Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lucifer Yellow-en robust Paracellulär permeabilitet markör i en cell modell av den mänskliga blod-hjärnbarriären

Published: August 19, 2019 doi: 10.3791/58900
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical, Administrative and Social Sciences, Duquesne University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky

Summary

Vi presenterar en fluorescensanalys för att visa att Lucifer Yellow (LY) är en robust markör för att bestämma den skenbara paracellulära permeabiliteten hos hCMEC/D3-cellmonolayers, en in vitro-modell av den humana blod-hjärnbarriären. Vi använde denna analys för att bestämma kinetiken hos en konflytande enskiktslager formation i odlade hcmec/D3 celler.

Abstract

Blod-hjärnbarriären BBB består av endotelceller som bildar en barriär mellan den systemiska cirkulationen och hjärnan för att förhindra utbyte av icke-essentiella joner och giftiga ämnen. Snäva korsningar (tj) tätar effektivt paracellulära utrymmet i enskiktslager resulterar i en intakt barriär. Denna studie beskriver en ly-baserade fluorescensanalys som kan användas för att bestämma dess skenbara permeabilitet koefficienten (Papp) och i sin tur kan användas för att bestämma kinetik av bildandet av konfluenta enskiktslager och den resulterande snäva korsningen och barriär integritet i monolayers hCMEC/D3. Vi ytterligare Visa en ytterligare nytta av denna analys för att avgöra tj funktionell integritet i transfekterade celler. Våra data från LY Papp analysen visar att hcmec/D3 celler seedade i en transwell setup effektivt begränsa ly paracellulära transport 7 dagar-post kultur. Som ett ytterligare verktyg för den presenterade analysen, visar vi också att DNA nanopartiklar transfektion inte förändrar ly paracellulär transport i hcmec/D3 monolayers.

Introduction

Blod-hjärnbarriären (BBB) är den skyddande barriären begränsa tillströmningen av plasma komponenter i hjärnvävnaden och består av hjärnans endotelceller tillsammans med stödjande celler såsom pericyter. Den viktigaste rollen av BBB är att fungera som en barriär som tätar utrymmet mellan perifert blod och centralanervsystemet (CNS) för att upprätthålla hemostas av neurala mikromiljön1,2. Hjärnan kapillära endotelceller tätar effektivt paracellulära vägen via bildandet av intercellulära snäva korsningar (TJs)1. Denna skyddande barriär tillåter glukos och utvalda näringsämnen att komma in i hjärnan samtidigt som det hindrar majoriteten av joner, giftiga ämnen och droger från att passera genom denna snäva barriär. Bortsett från dess skyddande roll, den naturliga barriären funktion av BBB utgör en allvarlig utmaning i utvecklingen av läkemedel leveranssystem som riktar sig till CNS.

In vitro cellkultur modeller av BBB är användbara verktyg för att studera dess biologi och att förstå effekterna av läkemedelsbehandling på TJ barriär integritet. Vi använde den mänskliga cerebrala mikrovaskulära endotelceller cellinjer (hcmec/D3) som en in vitro-modell eftersom det är en accepterad modell av mänskliga hjärnan endotel3 och recapitulates många funktioner av den mänskliga BBB. hcmec/D3is en av de mest använda cellinjer för modellering av BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Trots dess jämförelsevis låga värden av transendothelial elektriskt motstånd (TEER), ett mått på barriär täthet, behåller denna cell linje de flesta av de morfologiska och funktionella egenskaperna hos hjärnans endotelceller, även som en monokultur i avsaknad av som är odlade glialceller6,7. Cell linjen hcmec/D3 uttrycker flera BBB-markörer, inklusive aktiva transportörer och receptorer, fram till ungefär passage 35 utan att genomgå Dedifferentiering till instabila fenotyper6,7,9 ,10,11. Den mest slående kännetecknande för hcmec/D3 cellinjer som en in vitro-BBB-modellen är dess förmåga att bilda TJS5,9,11,12. Det bör noteras att även om stamcells-härledda BBB-modeller visade högre permeabilitet i många studier jämfört med hCMEC/D3 cellinjer och de uttrycker några BBB markörer, de är ännu inte utvecklas som den vanligaste BBB-cellen modell13. Viktigare är att stamceller härrör BBB modeller återstår att kännetecknas med avseende på maximala passage nummer som gör att cellerna att upprätthålla stabila BBB fenotyper14.

Tre primära metoder används ofta för att bestämma TJ barriär integritet, inklusive mätning av TEER, mätning av skenbar permeabilitet koefficienten (Papp) av små hydrofila spår molekyler såsom sackaros, inulin, Lucifer gul, etc. och immunofärgning av kända molekylära markörer av TJs såsom Claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER är en relativt enkel och kvantitativ metod som mäter det elektriska motståndet över cell enskiktslager odlade på ett poröst membran substrat5. Men TEER värden kan påverkas av experimentella variabler såsom sammansättningen av odlingsmediet och typ av mätinstrument. En sannolik kombination av dessa faktorer leder till en bred fördelning av TEER värden som sträcker sig från 2 till 1150 Ω cm2 i hcmec/D3 cell linjen odlade för 2-21 dagar13. Immunofärgning är en visuell metod för bestämning av förekomst av TJ-proteiner genom märkning av det riktade proteinet med hjälp av antikroppar. Emellertid, immunofärgning innebär en serie experimentella steg, inklusive behovet av att fastställa/permeabilize celler som kan resultera i experimentella artefakter och fluorescerande signaler kan blekna över tiden. Ovanstående faktorer kan leda till subjektiva fel som påverkar datakvaliteten.

Det primära fokus för detta arbete är att presentera en ly-baserade skenbara permeabilitet assay bestämma kinetik av en konfluenta enskiktslager formation i odlade hcmec/D3 celler. Även om andra avancerade in vitro-BBB-system, såsom samkultursystem, mikrofluidiska system, är fysiologiskt mer relevanta mimik med signifikant förbättrad barriärfunktion15,16,17, hcmec/D3 transwell setup är en enkel och pålitlig modell för att uppskatta kinetiken av TJ formation och snabbt skärmen effekten av olika läkemedelsformuleringar på barriärfunktion. I allmänhet, Papp värden är konsekventa för olika hydrofila lösta ämnen i hcmec/D3 monolayers. Till exempel de rapporterade P app värden för olika lågmolekylärt massa lösta ämnen (såsom sackaros, mannitol, ly, etc.) i olika in vitro- BBB-modeller är i storleksordningen 10-4 cm/min5,18,19 , 20. i vår experimentella inställning, är hjärnans endotelceller seedade på ett kollagen-belagda mikroporösa membran för cell infästning och enskiktslager bildas för att efterlikna in vivo barriären. Den LY läggas i den apikala sidan förväntas passera intercellulära snäva korsningar och ackumuleras i den basolaterala sidan. Större koncentrationer av LY i basolaterala sidan indikerar en omogen, inte-fullt funktionell barriär medan lägre koncentrationer återspeglar begränsad transport på grund av närvaron av funktionella TJs resulterar i en mogen barriär.

LY är en hydrofila färgämne med distinkta excitation/emission toppar och undviker behovet av att radiomärka Tracer molekyler såsom sackaros, mannitol eller inulin. Således kan fluorescensvärdena av LY användas för att direkt beräkna dess paracellulära permeabilitet över BBB monolayers. Också, jämfört med många kommersiellt tillgängliga färgämnen som används i biomedicinska fält som lider av små Stokes SKIFT som fluorescein21, den Stokes förskjutning av ly är ca 108 nm med tillräcklig spektralseparation, vilket gör att ly fluorescensdata som en robust avläsning för att bestämma paracellulär permeabilitet. Vi använde Western blotting som en ortogonal teknik för att demonstrera förändringar i uttrycket av den snäva korsningen markör protein, ZO-1, över kultur tid. ZO-1 uttryck detekteras via Western blotting används för att komplettera ly Papp data och i kombination, dessa data tyder på att de observerade förändringarna i ly papp värden är reflekterande av bildandet av en enskiktslager med gradvis ökning av uttryck för den snäva knutpunkten, ZO-1.

Som påpekats tidigare, är det centrala fokus för detta arbete att demonstrera en ly assay som en enkel teknik för att övervaka bildandet av en konfluenta enskiktslager med funktionella snäva korsningar. Men för att demonstrera en ytterligare nytta av den utvecklade analysen, vi mätt den LY Papp i DNA nanoparticle-transfected hcmec/D3 monolayers. Nukleinsyror kan kondenseras till polyelektrolytnanopartiklar med en diameter på 100-200 nm via elektrostatisk interaktion mellan de positivt laddade grupperna av polymerer och de negativt laddade fosfat grupperna av nukleinsyror22, 23. Vi hänvisar till dessa komplex som DNA nanopartiklar (DNA NPS) i vårt arbete. Medan vår avsikt är att transfect celler och uttrycka det önskade proteinet, måste vi se till att barriär egenskaperna hos hcmec/D3 enskiktslager inte äventyras. Våra data tyder på att en standard 4 h luciferas Gene transfection regim inte mätbart ändra den ly permeabilitet visar nyttan av ly Papp analysen för att avgöra förändringar i tj barriär integritet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. allmän hCMEC/D3 cellkultur

  1. Återupplivning av frysta celler
    Obs: all cellkultur underhåll och experiment utfördes inuti en steril biosäkerhet huva. Odlingsmedier, kosttillskott och reagenser köptes antingen som sterila produkter eller steriliserades via filtrering med ett membranfilter på 0,22 μm för att förhindra mikrobiell kontaminering.
    1. Tillsätt 8,5 mL kollagen lösning (0,15 mg/mL) i en vävnadskultur kolv (75 cm2 tillväxtområde, hänvisas hädanefter som T75) och placera den i en inkubator (37 ° c, 5% Co2) för 1 h.
    2. Ta bort kollagen lösningen och tvätta försiktigt kolven med steriliserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 15 mL komplett odlingssubstrat till kolven och låt verka i CO2 -inkubatorn i 15 minuter.
      Anmärkning: det kompletta mediet (slutlig koncentration) innehöll Endotelcelltillväxt basal medium-2 (500 mL) kompletterat med foster bovint serum (5%), penicillin-streptomycin (1%), hydrokortison (1,4 μM), syra askor bin (5 μg/mL), kemiskt definierade lipid koncentrat (1/100), HEPES (10 mM) och basisk fibroblasttillväxtfaktor (1 ng/mL).
    3. Flytta en kryovial av frysta hCMEC/D3 celler från flytande kväve tanken och snabbt Tina flaskan i ett 37 ° c vattenbad (< 1 min).
    4. När bara en liten flaga av is är synlig, snabbt aspirera och överföra cellerna till kolven som innehåller förvärmda medium. Skaka försiktigt kolven så att cellerna blandas med odlingsmediet.
    5. Placera kolven i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2) och observera cellerna under ett ljusmikroskop efter 2 h för att säkerställa att cellerna är fästa.
    6. När cellerna fäster botten av kolven, ta bort det gamla odlingsmediet och tillsätt 10 mL färsk förvärmd tillväxtmedium för att ersätta dimetylsulfoxid i det gamla tillväxt mediet24.
    7. Efter 24 h, kontrollera under ett ljusmikroskop för att observera Spindelformade celler och ersätta det gamla odlingsmediet med förvärmda färska odlingssubstrat.
  2. Underhåll av cell kultur
    1. Fyll på odlingsmediet varannan dag tills 100% Confluence. Kontrollera cellerna under mikroskopet innan du tar bort det gamla odlingsmediet och även efter att ha lagt till färskt odlingsmedium. Ta ut kolven från inkubatorn och undersök hCMEC/D3 celler under faskontrastmikroskop för att säkerställa att de verkar friska.
      Anmärkning: de flesta celler bör fästas på botten av kolven, har en spindel-formad morfologi och ofta gånger, ljusbrytande runt deras membran ses också. Odlingssubstrat bör vara transparent (icke-grumlig) och rosa-orange i färg.
    2. Ta bort gammalt odlingsmedium från kolven och överför 10 mL förvärmda färskt medium till kolven.
      Anmärkning: mediet bör läggas till den övre sidan av kolven och inte direkt på ytan av cellerna för att undvika att påverka cell infästningen.
    3. Vrid kolven tillbaka i horisontellt läge och häll den försiktigt flera gånger och kontrollera hCMEC/D3-cellerna under mikroskopet innan kolven återgår till inkubatorn (37 ° c, 5% CO2).
    4. Observera cellerna under ett inverterat ljusmikroskop varje gång före och efter hantering av cellerna, både under vanligt kulturarbete och under experiment. Registrera eventuella märkbara förändringar i cell nummer eller morfologi i laboratorie anteckningsboken.
  3. Cell passaging
    1. Inkubera en ny T75 kolv med 8,5 mL kollagen lösning för 1 h i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2).
    2. Ta bort kollagen lösningen och tvätta försiktigt kolven med steriliserad PBS. Tillsätt 10 mL förvärmda hCMEC/D3-medel till den nya kolven och Placera kolven i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2).
    3. Ta ut kolven ur inkubatorn och undersök hCMEC/D3-cellerna under ett faskontrastmikroskop för att kontrollera om cellerna är 100% konflytande.
    4. Avlägsna hCMEC/D3 cell medium från kolven som innehåller celler och tvätta hCMEC/D3-celler med 10 mL PBS.
      Anmärkning: FBS som tillsätts till odlingssubstrat innehåller proteashämmare såsom α1-antitrypsin och α2-Makroglobulin. Dessa hämmar trypsinization processen. Därför är det viktigt att tvätta cellerna med PBS för att avlägsna spår av FBS för att förhindra hämning av trypsinization processen.
    5. Tillsätt 1 mL 0,25% trypsin lösning som innehåller 0,02% EDTA och trypsinize för 2-5 min i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2) (knacka lätt på kolven på sidorna för att hjälpa till att lösa upp).
      Obs: lämna aldrig cellerna på trypsin/EDTA i mer än 6 min.
    6. Tillsätt 10 mL förvärmda hCMEC/D3-medium för att stoppa trypsinization-processen och Omsuspendera hCMEC/D3-cellen genom att Pipettera upp och ner flera gånger. Ta sedan bort hela cellsuspensionen från kolven till en 15 mL tub.
    7. Överför 1 mL av cellsuspensionen från 15 mL-röret till den nya kolven med förvärmda färskt medium (klyvning av celler 1:10) och returnera den nya kolven tillbaka till inkubatorn.
      Obs: innan du överför till den nya kolven, Pipettera cellsuspensionen upp och ner flera gånger för att minimera cell koncentrations gradienter.

2. cellplätering

  1. Placera vävnad kultur skär med mikroporösa membran (porstorlek: 0,4 μm, material: polyetylentereftalat (PET)) till en 24-brunn kultur tallrik.
  2. Tillsätt 400 μL kollagen typ I (0,15 mg/mL) i varje insats för vävnadsodling och inkubera i 1 timme i CO2 -inkubatorn (37 ° c, 5% Co2). Rock 24-brunnen plattan försiktigt för att möjliggöra även spridning av kollagen lösningen över mikroporösa membranet i vävnaden kultur skär.
  3. Ta bort kollagen lösningen och tvätta försiktigt mikroporösa membranet med 0,4 mL 1x PBS buffert.
  4. Plattan hCMEC/D3 celler med densiteten av 50 000 celler/cm2 i cellen infogar (15 000 celler i 500 μl av mediet).
    Anmärkning: för att minimera skillnaderna i cell nummer i varje vävnads odlings insats, var cellsuspensionen återsuspenderad med en 10 mL pipett innan celler läggs till i skären.
  5. Placera 24-brunnen plattan med vävnad kultur setup i en inkubator (37 ° c, 5% CO2) för att möjliggöra cell fastsättning och spridning.
  6. Inkubera plattan i 7 dagar så att cellerna kan nå 100% confluency. Ta bort odlingsmediet varannan dag och överför 0,5 mL förvärmda färska medier till vävnadskultur insatser.
  7. Upprepa pläteringsproceduren (steg 2.2-2.6) på en 12-brunn tallrik, 48-väl plattan och 96-bra tallrik. Använd 12-brunnen plattan för Western blotting att bestämma förändringar i ZO-1 uttryck. Använd 48-brunn plattan för DNA NP transfektion. Använd 96-well-plattan för ATP-analysen för att bestämma cellernas lönsamhet i transfekterade celler.

3. kinetik av celltillväxt.

  1. Utsäde cellerna vid en densitet av 50 000 cell/cm2 i en kollagen-belagda 24-well vävnad kultur plattan.
  2. På varje dag av experimentet, ta bort odlingsmediet och tvätta försiktigt cellerna två gånger med 500 μL 1x PBS. Tillsätt sedan 30 μL 0,25% trypsin-lösning som innehåller 0,02% EDTA och lämna plattan i ca 2-5 min i en inkubator (37 ° c, 5% CO2).
    Anmärkning: gradvis bildande av konflytande enskiktslager kan påverka omfattningen av cell avlossning och det är nödvändigt att öka volymerna av trypsin/EDTA som anges här: 30 μl för 1-5 dagar efter sådd, 60 μl för 6-7 dagar efter sådd och 100 μl för 8-10 dagar efter sådd .
  3. Tillsätt antingen 470 μL, 440 μL eller 400 μL av odlingssubstrat baserat på den volym av trypsin/EDTA-lösning som lagts till i steg 3,2 för att förbereda 500 μL cellsuspension i varje brunn.
  4. Suspendera cellerna genom att Pipettera upp och ner i varje brunn flera gånger och observera cellerna under ett mikroskop för att se till att alla celler är suspenderade i odlingsmediet. Om några celler fortfarande är fästa på plattan botten efter Pipettera flera gånger, försiktigt skrapa cellerna med hjälp av en plast cell skrapa för att underlätta cell avlossning.
  5. Avlägsna 0,1 mL cellsuspension från 500 μL cellsuspension i steg 3,3 och tillsätt i ett 1,5 mL-rör. Tillsätt sedan 0,1 mL av 0,4% Trypan blå lösning till cellsuspensionen och blanda väl.
  6. Rengör en hemacytometer med 70% isopropylalkohol. Tillsätt 20 μL av blandningen från steg 3,5 på varje sida i V-spåret och lokalisera 16 rutor under mikroskopet. De 16 rutorna betraktas som ett rutnät. Lokalisera två slumpmässiga galler på vardera sidan av hemacytometern och räkna alla levande, icke-blå celler.
    ANMÄRKNINGAR: celler som verkade blå i färg från uteslutna från att räkna, < 1% av cellerna färgade blå vid alla tidpunkter.
  7. Beräkna CELLTÄTHETEN (celler/cm2) baserat på följande formler.
    Genomsnittligt antal celler/rutnät = Equation 1 (EQ. 1)
    Utspädningsfaktor = Equation 2 (EQ. 2)
    Cell täthet (livskraftiga celler/cm2) =
    Equation 3
    (EQ. 3)
    Ekvationer 1-3. Livskraftiga celler är antalet celler som räknas i varje rutnät, antalet rutnät motsvarar antalet galler som finns under Mikroskop, volym blandning av cellsuspension och 0,4% Trypan blå är den volym som bereds i steg 3,5, volym av cellsuspension bort är volymen avlägsnas från 500 μL cellsuspension i steg 3,5, volymen av cellsuspensionen i varje brunn är den 500 μL cellsuspension från steg 3,3, tillväxt område av vävnad kultur plattan är tillväxtområdet för enda brunn i 24-brunn tallrik.

4. Lucifer gul skenbar permeabilitet (LY P app ) assay

  1. För att bestämma LY Papp varje dag efter seeding, Följ steg från 4,3. För bestämning av P-appen i transfekterade hcmec/D3-celler, tillsätt 8,3 μl av transfektionsformuleringen (figur 1) blandat med 50 μl komplett odlingssubstrat och inkubera i 4 h. transfektionformuleringar beskrivs i avsnitt 5.
  2. Efter den 4 h transfektion, tvätta försiktigt den apikala sidan två gånger med steril 1x PBS buffert för att avlägsna eventuella kvarvarande transfektion blandning. Varierande volymer PBS buffert kvar efter avlägsnande kan påverka koncentrationen av LY i den apikala sidan. Var noga med att se till att resterande PBS buffert i vävnad kultur skär är helt bort. Noggrant aspirera restreagenser och medium för att minimera cell avlossning.
    Anmärkning: detta steg hoppas över vid mätning av varje dag skenbar permeabilitet (Papp) av hcmec/D3 celler.
  3. Ta bort odlingsmediet och tillsätt 1,5 mL förvärmd (37 ° c) transportbuffert (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mm mgcl2, 1 mm NaH2PO4,5mm glukos, pH 7,4) till den basolaterala sidan.
    Anmärkning: volymen av transportbufferten i alla basolaterala utrymmen bör vara lika med att säkerställa noggrannheten hos beräkningen av permeabilitetskoefficienten.
  4. Tillsätt 58,3 μL 20 μM lösning till den apikala sidan av varje transwell-skär. Spara 50 μL av 20 μM-lösningen för fluorescensmätningar. Efter avlägsnande av kvarvarande PBS buffert från apikala sidan helt, tillsätt LY lösning så snabbt som möjligt för att undvika torkning hCMEC/D3 celler. Säkerställa korrekta volymer av LY lösning i den apikala sidan.
    Observera: för att minimera sönderfallet av ljus fluorescensintensitet bör lätt exponering begränsas. När väl pulvret är rekonstituerat ska lösningen förvaras vid 4 ° c, skyddad mot ljus.
  5. Inkubera i en skakapparat (37 ° c, 100 rpm) för 60 min. Ta sedan bort 30 μL av det LY-provet från varje apikal fack. Överför sedan 20 μM LY-lösningen och de apikala sido proven till förmärkta rör och späd provet 10 gånger med hjälp av transportbufferten.
    Anmärkning: det är nödvändigt att späda ut den 20 μM stamlösningen och de apikala sidoproverna eftersom den höga fluorescensintensiteten hos dessa prover potentiellt kan överbelasta och skada fluorescensdetektorn i fluorescensmikroplattläsaren.
  6. Ta bort 500 μL från varje basolateralt fack och överför provet till förmärkta rör.
    Anmärkning: prover tas bort från separata transwell vid angivna tidpunkter. Tids punkterna är varje dag efter sådd som börjar dag 1 till dag 10.
  7. Förbered en serie av LY standarder för standardkurvan (39,00 nM, 78,13 nM, 156,25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
  8. Tillsätt 100 μL av varje standard (i två exemplar), apikal och basolateralt prov till varje brunn i en svart 96-brunn tallrik (figur 1).
    Obs: svarta plåtar absorberar ljus och reducerar bakgrunds-och fluorescenscrossover bland brunnar.
  9. Använd en fluorescensmikroplattläsare (Ställ punkter: excitation 428 nm, emission 536 nm) för att mäta den ljusintensiteten för att beräkna P-appen. En fluorescens-Plattläsare används för denna studie.
  10. Beräkna Papp och% ly Recovery värden som beskrivs i manuskriptet texten.
    Ekvation 4. Formler för beräkning av P-appvärden .
    Beräkna den skenbara permeabilitet (P-app) koefficienten och% ly återhämtning med följande ekvationer. Det bör noteras att Papp värden kan beräknas antingen baserat på massa25 eller koncentration av ly.
    Equation 4 EllerEquation 5
    VA -volym i det apikala facket
    VB -volym i det basolaterala facket
    A-ytan på transwell-skärmembranet (0,3 cm2)
    Ma0 -den initiala massan i det apikala facket
    ΔMB/Δt-förändringen av massan över tid i det basolaterala facket
    CA0-den initiala koncentrationen i det apikala facket
    ΔCB/Δt-förändringen i koncentrationen över tiden i det basolaterala facket.
    Ekvation 5. Formler för beräkning av% ly återhämtning.
    Återhämtning (%) = Equation 6
    MAF är massan i det apikala facket vid sluttidpunkten, mBF är massan i det basolaterala facket vid sluttidpunkten, ma0 är den initiala massan i det apikala facket. 26 Anm.: den initiala massan beräknas baserat på volymen av den 20 μm-lösningen i steg 4,5. Detta experiment gjordes alltid med hjälp av celler under passage nummer 35 och genomfördes fyra oberoende gånger.

5. kalcium utarmning

  1. Ta bort odlingsmediet från transwell skär och 12-brunn plattan och försiktigt tvätta den apikala sidan och 12-brunn plattan med förvärmda kalcium-fri medium (minsta Essential medium Eagle spinner (S-MEM) medium) för att ta bort kalciumjoner från transwell skär och 12-brunn tallrik.
  2. Tillsätt 500 μL eller 2 mL förvärmda S-MEM 1xmedium till skären eller 12-brunn-plattan och inkubera i 24 timmar i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2). Efter inkubering, ta bort S-MEM 1x medium och tvätta cellerna en gång med förvärmda 1x PBS buffert.
  3. Följ steg 4.4-4.10 som beskrivs i avsnitt 4 för LY-behandling och efterföljande steg. Följ stegen 8.1.2-8.2.4 som beskrivs i avsnitt 8 för Western blotting och efterföljande steg.

6. transfektion

  1. Beredning av DNA-nanopartiklar (DNA NPs).
    1. Späd stamlösningen av gWIZ-Luc plasmid i 10 mM natriumacetat (NaAc) buffert (pH 5,0) och låt DNA-lösningen stå i 10 min vid rumstemperatur (RT).
      Anmärkning: DNA NP som innehåller övervägande enskilda DNA-molekyler kan beredas vid DNA-koncentrationer 20-40 μg/mL23. Således, gWIZ-Luc plasmid stamlösning måste spädas. Den frusna gWIZ-Luc plasmid beståndet måste tinas helt på is för att minimera temperatur stressen. Skaka försiktigt den utspädda DNA-lagerlösningen för 30 s på en standard bänk vortexblandare inställd på knopp position 3-5.
    2. Beräkna önskade N/P nyckeltal, används här som en numerisk parameter för att återspegla NP sammansättning.
      Equation 7
      Ekvation 6. N/P ratio beräkning: förhållandet mellan mol av amingrupper av katjoniska polymerer till de av fosfat grupperna av DNA. Massan av katjonpolymerer innebär den totala vägda mängden katjonpolymer. (Massa/avgift) katjoniska polymerer hänvisar till den molekylära vikten av katjonpolymer (poly (etyleneglykol) 5k-block-polyaspartamid med 48 dietylenetriamine sidokedjor (PEG-det)) normaliserade till antalet laddade primära aminer (48) per katjonpolymer ( mol/mol) är detta värde för vår polymer 306 da; DNA-massa: total mängd DNA som används i den formulering som erhålls genom att multiplicera volymen och koncentrationen i mg/mL. (Massa/avgift) DNA avser molekylvikten av DNA normaliserade till antalet fosfatgrupper per dubbelsträngad dna (325 da per nukleobas).
      Anmärkning: DNA NP-berednings tabellen (tabell 1) innehåller formulerings receptet för de olika proverna som testas i våra experiment. DNA NP bereddes med hjälp av en snabb titreringsteknik. PEG-DET polymer lösning lades längs väggarna i röret medan du håller röret i horisontellt läge. Sedan röret bytte till en vertikal position, följt av snabbt vortexa vid maximal hastighet för 10s. DNA NP tilläts stå i 30 minuter vid RT före användning. Regeln-av-tummen för DNA NP dosering är 0,5 μg DNA för ca. 1 cm2 tillväxtområde. Så, för varje transwell skär/varje brunn i en 48-väl tallrik/varje brunn i en 96-brunn tallrik, Förbered DNA NP på N/P 10 som innehåller 0.157/0.5/0.195 μg/brunn av gWIZ-Luc DNA.
    3. För prover som innehåller indikerad koncentration av poloxamer P84 (P84), tillsätt P84 till DNA NP och Vortex för 5 s. Den slutliga koncentrationen av P84 i varje prov är antingen 0,01% eller 0,03% WT.
  2. DNA NP-transfektion i en 48-brunn tallrik setup
    1. Utsäde cellerna med densiteten av 50 000 cell/cm2 i en 48 väl tallrik och växa tills sammanflödet i inkubatorn (37 ° c, 5% Co2).
    2. För varje behandlingsgrupp, blanda 25 μL av det angivna provet (transfektionsformulering) och 150 μL av hela odlingsmediet och 175 μL av denna blandning till varje brunn.
    3. Observera hCMEC/D3-cellerna under ett mikroskop för att säkerställa att cellerna verkar friska och är 100% konflytande vid tidpunkten för experimentet.
    4. Avlägsna odlingsmediet från brunnar och 175 μL transfektionblandning till varje brunn. Inkubera sedan plattan i 4 timmar i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2).
    5. Efter 4 h, ta bort transfektionsblandningen och tvätta hCMEC/D3-cellerna med förvärmda sterila 1x PBS-buffert.
      Obs: för att minimera oavsiktlig avlossning av hCMEC/D3-celler från plattan/insats ytan under tvätt stegen, Pipettera försiktigt tillräckligt med steril PBS längs väggarna i brunnarna och avlägsna eventuella nanopartiklar i det resterande odlingsmediet.
    6. Försiktigt klippa plattan några gånger och försiktigt aspirera och kassera PBS tvätta och tillsätt 500 μL av hCMEC/D3 förvärmda odlingssubstrat.
    7. Mikroskopiskt undersöka cellerna och rekord observationer på cellmorfologi och eventuella effekter av transfektion.
    8. Inkubera i 24 timmar i cellkulturens inkubator på 37 ° c för att möjliggöra luciferasproduktion. Efter 24 h, ta bort odlingsmediet helt och tvätta cellerna en gång med förvärmda 1x PBS.
    9. Lyse de transfekterade cellerna genom att tillsätta 100 μl av iskall luciferas cellkultur lysis 1x reagens per brunn.
    10. För mätning av luciferasproteinhalten, tillsätt 20 μL celllysat och 100 μL luciferasanalysbuffert (20 mM glycylglycin (pH 8), 1 mM MgCl2, 0,1 mm edta, 3,5 mm dtt, 0,5 mm ATP, 0,27 mm coenzym A) i ett 1,5 ml-rör.
    11. Läs den Luminescens av provet som beskrivs i steg 6.2.10 på en luminometer med en enda autoinjektor.
      Obs: luminiscens bör integreras över 10 s före läsning.
    12. Mät den totala mängden cellulärt protein i lysat med hjälp av en och Acid assay (BCA assay) kit genom att följa tillverkarens protokoll.
    13. Beräkna och uttrycka luciferas genuttryck som relativ ljusenheter (RLU) per totalt cellulära protein.

7. självlysande ATP-analys

  1. Utsäde cellerna med densiteten av 50 000 cell/cm2 i en 96 väl tallrik och växa tills sammanflödet i inkubatorn (37 ° c, 5% Co2).
  2. Transfect cellerna med 9,7 μL av transfektion formuleringen (beredning Detaljer finns i avsnitt 6) och 58,4 μL av komplett odlingssubstrat för 4 h.
  3. Ta bort transfektion blandningen och tvätta försiktigt cellerna med förvärmd PBS 1x buffert två gånger för att ta bort behandlingen reagenser helt.
    Anmärkning: olika volymer av restbuffert kan späda ut ATP-analysreagenser i olika utsträckning och kan potentiellt påverka data.
  4. Blanda 75 μL färskt förvärmda medium och ATP-analysreagens i en 1:1 utspädning med en multikanalpipett. Se till att vätskenivån i alla flerkanaliga pipettspetsar är densamma.
  5. Placera plattan på en vippskivemätare shaker i 15 min vid rumstemperatur. Efter 15 min av tillsats av reagenser, överför 60 μL av varje prov till en vit 96-brunn tallrik.
    Obs: vita plåtar är bättre att reflektera utgångs ljus än klara eller svarta plattor.
  6. Pop eventuella luftbubblor med hjälp av en nål innan du läser plattan. Läsplattan på en luminometern med en 1 s integrations tid. Läsplattan inom 20 min efter tillsats av ATP-analysreagens. Timing är avgörande för jämförelse mellan olika plattor, eftersom luminiscens signalen är övergående med en snabb sönderfalls frekvens.
  7. Beräkna procent (%) cellernas lönsamhet med hjälp av denna formel: (Luminescens av transfekterade celler/Luminescens av kontroll, obehandlade celler) x 100.

8. Western blotting för mätning av tätt knutpunkt protein ZO-1

  1. Cell Lys och protein utvinning
    Anmärkning: alla steg för protein utvinning från celler måste utföras vid 2-8 ° c.
    1. Utsäde cellerna vid en densitet av 50 000 cell/cm2 i en kollagen-belagda 12-well vävnad kultur plattan.
    2. På dag 3, dag 5, dag 7, dag 10 efter sådd och dag 7 (celler förinkuberas med kalcium fritt medium), ta bort odlingsmediet och tvätta försiktigt cellerna två gånger med 2 mL iskall 1x PBS. Tillsätt sedan 300 μL blandning av iskall 1x RIPA lysis buffert som innehåller 3 μg/mL aprotinin i varje brunn.
      Obs: blandningen ska vara nygjord och förvaras på is. Aprotinin används för att hämma proteaser som finns i celllysat från att försämra proteinet av intresse.
    3. Efter två frys-Thaw cykler (-80 ° c), skrapa cellerna med hjälp av en kall plast cell skrapa. Samla in cellen celllysat i mikrofugrör rör. Centrifugera sedan rören vid 200 x g i 30 minuter vid 4 ° c.
    4. Samla supernatanten i rena rör och placera dem på isen. Mät den totala mängden cellulärt protein i lysaterna med hjälp av BCA-analyssatsen genom att följa tillverkarens protokoll.
  2. Western blotting för detektering av tight Junction protein ZO-1
    1. Denature-portioner av totalt homogena innehållande 40 μg totalt protein med 1x Laemmli buffert vid 95 ° c, 5 min och föremål för elektrofores i en reducerande 6-7.5% natriumdodecylsulfat polyakrylamid gel (SDS-sida) (90 V, 10 min genom stapling gel, 120 V genom att lösa geler).
      Obs: när du laddar proverna eller standarder, kom ihåg att ladda långsamt och försiktigt i varje körfält, är noga med att inte bryta brunnen i processen.
    2. Överför de separerade proteinerna till ett nitrocellulosamembran med pH 8,5 överföringsbuffert som innehåller 192 mM glycin, 25 mM Tris bas, 10% metanol och 0,1% SDS (75 V, 110 min vid rumstemperatur).
      Vidrör inte membranet. Använd 70% isopropanol-tvättad plast tång för att hantera membranet. För att framgångsrikt överföra ZO-1 protein (MW 200 kDa) till membranet, pH bör vara runt 8.3-8.5. Om överföringbufferten är surare än så skulle överföringen inte ske. Om stegen banden är synliga fortfarande på gelen, skulle det vara bra att öka överföringstiden och SDS koncentration.
    3. Efter tvättning av membranet med hjälp av Tris-buffrad saltlösning som innehåller 0,1% Tween 20 (T-TBS), Använd blockerande lösning (1:1 LiCOR-Odyssey block: 1x Tris buffrad saltlösning) för att blockera membranen för 60 min.
    4. Skär försiktigt in membranet i två remsor. Inkubera med två primära antikroppar (ZO-1 monoklonal antikropp, spädning, 1:900 och glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) antikropp, spädning, 1:10 000) över natten vid 4 ° c. Sedan, inkubera i ZO-1 och GAPDH membran med åsna anti-mus IgG (utspädning, 1:50000). Efter tvättning membranen med hjälp av T-TBS, bild membranen i 700-kanalen på en 16-bitars Imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Först bestämde vi effekten av odling tid på LY permeabilitet för att bestämma den skenbara kinetik av TJ formation. Medelvärdet för P-appens värden från dag 1 till 10-post sådd visas i figur 2A. På dag 1 var medelvärdet för P-appen 4,25 x 10-4 cm/min och sjönk något till 3,32 x 10-4 cm/min på dag 2. Det genomsnittliga Papp- värdet ökade något till 3,93 x 10-4 cm/min på dag 3 och fluktuerade utan signifikanta förändringar fram till dag 6. Papp värden minskade signifikant till 2,36 x 10-4 cm/min på dag 7 jämfört med dag 1 (P < 0,05) förmodligen tyder på att barriären blev hårdare. Papp värden stabiliserades i intervallet mellan 2,14 x 10-4 och 2,36 x 10-4 cm/min från dag 7 till dag 10, vilket innebar att barriären bildandet var komplett och funktionell resulterar i minskade ly paracellulära transport. Vi beräknade procentandelen (%) Varje dag för att vara ca. 80%, ett värde som anses optimalt för att tillförlitligt beräkna Papp värde27 (FiGure 2b). Recovery% är ett viktigt index i LY assay. Till exempel, om celler metabolisera mest LY, är LY immobiliseras i celler eller pinnar till cellmembranet eller LY försämras under inkubering, skulle det vara felaktigt att tolka att observerade låg LY signal i basolaterala facket indikerar en stram barriär. Sålunda, Recovery% ger mer förtroende för att vi inte förlora betydande belopp av LY på grund av en eller flera av ovanstående möjligheter och gör det möjligt att tryggt uppskatta LY Papp värden. Som nämnts tidigare i inledningen avsnitt, större koncentrationer av LY i basolaterala sidan indikerar en ofullständig barriär medan lägre koncentrationer återspeglar begränsad transport, vilket tyder på en mogen, komplett barriär på grund av närvaron av funktionella Tjs. Vi presenterar också ytterligare bevis med hjälp av en ortogonala teknik, Western blotting detektion av ZO-1 protein (figur 4), för att bekräfta att de observerade förändringarna i ly Papp korrelerar med bildandet av snäva korsningar.

Eftersom transwell infoga installationen inte tillåter att direkt spåra förändringar i celltäthet, vi fastställt förändringar i celltäthet med hjälp av en standard Trypan blå uteslutnings analys. Vi bestämde därför förändringarna i celltäthet på en transparent vävnad kultur tallrik som lätt tillät oss att övervaka celltillväxt kinetik. Ökningen av celltäthet från 5,5 ± 1,0 x 104 celler/cm2 till 1,9 ± 0,2 x 105 celler/cm2 från dag 1 till 10-post sådd (figur 3) var linjär med en regressionskoefficient på 0,94. Dessa data tyder också på att de observerade förändringarna i ly Papp (figur 2A) är ett resultat av bildandet av en konfluenta enskiktslager under 10-dagarsperioden. Vi observerade cellerna under ett inverterat ljusmikroskop på varje dag och visuellt dokumenterade en gradvis ökning av cell nummer och enskiktslager formation.

Vi använde Western blotting att upptäcka förändringar i uttrycket av den snäva knutpunkten protein ZO-1 över tid (figur 4). Förändringarna i ZO-1 uttryck används för att ortogonalt komplettera LY Papp data och för att säkerställa att de observerade förändringarna i ly papp indikerar bildandet av en stram barriär. ZO-1 band intensiteter analyserades av densitometri och normaliserades i förhållande till uttrycket av en städ-genen, GAPDH. De två banden i figur 3a representerar de två isoformerna för zo-1 (zo-1α+ och zo-1α-)28. Densitometri analys visade att pixelvärdet av ZO-1 ökade från dag 3-7 efter sådd, vilket tyder på att TJ proteinet ZO-1 bildas kontinuerligt från dag 3-7. Efter kalcium utarmning behandling på dag 7 post-seeding, bandet av ZO-1 var nästan omöjlig att upptäcka, vilket tyder på att ZO-1 inte kunde bildas i avsaknad av kalciumjoner. Dessutom minskade pixelvärdet av ZO-1 markant vid dag 10 efter sådd. Signalintensiteten hos GAPDH från dag 3-10 syntes var jämförbar, utom på dag 7 när cellerna behandlades med kalcium fritt medium. En möjlig orsak till det lägre GAPDH-uttrycket i kalcium-behandlade celler kan bero på det mindre totala proteinet (28,9 μg totalt protein), återigen, sannolikt på grund av kalcium utarmning. Sammantaget avslöjade bandet densitometry analys en gradvis ökning av ZO-1 uttryck (i förhållande till GAPDH) fram till dag 7 och en minskning av uttryck på dag 10 när celler odlade i komplett odlingssubstrat. Analysen avslöjade också ett lägre uttryck av ZO-1 (i förhållande till GAPDH) på dag 7 i celler som behandlats med kalcium fritt medium.

Medan fokus för detta arbete är att presentera ly Papp analysen som en metod för att bestämma kinetik av en enskiktslager formation, för att demonstrera en ytterligare nytta av den utvecklade analysen, vi bestämde om DNA NP transfektion påverkat tj barriären integritet genom att mäta LY P-appen genom hcmec/D3-celler 4 h efter transfektion (figur 5). Vårt DNA NPs innehåller poloxamer P84 förmedlar höga nivåer av genuttryck i den svårtransfect hCMEC/D3-celllinjen (figur 6a). Specifikt ville vi avgöra om hydrofoba domäner poloxamer P84 i vårt DNA NPS kan stör tj integritet i transfekterade celler. % LY återhämtade sig i varje behandlingsgrupp var ca. 92%, vilket tyder på att de beräknade Papp värden är tillförlitliga (Figur 5b). Vi noterade att transfektion förfarande med hjälp av olika formuleringar påverkade inte den LY Papp, i förhållande till icke-transfected celler utsätts för ly Alone. Extracellulära kalcium är en kritisk komponent för upprätthållandet av cell-cell korsningar i olika celltyper29,30,31, inklusive hjärnan mikrokärl endotelceller. Sålunda, bibehålla celler i kalcium fritt medium (cfm) leder till störningar av TJS32,33. Därför använde vi celler behandlade med CFM för 24 h som en positiv kontroll.

Våra data visar att LY P-appen för celler som inkuberats med cfm var 2-faldigt högre jämfört med kontrollceller som inkuberades med det vanliga odlingsmediet. Detta 100% ökning av Papp antyder att cellerna hade förlorat sina TJS på grund av förlusten av kalciumjoner som behövs för dess bildande. Särskilt det faktiska värdet (5,14 x 10-4 cm/min) var något högre än den genomsnittliga Papp värde från dag 1-6 post sådd (figur 2) när TJS var ännu inte helt bildas. Om än inte signifikant, celler som transfekterade med DNA NP innehåller 0,01-0,03% poloxamer P84 visade en liten ökning i ly Papp värden jämfört med obehandlade celler upprätthålls i vanliga odlingssubstrat. Denna observation föreslog att DNA NP + P84 transfektion inte hade någon signifikant effekt på TJ barriär integritet. Sammantaget den ly Papp värden i transfekterade celler ungefär i genomsnitt 2,5 X10-4 cm/min och detta värde motsvarade det genomsnittliga värdet noteras under dag 7-10 efter sådd (figur 2) när ly Papp var minst, tyder på närvaron av funktionella TJs som effektivt begränsade LY paracellulär transport.

Vi presenterar ytterligare transfektion data för att visa att avsaknaden av förändringar i LY Papp (figur 5) är inte en okonsekvens observation. Trots de höga halter av transfektion observerats i DNA NPS + P84 grupp, noterade vi inga förändringar i ly Papp tyder på att våra formuleringar inte stör den tj barriären. Den relativt låga transfektionseffektiviteten i de nakna DNA-behandlade cellerna är typisk eftersom den anjoniska karaktären av plasmid-DNA (på grund av fosfatgrupper i ryggraden) och dess hydrofila natur begränsar cellernas upptag. DNA kondenserat i DNA NP medierade en 50-faldig ökning av transfektion jämfört med naken pDNA (figur 6). Tillägg av 0,01% P84 till DNA NP resulterade i en 18-faldig ökning jämfört med enbart DNA NP (P < 0,01). Öka P84 koncentrationen till 0,03 WT.% resulterade i en 30-faldig ökning jämfört med DNA NP-ensamt (P < 0,001). Dessa resultat är anmärkningsvärt med tanke på att hjärnans endotelceller är en svår att transfect celltyp.

Vi mätte cellernas genomförbarhet av celler som transfekterade under olika förhållanden för att bekräfta att transfektioningreppet inte orsakar cell stress. Adenosintrifosfat (ATP) är energi valutan i livet och återspeglar cellulära metabolisk funktion. Vi använde en luciferase-baserade ATP-test där luminiscens värden är direkt proportionella till ATP-nivåer. Possimo et al. rapporterade att luminiscens ATP-analysen var ett robust mått på metabolisk cellviabilitet34. Cellernas livskraft hos hcmec/D3-celler som transfekterade av de olika formuleringarna var jämförbar med obehandlade celler (Figur 5b), vilket tydde på att ATP-nivåerna var likartade också. Därför är DNA NPs som innehåller poloxamer P84 (0,01% till 0,03% w/w) säkra gen leverans formuleringar.

Figure 1
Figur 1 . Experimentell inställning för ly P -appen studie. 24-brunn plattan setup innehållande transwell skär (anpassad för att Visa DNA nanopartiklar transfektion som ett exempel, data i figur 5). Varje kolumn behandlades med det angivna provet för 4 h. kontroll indikerar att hCMEC/D3-celler behandlade med komplett odlingssubstrat medan kalcium förlust 24 h indikerar att cellerna inkuberades med kalcium fritt medium före exponeringen. I den högra mallen avbildas ly fluorescens-intensitetsmätningen i en svart 96-brunplåt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Skenbar kinetik för bildning av tj-barriären fastställd med hjälp av -appen analysen. (a) (Nacka) app genom hcmec/D3 enskiktslager odlade på transwell skär mättes vardagliga efter sådd celler. b)% ly återhämtade sig i varje behandlingsgrupp. Data representerar medelvärdet ± SD av två oberoende experiment (n = 3/experiment). Statistiska jämförelser gjordes med hjälp av icke-parade t-test (*P< 0,05, ns inte signifikant). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 3
Figur 3 . Kinetik av celltillväxt bestäms med hjälp av en Trypan blå uteslutnings analys. hCMEC/D3 celler var seedade i en 24-brunn tallrik vid en celltäthet av 50 000 celler/cm2. På varje dag av experimentet, celler dissocierades och blandas med en lika volym av 0,4% Trypan blå innan du räknar livskraftiga celler på en hemacytometer. Data motsvarar medelvärdet ± SD av tre oberoende mätningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Skenbar kinetik av zo-1 uttryck detekteras med Western blotting. a)hcmec-/D3-cellerna har seedats i en 12-välsplattan med en celltäthet på 50 000 celler/cm2. På varje dag av experimentet (dag 3, dag 5, dag 7 och dag 10-post seedning), var celler lyserat av 400 μl 1x Ripa buffert som innehåller 3 μg/ml aprotinin. Cell celllysat innehållande 40 μg totalt protein laddades på en 4-7.5% SDS-polyakrylamidgel. b) band densitometry-analys tillät normaliserande uttryck av zo-1-protein till GAPDH. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5 . Effekter av DNA NP transfektion på tj Barrier täthet mätt med hjälp av ly P -appen analysen. (a) hcmec/D3-celler odlades på transwell-skär i 7 dagar, transfekterade med PEG-det som innehåller gwizluc plasmid-DNA med/utan Pluronic P84 för 4 h och ersätts sedan med förvärmd transportbuffert som innehåller 50 μm ly för 1 h. kontroll representerar hCMEC/D3-cellerna inkuberas med odlingssubstrat för 4 timmar följt av LY Exposure (n = 4, *P< 0,05, ns inte signifikant). b)% ly återhämtat sig i varje behandlingsgrupp, värden som presenteras är genomsnittliga ± SD (n = 4). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 6
Figur 6 . DNA NPS förmedlar höga nivåer av transgener uttryck i hcmec/D3 enskiktslager. a) hcmec/D3-celler odlades 7 dagar och transfekterade med PEG-det som innehåller gwizluc plasmid-DNA med/utan Pluronic P84 (N/P 10, DNA-dos per brunn: 0,5 μg) för 4 timmar, avlägsnades transfektion och cellerna odlades i 24 timmar i fullständig tillväxt medium före mätning av genuttryck. Nivåer av luciferas genuttryck uttrycktes som relativ ljusenheter (RLU) nornalized till totalt cellulärt proteininnehåll. Data visar medelvärdet ± SD av tre oberoende experiment. Statistiska jämförelser gjordes med hjälp av ej parade t-test (* * p< 0,01, * * * P< 0,001). (b) DNA NPS är säkra transfektionsformuleringar i hcmec/D3 monolayers. Effekterna av DNA-DNA NP-transfektion på cellernas lönsamhet utvärderades med hjälp av en självlysande ATP-analys. hcmec/D3-celler transfekterade med de angivna proverna under 4 timmar efter vilka ATP-analysen utfördes genom att följa tillverkarens protokoll. Procent (%) cellernas lönsamhet beräknades på följande sätt: (Luminescens av transfekterade celler/Luminescens av kontroll, obehandlade celler) x100. Data representerar medelvärdet ± SD av två oberoende experiment (n = 3/experiment). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Experimentell installation Exempel namn Volym på 1 mg/mL plasmid-DNA (μL) Volym 10 mM NaAc-buffert, pH 5 (μL) Volym på 5 mg/mL polymer (μL) Volym på 10 viktprocent P84 (μL) Volym av odlingssubstrat (μL)
Vävnads kulturen infogaren Kontroll, obehandlade celler 0 0 0 0 58,3
Nakna DNA 0,157 8,143 50
DNA NP 7,843 0,3
DNA NP + 0,01% P84 7,6681 0,1749
DNA NP + 0,03% P84 7,26 0,0583
48-bra skylt Kontroll, obehandlade celler 0 0 0 0 175
Nakna DNA 0,5 24,5 150
DNA NP 23,56 0,94
DNA NP + 0,01% P84 23,385 0,175
DNA NP + 0,03% P84 23,035 0,525
96-bra skylt Kontroll, obehandlade celler 0 0 0 0 68,1
Nakna DNA 0,195 58,4
DNA NP 9,35 0,37
DNA NP + 0,01% P84 8,9307 0,0681
DNA NP + 0,03% P84 9,0669 0,2043

Tabell 1. De NP-formuleringar som används för att erhålla de rapporterade uppgifterna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En viktig roll för BBB är att förhindra utbyte av icke-väsentliga joner och giftiga ämnen mellan den systemiska cirkulationen och hjärnan för att upprätthålla hemostas av neurala mikromiljö. En av de karakteristiska dragen i BBB är förmågan hos de kapillära endotelceller att bilda snäva korsningar (TJs) som effektivt tätar paracellulär transportväg. Vi visade en LY Papp- analys som en kvantitativ metod för att bestämma den skenbara KINETIKEN av tj barriär bildning i odlade hcmec/D3 monolayers. ZO-1 uttryck detekteras via Western blotting ortogonalt validerade data från LY Papp studier som diskuteras i detalj i följande stycke. Som en ytterligare nytta av den utvecklade analysen, vi ytterligare visat att DNA NP transfektion inte mätbart ändra LY Papp visar lämpligheten av denna analys för att avgöra förändringar i tj barriäregenskaper i en experimentell installation.

Western blot-data avslöjade en tydlig ökning av zo-1-uttrycket på dag 3, 5, 7-post seedning och en liten minskning på dagen 10-post sådd (figur 4a). Från figur 1, kan man se att den ly Papp minskade från dag 1-7 post-seeding tyder på bildandet av TJS. Efter behandling med kalcium utarmning visade LY P-appen en markant ökning (figur 2A), medan zo-1-uttrycket uppvisade en markant reduktion (figur 4a). Extracellulära kalcium är en kritisk komponent för upprätthållandet av cell-cell korsningar i olika celltyper29,30,31, inklusive hjärnan mikrokärl endotelceller. Brist på kalcium i tillväxt mediet störs och dissocierade TJs33. Som förväntat, Papp värdet av kalcium-utarmade celler var signifikant högre än de obehandlade cellerna och nära Papp värdet av de tomma skär som innehåller inga celler (figur 2A). Den LY avslöjade en stadig platå i Papp värden från dag 7-10 efter sådd (figur 2A) tyder på att barriären helt hade bildats av dag 7 som resulterade i begränsad transport till basolaterala sidan. Den Western blot data visade en liten minskning av ZO-1 uttryck på dag 10 jämfört med dag 7-post seeding. Denna skillnad i observation är sannolikt på grund av bidraget från andra extracellulära proteiner, bortsett från ZO-1, att bibehålla barriär täthet. Sammanfattnings, har vi framgångsrikt använt data från två ortogonala tekniker för att bestämma kinetik av snäva korsningen barriär bildning i en mänsklig cell modell av BBB. Medan LY Papp analysen mätt funktionaliteten i tj barriären, den västra blot data spåras bildandet av TJS med zo-1 som ett markör protein.

Som en ytterligare nytta av den utvecklade analysen bekräftade vi att DNA NP transfektion i hcmec/D3 enskiktslager inte påverkar integriteten hos TJS (figur 5). Obehandlade celler som inkuberats med odlingssubstrat användes eftersom den negativa kontrollen och cellerna som förinkuberades med kalcium fritt medium för 24 timmar användes som en positiv kontroll. Celler där TJs stördes till följd av kalcium utarmning visade en 210% ökning i LY Papp jämfört med obehandlade celler. Våra data tyder på att DNA NP transfektion antingen i närvaro eller frånvaro av P84 påverkar inte TJ integritet. Det bör noteras att avsaknaden av ly Papp förändringar i transfekterade celler är inte en obetydlig observation. I själva verket, vår DNA NPS medla betydande nivåer av genuttryck i den svåra att transfect hcmec/D3 enskiktslager9,35,36,37. DNA NPs som innehåller 0,01 eller 0,03 WT.% P84 ökade luciferasgenuttryck med ca. 18-respektive 30-faldigt, jämfört med enbart DNA NPs (figur 6a). Vi visade också att våra NP-behandlingar inte inverkar negativt på de cellulära ATP-nivåerna, som används här som en indikator på funktionell cellviabilitet (figur 6b). Våra resultat understryker den utökade nyttan av denna LY Papp analys för att bestämma tj barriär integritet i en experimentell transfektion setup.

Ett kritiskt steg i utförandet av den LY analysen är att hålla samma mängd LY i apikala sidan och lika stor mängd transportbuffert i den basolaterala sidan över de olika tidpunkter i hela experimentet. Om olika mängder av LY eller ojämlika volymer av transportbuffert användes i brunnar, skulle beräkningen av Papp vara opålitliga, vilket resulterar i artificiellt stora standardavvikelser. En annan kritisk aspekt är att begränsa ljusexponeringen för att minimera sönderfallet av LY fluorescens intensitet. Också, vätskan måste avlägsnas helt innan du lägger exakt samma volym av LY lösning och transport buffert i apikala sidan och basolaterala sidan, respektive. Detta säkerställer att fluorescensavläsning kan användas på ett tillförlitligt sätt för P-appberäkning . Ett annat kritiskt steg i detta experiment är att omedelbart mäta de basolaterala proverna och undvika behovet av att frysa proverna efter insamling. Att utsätta de ly-innehållande proverna för att frysa-Tina cyklar resulterar i en större intra-Group variation av fluorescens signalerar. En begränsning av att använda transwell setup är att de levande cellerna är svåra att visualiseras genom konventionell mikroskopi eller avbildas av konfokalmikroskopi. Dessutom är det inte lätt översätta till en setup som tillåter samtidig odling av olika celltyper om inte blandade odling av säga, gliaceller och endotelceller är en möjlighet. Ändå, den LY analysen har följande fördelar: LY är ett färgämne med distinkta excitation/utsläpp toppar och en relativt stor Stokes förskjutning jämfört med färgämnen som natrium fluorescein, vilket möjliggör en robust mätning av sonden korsar BBB och undviker behovet av ytterligare radiomärkas som i fråga om spårämnen såsom sackaros eller mannitol. Hög återhämtning% s av LY ger tillförlitlig data för att tryggt beräkna Papp värden.

Baserat på våra resultat, drar vi slutsatsen att LY Papp metoden är en enkel och robust analys för att kvantifiera paracellulär permeabilitet över hcmec/D3 cell monolayers. Genom att använda LY Papp Metod, vi optimerat kulturen tid för bildandet av intakt barriär, och vi visade en ytterligare nytta av den utvecklade analysen genom att fastställa tj integritet i DNA NP-transfected cell monolayers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma för det ekonomiska stödet från 2017 New Investigator Award från American Association of Pharmacy, en Hunkele fruktade Disease Award från Duquesne University och School of Pharmacy start-up medel för Manickam Laboratory. Vi vill tacka Läckagelaboratoriet (Duquesne University) för Western blotting hjälp och tillåta användning av deras Odyssey 16-bitars Imager. Vi skulle också vilja inkludera en särskild anteckning om uppskattning för Kandarp Dave (Manickam Laboratory) för hjälp med Western blotting.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability? European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. The Blood-Brain Barrier. , Springer. 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).
  25. Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).

Tags

Bioteknik Lucifer gul paracellulär permeabilitet blod-hjärnbarriären hCMEC/D3 DNA nanopartiklar transfektion.
Lucifer Yellow-en robust Paracellulär permeabilitet markör i en cell modell av den mänskliga blod-hjärnbarriären
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, W., Han, L., Bae, Y.,… More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter