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Biology

मायोब्लास्ट विभेद और फ्यूजन के दौरान नाभिक को ट्रैक करने के लिए लाइव इमेजिंग का दोहन

Published: April 13, 2019 doi: 10.3791/58888
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 1,2, *1,2, *1
1Chromatin Dynamics Unit, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University, 3Department of Electronics, Information and Bioengineering, Politecnico di Milano
* These authors contributed equally

Summary

कंकाल पेशी विभेद एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है, जो विशेष रूप से परमाणु स्थिति पर निर्भर करता है । यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग द्वारा नाभिक आंदोलनों को ट्रैक myoblast भेदभाव और myoblast गठन के दौरान और स्वचालित ट्रैकिंग से जानकारी निकालने के द्वारा नाभिक गतिशीलता के एक मात्रात्मक लक्षण वर्णन करने के लिए ।

Abstract

कोशिकाओं के भीतर परमाणु स्थिति विकास और उत्थान में कई सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है । नाभिकीय पोजिशनिंग का सबसे पेचीदा उदाहरण कंकाल पेशी विभेद के दौरान होता है । मांसपेशी फाइबर (myofibers) मांसपेशी के अग्रदूत कोशिकाओं (myoblasts) मांसपेशी स्टेम सेल (उपग्रह कोशिकाओं) है कि प्रसार और भेदभाव से गुजरना से व्युत्पंन के विलय के द्वारा गठित बहुन्यूक्लिरेटेड कोशिकाओं रहे हैं । उचित मांसपेशी उत्थान और समारोह के लिए मायोफाइबरों के भीतर सही परमाणु स्थिति की आवश्यकता है । मायोब्लास्ट विभेद और मायोफाइबर गठन का आकलन करने के लिए आम प्रक्रिया प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति द्वारा विश्लेषित स्थिर कोशिकाओं पर निर्भर करती है, जो समय के साथ नाभिकीय आंदोलन और कोशिका व्यवहार के अध्ययन में बाधा करती है । यहां, हम मायोब्लास्ट विभेशिएशन के विश्लेषण और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा myoblast गठन के लिए एक विधि का वर्णन । हम स्वचालित परमाणु ट्रैकिंग के लिए एक सॉफ्टवेयर प्रदान करने के लिए एक उच्च थ्र्यूपुट मात्रात्मक लक्षण वर्णन के परमाणु गतिशीलता और मायोब्लास्ट व्यवहार (यानी, प्रक्षेप-पथ) और संलयन के दौरान प्राप्त करने के लिए ।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर में सबसे बड़ा ऊतक है, कुल 35%-शरीर द्रव्यमान1का ४०% । उपग्रह कोशिकाओं मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं रहे हैं, शारीरिक रूप से उनकी स्थिति के द्वारा विशेषता (प्लाज्मा झिल्ली के लिए juxtaposed, मांसपेशी फाइबर के बेसल लमिना के नीचे), कि myoblasts proliferating के लिए वृद्धि दे (myogenic संतति कोशिकाओं), जो अंततः अंतर और मौजूदा myofibers में एकीकृत और/या फ्यूज नए myofibers2,3,4बनाने के लिए । उनकी खोज और उनके जीव विज्ञान के अध्ययन में प्रगति मांसपेशियों के विकास और उत्थान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया गया है ।

प्रोटोकॉल को अलग और मायोट्यूब में myoblasts अंतर कई साल पहले विकसित किया गया है और अभी भी व्यापक रूप से कंकाल मांसपेशी भेदभाव5,6,7अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । तथापि, इन विधियों में से अधिकांश स्थिर प्रक्रियाओं है कि स्थिर कोशिकाओं के विश्लेषण पर भरोसा करते हैं और फलस्वरूप, वैज्ञानिकों को पूरी तरह से मायोब्लास्ट फ्यूजन और मायोफाइबर परिपक्वता के रूप में अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं, का पता लगाने के लिए अनुमति नहीं देते हैं । सबसे हड़ताली उदाहरण परमाणु स्थिति है, जो कसकर विनियमित है, नाभिक के साथ शुरू में myofiber के केंद्र में है और, तो, myofiber परिपक्वता के बाद परिधि में स्थित8,9। लाइव इमेजिंग इस तरह के एक अजीब घटना में आगे अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए सबसे उपयुक्त तकनीक है ।

यहां, हम एक तरीका है कि वैज्ञानिकों myoblast भेदभाव और समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा myoblast गठन रिकॉर्ड और मायोब्लास्ट नाभिक की स्वचालित ट्रैकिंग से मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है का वर्णन । इस विधि के एक उच्च थ्र्यूपुट मात्रात्मक लक्षण वर्णन परमाणु गतिशीलता और भेदभाव और फ्यूजन के दौरान मायोब्लास्ट व्यवहार प्रदान करता है । प्रोटोकॉल चार विभिंन भागों में बांटा गया है, अर्थात् (1) चूहों के हिंदने से मांसपेशियों का संग्रह, (2) प्राथमिक myoblasts के अलगाव कि यांत्रिक और एंजाइमी पाचन में होते हैं, (3) मायोब्लास्ट प्रसार और भेदभाव, और (4) लाइव इमेजिंग मायोब्लास्ट भेदभाव के पहले 16 एच के भीतर नाभिक को ट्रैक करने के लिए ।

निम्नलिखित प्रक्रिया में, myoblasts H2B-GFP चूहों से अलग कर रहे हैं और H2B-GFP अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए doxycycline के 1 μg/mL के साथ इलाज किया, के रूप में पहले से वर्णित10. वैकल्पिक रूप से, यह अन्य ट्रांसजेनिक चूहों कि नाभिक में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए या जंगली प्रकार चूहों से अलग कोशिकाओं transfect नाभिक में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए अलग करने के लिए संभव है, के रूप में Pimentel एट अल द्वारा वर्णित. 9.

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Protocol

पशु विषयों को शामिल सभी प्रक्रियाओं सैन Raffaele संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. माउस हिंदलिंब की मांसपेशियों का विच्छेदन

  1. चिमटी और कैंची (दोनों सीधे और घुमावदार) autoclaving द्वारा ।
  2. तैयार और फिल्टर (०.२२ μm) सभी मीडिया (अवरुद्ध मध्यम, पाचन माध्यम, मध्यम proliferating, और मध्यम अंतर) प्रयोग शुरू करने से पहले ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  3. मांसपेशियों के संग्रह के लिए एक ३५ मिमी पेट्री डिश में फास्फेट के 5 मिलीलीटर-buffered खारा (PBS) रखो ।
  4. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा या2 CO का उपयोग करके माउस बलिदान और इथेनॉल के साथ त्वचा । मांसपेशियों के अलगाव को सुविधाजनक बनाने के लिए, कैंची और चिमटी का उपयोग करके, हिंदअंग और ऊपरी अंगों से त्वचा को हटा दें ।
    नोट: स्नायु नवजात या वयस्क चूहों से अलग किया जा सकता है । नवजात चूहों में वयस्क चूहों की तुलना में उपग्रह कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है । हालांकि, किसी एकल वयस्क माउस से अलग किए जा सकने वाले सैटेलाइट कक्षों की कुल संख्या नीचे वर्णित प्रयोग करने के लिए पर्याप्त है ।
  5. टिबिएलिस, सोलियस, एक्सटेंसर डिजिटोरम लंग्स (EDL), gastrocnemius, quadriceps, और triceps को अलग, और उन्हें PBS युक्त पेट्री डिश में डाल दिया । पकवान को बर्फ पर छोड़ दें । ध्यान से निष्फल कैंची और चिमटी के साथ tendons और वसा को हटा दें ।

2. प्राथमिक myoblasts के अलगाव

नोट: सेल कल्चर के लिए सभी प्रक्रियाएं परिस्थितियों में की जाती हैं ।

  1. पीबीएस से मांसपेशियों को हटा दें । कट और मांसपेशियों को भरती, बाँझ घुमावदार कैंची का उपयोग करके, जब तक एक समान द्रव्यमान प्राप्त है. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में मांसपेशियों के टुकड़े रखो ।
  2. मांसपेशियों के टुकड़े करने के लिए पाचन मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और मजबूत आंदोलन के तहत 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते (२५० min-1) एक पानी के स्नान में, एंजल की मांसपेशियों को पचाने के लिए ।
  3. 10 मिलीलीटर डुलबेको के संशोधित ईगल के मध्यम (dmem) जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs), 1% ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1% जेंटॅमाइसिन (मध्यम अवरुद्ध) पाचन को रोकने के लिए जोड़ें ।
  4. 5 मिनट के लिए ४० x g पर सेंट्रीफ्यूज और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में supernatant इकट्ठा । बर्फ पर गोली सहेजें ।
    नोट: अपकेंद्रण के बाद, supernatant कुछ उपग्रह कोशिकाओं, रक्त कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं, और फाइब्रोब्लास्ट, जबकि गोली पचाया पेशी और संयोजी ऊतक के टुकड़े शामिल हैं । पृथक कक्षों की संख्या बढ़ाने के लिए, गोली नीचे वर्णित के रूप में पाचन के अतिरिक्त कदम के अधीन किया जाना चाहिए ।
  5. 5 मिनट के लिए ६५० x g में सुपरनैटंट को सेंट्रीफ्यूज कर दें और 10% FBS वाले dmem के 1 एमएल में पेलेट को रेसपेंड करें । बर्फ पर सस्पेंड गोली रखो ।
  6. दोहराएं कदम 2.2-2.5 2x कदम २.४ में प्राप्त गोली के बाकी के लिए और बाद में पहले सस्पेंड गोली जोड़ने के लिए बर्फ पर संरक्षण पहली बार फिर से बंद गोली ।
  7. एक ७० μm फिल्टर के माध्यम से सस्पेंड छर्रों पास और फिर एक ४० μm फिल्टर के माध्यम से. 10% FBS के साथ DMEM के 15 मिलीलीटर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए ६५० x g पर सेंट्रीफ्यूज ।
  8. लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 3 एमएल में सेल गोली Resuspend लाल रक्त कोशिकाओं को गिरेगा । यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते । PBS के ४० मिलीलीटर जोड़ें लाल रक्त कोशिकाओं के lysis को रोकने के लिए, और 5 मिनट के लिए ६५० x g पर सेंट्रीफ्यूज । supernatant निकालें और 10% fbs के साथ dmem के 5 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  9. कदम preplating के रूप में, थाली एक १५० मिमी uncoated पेट्री डिश में प्रसार माध्यम के 20 मिलीलीटर में कोशिकाओं । एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में ऊष्मायन के 1 एच के बाद (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2), मध्यम इकट्ठा ।
    नोट: फाइब्रोब्लास्ट, थाली को संलग्न, तो खारिज कर रहे हैं, जबकि सैटेलाइट कोशिकाओं निलंबन में रहते हैं ।
  10. चरण २.९ 3x दोहराएं और, पिछले preplating कदम पर, जो निलंबन में उपग्रह कोशिकाओं शामिल मध्यम इकट्ठा ।
  11. 5 मिनट के लिए ६५० x g पर सेंट्रीफ्यूज ।
  12. जबकि कोशिकाओं को केंद्रापसारक, कोट २ १५० मिमी कोलेजन के साथ पेट्री व्यंजन (०.१ मीटर एसिटिक एसिड में ०.१% समाधान की 10 मिलीलीटर) कर रहे हैं । ऐसा करने के लिए, थाली पर कोलेजन डाल, 5 मिनट के लिए सेते, और इसे हटा दें । थाली को 30 मिनट के लिए सूखने दें ।
  13. चरण २.११ में प्राप्त supernatant छोड़ें और प्रसार माध्यम (सामग्री की तालिका) के ४० मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । प्लेट दो कोलेजन पर कोशिकाओं लेपित १५० मिमी पेट्री व्यंजन (डिश प्रति 20 मिलीलीटर) और एक सेल संस्कृति इंयूबेटर (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, 5% ओ2) के प्रसार के माध्यम में 2-3 दिनों के लिए 1 μg/मिलीलीटर के साथ H2B-gfp अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए कोशिकाओं में रखने के लिए ।
    नोट: यह चरण myoblasts के प्रसार के आगे assays के लिए कोशिकाओं की एक उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है । कोशिका घनत्व बहुत कम मायोट्यूब में myoblasts के एक सहज भेदभाव से बचने के लिए बनाए रखा है.

3. मायोब्लास्ट प्रसार और भेदभाव assays

नोट: जब मायोब्लास्ट घनत्व अधिक है, कुछ कोशिकाओं बढ़ाव शुरू, और फिर, यह कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए आवश्यक है । आम तौर पर, यह अपने phenotype प्रभावित किए बिना कोशिकाओं 2x-3x विभाजित करने के लिए संभव है.

  1. छोड़ें मध्यम, pbs के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने, ट्रिप् सिन (1x) के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के लिए एक सेल इनयूबेटर में ३७ ° c पर थाली सेते । माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें और, जब गोल कोशिकाओं को अलग, 10% fbs के साथ dmem के 5 मिलीलीटर जोड़ने ट्रिप् सिन निष्क्रिय । कक्षों की संख्या की गणना करें (आमतौर पर यह 1 x 106 कक्षों/माउस के बारे में प्राप्त करना संभव है) ।
    नोट: 5 मिनट के लिए ट्रिप् सिन के साथ ऊष्मायन आम तौर पर myoblasts proliferating को अलग करने के लिए पर्याप्त है ।
  2. नीचे वर्णित assays में से किसी एक के लिए कक्ष का विषय है ।
    1. प्रसार परख
      1. थाली ५०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक एमएल में प्रसार मध्यम की अच्छी तरह से एक कोलेजन लेपित 12-well थाली में और एक सेल कल्चर इनयूबेटर (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2) में मढ़वाया कोशिकाओं सेते । 24, ४८, या ७२ h पर कक्षों को ठीक करें और गिनें ।
        नोट: मध्यम पोषक तत्व थकावट से बचने के लिए हर ४८ ज की जगह है ।
    2. अवविरूपण परख
      1. कोट एक 12-अच्छी थाली के साथ ३५० μL अंतर के मध्यम झिल्ली मैट्रिक्स (1:100) युक्त माध्यम । प्लेट को 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनसेबेट करें और मध्यम निकालें ।
      2. थाली २००,००० मैट्रिक्स लेपित थाली में भिंनता माध्यम में अच्छी तरह से कोशिकाओं/ सेल कल्चर इनयूबेटर (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, 5% O2) में कोशिकाओं को इंसेबेट करें जब तक कि वे प्लेट का पालन नहीं करते (2 ज सामान्यतः कोशिकाओं का पालन करने और विभेद शुरू करने के लिए पर्याप्त होते हैं) ।
      3. भेदभाव का आकलन करने के लिए, मायोसिन भारी श्रृंखला और नाभिक के रूप में पहले वर्णित11के लिए धुंधला प्रदर्शन । वैकल्पिक रूप से, नीचे वर्णित के रूप में लाइव इमेजिंग विश्लेषण करते हैं ।

4. लाइव-मायोब्लास्ट भेदभाव और परमाणु ट्रैकिंग की इमेजिंग

  1. लाइव सेल इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं डाल, 3.2.2 अनुभाग में प्राप्त किया और एक 12-well थाली में मढ़वाया, एक संनाभि माइक्रोस्कोप के तहत, एक ऊष्मायन प्रणाली के साथ सुसज्जित करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2में कोशिकाओं को बनाए रखने.
  2. एक 20x सूखी उद्देश्य का प्रयोग करें (०.७ NA) कोशिकाओं के सैकड़ों के साथ देखने के क्षेत्र प्राप्त करने के लिए, पर्याप्त myofiber गठन की निगरानी के लिए । H2B-GFP कोशिकाओं को कम तीव्रता ४८८ एनएम Argon लेजर के साथ imaged जा सकता है ।
    नोट: एक खुला पिनहोल सुनिश्चित करता है कि छवि गहराई (~ 10 μm) सेल मोटाई शामिल है ताकि कोशिकाओं ध्यान में प्रयोग भर में रखा जाता है । एक संनाभि माइक्रोस्कोप का उपयोग लाभप्रद है क्योंकि यह छवियों के संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार, हालांकि व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी भी इस्तेमाल किया जा सकता है । Myofiber गठन संचरण चैनल के माध्यम से निगरानी की जा सकती है ।
  3. 16-बिट और १,०२४ x १,०२४ पिक्सल प्रति फ्रेम हर 6 मिनट 16 एच के लिए छवियों को प्राप्त करें । प्रत्येक अधिग्रहीत स्थिति के लिए, एक multiframe. tif फ़ाइल जनरेट करें (उदाहरण देखें अनुपूरक फ़ाइलोंमें) ।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) से संबद्ध वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया है; अंय सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते समय समान लक्ष्य प्राप्त करने के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ।
  4. एक. zip अनुपूरक फ़ाइलके रूप में प्रदान किया गया सॉफ़्टवेयर डाउनलोड करें ।
    नोट: दिनचर्या स्क्रिप्ट है कि MATLAB में चलाया जाना चाहिए रहे हैं । सॉफ्टवेयर एक प्रकाशित सॉफ्टवेयर का एक अनुकूलन है12 myotube गठन के दौरान नाभिक की ट्रैकिंग के लिए अनुकूलित । इस सॉफ्टवेयर को दो भागों में बांटा गया है: पहले एक प्रत्येक फ्रेम में उंहें segmenting द्वारा नाभिक की पहचान करता है, जबकि दूसरा एक "पटरियों" नाभिक आंदोलन की (प्रक्षेपी) उत्पंन । परमाणु विभाजन और ट्रैकिंग के लिए पूर्ण कोड और शुरू करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड अनुपूरक फाइलोंमें प्रदान की जाती हैं ।
  5. ज़िप फ़ाइल निकालें और इसे उपयोग में व्यक्तिगत कंप्यूटर (PC) पर एक वांछित पथ में सहेजें । पहले से स्थापित आवश्यक सॉफ्टवेयर के साथ एक पीसी पर सभी नीचे मार्ग प्रदर्शन । नोट करें कि. zip फ़ाइल तीन फ़ोल्डरों से बना है जैसा कि नीचे बताया गया है ।
    नोट: फॉल्ट दिनचर्या में फॉल्ट के लिए चलाए जाने वाले फंक्शन होते हैं । ट्रैकिंग दिनचर्या, बजाय, ट्रैकिंग के लिए आवश्यक कार्य शामिल हैं । उदाहरण विभाजन ट्रैकिंग प्रणाली के साथ परिचित पाने के लिए बुनियादी लिपियों और फ़ाइलों को प्रदान करता है । नाभिक के विभाजन और ट्रैकिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला सॉफ्टवेयर MATLAB, R2015a या बाद के संस्करणों में ठीक से चलता है ।
  6. . Tif फ़ाइल से नाभिक को विभाजित करने के लिए, फ़ाइल का नाम, उदाहरण के लिए, Namefile. tif.
    1. उदाहरण विभाजन ट्रैकिंग फ़ोल्डर खोलें और dosegmentation. mपर क्लिक करें । इससे मतलब में कमांड विंडो खुल जाएगी ।
    2. फॉल्ट ट्रैकिंग फ़ोल्डर के उदाहरण में सभी तत्वों को देखने के लिए बाईं ओर वर्तमान फ़ोल्डर विंडो की जाँच करें । Dosegmentation. mपर डबल-क्लिक करें ।
      नोट: स्क्रिप्ट में किया जा करने के लिए है जो संशोधनों पर विस्तृत जानकारी StepbyStep. txt फ़ाइल में ढूँढा जा सकता है । इसमें स्क्रिप्ट को संशोधित करना अनिवार्य है ताकि चर फाइलेनमेइनपुट को namefile. tif और folderinput वह फ़ोल्डर है जहां. tif फ़ाइल समाहित है ।
    3. (ग्रीन रन बटन पर क्लिक करके) स्क्रिप्ट भागो । फॉल्ट के रिजल्ट को फाइल के रूप में सहेज कर रखा जाएगा । mat (सेगमेन्टेडनमेफेइल. मैट), जबकि नाभिक के विभाजन के उत्पादन के आंकड़े में कल्पना किया जा सकता है ।
      नोट: स्क्रिप्ट में वर्णित विभाजन के लिए पैरामीटर्स, यदि आवश्यक हो तो संशोधित किया जा सकता है । फॉल्ट की क्वालिटी को स्क्रिप्ट Checksegmentation का इस्तेमाल कर चेक किया जा सकता है. m (StepbyStep. txt फ़ाइल देखें). इस आधार पर, यदि फॉल्ट की गुणवत्ता खराब है (केवल कुछ नाभिक का पता लगाया), फॉल्ट के मापदंडों को समायोजित, Dosegmentation. m लिपि में स्पष्ट रूप से संकेत दिया, और प्रक्रिया को दोहराने ।
  7. पटरियों उत्पन्न करने के लिए (यानी, समय में नाभिक के प्रत्येक के प्रक्षेप), विभाजन में प्राप्त परमाणु स्थितियों का उपयोग कर, एक ही काम कर रहे फ़ोल्डर में स्क्रिप्ट Generatetracks. m चलाते हैं. सुनिश्चित करें कि एक इनपुट के रूप में उचित विभाजन फ़ाइल जोड़ने से पहले प्राप्त (अधिक जानकारी के लिए StepbyStep. txt फ़ाइल देखें) ।
    नोट: एक आउटपुट के रूप में, उपयोगकर्ता x-निर्देशांक और y-जनरेट की गई पटरियों के निर्देशांक के लिए एक अन्य मैट्रिक्स के लिए एक मैट्रिक्स के साथ एक फ़ाइल Trackednamefile. matप्राप्त होगा ।
  8. Checktracking. m का उपयोग कर पटरियों की गुणवत्ता का मूल्यांकन (अधिक जानकारी के लिए StepbyStep. txt फ़ाइल देखें). समय में प्रत्येक नाभिक की स्थिति की कल्पना करने में मदद करने के लिए इस अंतिम मार्ग के उत्पादन के आंकड़े का प्रयोग करें । हरे क्रॉस के लिए बाईं ओर की जांच करें जो प्रत्येक खंडों के नाभिक का संकेत है । एक विशिष्ट नाभिक का चयन करने के लिए, निचले स्क्रॉल पट्टी का उपयोग करें । ध्यान दें कि चयनित नाभिक लाल रंग में प्रवृत्त होंगे, जबकि दाईं ओर, चयनित कक्ष के प्रक्षेप पथ का समय (ऊपरी स्क्रॉल पट्टी का उपयोग करके) का अनुसरण किया जा सकता है.

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Representative Results

लाइव इमेजिंग में मायोब्लास्ट विभेद के दौरान स्वचालित रूप से नाभिकीय संचलन का पालन करने के लिए, नाभिक को वरीयता के रूप में प्रतिदीप् त रूप से लेबल किया जाना चाहिए । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि डीएनए-intercalating अणुओं का उपयोग करना संभव नहीं है क्योंकि इन अणुओं के प्रसार और प्राथमिक myoblasts13के भेदभाव के साथ हस्तक्षेप । एक उदाहरण के रूप में, प्रसार और भेदभाव प्राथमिक myoblasts के साथ या Hoechst (चित्रा 1) के बिना सभ्य में विश्लेषण किया गया है । यह स्पष्ट है कि प्रसार (चित्रा 1ए, बी) और भेदभाव (चित्रा 1 सी, मध्य पैनल) जोरदार Myoblasts में बिगड़ा hoechst ३३३४२ के साथ सभ्य हैं । इसके विपरीत, myoblasts H2B से अलग-GFP चूहों और doxycycline के साथ सुसंस्कृत हरे प्रतिदीप्ति के साथ नाभिक है और इसी तरह के लिए जंगली से अलग myoblasts प्रकार चूहों (चित्रा 1 सी, सही और बाएँ पैनलों, क्रमशः).

H2B-GFP प्रोटीन व्यक्त प्राथमिक myoblasts के साथ लाइव सेल इमेजिंग भेदभाव के दौरान नाभिक की ट्रैकिंग की अनुमति देता है (चित्रा 2 और अनुपूरक वीडियो 1). प्रारंभिक (चित्रा 2A) और अंतिम समय अंक (चित्रा 2a) में संचरण और Gfp चैनलों के विलय छवियों H2B-gfp myoblasts के भेदभाव के दौरान वैज्ञानिकों myotubes की पहचान करने के लिए अनुमति देते हैं और, फलस्वरूप, नाभिक कि अंत एक मायोट्यूब (जैसे, नीले घेरे में नाभिक) या नाभिक है कि एक myotube में फ्यूज नहीं (जैसे, लाल घेरे में नाभिक) में एकीकरण.

लाइव सेल इमेजिंग डेटा से नाभिक/सेल आंदोलनों के बारे में जानकारी निकालने के लिए, यह संभव है कि नाभिक की प्रक्षेप पथ को ट्रैक करने के लिए प्रदत्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । सॉफ्टवेयर H2B-GFP चैनल से छवि का उपयोग करता है (नाभिक; चित्रा 3A) एक मुखौटा बनाने के लिए और प्रत्येक फ्रेम में नाभिक खंड । एक फ्रेम में परमाणु विभाजन के लिए, एक "रूढ़िवादी" थ्रेशोल्ड Gaussian14छानने के बाद छवि पर ओत्सू की विधि का उपयोग कर चुना है । अगले, वस्तुओं मोटे तौर पर खंडित कर रहे हैं; एक महीन विभाजन प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक वस्तु फिर से अपने bounding बॉक्स में औसत के आधार पर एक सीमा का उपयोग कर नकाबपोश है । एक वाटरशेड रूपांतर तो पास वस्तुओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्रा 3B) । हमारे हाथ में, एक वाटरशेड रूपांतरण के लिए सबसे पास नाभिक अलग करने में असमर्थ रहा है (चित्रा 3B, * इनसेट) । इस प्रकार, हम छवि में बड़े वस्तुओं का चयन करें और एक नया वाटरशेड परिवर्तन (चित्रा 3B, * * इनसेट), जो अतिरिक्त पास नाभिक को अलग करने में सक्षम है लागू करने के लिए क्षेत्र का इस्तेमाल किया । इस दृष्टिकोण के साथ, नाभिक के अधिकांश छवि में पहचान कर रहे हैं (चित्रा 3 सी).

नाभिक को ट्रैक करने के लिए, हम15tinevez द्वारा प्रकाशित ट्रैकिंग दिनचर्या को शामिल करके दिनचर्या में सुधार. संक्षेप में, ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म लिंक नाभिक एक फ्रेम में प्रत्येक नाभिक की स्थिति और अगले एक में एक ही नाभिक की स्थिति के बीच दूरी का योग को कम करने के उद्देश्य के साथ लगातार फ्रेम में पता चला, इस तरह के लिए "हंगरी एल्गोरिथ्म" का उपयोग ड्रापआउट16. कदम के क्रम में है कि दूर तख्ते की एक निश्चित अधिकतम संख्या तक है अनलिंक नाभिक लिंक करने के लिए दोहराया है । किसी फ़्रेम में किसी वस्तु की स्थिति के बीच अधिकतम दूरी के लिए एक सीमा और अगले एक भी स्थापित है । यहां प्रस्तुत आंकड़ों के लिए, पांच तख्तों की एक अधिकतम संख्या और प्रति चरण 20 पिक्सेल की अधिकतम दूरी सही पटरियों की एक उच्च संख्या दे (चित्रा 3 डी) । महत्वपूर्ण बात, हम ट्रैकिंग की गुणवत्ता की जांच करने के लिए इन दिनचर्या का उपयोग कर सकते हैं । यह भी संभव है इस स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं है कि एक दिया व्यवहार है, उदाहरण के लिए (या नहीं) एक myofiber बनाने के लिए, और बाद में ब्याज की कोशिकाओं के सेट की गतिकीय सुविधाओं का विश्लेषण ।

लागू किया गया सॉफ़्टवेयर, सैकड़ों कक्षों (चित्र 3d) के लिए Equation 1 , फ़्रेम nमें प्रत्येक कक्ष के लिए x-और y-निर्देशांकों के साथ ट्रैक जनरेट करता है । हम नाभिक गति के बारे में जानकारी निकालने के लिए ऐसी जानकारी का उपयोग कर सकते हैं । एक उदाहरण के रूप में, प्रारंभिक फ़्रेम (n = 0) और अंतिम फ़्रेम n के बीच कुल विस्थापन निम्नानुसार परिभाषित किया गया है ।

प्रक्षेप पथ का विस्थापन = | | Equation 2 ||

यहां, "| | · | |" सदिश के आदर्श के लिए खड़ा है (चित्र 4a) ।

फ्रेम द में प्रत्येक नाभिक का वेग निम्नानुसार है ।
Equation 3

फिर, हम किसी दिए गए सेल के लिए प्रक्षेप-पथ की लंबाई को निम्नानुसार परिभाषित कर सकते हैं ।

प्रक्षेपवक्र की लंबाई =Equation 4

कैसे इन सरल मापदंडों पहले से ही प्रासंगिक जानकारी दे सकते है के एक उदाहरण के रूप में, हम myoblasts के साथ या Hoechst के बिना इंयूबेटेड के नाभिक प्रक्षेपी की लंबाई गणना । ऐसा प्रतीत होता है कि प्रक्षेप-पथ की कुल लंबाई थोड़ा अधिक है, यद्यपि यह अंतर महत्वपूर्ण नहीं है (चित्र 4B) । हालांकि, जब हम एक समय चूक के दौरान कुल विस्थापन गणना, हमने देखा कि Hoechst के साथ दाग कोशिकाओं के कुल विस्थापन से काफी छोटा था कि अनसना कोशिकाओं की तुलना में (चित्रा 4C) । यह इंगित करता है कि दाग कोशिकाओं की आवाजाही एक कम दिशात्मकता है । इस परिकल्पना को और अधिक सुदृढ़ करने के लिए हमने प्रत्येक फ्रेम में वेग के कोण की गणना करके किसी कोशिका की गति की दिशात्मकता का परिमाण निर्धारित किया है (चित्र 4क) ।

Equation 5

हम भी फ्रेम के बीच कोण की भिन्नता मात्रा निर्धारित.

Equation 6

एक प्रक्षेपवक्र के साथ कुल कोण भिन्नता तो निम्नानुसार परिभाषित किया जा सकता है.

कुल कोण रूपांतर =Equation 7

के रूप में की भविष्यवाणी की है, अनसना कोशिकाओं के लिए कुल कोण भिंनता महत्वपूर्ण Hoechst (चित्रा 4D) के साथ दाग कोशिकाओं की तुलना में छोटा है । इसलिए, दिशात्मकता के इस सरल उपाय, एक सीधी गणना से प्राप्त, इंगित करता है कि myoblasts Hoechst के साथ दाग कम उनके विस्थापन की दिशा बनाए रखने के लिए प्रवण हैं, जो बनाने में उनकी बिगड़ती क्षमता को दर्शाता है myotubes (चित्रा 1) ।

संक्षेप में, यहां वर्णित के रूप में उत्पंन लाइव सेल इमेजिंग डेटा परमाणु गतिशीलता और myotubes बनाने की क्षमता के बीच एक मात्रात्मक लिंक प्रदान करते है और परमाणु गतिशीलता और मायोब्लास्ट के एक उच्च थ्रपुट मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है भेदभाव और फ्यूजन के दौरान व्यवहार ।

Figure 1
चित्रा 1: Hoechst के साथ ऊष्मायन प्रसार और myoblasts के भेदभाव के साथ हस्तक्षेप । (क) प्रसरण माध्यम (बाएँ पैनल) में 24 ज के बाद hoechst के साथ प्राथमिक myoblasts दाग के प्रतिनिधि छवियों या hoechst (सही पैनल) के साथ प्रसार के माध्यम में 24 ज के लिए सुसंस्कृत, और (ख) सापेक्ष मात्रा । डेटा का मतलब है ± SEM, और सांख्यिकीय महत्व छात्र टीपरीक्षण के साथ मूल्यांकन किया गया । *P < ०.०५. (ग) प्राथमिक जंगली प्रकार myoblasts के प्रतिनिधि छवियों, (बाएं पैनल) के बिना या hoechst (मध्य पैनल) के साथ मध्यम अंतर में 24 एच के लिए सभ्य, और H2B-gfp myoblasts के लिए सुसंस्कृत मध्यम (सही पैनल) फर्क में 24 एच के लिए और दाग Hoechst (नीला) और एक विरोधी myosin भारी श्रृंखला एंटीबॉडी (MyHC; लाल) के साथ । स्केल सलाखों = ५०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: H2B के लाइव इमेजिंग-GFP myoblasts भेदभाव के दौरान । पर (A) प्रारंभिक (t = 0 h) और (B) अंतिम समय बिंदु (t = 16 h) H2B-gfp myoblasts (20x उद्देश्य) के अंतर के दौरान ट्रांसमिशन और gfp चैनलों की मर्ज की गई छवियाँ । पेनल बीमें काले तीर के साथ मायोट्यूब्स के कुछ उदाहरण हाइलाइट किए गए हैं । स्केल पट्टियां = ५० μm । (ग) पैनलों a और B से बिंदीदार क्षेत्रों को बढ़ाया गया है जिसमें किसी एकल नाभिक की पहचान करना संभव है जो एक मायोट्यूब (नीले रंग में) में समाकलित होता है या नहीं (लाल) में t = 0 h, t = 8 ज, और t = १६ एच. स्केल सलाखों = ५० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: H2B के विभाजन-GFP myoblasts भेदभाव के दौरान ट्रैकिंग । (क) लगभग ४०० कोशिकाओं के नाभिक को दर्शाने वाले समय के एक फ्रेम का उदाहरण । (ख) नाभिक मास्किंग और विभाजन का उदाहरण है । उज्ज्वल वस्तुओं दोनों एक वैश्विक और एक स्थानीय दहलीज का उपयोग कर खंडित हैं, और एक वाटरशेड रूपांतरण पास के नाभिक को अलग करने के लिए लागू किया जाता है. पास के नाभिक खंड (* इनसेट) के लिए मुश्किल हो सकता है, तो एक दूसरे वाटरशेड आधारित विभाजन बड़े क्षेत्रों की वस्तुओं में किया जाता है नाभिक की एक उच्च संख्या खंड (* * इनसेट). (ग) का पता लगाया परमाणु पदों (लाल पार), कि बाद में ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म में प्रयोग किया जाता है । (घ) पटरियों ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म है कि दो लगातार फ्रेम में प्रत्येक वस्तु की स्थिति के बीच दूरियों के योग को ंयूनतम का उपयोग कर उत्पंन । प्रत्येक वस्तु के लिए ऐसी दूरी का एक अधिकतम संभव मूल्य एक इनपुट है कि वैज्ञानिकों को एक से अधिक फ्रेम से अलग नाभिक लिंक करने की अनुमति देता है के रूप में प्रदान की जाती है । स्केल सलाखों = ५० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: नाभिक गतिकी का मात्रात्मक विश्लेषण कोशिका दिशात्मकता को बनाए रखने के लिए Hoechst के साथ myoblasts इनयूबेटेड की बिगड़ा क्षमता को उजागर । (क) पैरामीटर माप का विवरण । दो क्रमिक तख्तों में स्थिति को देखते हुए नाभिक के वेग को परिभाषित करना संभव है । प्रक्षेपवक्र कोण और कोण भिन्नता तो आसानी से योजना में संकेत के रूप में पदों से गणना की जा सकती है । (ख) प्रक्षेप-पथ लंबाई का वितरण (ग) कुल विस्थापन, और (घ) होचस्ट (हरित रेखा) या होचस्ट (नीली रेखा) के बिना, माइओब्ले के प्रक्षेप-पथ का परिवर्तन । दो वितरणों काफी अलग नहीं हैं, जबकि कुल विस्थापन उल्लेखनीयतया अधिक है, और कोण की भिन्नता अनसना कोशिकाओं के लिए काफी कम है (एक तरफा कोल्मोगोरोव-Smirnov परीक्षण, *p < ०.०५ और * *p < ०.००५). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक वीडियो 1: H2B के लाइव इमेजिंग-GFP myoblasts भेदभाव के दौरान । H2B-GFP myoblasts के इमेजिंग मध्यम से अंतर में प्रारंभिक (टी = 0 ज) अंतिम समय अंक (टी = 16 ज) के लिए पारेषण और gfp चैनल (20x उद्देश्य) का उपयोग कर । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मांसपेशी फाइबर (myofibers) बहुविकृत कोशिकाओं है कि मांसपेशी पूर्ववर्ती कोशिकाओं (myoblasts) मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (उपग्रह कोशिकाओं) है कि प्रसार और भेदभाव2,3, से व्युत्पंन से व्युत्पन्न के विलय के द्वारा गठित कर रहे हैं 4. मायोब्लास्ट भेदभाव का आकलन करने के लिए, आम प्रक्रिया मध्यम अंतर में संवर्धन myoblasts के होते हैं और विभिन्न समय बिंदुओं पर कोशिकाओं फिक्सिंग myhc, भेदभाव का एक मार्कर, और के दाग के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन करने के लिए डीएनए-intercalating अणुओं के साथ नाभिक (उदा., Hoechst)5. इस विधि विभिन्न मापदंडों को मापने के द्वारा myoblast भेदभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है, इस तरह के भेदभाव सूचकांक (MyHC पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या/कुल सेल नंबर) या संलयन सूचकांक (न्यूनतम दो नाभिक के साथ myoblast की संख्या/कुल सेल संख्या) . हालांकि, मायोब्लास्ट फ्यूजन और मायोट्यूब गठन अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं है कि नाभिक8की गतिशीलता पर भरोसा करते हैं । दरअसल, myofibers के भीतर परमाणु स्थिति उचित मांसपेशी उत्थान और समारोह17के लिए आवश्यक है । Myoblasts की गतिशीलता और उनके नाभिक के बाहर बारी के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर मायोब्लास्ट भेदभाव का मूल्यांकन करने के लिए और पेशी विकारों में उपंयास दोषों को उजागर करने के लिए हो सकता है । इसलिए, यह आवश्यक है के लिए उपंयास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कोशिका व्यवहार और परमाणु आंदोलन के दौरान मायोब्लास्ट भेदभाव और myoblast गठन ।

यहां, हम एक विधि है कि वैज्ञानिकों मायोब्लास्ट भेदभाव और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा myoblast गठन का पालन करने के लिए और नाभिक की स्वचालित ट्रैकिंग से मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है का वर्णन । इस विधि का लाभ myoblasts के फ्लोरोसेंट नाभिक के भेदभाव के दौरान ट्रैक करने की संभावना है, H2B से अलग-gfp चूहों, किसी भी सेल अभिकर्मक या अतिरिक्त धुंधला बिना. H2B-GFP चूहों वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं और, फलस्वरूप, आसानी से सुलभ. वैकल्पिक रूप से, यह अन्य ट्रांसजेनिक चूहों कि नाभिक में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए या नाभिक में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जंगली प्रकार चूहों से अलग कोशिकाओं transfect से myoblasts अलग करने के लिए संभव है, के रूप में पहले बताया9 . इन विभिंन विकल्पों और आगे विधि के संभावित अनुप्रयोगों का विस्तार यहां प्रस्तुत किया ।

वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक myoblasts की संस्कृति पर निर्भर करता है, और फलस्वरूप, एक उच्च परिवर्तनशीलता निंनलिखित प्रायोगिक प्रक्रियाओं में मनाया जा सकता है, भी nonmyogenic कोशिकाओं की मांसपेशियों से अलगाव के बाद संभावित उपस्थिति के कारण18 . इस सीमा को दूर करने के लिए, यह के रूप में पहले वर्णित19सेल छंटाई द्वारा myoblasts अलग करने के लिए संभव है । विधि में एक अंय महत्वपूर्ण बिंदु यहां वर्णित करने के लिए नाभिक का एक सही ट्रैकिंग जब कोशिकाओं को एक दूसरे के करीब हैं, जैसे myotube गठन के दौरान उत्पंन करने के लिए कठिनाई है । हालांकि, सॉफ्टवेयर दिनचर्या यहां पर चर्चा की वैज्ञानिकों नेत्रहीन ट्रैकिंग की गुणवत्ता का निरीक्षण करने की अनुमति है और, यदि आवश्यक हो, एक बाद के विश्लेषण के लिए ब्याज की कोशिकाओं के एक सबसेट का चयन करने के लिए । सॉफ्टवेयर के आगे सुधार myofiber गठन के दौरान परमाणु गतिशीलता का एक पूरा लक्षण वर्णन प्रदान करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

अंत में, इस विधि के विभिंन स्थितियों की तुलना द्वारा myoblast भेदभाव के दौरान नाभिक गतिशीलता में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उपयोगी है, के रूप में हम Hoechst ऊष्मायन के साथ की सूचना दी । इस उदाहरण समय-चूक प्रयोगों से सार्थक गतिशील डेटा को निकालने की क्षमता दिखाता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थन किया गया AFM-टेलीथन के लिए ev (#21545) और द्वारा ओस्पेडेल सैन Raffaele (OSR) बीज अनुदान S.Z. (ZAMBRA5X1000) । Institut Pasteur के इमेज एनालिसिस हब से डॉ जीन Yves Tinevez अपने "सरल ट्रैकर" MATLAB दिनचर्या को सार्वजनिक रूप से साझा करने के लिए स्वीकार किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
chicken embryos extract Seralab CE-650-J
collagenase Sigma C9263-1G 125units/mg
collagen from calf skin Sigma C8919
dispase Gibco 17105-041 1.78 units/mg
doxyciclin Sigma D1515
DMEM Sigma D5671
fetal bovine serum Life technologies 10270106
gentamicin Sigma G1397
Horse serum Invitrogen 16050-098
Hoechst life technologies 33342
IMDM Sigma I3390
L-glutamine Sigma G7513
Matrigel Corning 356231
penicillin-streptomycin Sigma P0781
red blood cells lysis medium Biolegend 420301
Digestion medium
collagenase 40 mg
dispase 70 mg
PBS 20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum 10%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum 20%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum 2%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 1%
filtered 0.22um

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References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
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Careccia, G., Colombo, F., Tirone, M., Agresti, A., Bianchi, M. E., Zambrano, S., Vénéreau, E. Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion. J. Vis. Exp. (146), e58888, doi:10.3791/58888 (2019).

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