلماء بفحص نوعية التتبع بصريا، وإذا لزم الأمر، لتحديد مجموعة فرعية خلايا ذات أهمية بالنسبة تحليل لاحق. قد يلزم إدخال مزيد من التحسينات البرنامج لتقديم وصف كامل لديناميات النووية أثناء تشكيل ميوفيبير.
وفي الختام، أن هذا الأسلوب مفيد لتوفير كمية من التبصر في ديناميات الأنوية خلال التمايز ميوبلاست بمقارنة ظروف مختلفة، كما ذكرت مع الاحتضان هويشت. يوضح هذا المثال القدرة على استخراج البيانات الديناميكية ذات مغزى من الوقت الفاصل بين التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل قبل فؤاد-الحفل الخيري إلى أ. ف. (#21545) ومنحة البذور المستشفى سان رافائيل (OSR) إلى S.Z. (ZAMBRA5X1000). الدكتور جان-إيف تينيفيز من "مركز تحليل الصورة" من معهد باستور المسلم لتقاسم علنا إجراءات MATLAB "تعقب بسيطة" له.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
- Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
