Summary
골격 근육 분화 특히 핵 위치에 의존 하는 매우 역동적인 과정 이다. 여기, 우리가 myoblast 차별화 및 myotube 형성 동안 라이브 셀 이미징에 의해 핵 움직임을 추적 하 고 자동 추적에서 정보를 추출 하 여 핵 역학의 정량적 특성 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
세포 내에서 핵 위치 하는 것은 여러 세포 프로세스 개발 및 재생에 중요 합니다. 핵 위치의 가장 흥미로운 예제 골격 근육 분화 동안 발생합니다. 근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 증식과 분화를 받 다 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성. Myofibers 내에서 정확한 핵 위치 하는 것이 적절 한 근육 재생 및 기능에 대 한 필요 합니다. Myoblast 차별화와 myofiber 형성 평가 하는 일반적인 절차는 고정된 세포 면역 형광 검사, 시간이 지남에 핵 운동 및 셀 동작의 연구를 방해에 의해 분석에 의존 합니다. 여기, 라이브 셀 이미징에 의해 myoblast 차별화와 myofiber 형성의 분석 하는 방법을 설명합니다. 차별화 및 퓨전 중 핵 역동성 및 myoblast 행동 (즉, 궤적)의 높은 처리량 양적 특성을 얻기 위해 자동화 된 핵 추적에 대 한 소프트웨어를 제공 하 고.
Introduction
골격 근육 몸 질량1의 35%-40%에 달하는 인체에서 가장 큰 조직 이다. 인공위성 세포는 근육 줄기 세포, 해부학 적 특징 확산 myoblasts (조직적 조상 세포)을 일으키 다, (플라즈마 막 아래 근육 섬유의 기저 lamina에 juxtaposed), 그들의 위치는 결국 차별화 및 기존 myofibers에 통합 그리고/또한 형태 새로운 myofibers2,,34퓨즈. 그들의 발견 및 그들의 생물학 연구에서 근육 발달 및 재생에 중요 한 통찰력을 주도하 고 있다.
격리 하 고 myotubes로 myoblasts 분화 프로토콜 많은 년 전에 개발 되었습니다 하 고 골격 근육 감 별 법5,,67공부에 아직도 널리 이용 된다. 그러나, 이러한 방법의 대부분 고정된 셀의 분석에 의존 하 고, 따라서 완전히 myoblast 퓨전 myofiber 성숙 등 매우 역동적인 과정을 탐구 하는 과학자를 허용 하지 않는 정적 프로시저를 나타냅니다. 가장 눈에 띄는 예는 단단히 통제, 처음에 myofiber의 중심 핵과 이며, 다음, myofiber 성숙8,9후 주변에 있는 핵 위치입니다. 라이브 영상 추가 같은 독특한 현상에 대 한 통찰력을 얻을 수 가장 적합 한 기술입니다.
여기, 우리 과학자 myoblast 차별화 및 myotube 형성 시간 경과 현미경으로 기록 하 고 myoblast 핵의 자동 추적에서 정량 분석을 수행할 수 있도록 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 차별화와 퓨전 중 핵 역동성과 myoblast 행동의 높은 처리량 양적 특성을 제공합니다. 프로토콜은 나누어 4 개의 다른 부분, 즉 (1) 컬렉션 (2) 마우스의 hindlimbs에서 근육의 기계 및 효소 소화, (3) myoblast 확산 및 감 별 법, (4)으로 구성 된 기본 myoblasts의 격리 핵 myoblast 차별화의 첫 번째 16 h 내 추적 영상 라이브.
다음 절차에서는 myoblasts H2B GFP 마우스에서 격리 되며 doxycycline H2B GFP 표현, 앞에서 설명한10유도 1 µ g/mL로 치료. 또는, 핵에서 형광 단백질을 표현 하는 다른 유전자 변형 생쥐에서 myoblasts 격리 하거나 transfect 세포 Pimentel 외에 의해 설명 된 대로, 핵에서 형광 단백질을 표현 하기 위해 야생-타입 마우스에서 분리 가능 하다. 9.
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Protocol
동물 주제와 관련 된 모든 절차는 산 라파엘 레 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 마우스 hindlimb 근육의 해 부
- 압력가 마로 소독 하 여 핀셋과가 위 (직선 및 곡선)을 소독.
- 준비 하 고 실험을 시작 하기 전에 모든 미디어 (매체 차단, 소화 매체, 매체, 확산 및 매체 차별화) (0.22 μ m)을 필터링 ( 재료의 표참조).
- 35 mm 페 트리 접시 근육 컬렉션에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5 mL를 넣어.
- 자 궁 경부 전위 또는 CO2 를 사용 하 여 마우스를 희생 하 고 에탄올으로 피부를 소독. 근육의 분리를 촉진 하기 위하여가 위, 핀셋를 사용 하 여 hindlimbs 및 위 사지에서 피부를 제거 합니다.
참고: 근육 신생아 또는 성인 쥐에서 분리 수 있습니다. 신생아 쥐 성인 쥐에 비해 위성 세포의 증가 수가 있다. 그러나, 단일 성인 마우스에서 격리 될 수 있는 위성 세포의 총 수는 아래에서 설명 하는 실험을 수행 하기 위해 충분 합니다. - Tibialis, soleus, 신 근 digitorum longus (EDL), gastrocnemius, 허벅지 근육, 및 삼 두 근, 분리 하 고 PBS를 포함 하는 배양 접시에 넣어. 얼음에 접시를 남겨 주세요. 힘 줄과 지방 소독된가 위, 핀셋으로 조심 스럽게 제거.
2입니다. 기본 myoblasts의 격리
참고: 메 마른 조건에서 세포 배양에 대 한 모든 절차 완료 됩니다.
- PBS에서 근육을 제거 합니다. 고 균일 한 질량을 얻을 때까지 무 균 곡선된가 위를 사용 하 여, 근육을 말하다. 근육 조각 50 mL 튜브에 넣어.
- 근육 조각 소화 매체의 10 mL를 추가 하 고 근육 효소 소화를 물 욕조에 강한 동요 (250 분-1)에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 10 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 글루타민, 1% 페니실린/스, 그리고 1 %gentamicin (차단 매체) 소화 중지를 추가 합니다.
- 5 분 동안 40 x g 에서 centrifuge 고 50 mL 튜브에 상쾌한을 수집 합니다. 얼음에 펠 릿을 저장 합니다.
참고: 원심, 후는 상쾌한 되어 일부 위성 세포, 혈액 세포, 내 피 세포 및 섬유 아 세포, 소화 되지 않은 근육과 결합 조직의 펠 릿 포함 됩니다. 격리 된 셀의 수를 늘리려면, 펠 릿 아래 설명 된 대로 소화의 추가 단계를 받게 해야 합니다. - 원심 650 x g 5 분 삭제에서 상쾌한은 상쾌한 고 10% 포함 된 DMEM의 1 mL에 펠 릿을 resuspend FBS. 얼음에 resuspended 펠 릿을 유지.
- 2.2-2.5 단계 2.4에서에서 얻은 2 x 펠 릿의 나머지 부분에 대 한 단계를 반복 하 고 첫 번째 resuspended 펠 릿 얼음에 보존 이후 resuspended 펠 릿 추가.
- 70 µ m 필터를 통해 그리고 40 µ m 필터를 통해 resuspended 펠 릿을 전달 합니다. 650 x g 5 분에서 10 %FBS, 및 원심 분리기 DMEM의 15 mL를 추가 합니다.
- 붉은 혈액 세포를 고갈에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 3 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 실 온에서 5 분 동안 그것을 품 어. 붉은 혈액 세포의 세포를 중단 하 고 5 분 제거는 상쾌한 650 x g 에서 원심 10 %DMEM 5 ml에서는 펠 릿 resuspend PBS의 40 mL를 추가 FBS.
- Preplating 단계로 셀 150 m m 코팅된 페 트리 접시에 확산 매체의 20 mL에 접시. (37 ° C, 5% CO2) 셀 문화 인큐베이터에서 보육의 1 시간 후 매체를 수집 합니다.
참고: 섬유 아 세포, 플레이트에 다음 삭제 됩니다, 위성 세포 현 탁 액에서 남아 있는 동안. - 2.9 3 x, preplating의 마지막 단계에서 단계를 반복, 정지에서 위성 셀을 포함 하는 매체를 수집.
- 5 분 동안 650 x g 에서 원심 분리기.
- 셀 centrifuging는 동안 코트 콜라겐 (10 mL의 0.1 m M 초 산의 0.1% 솔루션)과 2 개의 150 mm 접시. 이렇게 하려면 콜라겐 접시에, 5 분 동안 품 어 놓고 그것을 제거. 접시 30 분 동안 건조 하자.
- 2.11 단계에서 얻은 상쾌한 삭제 하 고 확산 매체 (자료 테이블)의 40 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 접시 두 콜라겐 코팅 150 mm 접시 (접시 당 20 mL)에 셀 하 고 1 µ g/mL doxycycline H2B GFP 식 유도 하의 함께 2-3 일에 대 한 확산 매체에 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) 셀 유지.
참고:이 단계는 myoblasts 추가 분석에 대 한 셀의 높은 번호를 얻을 수의 확산을 수 있습니다. 셀 밀도 myotubes로 myoblasts의 자발적인 차별화를 피하기 위해 매우 낮은 유지 됩니다.
3. Myoblast 확산 및 감 별 법 분석
참고: myoblast 밀도 높은 경우, 일부 셀 시작 신장, 그리고, 그것은 셀을 분할 하는 데 필요한. 일반적으로, 그것은 그들의 표현 형에 영향을 주지 않고 셀 2 x-3 x를 분할 수 있습니다.
- 매체를 폐기, PBS의 5 mL로 세포 세척, trypsin (1x)의 2 개 mL를 추가 5 분 검사 현미경에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품 어 고, 둥근 세포를 분리 하는 경우 추가 10 %DMEM 5 mL는 트립 신을 비활성화 하는 FBS. 셀의 개수 (보통 약 1 x 106 셀/마우스를 얻을 수 이다).
참고: 5 분에 대 한 트립 신 가진 외피는 보통 proliferating myoblasts 분리 하는 충분 한. - 아래에서 설명 하는 분석 중 셀 제목.
-
확산 분석 실험
- 50, 000 셀/잘 1 mL/콜라겐 코팅 12-잘 접시에 확산 매체의 접시와 도금된 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 품 어. 해결 하 고 24, 48 또는 72 h에 셀.
참고: 매체 양분 소모를 피하기 위해 모든 48 h 바뀝니다.
- 50, 000 셀/잘 1 mL/콜라겐 코팅 12-잘 접시에 확산 매체의 접시와 도금된 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 품 어. 해결 하 고 24, 48 또는 72 h에 셀.
-
차별화 분석 결과
- 차별 매체 포함 하 지하실 멤브레인 매트릭스 (1: 100)의 350 µ L와 12-잘 접시 코트. 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어 고 매체를 제거 합니다.
- 200, 000 셀/매트릭스 코팅 접시에 차별화 매체에 잘 플레이트. 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 5% O2)에 품 어 그들은 접시를 준수 될 때까지 (2 h는 일반적으로 충분히 준수 하 고 분화를 시작 하는 셀에 대 한).
- 차별화, 평가 하려면 앞에서 설명한11myosin 무 겁 사슬 및 핵 얼룩 수행 합니다. 아래 설명 된 대로 또는 라이브 이미징 분석을 수행 합니다.
-
확산 분석 실험
4. myoblast 차별화 및 핵 추적의 라이브 영상
- 라이브 셀 이미징에 대 한 섹션 3.2.2에서에서 얻은 5% CO2에서 37 ° C에서 세포를 유지 하는 인큐베이션 시스템을 갖춘 공초점 현미경 12-잘 접시에서 도금 셀을 넣어.
- 필드의 볼을 20 배 건조 목표 (0.7 없음)를 사용 하 여 셀, 충분히 myofiber 대형 모니터의 수백. H2B GFP 셀 낮은 강도 488 nm 아르곤 레이저는 몇 군데 될 수 있습니다.
참고: 오픈 pinhole 이미지 깊이 (~ 10 µ m)에 셀 두께 포함 세포 실험을 통해 초점에 보관 되는 보장 합니다. Confocal 현미경을 사용 하 여 유리 하다는 이미지의 신호 대 잡음 비율 개선 이후 넓은 필드 현미경 사용 될 수도 있지만. Myofiber 대형 전송 채널을 통해 모니터링할 수 있습니다. - 프레임 16 h에 대 한 모든 6 분 당 16 비트 및 1024 x 1024 픽셀의 이미지를 취득 합니다. 각 인수 위치에 대 한 multiframe.tif 파일을 생성 ( 보조 파일에서 예를 참조).
참고: 현재 프로토콜에서 현미경 (자료 테이블)과 관련 된 상용 소프트웨어 사용 되었습니다; 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 다른 현미경을 사용 하 여 같은 목표를 달성 하기 위해. - .Zip 파일을 보조로 제공 하는 소프트웨어를 다운로드 합니다.
참고: 루틴은 MATLAB에서 실행 해야 하는 스크립트. 소프트웨어 게시 소프트웨어12 myotube 형성 중 핵의 추적에 대 한 최적화의 적응 이다. 이 소프트웨어 두 부분으로 나누어져 있습니다: 첫 번째 두 번째 "트랙" (궤도) 핵 운동의 생성 하는 동안, 그들을 분할 하 여 각 프레임에 핵을 식별. 핵 세분화 및 추적 및 시작 하는 단계별 가이드에 대 한 전체 코드는 보조 파일에 제공 됩니다. - Zip 파일을 추출 하 고 사용에 개인용 컴퓨터 (PC)에서 원하는 경로에 저장 합니다. 모든 수행에 필요한 소프트웨어가 이미 설치 된 PC에 구절 아래. Note로 아래에 언급 된 세 폴더의.zip 파일 구성.
참고: 분할 루틴 함수는 세분화에 대 한 실행 수를 포함 합니다. 추적 루틴, 대신, 추적에 필요한 기능을 포함 합니다. 예 세그먼테이션 추적 기본 스크립트 및 파일 시스템에 익숙해질을 제공 합니다. 소프트웨어 사용 세분화 되 고 핵의 추적 MATLAB, R2015a 또는 이후 버전에서 제대로 실행 됩니다. - .Tif 파일에서 핵 세그먼트, 예를 들어 NameFile.tif파일을 이름을 지정 합니다.
- 예 세그먼테이션 추적 폴더를 열고 DoSegmentation.m를 클릭 합니다. 이 MATLAB에 명령 창이 열립니다.
- 예 세그먼테이션 추적 폴더의 모든 요소를 보고 왼쪽에 현재 폴더 창을 확인 합니다. DoSegmentation.m두 번 클릭.
참고: 스크립트에서 할 수 있는 수정에 대 한 자세한 정보는 StepbyStep.txt 파일에서 찾을 수 있습니다. 그것은 변수 filenameinput 은 NameFile.tif 와 folderinput 는.tif 파일이 포함 된 폴더는 스크립트 수정 필수입니다. - 스크립트 실행 (녹색에 클릭 하 여 실행 버튼). 핵의 분할 출력 그림에 구상 될 수 있다 하는 동안 세분화의 결과 file.mat (SegmentedNameFile.mat)로 저장 됩니다.
참고: 필요한 경우 스크립트에 설명 된 세그먼트에 대 한 매개 변수를 수정할 수 있습니다. CheckSegmentation.m 스크립트를 사용 하 여 세분화의 품질을 확인할 수 있습니다 (StepbyStep.txt 파일을 참조). 세그먼트화의 품질은 저하 하는 경우,이에 따라 (단 몇 가지 핵 감지), 명확 하 게 DoSegmentation.m 스크립트에 표시 된 세분화의 매개 변수를 조정 하 고 절차를 반복 합니다.
- (즉, 각 시간에 핵의 궤적) 트랙을 생성 하려면 동일한 작업 폴더에 GenerateTracks.m 스크립트를 실행 세그먼트에서 얻은 핵 위치를 사용 하 여. 적절 한 분할 파일을 입력으로 추가 하십시오 (자세한 내용은 StepbyStep.txt 파일 참조) 전에 취득.
참고: 사용자는 출력으로 x-좌표에 대 한 매트릭스와 생성 된 트랙의 y 좌표에 대 한 또 다른 매트릭스 파일 TrackedNameFile.mat를 얻을 것 이다. - CheckTracking.m 를 사용 하 여 트랙의 품질을 평가 (자세한 내용은 StepbyStep.txt 파일을 참조). 이 마지막 대목의 출력 그림을 사용 하 여 시간에 각 핵 위치를 시각화 하는 데 도움이. 각 세그먼트 핵을 나타내는 녹색 십자가 대 한 왼쪽에 확인 하십시오. 하나의 특정 핵을 선택 아래 스크롤 막대를 사용 합니다. 선택 된 핵 원으로 표시 됩니다 참고 빨간색, 오른쪽에 선택된 된 셀의 궤적 지켜질 수 있다 시간에서 (사용 하 여 위쪽 스크롤 막대).
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Representative Results
자동으로 myoblast 차별화 라이브 영상에서 중 핵 움직임을 따라, 핵 우선적으로 표시 되어야 합니다 놓여있는지. Intercalating DNA 분자를 사용 하는 가능한 이러한 분자 확산과 기본 myoblasts13의 방해 때문에 중요 하다. 예를 들어, 확산 및 감 별 법 또는 Hoechst (그림 1) 없이 교양 기본 myoblasts에서 분석 되었습니다 했습니다. 확산 (그림 1A, B)와 차별화 (그림 1C, 중간 패널) 강하게 myoblasts Hoechst 33342와 교양에 장애가 있는 분명 하다. 반대로, myoblasts H2B GFP 마우스에서 고립 되 고 doxycycline와 교양 녹색 형광과 핵을가지고 고 마찬가지로 myoblasts 야생-타입 마우스 (그림 1C, 오른쪽과 왼쪽 패널, 각각)에서 절연을 차별화 합니다.
라이브 셀 이미징 H2B GFP 단백질을 표현 하는 기본 myoblasts와 차별화 (그림 2 및 보조 비디오 1) 중 핵의 추적을 허용 한다. 전송 및 초기 (그림 2A) 및 마지막 시간 동안 H2B GFP myoblasts의 차별화 포인트 (그림 2B) 허용 myotubes 그리고, 따라서, 결국 핵을 식별 하는 과학자에 GFP 채널의 이미지를 병합 (예를 들어, 파란색 원에 핵) myotube에 통합 또는 myotube (예를 들어, 빨간색 동그라미에서 핵)으로 융합 하지 않는 핵.
라이브 셀 이미징 데이터에서 핵/셀 움직임에 대 한 정보를 추출, 그것은 핵의 궤적을 추적 하기 위해 제공 된 소프트웨어를 사용 하 여. 소프트웨어는 H2B GFP 채널 (핵;에서 이미지를 사용 하 여 그림 3A) 마스크를 만들려면 고 각 프레임에 핵 세그먼트. 프레임에 핵 세분화, "보수적인" 임계값 가우시안 필터링14후 이미지에 오쓰의 메서드를 사용 하 여 선택 됩니다. 그런 다음 개체는 대략 세그먼트; 세밀 하 게 세분화를 얻으려면, 각 개체의 경계 상자에 평균에 따라 임계값을 사용 하 여 다시 마스크입니다. 분수령 변환 다음 개체 (그림 3B) 근처를 분리 하는 데 사용 됩니다. 우리의 손에서 하나의 분수령 변환 대부분 근처 핵을 분리 할 수 있다 (그림 3B, * 인세트). 따라서, 우리는 이미지에 더 큰 개체를 선택 하 여 새로운 분수령 변환을 적용 영역 사용 (그림 3B, * * 인세트), 즉 핵 가까운 추가 분리 수. 이 방식으로 핵의 대부분은 이미지 (그림 3C)에서 식별 됩니다.
핵을 추적 하려면 우리 Tinevez15의해 추적 루틴을 통합 하 여 루틴을 개선. 즉, 추적 알고리즘 등 핵 프레임에 각 핵의 위치와 "헝가리어 알고리즘"을 사용 하 여 다음 중 하나에 동일한 핵의 위치 사이 거리의 합을 최소화 하는 것을 목적으로 연속 프레임에서 검출 링크 최소화16. 단계 떨어져 프레임의 특정 최대 수는 연결 되지 않은 핵 연결 반복 됩니다. 프레임에서 개체의 위치와 다음 사이 최대 거리에 대 한 임계값도 설정 됩니다. 여기에 제시 된 데이터에 대 한 최대 5 프레임 수와 단계 당 20 픽셀의 최대 거리 올바른 트랙 (그림 3D)의 높은 숫자를 제공 합니다. 중요 한 것은, 우리는 추적의 품질을 확인 하려면 이러한 루틴을 사용할 수 있습니다. 그것은 또한이 스크립트를 사용 하 여 주어진 동작, 예를 들면 (또는 안)을 형성 하는 셀을 찾을 수 myofiber, a 이후 관심의 세포의 집합의 동적 기능을 분석 하 고.
적용된 소프트웨어 생성 트랙으로는 x-및 y-좌표 각 셀에 대 한 프레임 n, 
, 셀 (그림 3D)의 수백을 위해. 우리는 핵 모션에 대 한 정보를 추출 이러한 정보를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 초기 프레임 사이 총 변위 (n = 0)와 마지막 프레임 N 다음과 같이 정의 됩니다.
궤적의 변위 = | | 
||
여기, "| | · | |" (그림 4A) 벡터의 규범에 대 한 의미.
프레임 n 에 각 핵의 속도 다음과 같습니다.
다음, 우리는 다음과 같이 특정된 셀에 대 한 궤적의 길이 정의할 수 있습니다.
궤적의 길이 =
이러한 간단한 매개 변수 관련 정보를 이미 제공 어떻게의 예를 들어, 우리는 myoblasts Hoechst 없이 incubated의 핵 궤도의 길이 계산 합니다. 궤도의 총 길이 셀 Hoechst, 물에 대 한 약간 높은 있지만 차이점은 중요 한 (그림 4B) 나타납니다. 그러나 때 우리는 시간 경과 중 총 변위 계산, Hoechst 물 세포의 총 변위는 흠 없는 세포 (그림 4C) 보다 훨씬 작은 관찰 합니다. 이 스테인드 세포의 움직임 낮은 방향을 나타냅니다. 이 가설을 더 강화 하기 위해 우리 각 프레임 (그림 4A)에서 각도 계산 하 여 셀의 동의의 방향을 측정할.
우리는 또한 프레임 사이의 각도의 변화를 측정할.
궤적을 따라 총 각도 변화는 다음과 같이 정의 수 다음.
총 각도 변형 =
예측, 흠 없는 셀에 대 한 총 각도 변형 작은 셀 Hoechst (그림 4D)으로 물에 비해 크게는. 따라서,이 간단한 정도의 간단한 계산에서 얻은 방향 나타냅니다 Hoechst로 얼룩진 myoblasts 덜 형성에 장애가 그들의 능력을 반영 하는 그들의 변위의 방향을 유지 하는 경향이 있다 myotubes (그림 1)입니다.
즉, 라이브 세포 이미징 데이터 여기에 설명 된 대로 생성 핵 역학과 양식 myotubes 수 사이의 양적 링크를 제공 하 고 핵 역학 및 myoblast의 높은 처리량 양적 특성에 대 한 입력으로 사용할 수 있습니다. 분화와 융합 하는 동안 동작입니다.
그림 1: Hoechst와 부 화 확산 및 myoblasts의 방해. (A) 기본 myoblasts Hoechst 확산 매체 (왼쪽된 패널)에서 24 시간 후 물 또는 Hoechst (오른쪽 패널), 및 (B) 상대 정량화 확산 매체에 24 h에 대 한 교양의 대표 이미지. 데이터는 평균 ± SEM을, 그리고 통계적 의미는 학생의 t와 함께 평가 되었다-테스트. P < 0.05. (왼쪽된 패널) 없이 매체 차별화에 24 h에 대 한 교양 기본 야생-타입 myoblasts의 대표 이미지 (C) 또는 Hoechst (중간 패널)와 H2B GFP myoblasts 차별 매체 (오른쪽 창)에서 24 h에 대 한 교양 및 스테인드의 Hoechst (파란색)과 반대로 myosin 무거운 체인 항 체 (MyHC; 레드). 스케일 바 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 분화 동안 H2B GFP myoblasts의 영상 라이브. 병합 된 이미지 전송 및 GFP의 채널 (A)에서 초기 (t = 0 h) 점과 (B) 마지막 시간 (t = 16 h) H2B GFP myoblasts (20 x 목표)의 분화 하는 동안. Myotubes의 몇 가지 예는 패널 B에 검은 화살표와 함께 강조 표시 됩니다. 스케일 바 50 µ m. (C) 확대 점선 영역 패널 A 와 B (파란색)에서 myotube에 통합 끝나는 단일 핵을 식별 하는에서 = 또는 하지 (레드) t = 0 h, t = 8 h, 및 t < / c12 > = 16 h. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: H2B GFP myoblasts 차별화 중 추적의 세분화. (A) 약 400 세포의 핵을 보여주는 시간이 만료 된 프레임의 예입니다. (B) 핵 마스킹 및 시장 세분화의 예입니다. 밝은 개체는 글로벌 및 로컬 임계값을 사용 하 여 세그먼트는 고 유역 변환 핵 근처 분리에 적용 됩니다. 근처 핵 세그먼트에 어려울 수 있습니다 (* 인세트), 그래서 두 번째 유역 기반 세분화 핵의 더 높은 수 세그먼트에 큰 영역의 개체에서 수행 됩니다 (* * 인세트). (C) 핵 위치 (붉은 십자가), 나중 되 추적 알고리즘에 사용 감지. (D) 추적 2 연속 프레임에 각 개체의 위치 사이 거리의 합을 최소화 하는 추적 알고리즘을 사용 하 여 생성 합니다. 각 개체에 대 한 같은 거리의 최대 가능한 값은 연결할 하나 이상의 프레임을 구분 하는 핵 과학자를 허용 하는 입력으로 제공 됩니다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 핵 역학의 정량 분석 밝히기 myoblasts Hoechst와 incubated의 장애인된 능력을 셀 방향을 유지 하기. (A) 매개 변수 측정의 설명입니다. 그것은 두 개의 연속 프레임 위치를 고려 하 여 핵의 속도 정의 수 있습니다. 궤적 각도 각도 변형 수 있습니다 다음 쉽게 산출 될 위치에서 계획에 표시 된 대로. (B) 배포 궤도 길이, (C) 총 변위, myoblasts의 궤적 각도의 (D) 변화 incubated Hoechst (녹색 선) 없이 또는 Hoechst (파란 선). 총 배기량은 상당히 높은 각도의 변화는 크게 흠 없는 세포에 대 한 낮은 하는 동안 두 배포판 크게 다른 되지 않습니다 (일방적인 Kolmogorov 스미 르노 프 테스트, *p < 0.05와 * *p < 0.005)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 비디오 1: 라이브 이미징 H2B GFP myoblasts의 차별화 중. H2B GFP myoblasts 초기에서 매체 차별화에 교양의 이미징 (t = 0 h) 마지막 시간 포인트 (t = 16 h) 전송 및 GFP 채널 (20 x 목표)를 사용 하 여. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 확산 그리고 감 별 법2,3,를 받아야 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성 되는 4. Myoblast 차별화를 평가 하기 위해 일반적인 절차 myoblasts 매체를 차별화 하 고 MyHC, 차별화, 마커 및의 얼룩에 얼룩이 면역 형광 검사를 수행 하기 위해 다른 시간 지점에서 세포를 고정에서 경작의 구성 핵 DNA intercalating 분자 (예를 들어, Hoechst)5. 이 메서드는 myoblast 차별화 차별화 인덱스 (MyHC-긍정적인 세포/총 휴대폰 번호의 수) 또는 퓨전 인덱스 (적어도 두 핵/총 휴대폰 번호와 함께 myotubes 수) 등의 다른 매개 변수를 측정 하 여 평가 하 . 그러나, myoblast 퓨전과 myotube 형성 하는 핵8의 운동에 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 실제로, myofibers 내에서 핵 위치는 적절 한 근육 재생 및 기능17필요 합니다. Myoblasts와 그들의 핵의 이동성 myoblast 차별화를 평가 하 고 근육 장애에 새로운 결함을 폭로 하는 중요 한 매개 변수를 밖으로 차례 수도 있습니다. 따라서, 핵 운동 myoblast 차별화와 myofiber 형성 하는 동안 셀 동작을 공부 하 고 새로운 절차를 개발 하는 필수적 이다.
여기, 우리가 있는 과학자 들을 라이브 셀 이미징 myoblast 차별화 및 myotube 형성에 따라 핵의 자동 추적에서 정량 분석을 수행 하는 메서드를 설명 합니다. 이 방법의 장점은 myoblasts, 세포 transfection 또는 추가 얼룩 없이 H2B GFP 마우스에서 고립의 형광 핵의 분화 동안 추적 가능성. H2B GFP 마우스는 상용 및, 따라서, 쉽게 접근할 수. 또는, 핵에서 형광 단백질을 표현 하는 다른 유전자 변형 생쥐에서 myoblasts 격리 수 또는 transfect 세포에 앞에서 설명한9로는 핵에서 형광 단백질을 표현 하는 야생-타입 마우스에서 분리 . 이러한 다양 한 옵션 추가 여기에 제시 된 방법의 잠재적인 응용 프로그램을 확장 합니다.
현재 프로토콜 기본 myoblasts의 문화에 의존 하 고 또한 인해 근육18 에서 격리 후 nonmyogenic 셀의 다음 실험 절차에 높은 가변성 수 있습니다 관찰 하는 따라서, . 이 한계를 극복, 하 셀 앞에서 설명한19로 정렬 하 여 myoblasts 분리 가능 하다. 여기에 설명 된 방법의 또 다른 중요 한 포인트는 때 셀, 서로 거의 같은 myotube 형성 중 핵의 완벽 한 추적을 생성 하는 데 어려움. 그러나, 여기서 설명 하는 소프트웨어 루틴 과학자 시각적으로 추적 품질 검사를 허용 하 고, 이후 분석에 대 한 관심의 셀의 하위 집합을 선택 하려면, 필요한 경우. 소프트웨어의 추가 개선 myofiber 형성 중 핵 역학의 완전 한 특성을 제공 해야 할 수도 있습니다.
결론적으로,이 방법은 우리가 Hoechst 외피와 보고 다른 조건을 비교 하 여 myoblast 차별화 중 핵 역동성에 양적 통찰력을 제공 하기 유용 하다. 이 예제에서는 시간 경과 실험에서 의미 있는 동적 데이터를 추출 하는 기능을 보여 줍니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 AFM-텔 레 톤 E.V. (#21545)에 의해 고 스타지오네 산 라파엘 레 (OSR) 씨 그랜트 S.Z. (ZAMBRA5X1000)에 의해 지원 되었다. 파스퇴르의 이미지 분석 허브에서 박사 장 이브 Tinevez 공개적으로 그의 "간단한 추적기" MATLAB 루틴을 공유에 대 한 인정 이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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