Summary
Differenziazione del muscolo scheletrico è un processo altamente dinamico, che in particolare si basa sul posizionamento nucleare. Qui, descriviamo un metodo per tracciare i movimenti di nuclei da formazione immagine di tensione delle cellule durante la formazione di differenziazione e miotubi dei mioblasti ed effettuare una caratterizzazione quantitativa delle dinamiche di nuclei di estrazione di informazioni da inseguimento automatico.
Abstract
Nucleare di posizionamento all'interno delle cellule è importante per molteplici processi cellulari, nello sviluppo e rigenerazione. L'esempio più intrigante di posizionamento nucleare si verifica durante la differenziazione del muscolo scheletrico. Fibre muscolari (myofibers) sono cellule multinucleated formate dalla fusione delle cellule del precursore di muscolo (mioblasti) derivati da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione. Corretto posizionamento nucleare all'interno di miofibre è richiesto per la rigenerazione muscolare adeguata e la funzione. La procedura comune per valutare la formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti si basa su celle fisse analizzate mediante immunofluorescenza, che ostacola lo studio del comportamento delle cellule e del movimento nucleare nel corso del tempo. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi della formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti da formazione immagine di cellule vive. Mettiamo a disposizione un software per il rilevamento automatizzato ottenere una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle dinamiche nucleare e comportamento dei mioblasti (vale a dire, la traiettoria) durante la differenziazione e la fusione nucleare.
Introduction
Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo umano, per un totale di 35% - 40% della massa del corpo1. Le cellule satelliti sono cellule staminali del muscolo, anatomicamente caratterizzate dalla loro posizione (giustapposti alla membrana del plasma, sotto la lamina basale delle fibre muscolari), che danno origine ai mioblasti proliferanti (cellule progenitrici miogenico), che alla fine differenziare e integrare nelle miofibre esistenti e/o fusibile per formare nuove miofibre2,3,4. La loro scoperta e i progressi nello studio della loro biologia ha portato a significativi approfondimenti lo sviluppo muscolare e la rigenerazione.
Protocolli per isolare e differenziare i mioblasti in miotubi sono stati sviluppati molti anni fa e sono ancora ampiamente utilizzati per lo studio del muscolo scheletrico differenziazione5,6,7. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi rappresentano procedure statiche che si basano sull'analisi delle celle fisse e, di conseguenza, non consentono agli scienziati di esplorare pienamente processi altamente dinamici, come fusione dei mioblasti e maturazione miofibre. L'esempio più eclatante è il posizionamento del nucleare, che è strettamente regolata, con nuclei inizialmente nel centro della myofiber e, quindi, situata alla periferia dopo miofibre maturazione8,9. La formazione immagine dal vivo è la tecnica più appropriata per ottenere ulteriori approfondimenti tale fenomeno peculiare.
Qui, descriviamo un metodo che consente agli scienziati di registrare dei mioblasti differenziazione e miotubi formazione da microscopia time-lapse e per eseguire analisi quantitative dall'inseguimento automatico dei nuclei dei mioblasti. Questo metodo fornisce una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle nucleare dinamiche e dei mioblasti comportamento durante la differenziazione e la fusione. Il protocollo è diviso in quattro parti, vale a dire (1) l'insieme di muscoli dalle zampe posteriori di topi, (2) l'isolamento di mioblasti primari che consiste nella digestione meccanica ed enzimatica, (3) dei mioblasti proliferazione e differenziazione e (4) live imaging per tenere traccia di nuclei all'interno le prime 16 ore di differenziamento dei mioblasti.
Nella procedura seguente, mioblasti sono isolate da topi H2B-GFP e trattati con 1 µ g/mL di doxiciclina per indurre l'espressione di H2B-GFP, come descritto in precedenza10. In alternativa, è possibile isolare i mioblasti da altri topi transgenici che esprimono una proteina fluorescente nel nucleo o a transfect le cellule isolate da topi wild-type per esprimere una proteina fluorescente nel nucleo, come descritto da Pimentel et al. 9.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di uso e San Raffaele istituzionale Animal Care.
1. dissezione dei muscoli hindlimb del mouse
- Sterilizzare in autoclave pinzette e forbici (sia dritti e curve).
- Preparare e filtro (0,22 µm) tutti i media (blocco medio, digestione medio, medio di proliferazione e differenziazione medio) prima di iniziare l'esperimento (Vedi Tabella materiali).
- Mettere 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) in una capsula di Petri per la raccolta del muscolo da 35 mm.
- Sacrificare il mouse dislocazione cervicale o usando CO2 e sterilizzare la pelle con etanolo. Togliere la pelle dalle zampe posteriori e arti superiori utilizzando forbici e pinzette, per facilitare l'isolamento dei muscoli.
Nota: I muscoli possono essere isolati da topi neonatali o adulti. Topi neonatali hanno un numero aumentato di cellule satelliti rispetto ai topi adulti. Tuttavia, il numero totale di cellule satelliti che possono essere isolate da un topo adulto singolo è sufficiente per eseguire l'esperimento descritto di seguito. - Isolare tibialis, Soleo, longus di digitorum dell'estensore (EDL), gastrocnemio, quadricipiti e tricipiti e metterli nel piatto Petri contenente PBS. Lasciare il piatto sul ghiaccio. Rimuovere con cura i tendini e grasso con forbici sterilizzate e pinzette.
2. isolamento di mioblasti primari
Nota: Tutte le procedure per la coltura cellulare avviene in condizioni di sterilità.
- Rimuovere i muscoli da PBS. Tagliare e sminuzzare i muscoli, utilizzando forbici curve sterile, fino ad ottenga una massa omogenea. Mettere i pezzi di muscolo in un tubo da 50 mL.
- Aggiungere 10 mL di terreno di digestione per i pezzi di muscolo e incubare a 37 ° C per 30 min sotto forte agitazione (250 min-1) in un bagno di acqua, per digerire enzimaticamente i muscoli.
- Aggiungere 10 mL di Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), la glutamina 1%, 1% di penicillina/streptomicina e gentamicina 1% (blocco medio) per interrompere la digestione.
- Centrifugare a 40 x g per 5 min e raccogliere il surnatante in una provetta da 50 mL. Salvare il pellet sul ghiaccio.
Nota: Dopo la centrifugazione, il sovranatante contiene alcune cellule satelliti, cellule del sangue, cellule endoteliali e fibroblasti, mentre il pellet contiene pezzi di muscolo non digerito e tessuto connettivo. Per aumentare il numero di cellule isolate, il pellet dovrà essere sottoposti a ulteriori passaggi di digestione come descritto di seguito. - Centrifugare il supernatante a 650 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di DMEM contenente 10% FBS. Mantenere il sedimento risospeso sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi da 2.2 – 2,5 x 2 per il resto del precipitato ottenuto nel passaggio 2.4 e aggiungere i pellet successivamente sedimento sedimento risospeso prima conservato sul ghiaccio.
- Passare i pellet sedimento attraverso un filtro di 70 µm e poi attraverso un filtro a 40 µm. Aggiungere 15 mL di DMEM con 10% FBS e centrifugare a 650 x g per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di tampone di lisi delle cellule di anima rosse per vuotare i globuli rossi. Incubare per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 40 mL di PBS per fermare la lisi dei globuli rossi e centrifugare a 650 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di DMEM con 10% FBS.
- Come passo preplating, piastra le cellule in 20 mL di terreno di proliferazione in una capsula Petri 150 mm non patinata. Dopo 1 h di incubazione in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2), raccogliere il mezzo.
Nota: Fibroblasti, collegamento alla piastra, quindi vengono eliminati, mentre le cellule satelliti rimangono in sospensione. - Ripetere il passaggio 2,9 3 x e, nell'ultima fase preplating, raccogliere il mezzo che contiene le cellule satelliti in sospensione.
- Centrifuga a 650 x g per 5 min.
- Mentre le cellule sono centrifugazione, cappotto due capsule di Petri 150mm con collagene (10 mL di soluzione 0,1% in acido acetico 0,1 M). Per farlo, mettere il collagene sulla piastra, incubare per 5 minuti e rimuoverlo. Asciugare la piastra per 30 min.
- Scartare il sopranatante ottenuto nel passaggio 2.11 e risospendere il pellet cellulare in 40 mL di terreno di proliferazione (Tabella materiali). Piastra le cellule su due capsule di Petri rivestite con collagene 150 mm (20 mL per ogni piatto) e mantenere le cellule in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) nel terreno di proliferazione per 2 – 3 giorni con 1 µ g/mL di doxiciclina per indurre l'espressione di H2B-GFP.
Nota: Questo passaggio consente la proliferazione dei mioblasti per ottenere un numero maggiore di cellule per ulteriori analisi. Densità delle cellule viene mantenuta molto bassa per evitare una spontanea differenziazione dei mioblasti in miotubi.
3. dei mioblasti saggi di proliferazione e differenziazione
Nota: Quando la densità dei mioblasti è alta, alcune cellule avviare allungamento, e quindi, è necessario dividere le celle. In genere, è possibile dividere celle 2 x-3 x senza intaccare il loro fenotipo.
- Eliminare il prodotto, lavare le cellule con 5 mL di PBS, aggiungere 2 mL di tripsina (1x) e incubare la piastra a 37 ° C in un'incubatrice di cellulare per 5 min. Check sotto il microscopio e, quando cellule rotonde scollegare, aggiungere 5 mL di DMEM con 10% FBS per inattivare la tripsina. Contare il numero di cellule (di solito è possibile ottenere circa 1 x 106 cellule/del mouse).
Nota: L'incubazione con tripsina per 5 min è in genere sufficiente per staccare i mioblasti proliferanti. - Sottoporre le cellule a uno dei saggi descritti di seguito.
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Analisi di proliferazione
- Piastra di 50.000 cellule/pozzetto in 1ml/bene di medie di proliferazione in un piatto di 12-pozzetti rivestite con collagene e incubare le cellule placcate in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2). Difficoltà e contare le celle a 24, 48 o 72 ore.
Nota: Il mezzo è sostituito ogni 48 h per evitare l'esaurimento dei nutrienti.
- Piastra di 50.000 cellule/pozzetto in 1ml/bene di medie di proliferazione in un piatto di 12-pozzetti rivestite con collagene e incubare le cellule placcate in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2). Difficoltà e contare le celle a 24, 48 o 72 ore.
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Analisi di differenziazione
- Ricoprire una piastra 12-pozzetti con 350 µ l di matrice della membrana basale contenente medio di differenziazione (1: 100). Incubare la piastra a 37 ° C per 30 min e rimuovere il mezzo.
- Piastra 200.000 cellule/pozzetto in mezzo di differenziazione nella piastra rivestite con matrice. Incubare le cellule in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) fino a quando essi aderiscono alla piastra (2h sono generalmente abbastanza per le cellule di aderire e di avviare la differenziazione).
- Per valutare la differenziazione, eseguire la colorazione per la catena pesante della miosina e nuclei come descritto in precedenza11. In alternativa, eseguire analisi di vivere-Imaging per applicazioni come descritto di seguito.
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Analisi di proliferazione
4. Live-imaging di differenziamento dei mioblasti e rilevamento nucleare
- Per live cell imaging, mettere le cellule, ottenute nella sezione 3.2.2 e placcato in un piatto di 12-pozzetti, sotto un microscopio confocale, dotato di un sistema di incubazione per mantenere le cellule a 37 ° C in 5% CO2.
- Utilizzare un obiettivo asciutto 20x (0,7 NA) per ottenere campi di vista con centinaia di cellule, abbastanza per monitorare myofiber formazione. Cellule di H2B-GFP possono essere imaged con un laser di Argon di basso-intensità 488 nm.
Nota: Un foro stenopeico aperto assicura che la profondità dell'immagine (~ 10 µm) contiene lo spessore delle cellule in modo che le cellule sono tenute in stato attivo in tutto l'esperimento. Utilizzando un microscopio confocale è vantaggioso poiché migliora il rapporto segnale-rumore delle immagini, potrebbe essere utilizzata anche grandangolari microscopia. Myofiber formazione possa essere monitorati attraverso il canale di trasmissione. - Acquisire immagini di 16 bit e 1.024 x 1.024 pixel per frame ogni 6 min per 16 h. Per ogni posizione acquisita, generare un file di multiframe.tif (Vedi esempio nei File supplementari).
Nota: Nel presente protocollo, software commerciale connesso con il microscopio (Tabella materiali) è stato utilizzato; utilizzare il software appropriato per raggiungere lo stesso obiettivo, quando si utilizzano altri microscopi. - Scarica il software fornito come zip file supplementari.
Nota: Le routine sono script che deve essere eseguito in MATLAB. Il software è un adattamento di un software pubblicati12 ottimizzato per il tracciamento dei nuclei durante la formazione dei miotubi. Questo software è diviso in due parti: il primo si identifica i nuclei in ogni fotogramma segmentando li, mentre la seconda si genera "tracce" (traiettorie) del movimento di nuclei. Il codice completo per la segmentazione nucleare e rilevamento e una guida dettagliata introduttiva all'utilizzo sono forniti nei File supplementari. - Estrarre il file zip e salvarlo in un percorso desiderato sul personal computer (PC) in uso. Eseguire tutte le sotto passaggi su un PC con il software già installato. Si noti che il file. zip è composta da tre cartelle come indicato di seguito.
Nota: Segmentazione routine contiene le funzioni da eseguire per la segmentazione. Routine di rilevamento, invece, contiene le funzioni necessarie per il tracciamento. Esempio di segmentazione di rilevamento fornisce i file per familiarizzare con il sistema e gli script di base. Il software utilizzato per la segmentazione e rilevamento dei nuclei viene eseguito correttamente in MATLAB, R2015a o versioni successive. - Per segmentare i nuclei dal file con estensione TIF, nome del file, ad esempio, NameFile.tif.
- Aprire la cartella di Esempio di segmentazione di rilevamento e fare clic su DoSegmentation.m. Verrà aperta la finestra di comando in MATLAB.
- Controllare la finestra di Cartella corrente sulla sinistra per vedere tutti gli elementi nella cartella di Esempio di segmentazione di rilevamento . Fare doppio clic su DoSegmentation.m.
Nota: Informazioni dettagliate sulle modifiche che devono essere fatte nello script possono essere trovate nel file StepbyStep.txt. È obbligatorio per modificare lo script in modo che la variabile filenameinput è NameFile.tif e folderinput è la cartella dove è contenuto il file con estensione TIF. - Eseguire lo script (cliccando sul verde pulsante Esegui ). Il risultato della segmentazione verrà salvato come un file.mat (SegmentedNameFile.mat), mentre la segmentazione dei nuclei possa essere visualizzata nella figura uscita.
Nota: I parametri per la segmentazione, descritto nello script, possono essere modificati se necessario. La qualità della segmentazione può essere controllata utilizzando lo script CheckSegmentation.m (vedere il file StepbyStep.txt). Sulla base di questo, se la qualità della segmentazione è scarsa (solo pochi nuclei di rilevato), regolare i parametri della segmentazione, chiaramente indicata nello script DoSegmentation.m e ripetere la procedura.
- Per generare le tracce (cioè, le traiettorie di ciascuno dei nuclei nel tempo), usando le posizioni nucleare ottenuta nella segmentazione, eseguire lo script GenerateTracks.m nella stessa cartella di lavoro. Assicurarsi di aggiungere il file corretta segmentazione come input, ottenuti prima (vedere il file StepbyStep.txt per maggiori informazioni).
Nota: Come un'uscita, l'utente otterrà un file TrackedNameFile.mat, con una matrice per le coordinate x e un'altra matrice per le coordinate y dei brani generati. - Valutare la qualità delle tracce utilizzando CheckTracking.m (vedere il file StepbyStep.txt per maggiori informazioni). Utilizzare la figura di uscita di questo ultimo passaggio consente di visualizzare ogni posizione di nuclei in tempo. Verifica sulla sinistra per croci verdi che indicano ogni nucleo segmentato. Per selezionare uno specifico nucleo, utilizzare la barra di scorrimento inferiore. Si noti che il nucleo selezionato sarà cerchiato in rosso, mentre sulla destra, la traiettoria della cella selezionata può essere seguita nel tempo (utilizzando la barra di scorrimento superiore).
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Representative Results
Per seguire automaticamente movimento nucleare durante la differenziazione dei mioblasti in vivo imaging, i nuclei fluorescente preferenzialmente devono essere etichettati. È importante notare che utilizzando molecole intercalanti del DNA non è fattibile perché queste molecole interferiscono con la proliferazione e la differenziazione di mioblasti primari13. Ad esempio, proliferazione e differenziazione sono state analizzate in mioblasti primari coltivate con o senza Hoechst (Figura 1). È evidente che la proliferazione (Figura 1A, B) e la differenziazione (Figura 1, pannello centrale) sono fortemente alterate in mioblasti coltivati con Hoechst 33342. Al contrario, mioblasti isolati da topi H2B-GFP e coltivati con doxiciclina hanno nuclei con fluorescenza verde e differenziano similmente ai mioblasti isolati da topi wild-type (pannelli diFigura 1, destra e sinistra, rispettivamente).
Live cell imaging con mioblasti primari esprimenti la proteina GFP H2B permette il tracciamento dei nuclei durante il differenziamento (Figura 2 e complementare Video 1). Unire immagini di trasmissione e canali GFP presso l'iniziale (Figura 2A) e il tempo finale punti (Figura 2B) durante il differenziamento dei mioblasti H2B-GFP permettono agli scienziati di identificare miotubi e, di conseguenza, i nuclei che finiscono l'integrazione in un miotubi (ad es., il nucleo nel cerchio blu) o nuclei che non si fondono in un miotubi (ad es., il nucleo nel cerchio rosso).
Per estrarre informazioni sui movimenti di nuclei/cella dai dati live cell imaging, è possibile utilizzare il software fornito per tenere traccia le traiettorie dei nuclei. Il software utilizza l'immagine dal canale H2B-GFP (i nuclei; Figura 3A) per creare una maschera e per segmentare i nuclei in ogni fotogramma. Per segmentazione nucleare in una cornice, una soglia "conservatore" viene selezionata mediante il metodo di Otsu sull'immagine dopo gaussiana filtro14. Successivamente, gli oggetti sono più o meno segmentato; per ottenere una segmentazione più fine, ogni oggetto viene mascherato nuovamente utilizzando una soglia sulla base della media nella relativa casella di delimitazione. Una trasformazione di spartiacque viene quindi utilizzata per separare gli oggetti (Figura 3B) vicini. Nelle nostre mani, una trasformazione di spartiacque è stato in grado di separare la maggior parte dei nuclei vicini (Figura 3B, * inserto). Così, abbiamo usato l'area per selezionare gli oggetti più grandi nell'immagine e applicare una nuova trasformazione di spartiacque (Figura 3B, * * inserto), che è in grado di separare aggiuntivi vicini nuclei. Con questo approccio, la maggior parte dei nuclei vengono identificati nell'immagine (Figura 3).
Per tenere traccia dei nuclei, abbiamo migliorato le routine incorporando le routine di rilevamento pubblicate da Tinevez15. In breve, l'algoritmo di rilevamento collega nuclei rilevati in fotogrammi consecutivi con lo scopo di minimizzare la somma delle distanze tra la posizione di ogni nucleo in un frame e la posizione dello stesso nucleo in quello successivo, utilizzando l'algoritmo"ungherese" per tali minimizzazione16. Il passo viene ripetuto al fine di collegare i nuclei non collegati che sono fino a un certo numero massimo di fotogrammi di distanza. Inoltre è stabilita una soglia per la distanza massima tra la posizione di un oggetto in un fotogramma e quello successivo. Per i dati presentati qui, un numero massimo di cinque fotogrammi e una distanza massima di 20 pixel per ogni passo dare un elevato numero di tracce corrette (Figura 3D). Soprattutto, possiamo usare queste routine per controllare la qualità del tracking. È anche possibile utilizzare questo script per trovare le celle che hanno un dato comportamento, ad esempio formando (o non) a myofiber e successivamente analizzare le caratteristiche dinamiche del set di celle di interesse.
Software applicato genera le tracce con coordinate x e y per ogni cella nel telaio n, 
, per centinaia di cellule (Figura 3D). Possiamo usare tali informazioni per estrarre informazioni sul movimento di nuclei. Ad esempio, lo spostamento totale tra il frame iniziale (n = 0) e il fotogramma finale N è definito come segue.
Spostamento di una traiettoria = | | 
||
Qui, "| | · | |" sta per la norma del vettore (Figura 4A).
La velocità di ogni nucleo nel telaio n è come segue.
Quindi, possiamo definire la lunghezza di una traiettoria per una determinata cella come segue.
Lunghezza della traiettoria =
Come un esempio di come questi parametri semplici possono già dare informazioni rilevanti, abbiamo calcolato la lunghezza delle traiettorie di nuclei di mioblasti incubati con o senza Hoechst. Sembra che la lunghezza totale delle traiettorie è leggermente superiore per le cellule colorate con Hoechst, sebbene la differenza non è significativa (Figura 4B). Tuttavia, quando abbiamo calcolato la cilindrata totale durante un lasso di tempo, abbiamo osservato che la cilindrata totale di cellule colorate con Hoechst era sensibilmente inferiore a quella delle cellule senza macchiate (Figura 4). Questo indica che il movimento di cellule marcate ha una bassa direzionalità. Per rafforzare ulteriormente questa ipotesi, abbiamo quantificato la direzionalità del moto di una cella calcolando l'angolo della velocità in ogni fotogramma (Figura 4A).
Abbiamo quantificato anche la variazione dell'angolo tra fotogrammi.
La variazione dell'angolo totale lungo una traiettoria può quindi essere definita come segue.
Totale variazione dell'angolo =
Come previsto, la variazione dell'angolo totale per le celle senza macchiate è significativamente inferiore rispetto a cellule colorate con Hoechst (Figura 4). Quindi, questa misura semplice di direzionalità, ottenuti da un semplice calcolo, indica che i mioblasti colorate con Hoechst sono meno incline a mantenere la direzione del loro spostamento, che riflette la loro capacità alterata nella formazione miotubi (Figura 1).
In breve, dati di imaging cellulare diretta generati come descritto qui forniscono un link quantitativo tra nucleare dinamica e la capacità di miotubi di forma e possono essere utilizzati come input per una caratterizzazione quantitativa di alto-rendimento delle dinamiche nucleare e dei mioblasti comportamento durante la differenziazione e la fusione.
Figura 1: incubazione con Hoechst interferisce con la proliferazione e la differenziazione dei mioblasti. (A) immagini rappresentative di mioblasti primari coltivati per 24 h nel mezzo di proliferazione con Hoechst (pannello di destra) e (B) la quantificazione relativa o tinto con Hoechst dopo 24 h nel mezzo di proliferazione (pannello di sinistra). I dati sono la media ± SEM e la significatività statistica è stata valutata con di Student t-test. P < 0.05. (C) immagini rappresentative di mioblasti primari di selvaggio-tipo, coltivati per 24 h nella differenziazione del mezzo senza (pannello sinistro) o con Hoechst (pannello centrale) e di H2B-GFP mioblasti coltivati per 24 h nella differenziazione medio (pannello di destra) e macchiato con Hoechst (blu) e un anticorpo di catena pesante anti-miosina (MyHC; rosso). Le barre di scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Live imaging di H2B-GFP mioblasti durante il differenziamento. Immagini unite della trasmissione e della GFP canali al punto (A) l'iniziale (t = 0 h) e (B) tempo finale punti (t = 16 h) durante il differenziamento dei mioblasti H2B-GFP (obiettivo x 20). Alcuni esempi di miotubi sono evidenziati con frecce nere nel pannello B. Le barre di scala = 50 µm. (C) aree Magnified punteggiato da pannelli A e B in cui è possibile identificare un singolo nucleo che finisce per integrare un miotubi (in blu) o non (in rosso) a t = 0 h, t = 8 h e t < / C12 > = 16 h. Le barre di scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: segmentazione dei mioblasti H2B-GFP rilevamento durante il differenziamento. (A) esempio di una cornice del lasso di tempo mostrando i nuclei delle cellule circa 400. (B) esempio di nuclei di mascheramento e segmentazione. Oggetti luminosi sono segmentati utilizzando sia un globale e un limite locale, e viene applicata una trasformazione di spartiacque per separare è vicino a nuclei. I nuclei vicini potrebbero essere difficili segmento (* inserto), pertanto viene eseguita una seconda segmentazione basata su spartiacque in oggetti di grandi aree per segmentare un maggior numero di nuclei (* * inserto). (C) rilevato posizioni nucleare (croci rosse), che vengono poi utilizzati nell'algoritmo di rilevamento. (D) brani generati utilizzando l'algoritmo di rilevamento che minimizza la somma delle distanze tra la posizione di ogni oggetto in due fotogrammi consecutivi. Un valore massimo possibile di tale distanza per ogni oggetto viene fornito come input che permette agli scienziati di collegare i nuclei separati da più di un fotogramma. Le barre di scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: analisi Quantitative delle dinamiche di nuclei di scoprire la capacità alterata di mioblasti incubati con Hoechst di mantenere la direzionalità delle cellule. (A) Descrizione delle misure di parametri. È possibile definire la velocità di un nucleo considerando la posizione in due fotogrammi consecutivi. L'angolo di traiettoria e la variazione dell'angolo può quindi essere facilmente calcolate dalle posizioni come indicato nello schema. (B) distribuzione della lunghezza di traiettorie, cilindrata totale (C) e (D) variazione dell'angolo traiettorie dei mioblasti incubato senza Hoechst (linea verde) o con Hoechst (linea blu). Le due distribuzioni non siano significativamente diverse, mentre la cilindrata totale è significativamente più alta, e la variazione dell'angolo è significativamente più bassa per le cellule non macchiate (unilaterale test di Kolmogorov-Smirnov, *p < 0.05 e * *p < 0,005). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare Video 1: Live imaging di H2B-GFP mioblasti durante il differenziamento. Imaging di H2B-GFP mioblasti coltivati nella differenziazione medio dall'iniziale (t = 0 h) ai punti di tempo finale (t = 16 h) utilizzo di trasmissione e canali GFP (obiettivo x 20). Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Fibre muscolari (myofibers) sono multinucleate che si formano dalla fusione di cellule precursori muscolari (mioblasti) derivata da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione2,3, 4. Per valutare stimola il differenziamento, la procedura comune consiste di coltura mioblasti in differenziando le medie e fissare le cellule in diversi momenti per eseguire immunofluorescenza che macchia per MyHC, un indicatore di differenziazione e la macchiatura di nuclei con intercalanti del DNA molecole (ad es., Hoechst)5. Questo metodo è utile per valutare il differenziamento dei mioblasti misurando diversi parametri, quali l'indice di differenziazione (numero di numero di cellulare di cellule/totale MyHC-positivo) o l'indice di fusione (numero di miotubi con almeno due nuclei/cella numero totale) . Tuttavia, la fusione dei mioblasti e la formazione dei miotubi sono processi altamente dinamici che si basano sulla motilità dei nuclei8. Infatti, posizionamento nucleare all'interno di miofibre è richiesto per la rigenerazione muscolare adeguato e funzione17. La mobilità dei mioblasti e dei loro nuclei potrebbe rivelarsi un parametro critico per valutare il differenziamento dei mioblasti e scoprire nuovi difetti in disordini muscolari. Quindi, è essenziale sviluppare nuove procedure per studiare il comportamento delle cellule e movimento nucleare durante il differenziamento dei mioblasti e formazione myofiber.
Qui, descriviamo un metodo che consente agli scienziati di seguire la formazione di differenziazione e miotubi dei mioblasti da formazione immagine di cellule vive e per eseguire analisi quantitative dall'inseguimento automatico dei nuclei. Il vantaggio di questo metodo è la possibilità di tenere traccia durante la differenziazione dei nuclei fluorescente di mioblasti, isolate da topi di H2B-GFP, senza transfezione delle cellule o colorazione aggiuntiva. I topi di H2B-GFP sono commercialmente disponibili e, di conseguenza, facilmente accessibile. In alternativa, è possibile isolare i mioblasti da altri topi transgenici che esprimono una proteina fluorescente nel nucleo o a transfect le cellule isolate da topi wild-type per esprimere una proteina fluorescente nel nucleo, come descritto in precedenza9 . Queste diverse opzioni ulteriormente estendono le potenzialità applicative del metodo presentato qui.
Il protocollo attuale si basa sulla cultura di mioblasti primari, e di conseguenza, un'alta variabilità potrebbe essere osservata nelle seguenti procedure sperimentali, anche a causa della potenziale presenza di cellule nonmyogenic dopo l'isolamento dai muscoli18 . Per ovviare a questa limitazione, è possibile isolare i mioblasti di cella ordinamento come descritto in precedenza19. Un altro punto critico nel metodo descritto qui è la difficoltà a generare una perfetta tracciabilità dei nuclei, quando le cellule sono vicino a vicenda, come durante la formazione dei miotubi. Tuttavia, la routine di software discussi qui permettono agli scienziati di ispezionare visivamente la qualità del tracking e, se necessario, per selezionare un sottoinsieme delle cellule di interesse per una successiva analisi. Ulteriore miglioramento del software potrebbe essere necessario fornire una completa caratterizzazione della dinamica nucleare durante la formazione del myofiber.
In conclusione, questo metodo è utile per fornire la comprensione quantitativa nelle dinamiche di nuclei durante il differenziamento dei mioblasti confrontando diverse condizioni, come abbiamo segnalato con Hoechst incubazione. Questo esempio illustra la capacità di estrarre dati dinamici significativi da esperimenti di time-lapse.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da AFM-Telethon a E.V. (#21545) e con la concessione di seme di Ospedale San Raffaele (OSR) a S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez dall'Hub di analisi di immagine dell'Institut Pasteur è riconosciuto per condividere pubblicamente la sua routine MATLAB "Semplice Tracker".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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