Summary
Skeletmuskulatur differentiering er en yderst dynamisk proces, som især afhængig af nukleare positionering. Her, beskriver vi en metode til at spore kerner bevægelser af levende celle imaging under myoblast differentiering og myotube dannelse og udføre en kvantitativ karakterisering af kerner dynamics af uddrager information af automatisk sporing.
Abstract
Nukleare positionering i celler er vigtige for flere cellulære processer i udvikling og regeneration. Den mest spændende eksempel på nukleare positionering opstår under skeletmuskulatur differentiering. Muskelfibre (myofibers) er multinucleated celler dannes ved fusion af muskel forløber celler (myoblasts) stammer fra muskel stamceller (satellit celler), gennemgår spredning og differentiering. Korrekt nuklear placering inden for myofibers er nødvendig for korrekt muskel regenerering og funktion. Den fælles procedure for vurdering af myoblast differentiering og myofiber dannelse bygger på faste cellerne analyseres ved immunfluorescens, som hindrer studiet af nukleare bevægelse og celle opførsel over tid. Her, beskriver vi en metode til analyse af myoblast differentiering og myofiber dannelsen af levende celle billeddannelse. Vi leverer en software til automatiseret nukleart sporingen at opnå en høj overførselshastighed kvantitative karakterisering af nukleare dynamics og myoblast adfærd (dvs. bane) under differentiering og fusion.
Introduction
Skeletmuskulatur er den største væv i den menneskelige krop, sammentælling 35-40% af kroppens masse1. Satellit celler er muskel stamceller, anatomisk karakteriseret ved deres position (sammenstillet til plasma-membran nedenunder basal lamina af muskelfibre), som giver anledning til prolifererende myoblasts (myogenic stamceller), som i sidste ende differentiere og integrere i eksisterende myofibers og/eller smelter sammen og form nye myofibers2,3,4. Deres opdagelse og fremskridt i undersøgelsen af deres biologi har ført til betydelig indsigt i muskel udvikling og regeneration.
Protokoller til at isolere og differentiere myoblasts i myotubes er blevet udviklet for mange år siden og er stadig meget udbredt at studere skeletmuskulatur differentiering5,6,7. Men de fleste af disse metoder udgør statisk procedurer, der er afhængige af analysen af faste celler og derfor ikke tillader videnskabsfolk til fuldt ud at udforske meget dynamiske processer som myoblast fusion og myofiber modning. Det mest slående eksempel er nukleare positionering, som er stramt reguleret med kerner først i midten af myofiber og derefter placeret i periferien efter myofiber modning8,9. Live imaging er den mest hensigtsmæssige teknik til at opnå yderligere indsigt i sådan en ejendommelige fænomen.
Her, beskriver vi en metode, der gør det muligt for forskere at optage myoblast differentiering og myotube dannelse af time-lapse mikroskopi og udføre kvantitative analyser fra den automatiske sporing af myoblast kerner. Denne metode giver en høj overførselshastighed kvantitative karakterisering af nukleare dynamics og myoblast adfærd under differentiering og fusion. Protokollen er opdelt i fire forskellige dele, nemlig (1) samling af muskler fra hindlimbs af mus, (2) isolering af primære myoblasts, der består i mekaniske og enzymatiske fordøjelse, (3) myoblast spredning og differentiering og (4) Live imaging til at spore kerner inden for de første 16 h af myoblast differentiering.
I følgende procedure er myoblasts isoleret fra H2B-normal god landbrugspraksis mus og behandlet med 1 µg/mL af doxycyclin at fremkalde H2B-normal god landbrugspraksis udtryk, som tidligere beskrevet10. Alternativt er det muligt at isolere myoblasts fra andre Transgene mus, der udtrykker en fluorescerende proteiner i kernen eller transfect cellerne isoleret fra wild-type mus til at udtrykke en fluorescerende proteiner i kernen, som beskrevet af Pimentel mfl. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr emner blev godkendt af San Raffaele institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. dissektion af mus hindlimb muskler
- Sterilisere pincet og saks (både lige og buede) ved autoklavering.
- Forberede og filtrere (0,22 µm) alle medier (blokerende medium, fordøjelsen medium, prolifererende medium og differentiering medium) før du starter eksperimentet (Se Tabel af materialer).
- Sætte 5 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i en 35 mm petriskål for muskel samling.
- Ofre musen af cervikal dislokation eller ved hjælp af CO2 og sterilisere huden med ethanol. Fjern skindet fra hindlimbs og øvre lemmer ved hjælp af saks og pincet, for at lette isolering af muskler.
Bemærk: Muskler kan være isoleret fra neonatal eller voksen mus. Neonatal mus har et øget antal af satellit celler i forhold til voksne mus. Det samlede antal af satellit celler, der kan isoleres fra en enkelt voksen mus er imidlertid tilstrækkelige til at udføre eksperimentet beskrevet nedenfor. - Isolere tibialis, soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius, quadriceps og triceps og læg dem i en petriskål, som indeholder PBS. Lad fadet på is. Fjern forsigtigt sener og fedt med steriliseret saks og pincet.
2. isolering af primær myoblasts
Bemærk: Alle procedurer for cellekultur er gjort under sterile forhold.
- Fjerne musklerne fra PBS. Skære og hakkekød musklerne, ved hjælp af steril buet saks, indtil der opnås en ensartet masse. Put muskel stykker i en 50 mL tube.
- Der tilsættes 10 mL af fordøjelsen medium til muskel stykker og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. under stærk uro (250 min-1) i vandbad til enzymatisk fordøje musklerne.
- Tilsæt 10 mL af Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS), 1% glutamin, 1% penicillin/streptomycin og 1% gentamicin (blokerende medium) at stoppe fordøjelsen.
- Der centrifugeres ved 40 x g i 5 min og indsamle supernatanten i en 50 mL tube. Gem pelleten på is.
Bemærk: Efter centrifugering, supernatanten indeholder nogle satellit celler, blodlegemer, endotelceller, og fibroblaster, mens pellet indeholder stykker af ufordøjet muskel og bindevæv. For at øge antallet af isolerede celler, skal pellet underkastes yderligere trin i fordøjelsen som beskrevet nedenfor. - Der centrifugeres supernatanten ved 650 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i 1 mL af DMEM indeholdende 10% FBS. Holde den resuspenderede pellet på is.
- Gentag trin 2,2-2,5 2 x for resten af toerstoffet fremstillet i trin 2.4 og tilføje de efterfølgende resuspenderede pellets til den første resuspenderede pellet bevaret på is.
- Passere de resuspenderede pellets, gennem en 70 µm filter og derefter gennem et 40 µm filter. Tilsættes 15 mL DMEM med 10% FBS, og der centrifugeres ved 650 x g i 5 min.
- Resuspenderes celle i 3 mL af røde blodlegemer lysisbuffer nedbryder de røde blodlegemer. Inkuber det i 5 min ved stuetemperatur. Der tilsættes 40 mL PBS at stoppe lysering af de røde blodlegemer, og der centrifugeres ved 650 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i 5 mL af DMEM med 10% FBS.
- Som preplating skridt, plade celler i 20 mL af spredning medium i en 150 mm ubestrøget petriskål. Efter 1 h inkubation i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2), indsamle medium.
Bemærk: Fibroblaster, knyttet til pladen, derefter kasseres, medens satellit celler i suspension. - Gentag trin 3 for 2,9 x og på det sidste preplating skridt, indsamle det medium, der indeholder satellit celler i suspension.
- Der centrifugeres ved 650 x g i 5 min.
- Mens cellerne centrifugering, pels to 150 mm petriskåle med kollagen (10 mL af en 0,1% opløsning i 0,1 M eddikesyre). Gør du sætte kollagen på pladen, inkuberes i 5 min, og fjern det. Lad pladen tørres i 30 min.
- Supernatanten fremstillet i trin 2.11 og resuspenderes celle i 40 mL af spredning medium (Tabel af materialer). Plade celler på to kollagen-belagt 150 mm petriskåle (20 mL pr parabol) og holde celler i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) i spredning medium for 2-3 dage med 1 µg/mL af doxycyclin at fremkalde H2B-normal god landbrugspraksis udtryk.
Bemærk: Dette trin giver mulighed for spredning af myoblasts at opnå et højere antal celler for yderligere assays. Celle tæthed vedligeholdes meget lav at undgå en spontan differentiering af myoblasts i myotubes.
3. Myoblast spredning og differentiering assays
Bemærk: Når myoblast tæthed er høj, nogle celler indlede strækforlængelse, og derefter, er det nødvendigt at opdele celler. Generelt, er det muligt at opdele celler 2 x-3 x uden at påvirke deres fænotype.
- Kassér mediet, cellerne vaskes med 5 mL PBS, tilsættes 2 mL trypsin (1 x), og Inkuber plade ved 37 ° C i en celle inkubator i 5 min. Check under mikroskop og, når runde celler frigøre, tilsættes 5 mL af DMEM med 10% FBS til at inaktivere trypsin. Tæller antallet af celler (normalt det er muligt at få omkring 1 x 106 celler/mus).
Bemærk: Inkubation med trypsin i 5 min er normalt nok til at frigøre den prolifererende myoblasts. - Underlagt cellerne til en af de undersøgelser, som beskrevet nedenfor.
-
Spredning analyse
- Plade 50.000 celler/brønd i 1 mL/godt af spredning medium i en kollagen-belagt 12-godt plade og Inkuber i forgyldt celler i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Fix og tælle cellerne på 24, 48 eller 72 h.
NOTE: Medium erstattes hver 48 timer for at undgå næringsstof udmattelse.
- Plade 50.000 celler/brønd i 1 mL/godt af spredning medium i en kollagen-belagt 12-godt plade og Inkuber i forgyldt celler i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Fix og tælle cellerne på 24, 48 eller 72 h.
-
Differentiering assay
- Coat en 12-godt plade med 350 µL af differentiering medium indeholdende basalmembranen matrix (1: 100). Inkuber plade ved 37 ° C i 30 min og fjern mediet.
- Plade 200.000 celler/brønd i differentiering medium i matrix-belagt plade. Inkuber celler i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) indtil de overholder pladen (2 h er generelt nok for cellerne at overholde og starte differentiering).
- For at vurdere differentiering, udføre farvning for myosin heavy chain og kerner som tidligere beskrevet11. Alternativt kan du udføre live imaging analyser som beskrevet nedenfor.
-
Spredning analyse
4. Live-imaging myoblast differentiering og nukleart sporingen
- For levende celle imaging, sætte cellerne, fremstillet i afsnit 3.2.2 og forgyldt i en 12-godt plade under en Konfokal mikroskop, udstyret med et system til inkubation at opretholde celler ved 37 ° C i 5% CO2.
- Bruge en 20 x tør mål (0,7 NA) for at få felter i visningen med hundredvis af celler, nok til at overvåge myofiber dannelse. H2B-NGL celler kan være afbildet med en lav intensitet 488 nm Argon laser.
Bemærk: En åben pinhole sikrer at billeddybde (~ 10 µm) indeholder celle tykkelse, således at celler holdes i fokus under hele forsøget. Ved hjælp af en Konfokal mikroskop er en fordel da det forbedrer signal-støj-forholdet af billederne, selvom wide-felt mikroskopi kan også bruges. Myofiber dannelse kan overvåges via transmissionskanal. - Erhverve billeder af 16-bit og 1.024 x 1.024 pixel pr. ramme hver 6 min for 16 h. For hver erhvervede position, generere en multiframe.tif fil (se eksempel i Supplerende filer).
Bemærk: I denne protokol, kommerciel software forbundet med mikroskop (Table of Materials) har været anvendt; Brug den relevante software til at nå det samme mål, når du bruger andre mikroskoper. - Download softwaren, der leveres som en .zip supplerende fil.
Bemærk: Rutiner er scripts, der skal køres i MATLAB. Softwaren er en tilpasning af en udgivet software12 optimeret til sporing af atomkerner under myotube dannelse. Denne software er opdelt i to dele: den første, der identificerer kerner i hver ramme af segmentering dem, mens den anden ene genererer "spor" (baner) kerner bevægelighed. Den komplette kode for nukleare segmentering og sporing og en trinvis vejledning til at komme i gang er fastsat i de Supplerende filer. - Uddrag zipfil og gemme det i en ønskede sti på den personlige computer (PC) i brug. Udføre alle de nedenstående passager på en PC med den nødvendige software allerede installeret. Bemærk, at .zip-filen består af tre mapper, som nævnt nedenfor.
Bemærk: Segmentering rutiner indeholder funktioner til at køre for segmenteringen. Sporing af rutiner, i stedet, indeholder de funktioner, der kræves til at spore. Eksempel segmentering sporing giver grundlæggende scripts og filer til at stifte bekendtskab med systemet. Softwaren bruges til segmentering og sporing af kerner kører ordentligt i MATLAB, R2015a eller senere versioner. - For at segmentere kerner fra .tif-fil, Navngiv filen, for eksempel, NameFile.tif.
- Åbn mappen Eksempel segmentering Tracking og klik på DoSegmentation.m. Dette åbner kommandovinduet i MATLAB.
- Kontroller vinduet Aktuel mappe til venstre for at se alle elementer i mappen Eksempel af segmentering sporing . Dobbeltklik på DoSegmentation.m.
Bemærk: Detaljerede oplysninger om de ændringer, der skal gøres i scriptet kan findes i filen StepbyStep.txt. Det er obligatorisk at ændre scriptet, så de variable filenameinput er NameFile.tif og folderinput er den mappe, hvor filen .tif er indeholdt. - Kør scriptet (ved at klikke på grønne køre knap). Resultatet af segmenteringen vil blive gemt som en file.mat (SegmentedNameFile.mat), mens segmenteringen af kerner kan visualiseres i figuren output.
Bemærk: Parametre for segmentering, beskrevet i scriptet kan ændres, hvis det er nødvendigt. Kvaliteten af segmenteringen kan kontrolleres ved hjælp af scriptet CheckSegmentation.m (se filen StepbyStep.txt). Baseret på dette, hvis kvaliteten af segmenteringen er dårlig (kun et par kerner opdaget), justere parametrene for segmentering, tydeligt angives i scriptet DoSegmentation.m og Gentag proceduren.
- For at generere spor (dvs. baner af hver af kerner i tid), ved hjælp af de nukleare positioner er fremstillet i segmentering, køres scriptet GenerateTracks.m i den samme arbejdsmappe. Sørg for at tilføje filen ordentlig segmentering som input, fremstillet før (se filen StepbyStep.txt for yderligere oplysninger).
Bemærk: Som et output, vil brugeren få en fil TrackedNameFile.mat, med en matrix for x-koordinaterne og en anden matrix for y-koordinaterne for de genererede spor. - Evaluere kvaliteten af sporene ved hjælp af CheckTracking.m (se filen StepbyStep.txt for yderligere oplysninger). Bruge figuren output af denne sidste passage til at visualisere hvert kerner position i tid. Check til venstre for grønne Kors, der angiver hver segmenterede kerne. For at vælge en specifik kerne, bruge den lavere scrollbar. Bemærk, at den valgte kerne vil være cirklet i rød, mens på højre bane i den markerede celle kan følges i tid (ved hjælp af den øverste scrollbar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Automatisk følge nukleare bevægelse under myoblast differentiering i live imaging, bør atomkerner fortrinsvis fluorescently mærket. Det er vigtigt at bemærke, at ved hjælp af DNA-intercalating molekyler ikke er muligt da disse molekyler forstyrre spredning og differentiering af primær myoblasts13. Som et eksempel, er spredning og differentiering blevet analyseret i primære myoblasts kulturperler med eller uden Hoechst (figur 1). Det er indlysende, at spredning (figur 1A, B) og differentiering (figur 1 c, midterste panel) er stærkt nedsat i myoblasts kulturperler med Hoechst 33342. Omvendt kan myoblasts isoleret fra H2B-normal god landbrugspraksis mus og kulturperler med doxycyclin har kerner med grønne fluorescens og differentiere ligeledes til myoblasts isoleret fra wild-type mus (figur 1 c, højre og venstre paneler, henholdsvis).
Levende celle imaging med primære myoblasts udtrykker H2B-normal god landbrugspraksis protein giver mulighed for sporing af kerner under differentiering (figur 2 og supplerende Video 1). Flettet billeder af transmission og normal god landbrugspraksis kanaler i indledende (figur 2A) og sidste gang point (figur 2B) under differentiering af H2B-NGL myoblasts tillade forskerne at identificere myotubes og dermed kerner, der ender med integrere en myotube (fx, kernen i den blå cirkel) eller kerner, der ikke smelter ind i en myotube (fx, kernen i den røde cirkel).
For at udtrække oplysninger om kerner/celle bevægelser fra den levende celle billeddiagnostiske data, er det muligt at bruge den medfølgende software til at spore baner af kerner. Programmet bruger billedet fra H2B-normal god landbrugspraksis kanal (kerner; Figur 3A) oprette en maske og segmentere kerner i hver ramme. Nukleare segmentering i en ramme vælges en "konservativ" threshold med Otsus metode på billedet efter Gaussisk filtrering14. Næste, objekter er nogenlunde segmenteret; for at få en finere segmentering, er hvert objekt maskeret igen ved hjælp af en grænseværdi baseret på gennemsnittet i dens afgrænsningsområde. En skelsættende transformering bruges derefter til at adskille i nærheden objekter (figur 3B). I vores hænder, et vandskel transform har været i stand til at adskille de fleste nærliggende kerner (figur 3B, * indsatser). Dermed, vi brugte området til at vælge de større objekter i billedet og anvende en ny vandskel transformation (figur 3B, ** inset), som er i stand til at adskille yderligere i nærheden kerner. Med denne tilgang, er de fleste af kerner identificeret i billede (figur 3 c).
For at spore atomkerner, forbedret vi rutiner ved at indarbejde tracking rutiner udgivet af Tinevez15. Kort sagt, links tracking algoritme kerner opdaget i sammenhængende rammer med henblik på at minimere summen af afstandene mellem positionen for hver kerne i en ramme og placeringen af den samme kerne i den næste ene, bruger den "ungarske algoritme" for en sådan minimering16. Trinnet gentages for at sammenkæde sammenkædet kerner, der er op til et bestemt maksimalt antal rammer væk. En grænse for den maksimale afstand mellem placeringen af et objekt i en ramme og den næste, er også etableret. For data præsenteret her, giver et maksimalt antal fem rammer og en maksimal afstand på 20 pixels per trin et højt antal korrekte numre (figur 3D). Vigtigere, kan vi bruge disse rutiner til at kontrollere kvaliteten af sporingen. Det er også muligt at bruge dette script til at finde celler, der har en given adfærd, for eksempel danner (eller ej) en myofiber, og efterfølgende analysere de dynamiske funktioner i sæt af celler af interesse.
Den anvendte software genererer spor med x - og y-koordinaterne for hver celle i ramme Nielsen, 
, for hundredvis af celler (figur 3D). Vi kan bruge disse oplysninger til at udtrække oplysninger om kerner bevægelse. Som et eksempel, den samlede forskydning mellem den første ramme (n = 0) og den sidste ramme N er defineret som følger.
Forskydning af en bane = || 
||
Her, "|| · ||" står for normen af vektor (figur 4A).
Hastighed for hver kerne i ramme Nielsen er som følger.
Derefter, vi kan definere længden af en bane for en given celle som følger.
Længden af bane =
Som et eksempel på hvordan disse enkle parametre kan allerede give relevante oplysninger, beregnet vi længden af kerner baner af myoblasts inkuberes med eller uden Hoechst. Det fremgår, at den samlede længde af baner er lidt højere for celler farves med Hoechst, selv om forskellen ikke er signifikant (figur 4B). Men når vi beregnet de samlede forskydning i løbet af en time lapse, vi observeret, at den samlede forskydning af celler farves med Hoechst var betydeligt mindre end for unstained celler (figur 4 c). Dette indikerer, at flytning af farvede celler har en lavere tekstretning. For at styrke denne hypotese, kvantificeres vi retningen af bevægelse af en celle ved at beregne vinklen af hastigheden i hver ramme (figur 4A).
Vi tal også variation af vinklen mellem rammer.
Den samlede vinkel variation langs en bane kan derefter defineres som følger.
Total vinkel variation =
Som forudsagt, er den samlede vinkel variation på de unstained celler betydeligt mindre sammenlignet med celler farves med Hoechst (figur 4D). Derfor, denne enkle foranstaltning af direktionalitet, fremstillet af en simpel beregning viser, at myoblasts farves med Hoechst er mindre tilbøjelige til at opretholde retningen af deres fordrivelse, som afspejler deres nedsat evne til at danne myotubes (figur 1).
Kort sagt, levende celle billeddiagnostiske data genereret som beskrevet her give en kvantitativ forbindelse mellem nuklear dynamics og evnen til at form myotubes og kan bruges som input til en høj overførselshastighed kvantitative karakterisering af nukleare dynamics og myoblast adfærd under differentiering og fusion.
Figur 1: inkubation med Hoechst forstyrrer spredning og differentiering af myoblasts. (A) repræsentative billeder af primær myoblasts farves med Hoechst efter 24 h i spredning medium (venstre panel) eller kulturperler for 24 h i spredning medium med Hoechst (højre panel), og (B) den relative kvantificering. Data er den gennemsnitlige ± SEM, og den statistiske signifikans blev vurderet med Student's t-test. P < 0,05. (C) repræsentative billeder af primære vildtype myoblasts, kulturperler for 24 h i differentiere medium uden (venstre panel) eller med Hoechst (midterste panel) og af H2B-NGL myoblasts kulturperler for 24 h i differentiere medium (højre panel) og farves med Hoechst (blå) og en anti-myosin heavy chain antistof (MyHC, red). Skala barer = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Live imaging af H2B-NGL myoblasts under differentiering. Flettede billeder af transmission og normal god landbrugspraksis kanaler ved (A) oprindelige (t = 0 h) og (B) sidste gang point (t = 16 h) under differentiering af H2B-NGL myoblasts (20 x mål). Nogle eksempler på myotubes er fremhævet med sorte pile i panelet B. Skala barer = 50 µm. (C) Magnified stiplede områder fra paneler A og B , hvor det er muligt at identificere en enkelt kerne, der ender med at integrere en myotube (i blåt) eller ikke (i rødt) ved t = 0 h, t = 8 h, og t < / C12 > = 16 h. Skala barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: segmentering af H2B-NGL myoblasts sporing under differentiering. (A) eksempel på en ramme af tid bortfalder viser kerner af ca. 400 celler. (B) eksempel på kerner maskering og segmentering. Lyse objekter er opdelt ved hjælp af en global og en lokal tærskel, og et vandskel transformation er anvendt til at adskille i nærheden kerner. Nærliggende kerner kan være svært at segment (* indsat), så en anden vandskel-baserede segmentering er udført i objekter af store områder at segmentere et højere antal kerner (** indsatser). (C) registreres nukleare positioner (Røde Kors), som er senere bruges i tracking algoritme. (D) spor genereret ved hjælp af tracking algoritme, der minimerer summen af afstandene mellem hvert objekts position i to på hinanden følgende frames. En maksimal mulig værdi af sådanne afstand for hvert objekt er fastsat som et input, der giver forskerne til at sammenkæde kerner adskilles af mere end én ramme. Skala barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvantitative analyser af kerner dynamics afdække myoblasts inkuberes med Hoechst nedsat evne til at opretholde celle direktionalitet. (A) Beskrivelse af parameteren målinger. Det er muligt at definere hastigheden af en kerne af overvejer position i to på hinanden følgende frames. Bane vinkel og vinklen variation kan derefter let beregnes fra positioner som angivet i ordningen. (B) fordeling af baner længde, (C) samlede deplacement og (D) variation af baner vinklen på myoblasts inkuberes uden Hoechst (grøn linje) eller med Hoechst (blå linje). De to fordelinger er ikke væsentligt anderledes, mens den samlede deplacement er betydeligt højere, og variationen af vinklen er betydeligt lavere for unstained celler (ensidig Kolmogorov-Smirnov test, *p < 0,05 og **p < 0.005). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Video 1: Live imaging af H2B-NGL myoblasts under differentiering. Imaging af H2B-NGL myoblasts kulturperler i differentiere mediet fra oprindelige (t = 0 h) til sidste gang point (t = 16 h) ved hjælp af transmission og normal god landbrugspraksis kanaler (20 x mål). Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muskelfibre (myofibers) er multinucleated celler, der er dannet ved fusion af muskel prækursorer celler (myoblasts) stammer fra muskel stamceller (satellit celler), gennemgår spredning og differentiering2,3, 4. For at vurdere myoblast differentiering, består den fælles procedure i dyrkning af myoblasts i differentiere medium og fastsættelse af celler på forskellige tidspunkter til at udføre immunofluorescens farvning for MyHC, en markør for differentiering, og farvning af kerner med DNA-intercalating molekyler (fx, Hoechst)5. Denne metode er nyttig til at vurdere myoblast differentiering ved at måle forskellige parametre, såsom differentiering indeks (antallet af MyHC-positive celler/total celle nummer) eller fusion indeks (antallet af myotubes med mindst to kerner/total celle nummer) . Myoblast fusion og myotube dannelse er dog meget dynamiske processer, der er afhængige af motilitet af kerner8. Faktisk, nukleare positionering indenfor myofibers er nødvendig for korrekt muskel regenerering og funktion17. Myoblasts og deres kerner mobilitet kan vise sig for at være en kritisk parameter at vurdere myoblast differentiering og at afdække roman defekter i muskulære lidelser. Derfor er det vigtigt at udvikle nye procedurer for at studere cellen adfærd og nukleare bevægelse under myoblast differentiering og myofiber dannelse.
Her, beskriver vi en metode, der gør det muligt for forskerne at følge myoblast differentiering og myotube dannelse af levende celle imaging og foretage kvantitative analyser fra den automatiske sporing af kerner. Fordelen ved denne metode er muligheden for at spore under differentiering af fluorescerende kerner af myoblasts, isoleret fra H2B-normal god landbrugspraksis mus, uden hvilken som helst celle Transfektion eller yderligere farvning. H2B-normal god landbrugspraksis mus er kommercielt tilgængelige, og dermed let tilgængelig. Alternativt er det muligt at isolere myoblasts fra andre Transgene mus, der udtrykker en fluorescerende proteiner i kernen eller til transfect cellerne isoleret fra wild-type mus til at udtrykke en fluorescerende proteiner i kernen, som tidligere beskrevet9 . Disse forskellige muligheder yderligere udvide de potentielle anvendelser af den metode, der præsenteres her.
Den nuværende protokol er baseret på kultur af primære myoblasts, og derfor en høj variation kan observeres i de følgende eksperimentelle procedurer, også på grund af potentielle tilstedeværelsen af nonmyogenic celler efter isolation fra muskler18 . For at overvinde denne begrænsning, er det muligt at isolere myoblasts af cellen sortering som tidligere beskrevet19. Et andet kritisk punkt i metoden beskrevet her er vanskeligt at skabe en perfekt sporing af kerner når cellerne er tæt på hinanden, som under myotube dannelse. Softwarerutiner drøftet her tillader dog forskere til at visuelt inspicere kvaliteten af sporing og, om nødvendigt, til at vælge et undersæt af celler af interesse for en efterfølgende analyse. Yderligere forbedring af softwaren kan være forpligtet til at give en fuldstændig karakterisering af nukleare dynamics under myofiber dannelse.
Til sidst, er denne metode nyttigt at give kvantitative indsigt i kerner dynamics under myoblast differentiering ved at sammenligne forskellige betingelser, som vi rapporterede med Hoechst inkubation. Dette eksempel illustrerer evne til at udtrække meningsfuld dynamiske data fra time-lapse eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af AFM-Telethon at E.V. (#21545) og Ospedale San Raffaele (OSR) frø tilskud til sz (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez fra hubben billede analyse af Institut Pasteur er anerkendt for offentligt deler sin "Simple Tracker" MATLAB rutiner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
- Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
