Summary
Tüp bebek kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri için gelecek vaat eden bir araç olarak bir biyomarker ateroskleroz için ölçümdür. Bu da çalışmanın, biz optimize etmek ve bir floresan NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.
Abstract
Ateroskleroz kardiyovasküler hastalık (CVD) yol açar. Hala belirsiz olup kolesterol HDL (cHDL) konsantrasyon ateroskleroz gelişmede nedensel bir rol oynar. Ancak, önemli bir aterom plak oluşumu, erken evrelerinde kolesterol sızma kapasitesi HDL (makrofajlar kolesterolden kabul etme yeteneği HDL parçacıkların) için faktördür köpük hücre oluşumunu önlemek için. Bu endotel ve ters kolesterol taşıma (RCT) kolesterol karaciğer yoluyla ortadan kaldırmak için bir parçası kolesterol birikimi kaçınmak önemli bir adımdır. Kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri biyomarker ateroskleroz için kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. Geleneksel olarak, [3H]-kolesterol kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılır. Bu çalışmada, floresan etiketli-kolesterol (NBD-kolesterol) kullanarak daha güvenli ve daha hızlı bir strateji geliştirmek için THP 1 türetilmiş makrofajlar kolesterol alımı ve sızma sürecinde izlemek için hücresel bir tahlil amacımız. Son olarak, biz optimize etmek ve NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.
Introduction
Dünya Sağlık Örgütü göre iskemik kalp hastalığı ve inme (muhasebe 15.2 milyon ölüm olmak üzere toplam)1ölüm dünya çapında geçerli asıl nedenleri vardır. Ateroskleroz ve kan damarları2,3' te aterom plak yırtılması tarafından öncesinde kardiyovasküler hastalık (CVD) ikisi de.
Ateroskleroz makrofajlar, T hücreleri, mast hücreleri ve dendritik hücreler endotel sızmak ve sonunda aterosklerotik plaklar oluşturan kan birikir bir gemi Duvar iltihabi bir hastalıktır. Aterosklerotik plaklar çekirdek ve kolesterol kristalleri, yüksek çözünürlüklü B-mod ultrasonografi ölçümleri karotis intima media kalınlığı4,5tarafından kanıtlanan bir lipid mevcut. Makrofajlar, kolesterol sızma lipid alıcısı parçacıklar doğru ve çöpçü reseptör SR-BI aracı ATP-bağlayıcı kaset (ABC) reseptörleri ABCA1, ATP bağlama kaset Alt familya G üye 1 (ABCG1) tarafından yapılır. Kolesterol akını ve sızma makrofajlar içinde dengesizlik ateroskleroz başlatma6anahtar bir süreç olarak kabul edilir. Kolesterol sızma periferik doku için plazma kolesterol eleme önemli bir adım ve karaciğer ters kolesterol taşıma (RCT) denen bir süreç olarak kabul edilir. Kolesterol yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) parçacıklar yüzeyinde bulunan makrofajlar ağırlıklı olarak apolipoprotein A1 (ApoA1) üzerinden aktarılır. HDL kolesterol karaciğere atılımı ve yeniden kullanımı7,8,9sonra taşıma.
Geleneksel olarak, trityum (3H) radyo etiketli kolesterol kolesterol sızma10dakika sonra kullanılmıştır. Radioisotopes emisyon sinyalinin son derece hassas10' dur; Ancak, radyo etiketli kolesterol uzun iletişim kuralları, iyonizan radyasyona maruz kalma riski ve özel radyoaktivite tesisler ve ekipman radyoaktif emisyon güvenli kullanımı sağlamak için ihtiyaç gibi bariz handikapları sunar. Aksine, floresans başarıyla sadeliği floresan sinyal algılama, fluorophores mevcut çok çeşitli ve emanet11nedeniyle tanı teknikleri dahil edilmiştir. Çeşitli floresan etiketli steroller kolesterol metabolizması (BODIPY) dehydroergosterol (ile içsel floresan), dansyl kolesterol, 4,4 üzerinden-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene de dahil olmak üzere eğitim için kullanılan - kolesterol ve 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-kolesterol). Özellikle, NBD-kolesterol verimli bir alımı insan hücreleri12' sunar. İki farklı NBD etiketli-kolesterol Şu anda kullanılabilir: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) ve 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Şekil 1). 25-NBD-kolesterol hücresel zar dinamiği araştırma13,14' te ağırlıklı olarak kullanıldığı gibi kolesterol ile 22-NBD yan etiketli en iyi kolesterol sızma çalışmalar, uygun olmayabilir.
Hücre hatları genellikle tüp bebek kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılan insan lösemi kaynaklı THP-1 hücreleri, fare ham 264.7 hücreleri15veya J774.1 gibi monosit benzeri hücrelerdir. Bu hücrelerin tümünü phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) kullanılarak in vitro makrofajlar içine farklılaşmış, ama makrofajlar (dmTHP-1) en iyi THP 1 türetilmiş yansıtmak ve insan makrofajlar16taklit.
Mevcut çalışmada, en iyi duruma getirme ve 22-NBD-kolesterol [3H] Alternatif olarak kullanarak serum numuneleri dmTHP-1, kolesterol sızma kapasitesini belirlemek için bir floresan yüksek üretilen iş yöntemi standartlaştırmak-kolesterol. Buna ek olarak, biz en iyi duruma getirilmiş floresan tekniği ile standart radyoaktif analog karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada, etik kurul onayı (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, hastane Kliniği, Barcelona; onay numarası HCB/2014/0756) ve yazılı tüm konulardan haberdar izni elde edilmiştir.
1. NBD-kolesterol hazırlık
- NBD-stok (2 mM) elde etmek için kolesterol (MW 494.63; bkz: Malzemeler tablo) saf etanol geçiyoruz. 10 mg flakon için tüm şişe içeriği 2 mM hisse senedi almak için etanol 10,1 mL hacminde geçiyoruz.
- RPMI % 10 fetal Sığır serum ve %5 penisilin/streptomisin ile (R10 orta) takıma 5 mikron son bir konsantrasyon ulaşmak için 1640 stokta NBD kolesterolden oranında seyreltin (örneğin, NBD-kolesterol 10 mL, 5 mikron son konsantrasyonu elde etmek) tarafından NBD-kolesterol R10 Orta (2 mM) stokta 25 μL sulandrarak. Bu birim bir 96-şey plaka için yeterlidir.
2. hücre kültür ve tohum (2 gün)
- Kültür THP-1 hücreleri R10 orta 37 ° c, % 5 CO2. 106 hücre/mL x 0,3 için 3 günde ayarlayın.
- Düz, açık alt kısmında 0.2 x 106 hücreler/iyi R10 Orta (iyi başına 100 μL) ile beyaz bir 96-şey plaka hücrelerde tohum.
- 100 nM phorbol 12-myristate 13-asetat hücrelerle tedavi (PMA; 10 mikron stoktan) 48-72 h, 37 ° C'de kuluçka için % 5 CO2 THP-1 ayırt etmek için hücreleri dmTHP-1'e.
Not: R10 orta 500 μL içinde 5 μL PMA stok (10 mikron) kullanmak için önerilir. Bundan önce dimetil sülfoksit (DMSO), aliquot ve hisse senedi-20 ° C'de 10 mL 1 g liyofilize şişede çözülerek PMA hisse senedi 10 mikron hazırlamak - Alternatif olarak (öneri) birleştirmek adım 2.2 ve 2.3 daha iyi homojenizasyon için. THP-1 hücre 15 mL tüp 10 mL hazırlamak, PMA stok (10 mikron) 200 μL eklemek, karışımı yavaşça ve hemen iyi plaka üzerine başına 100 μL tohum. 2.3. adımda açıklandığı gibi hücreleri kuluçkaya.
3. Apolipoprotein B Serum (ABDS) hazırlık (günde 2 ya da 3) tükenmiş
- Polietilen glikol (PEG) çözüm hazırlamak için glisin (steril H2O ile) % 10 PBS'ye pH 7.4 200 mM bir konsantrasyon içinde oranında seyreltin. PEG PEG elde etmek için 8000 10 g için 200 mM glisin 40 mL ekleyin %20 (w/v). Şiddetle homojenize çözüm mix.
- 4 uygulamak parçalar % 20 serum/plazma her serum/plazma örneği 1,5 mL tüp içinde 10 parça başına PEG ve karışımı buz 25 dk17 bırakmaktır (plazma veya serum, 100 μL eklemek için %20 40 μL Örneğin, çözüm PEG).
- PEG-apolipoprotein B çökelti, 13.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
- Çökelti atmak. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın.
Not: Biz ABDS gün 3 (taze) hazırlama öneririz. Bu mümkün değilse, ABDS 2 gün hazırlamak ve gecede 4 ° C'de saklayın.
4. NBD-kolesterol hücre yükleme (2 gün)
- DmTHP-1'in kültür orta atın ve hücreleri iki kez 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile yıkayın.
- 5 mikron hücrelerle yük NBD-kolesterol (iyi başına 100 μL) R10 orta ve gecede kuluçkaya 37 ° C, % 5 CO2.
5. kuluçka kolesterol alıcısı (3 gün) ile
- Orta atın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
- 2-%5 ABDS veya renksiz RPMI 1640 Orta (iyi başına 100 μL) için 4-6 h 37 ° C'de seyreltilmiş saf lipid alıcısı (HDL, ApoA, apolipoprotein, vb) istenen konsantrasyonu hücrelerle kuluçkaya
Not: renksiz RPMI 1640 orta alıcısı ve olumlu bir denetimi (C +) (örneğin, sağlıklı bağış bir havuzdan ABDS) veya saf HDL olmadan oluşan bir negatif kontrol (C-) içerir. Not (ek Şekil 1) analiz olumlu denetim özellikle hasta numuneleri (hastalık koşullar) olduğunda geçerlidir. - Hücre lizis çözümü 1 (50 mM Tris arabellek, 150 mM NaCl, H2O) bir 200 mL hazır hazırlamak. Hücre lizis çözüm 1:1 (v: v) 1 oranı lizis çözüm 2 elde etmek için saf etanol ile karıştırın.
6. floresan sinyal yakalama (3. gün)
-
Medya NBD-kolesterol algılama
- Hücre orta plakalar kaldırmak ve yeni bir beyaz 96-şey plaka opak bir düz dipli ile toplamak.
- Medya örneklerinde bir en uygun floresan sinyal algılama için 1:1 oran 96-şey beyaz tabak içinde elde etmek için her Orta örneğinin 100 μL saf etanol 100 μL ekleyin.
- Plaka tedavi medya ile daha fazla ölçmek için luminometer içinde bir 463⁄536 nm (uyarma/emisyon) dalga boyu floresan yoğunluğu (FI) tutun.
-
Hücre içi NBD-kolesterol algılama
- Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
- Hücre içi kolesterol elde etmek için onları 100 μL lizis çözüm iyi 2 ile kuluçka hücreleri parçalayıcı ve oda sıcaklığında (RT) 25 min için plaka sallamak.
- Bir en uygun floresan sinyal algılama hücre lysate örneklerinde yakalamak için hücre lysates aynı beyaz floresan yoğunluğu 96-şey plaka ile açık düz alt (aynı plaka içinde adım 2.2 hücreleri seribaşı).
- 6.3 floresan yoğunluğu (FI) içinde luminometer duyarlılığı parametresi 50 yazılım ayarlarken ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek).
7. sonuçları analiz
- Bir örnek kolesterol sızma oranı formülüne göre hesaplanan yüzde olarak ifade:
- Kolesterol sızma (CE) son ölçü negatif kontrol (NBD-kolesterol ile yüklü ama kolesterol alıcısı olmadan renksiz RPMI 1640 orta ile inkübe örnek) CE çıkararak CE elde bir tane verdim:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolesterol sızma tahlil vitro bir verilen serum, plazma veya HDL parçacıkları içeren süpernatant kolesterol sızma kapasitesini belirlemek için amaçtır. Etiketli-kolesterol bir standart makrofaj hücre kültürünü bir kültürün içine yükleme ve FBS ücretsiz medya ile hücre içine seyreltilmiş test örnek ile iletişim inducing yöntemi oluşur. Son olarak, NBD floresan düzeylerinden medya ve hücre lysate olarak ölçülür. Ölçümler en iyi duruma getirmek için hücreleri effluxed kolesterolden medya için etanol içeren bir çözücü bir hacmi ile karıştırılır. NBD-kolesterol hücrelerde kalan etanol veya ölçümleri önce deterjan içeren bir çözücü içine resuspended. Son olarak, effluxed/toplam etiketli-kolesterol oranı belirlenir. Teknik ayarlamak için apolipoprotein B tükenmiş serum (ABDS) sağlıklı bağış bir havuzdan kullanıldı.
NBD-kolesterol orta ve etanol için en iyi seyreltme koşulları araştırıldı. Ücretsiz NBD-kolesterol floresan davranışını etanol ve renksiz RPMI 1640 farklı oranları da dahil olmak üzere çeşitli çözücü ortamlarda, test ettik. NBD-kolesterol saf etanol içinde en yüksek FI yayılan NBD-kolesterol sulu çözüm seyreltilmiş floresan yoğunluğu (FI) en düşük FI değerleri gösterdi. Bu 22-NBD-kolesterol molekülü floresans emisyon içeren bu orta son derece bağımlı olduğunu göstermektedir. Buna göre 22-NBD-kolesterol floresans sinyalinin ortamı içeren bir etanol yerleştirildiğinde anlamlı yüksektir. Biz bir 1:1 medya: etanol oranında floresan yoğunluğu sinyal orantılı olarak 0,5-50 mikron, sonda uygun bir davranış bu durumda öne aralığında analog kolesterol konsantrasyonu ile (Şekil 2 arttığını gözlenen ). 1:1 durumda (ortam: etanol) doğrusal davranışı takip denklemi tarafından temsil edilir: y 20.88 = x + 146.7 R2 0.9341 =.
Bu yöntem bir anahtar için sızma kolesterol böylece kolesterol alıcısı yüklü hücrelerle kuluçka harcanan zaman adımdır. Gerekli kuluçka süresini belirlemek için hücre medya farklı timepoints (1-24 h; hasat Şekil 3). Kolesterol sızma 0-6 h aralığında doğrusal olarak gelişti (p < 0,0001; y 18,2 = x + 127.3) bir saat-bağımlı şekilde. ABDS eklendi hücrelere yakalanan yüksek sinyal 6 h sonraydı. 6 h sonra sızma, düzenlilik, kuluçka ABDS (Şekil 3) ile 6 h sonra değişkenliği artan kolesterol kaybetmiş.
Ayrıca doygunluk eşik ve Dinamik Aralık için insan ABDS HDL içeren medya (ABDS) farklı oranlarda CE ölçerek uygulanan test ettik. NBD-kolesterol sızma yüksek işlem hacmi tahlil (96-şey plaka) doğrusal olarak % 1-7 ABDS, nerede bir konsantrasyon bağımlı şekilde kolesterol sızma kapasite % 7 ABDS (Şekil 4) zirvesine ulaşan ABDS ile FI artış içinde gelişti. 7 daha yüksek konsantrasyonları FI ABDS yüzde ile ters bir ilişki içinde azalmıştır. Kolesterol reentering NBD-kolesterolün hücrelerden HDL medyada mevcut dolu olmasından.
Kolesterol sızma ölçmek için standart yöntem radyo etiketli (3H) kolesterol16kullanır. Bizim floresans tabanlı yöntem performansını değerlendirmek için gerçekleştirilen ve floresan ve radyo etiketli teknikleri ile karşılaştırıldığında. Geleneksel radyoaktivite tekniği ve bizim NBD-kolesterol yöntemi son derece ilişkili bulduk (Pearson r 0.97; = p < 0.001) kullanarak farklı konsantrasyonlarda ABDS (% 1-8; Şekil 5). Genel olarak, bu bizim floresan yöntemi radyoaktif tekniğinden daha güvenli bir alternatif olabileceğini düşündürmektedir.
Son olarak, biz bizim Yöntem floresan sonda NBD farklı karşılaştırıldığında. Biz hücrelerde kolesterol sızma belirlemeye yönelik bir ticari yüksek üretilen iş hücre tabanlı tahlil kiti bizim yöntemine göre (kolesterol sızma tahlil kiti; hücre tabanlı). Bizim grupta geliştirilen yöntem içinde CE değerler 5 ile % 15 arasında (% ABDS) alıcısı konsantrasyon artış hassastı. Ancak, üreticinin yönergeleri izleyin, gerçekleştirilen ticari kiti, CE önlemler ABDS denetlesinler aralığı boyunca % 5 altında sonuçlandı; Böylece, elde edilen CE ne zaman aslında etkilenmedi ABDS yapıldı (Şekil 6) arttı.
Şekil 1: Moleküler yapılar doğal kolesterol (A), 22-NBD-kolesterol (B) ve 25-NBD-kolesterol (C). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: NBD-kolesterol floresan yoğunluğu (FI) etanol ve renksiz RPMI 1640 orta farklı oranlara sahip. NBD-kolesterol seyreltilmiş 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 ve 0:1 etanol: Orta oranlarıyla sulu NBD-kolesterol konsantrasyonu 0.5 ve 50 µM. FI arasında sinyal algılandı tarafından luminometer duyarlılığı parametresi 70 fluorimeter yazılım ayarlanmış. Medya ve hücre lysate FI sinyal beyaz 96-şey levhalar kullanılarak ölçülmüştür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: zaman-ilerleme NBD-kolesterol sızma THP 1 türetilmiş makrofajlar içinde. DmTHP-1 ile 5 mikron yüklü NBD-kolesterol ve %5 ABDS ile inkübe. Hücre medya farklı timepoints (1 – 24 h), beyaz bir 96-şey plaka ölçüldü. Değerleri quadruplicate Wells ortalama ± standart sapma sunulmaktadır. FI sinyal tarafından luminometer duyarlılığı parametresi ayarlanmış 70 fluorimeter yazılım algılandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: makrofajlar THP 1 elde edilen 96-şey plaka ABDS farklı konsantrasyonları ile NBD-kolesterol sızma. DmTHP-1 hücreleri 5 ile tedavi edildi µM NBD-kolesterol, farklı oranlarda ABDS inkübe ve etanol ile lysed. Medya ve hücre lysate FI sinyal beyaz bir 96-şey plaka fluorimeter 1:1 (etanol: lizis çözüm 1) kullanılarak ölçüldü. Ölçülerin negatif denetimlerinin (ABDS tedavi edilmezse medya) sağlanan düzeylerde düşülen. Değerleri onaylatılacak Wells ortalama ± standart sapma sunulmaktadır. FI sinyal tarafından luminometer duyarlılığı parametresi 50 fluorimeter yazılım de ayarlanmış algılandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Korelasyon NBD-kolesterol ve [3H]-kolesterol sızma THP 1 türetilmiş makrofajlar içinde. Aşağıdaki dmTHP-1 ile ilgili etiketli-kolesterol 6 h için. Kolesterol sızma 1-%8 ABDS kullanılarak ölçüldü. NBD-kolesterol örnekleri için 1:1 etanol: lizis çözüm 1 fluorimeter beyaz 96-şey plakalar kullanılarak floresan sinyal algılandı. FI sinyal tarafından luminometer duyarlılığı parametresi 50 fluorimeter yazılım de ayarlanmış algılandı. [3H] için-kolesterol örnekleri, radyoaktif sinyal orta 100 µL kullanarak algılandı ve mercek kokteyl ve mercek Counter, düşük ve ark.17tarafından. açıklanan protokol sonrası kırmızı ile karışık lysate hücre Korelasyon verimliliği Pearson r korelasyon katsayısı kullanarak tespit edilmiştir. Negatif denetimleri (ABDS tedavi edilmezse medya) önlemler floresans ve radyoaktif düzeyleri sağlanan düşülen. Değerleri onaylatılacak Wells ortalama ± standart sapma sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: yüksek işlem hacmi NBD-kolesterol sızma tahlil ve ticari floresan hücre tabanlı tahlil seti arasında karşılaştırma. Kolesterol sızma ABDS üzerinden kullanarak lysis solvent etanol (% 50) veya ara 80 (% 1) olarak açıklanan protokol sonrası değerlendirildi. Floresan hücre tabanlı tahlil kit seti üreticinin protokolüne göre değerlendirildi. Değerleri onaylatılacak Wells ortalama ± standart sapma sunulmaktadır. FI sinyal duyarlılığı parametresi 50 fluorimeter yazılım de ayarlanmış luminometer tarafından tespit Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: iş akışı diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 1: NBD-kolesterol sızma HIV infekte hastaların ve standart bir pozitif kontrol (C +) serum örneklerinin. HIV infekte hastaların kümesine uygulanmış NBD-kolesterol sızma yöntemi arası bireysel varyasyonu gösterilir. Olumlu bir iç kontrol (C +) de NBD-kolesterol sızma sera örnekleri 8 sağlıklı hastaların havuzundan temsil eder. Hata çubukları standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Floresan etiketli kolesterol çözümlemek ve özellikleri ve metabolizma doğal kolesterol tüp bebek araştırmak için umut verici bir stratejidir. Başlıca avantajları vardır bu hücreleri tarafından alınabilir, hücre içi sağlar ve membran dağıtım çalışmaları ve kolesterol sızma deneyleri bu Protokolü (Şekil 7) olduğu gibi bu tür uygulanabilir. Bazı floresan etiketli steroller kolesterol izleme BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol ve 22 - ve 25-NBD-kolesterol12de dahil olmak üzere tüp bebek izin verir. Özellikle, 22-NBD-kolesterol ile farklı hücre tipleri ve yerine radyo etiketli kolesterol18kolesterol dynamics eğitimi için uygundur. Kolesterol sızma tahlil floresan sinyal değerlendirmek için hiçbir uzlaşma yöntemi vardır. Şarkı vd.14 hasat FI ayrı ayrı; ölçmek için orta ve hücre lysates Liu vd.14 diğer kaplamalar için orta transfer ve hücre içi floresan sinyal doğrudan kültür plaka; ölçüldü ve Zhang vd15 lizis arabellek saf etanol sulandırmak ve floresan yoğunluğu sinyal19tespit floresan kolesterol arıtma tarafından takip hücreleri parçalayıcı eskiden. Medya ve hücreleri hücre medya homojenizasyon ve ölçümleri lysate etkin bir şekilde izin aynı son solvent kompozisyon bizim kolesterol sızma tahlil kullanın.
Bu da çalışmanın zamanla NBD-kolesterol sızma profilli ve kuluçka alıcısı ABDS, benzer şarkı ve ark.14 ve Liu ve ark.14 ve aksine Zhang 1s kuluçka dönemi kullanan vd. ile 6 h kadar bir zamana bağımlı ilerleme bulundu lipid alıcısı19ile. Bulduk, kuluçka 6 h sonra effluxed kolesterol doğrusallık kaybetti; Bu nedenle, 6 h aşmayacak şekilde her şeyden önemlidir. En iyi kolesterol sızma yelpazemizi alıcısı ekledikten sonra 3-6 h arasında yapıldı. Biz hücreler kolesterol alıcısı ile 4 h için kuluçka öneririz. Ek kritik adımlar arka plan, bir yarı konfluent hücre kültür katmanı tohum ve doğru bir bağlılık bu plaka sağlanması önlemek için alıcısı uygulamak için renksiz medya kullanımı vardır. Bu açık beyaz kalenin dibinde bir ters ışık mikroskobu altında hücre takip etmek yararlıdır olması gerekmektedir.
Arıtılmış lipid alıcısı kolesterol sızma testinde kullanmak çoğu kolesterol sızma deneyleri yapılmaktadır. Mevcut teknik insan serum veya Plazma numuneleri kolesterol sızma kapasitesi elde etmek için geliştirilmiştir. Serum içinde mevcut iç kolesterol alıcısı kullanıyoruz ama apolipoprotein B hücreleri20,21içinde kolesterol moleküllerin recirculate içeren parçacıklar kaldırmak için önemlidir. Değişiklikler saf ApoAI ve HDL alıcısı da kullanılabilir. Ayrıca, hücre hatları insan THP-1'den farklı floresan kolesterol sızma deneyleri, ham 264.7 veya J774A1 makrofajlar gibi içinde başarılı bir şekilde kullanılmıştır ve böylece-cekti büyük olasılıkla iş bizim yöntemi15,22.
Bu yöntemin ana sınırlamaları belirli hücre satırı, bir standart hücre satırı sonuçlar bağlıdır ama boş hücre yöntemi bir biyomarker kullanmak için avantajlı olacağını var. Ayrıca, bu yöntem standartlaştırmak için kullanılan sera dondurulmuş; NBD yan kolesterol üzerinde radyo etiketli olandan daha az fizyolojik ve onun alımını endojen kolesterol farklıdır; ve süreçleri (, içeren serum parçacıklar, bir hücre, olası esterleşme kolesterol, kolesterol veya eşzamanlı sızma ve akını süreçleri mümkün difüzyon) kümesi, nihai sonucunu test ettik. Ancak, bir avantaj olarak, floresans tabanlı teknikleri yerine geleneksel radyo etiketli teknikleri ve [3H] ikame olarak yüksek potansiyele sahip göstermiştir-kolesterol, izlemek için bir floresan etiketli molekül tarafından kolesterol sızma14deneyleri.
Gelecekteki kardiyovasküler olaylar24,25ile karşılıklı olarak ilişkilendirir gibi kolesterol sızma ateroskleroz23, biyomarker hareket edebilir. Ateroskleroz makrofajlar rolü eğitim için saflaştırılmış HDL ve kompozisyon ile olabilir; Ancak, donanım tanımlama dillerinin arıtma zorlu ve zaman alıcı bir süreç olduğunu. Ayrıca, arıtma sırasında diğer serum bileşenleri aterojenik etkisi ile göz ardı kayıp veya olabilir. Bu nedenle, ABDS lipid alıcısı olarak seçildi. Yüksek işlem hacmi ölçek ve zaman azaltılması mercek counter için plaka okuyucu yerine, aynı kültür plaka (durumunda hücre lysate) Floresan sinyal ölçme ve protokol tarafından iki gün azaltarak mümkün yapıldı. Hücreleri farklı bir ticari seti için kolesterol sızma değerlendirmek için alınan önlemler daha serum konsantrasyonları maruz kalır Ayrıca, bu teknik daha yüksek hassasiyet gösterir.
Sonuç olarak, geleneksel radyoaktif yöntemi ile ilişkili olan bir NBD-kolesterol sızma tahlil tarif edilmiştir. ABDS şeklinde lipid alıcısı (serum veya plazma) insan örneklerinden kuluçkaya için en uygun zaman belirledi. Biz hücre tohum, farklılaşma, dinamik alan ve doygunluk noktasına tekniğin optimize. Onun ana yenilik gelince, biz ölçümlerde yüksek yoğunluklarda ve geliştirilmiş bir doğrusal aralığı elde etmek için kullanılan bir çözelti arada optimize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar mucitler başlıklı patent başvuru (EPO; 18382337.6-1118; 17 Mayıs 2018) olduğunu bildirmek istiyorum "kolesterol sızma belirlemek için yöntem" dayalı bu yöntemi.
Acknowledgments
Bu eser kısmen tarafından desteklenen araştırma FIS (PS12/00866) Instituto de Salud Carlos III, Madrid, İspanya üzerinden; verir. Fondo Europeo para el Desarrollo bölgesel (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-sayımlı (RD16/0025/0002) ve eğer programı / Generalitat de Catalunya. Yazarlar Retrovirology ve Viral Immunopathology laboratuvar Institut d'Investigacions Biomèdiques Ağustos Pi I Sunyer (IDIBAPS) teşekkür ederiz. Biz T. Escribà, C. Rovira ve C. Hurtado onların yardım ve bilgi ve Teknoloji Transfer Ofisi S. Cufí korumak icat onun rehberlik için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
