Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري

Published: August 19, 2019 doi: 10.3791/58900
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical, Administrative and Social Sciences, Duquesne University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky

Summary

نقدم اختبار الفلورة لإثبات أن لوسيفر الأصفر (LY) هو علامة قوية لتحديد نفاذية شبه الخلايا الظاهرة من الخلايا أحادية hCMEC /D3، وهو نموذج في المختبر من حاجز الدم والدماغ البشري. استخدمنا هذا الفحص لتحديد حركية تشكيل أحادي الطبقات في خلايا hCMEC/D3 المستزرعة.

Abstract

يتكون حاجز الدم في الدماغ BBB من الخلايا البطانية التي تشكل حاجزا بين الدورة الدموية الجهازية والدماغ لمنع تبادل الأيونات غير الضرورية والمواد السامة. تقاطعات ضيقة (TJ) ختم فعال الفضاء شبه الخلوية في الطبقات الأحادية مما أدى إلى حاجز سليمة. تصف هذه الدراسة فحص الفلورة القائم على LY التي يمكن استخدامها لتحديدمعامل نفاذية واضحة (P التطبيق) وبدورها يمكن استخدامها لتحديد حركية تشكيل الطبقات الأحادية المطابقة وتقاطع ضيق الناتجة سلامة الحاجز في الطبقات الأحادية hCMEC/D3. كما نبرهن على فائدة إضافية من هذا الاختبار لتحديد السلامة الوظيفية TJ في الخلايا المنقولة. بياناتنا من LY Pالتطبيق فحص يظهر أن الخلايا hCMEC / D3 البذر في إعداد transwell تحد بشكل فعال LY النقل شبه الخلوي 7 أيام بعد الثقافة. كفائدة إضافية من فحص المقدمة، ونحن نثبت أيضا أن نقل الجسيمات النانوية الحمض النووي لا يغير LY النقل شبه الخلوي في الطبقات الأحادية hCMEC/D3.

Introduction

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو الحاجز الوقائي الذي يحد من تدفق مكونات البلازما إلى أنسجة الدماغ ويتكون من خلايا بطانة الدماغ جنبا إلى جنب مع الخلايا الداعمة مثل pericytes. الدور الرئيسي لBBB هو أن تكون بمثابة الحاجز الذي يختم المسافة بين الدم المحيطي والجهاز العصبي المركزي (CNS) للحفاظ على الهيموسات من البيئة الدقيقة العصبية1،2. الخلايا البطانية الشعرية في الدماغ ختم المسار شبه الخلوي بشكل فعال عن طريق تشكيل تقاطعات ضيقة بين الخلايا (TJs)1. هذا الحاجز الواقي يسمح الجلوكوز والمواد الغذائية المختارة لدخول الدماغ في حين أنه يمنع غالبية الأيونات والمواد السامة والأدوية من المرور من خلال هذا الحاجز الضيق. وإلى جانب الدور الوقائي الذي يضطلع به المكتب، فإن وظيفة الحاجز الطبيعي لـ BBB تشكل تحديا ً شديداً في تطوير نظم إيصال المخدرات التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي.

في المختبر نماذج زراعة الخلايا من BBB هي أدوات مفيدة لدراسة البيولوجيا وفهم آثار العلاج من المخدرات على سلامة حاجز TJ. استخدمنا خط الخلايا البطانية الأوعية الدموية المجهرية الدماغية البشرية (hCMEC/D3) كنموذج في المختبر لأنه نموذج مقبول من بطانة الدماغ البشري3 ويلخص العديد من وظائف BBB البشرية. hCMEC /D3is واحدة من خطوط الخلايا الأكثر استخداما لنمذجة BBB في المختبر4،5،6،7،8،9. على الرغم من قيمها المنخفضة نسبيا من المقاومة الكهربائية عبر الانعندوات (TEER)، وهو مقياس لضيق الحاجز، يحتفظ هذا الخط الخلوي بمعظم الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا البطانية الدماغية، حتى كثقافة أحادية في غياب الخلايا الغليفية المشتركة الثقافة6،7. خط الخلية hCMEC /D3 يعبر عن علامات BBB متعددة بما في ذلك الناقلين النشطين والمستقبلات حتى مرور ما يقرب من 35 دون الخضوع للتمييز إلى الأنماط الظاهرية غير المستقرة6و7و9 ،10،11. السمة الأكثر لفتا للانتباه من خط الخلية hCMEC / D3 كنموذج BBB في المختبر هو قدرته على تشكيل TJs5،9،11،12. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن نماذج BBB المشتقة من الخلايا الجذعية أظهرت نفاذية أعلى في العديد من الدراسات مقارنة مع خط الخلية hCMEC/D3 وأنها لا تعبر عن بعض علامات BBB، فإنها لم تتطور بعد كنموذج الخلية BBB الأكثر شيوعا13. الأهم من ذلك، لا تزال نماذج BBB المشتقة من الخلايا الجذعية تتميز فيما يتعلق بأرقام المرور القصوى التي تسمح للخلايا للحفاظ على الأنماط الظاهرية BBB مستقرة14.

وتستخدم عادة ثلاث طرق أولية لتحديد سلامة حاجز TJ، بما في ذلك قياس TEER،وقياس معامل نفاذية واضح (P التطبيق) من جزيئات التتبع المائية الصغيرة مثل السكروز، الإينولين، لوسيفر الأصفر، الخ والمناعة من علامات الجزيئية المعروفة من TJs مثل claudin-5، ZO-1، occludin، الخ5. TEER هو طريقة بسيطة نسبيا وكمية أن يقيس المقاومة الكهربائية عبر أحاديةالخلية المستزرعة على الركيزة غشاء مسامية 5. ومع ذلك، يمكن أن تتأثر قيم TEER بالمتغيرات التجريبية مثل تكوين وسط الثقافة ونوع أداة القياس. مزيج محتمل من هذه العوامل يؤدي إلى توزيع واسع من قيم TEER تتراوح بين 2 إلى 1150 Ω سم2 في خط الخلية hCMEC /D3 المستزرعة لمدة 2-21 يوما13. تلطيخ المناعة هو طريقة بصرية لتحديد وجود بروتينات TJ عن طريق وضع العلامات على البروتين المستهدف باستخدام الأجسام المضادة. ومع ذلك، ينطوي التلطيخ المناعي على سلسلة من الخطوات التجريبية، بما في ذلك الحاجة إلى إصلاح/نفاذية الخلايا التي قد تؤدي إلى قطع أثرية تجريبية وإشارات الفلورسنت قد تتلاشى مع مرور الوقت. قد تؤدي العوامل المذكورة أعلاه إلى أخطاء ذاتية تؤثر على جودة البيانات.

التركيز الرئيسي لهذا العمل هو تقديم فحص نفاذية واضحة تستند إلى LY تحديد حركية تشكيل أحادي الطبقات المنافي في الخلايا المستزرعة hCMEC/D3. على الرغم من أن أنظمة BBB المتقدمة الأخرى في المختبر، مثل أنظمة الثقافة المشتركة، وأنظمة السوائل الدقيقة، هي من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية يحاكي مع وظيفة حاجز تحسنت بشكل كبير15،16،17،hCMEC /D3 transwell الإعداد هو نموذج بسيط وموثوق بها لتقدير حركية تشكيل TJ وفرز بسرعة تأثير تركيبات المخدرات المختلفة على وظيفة الحاجز. بشكل عام، قيمالتطبيق P متسقة لمختلف solutes المائية في الطبقات الأحادية hCMEC/D3. على سبيل المثال، قيمالتطبيق P المبلغ عنها لمختلف solutes الكتلة الجزيئية المنخفضة المختلفة (مثل السكروز، مانيتول، LY، الخ) في مختلف نماذج BBB في المختبر هي في ترتيب 10-4 سم / دقيقة5،18،19 , 20.في الإعداد التجريبي لدينا، يتم بذر الخلايا البطانية الدماغ على غشاء ميكرومبوروس المغلفة بالكولاجين لتعلق الخلية وتشكيل أحادية الطبقة لتقليد الحاجز في الجسم الحي. وأضاف LY في الجانب apical ومن المتوقع أن اجتياز التقاطعات الضيقة بين الخلايا وتتراكم في الجانب الباضلي. وتشير تركيزات أكبر من LY في الجانب الباضيلي إلى وجود حاجز غير ناضج وغير عملي بالكامل، في حين تعكس التركيزات المنخفضة النقل المقيد بسبب وجود TJs وظيفية مما يؤدي إلى حاجز ناضج.

LY هو صبغة مائية مع قمم الإثارة / الانبعاثات متميزة ويتجنب الحاجة إلى جزيئات تتبع العلامة الراديوية مثل السكروز، مانيتول أو الإينولين. وهكذا، يمكن استخدام قيم الفلورة من LY لحساب نفاذية شبه الخلوية مباشرة عبر الطبقات الأحادية BBB. أيضا، بالمقارنة مع العديد من الأصباغ المتاحة تجاريا المستخدمة في المجالات الطبية الحيوية التي تعاني من التحولات ستوكس الصغيرة مثل الفلورسين21،تحول ستوكس من LY حوالي 108 نانومتر مع فصل الطيفية كافية، مما يسمح LY البيانات الفلورية باعتبارها قراءة قوية لتحديد نفاذية شبه الخلوية. استخدمنا النشاف الغربي كتقنية متعامدة لإظهار التغيرات في التعبير عن البروتين علامة تقاطع ضيق، ZO-1، على مدى وقت الثقافة. يتم استخدام التعبير ZO-1 الكشف عن طريق النشاف الغربية لتكملة بياناتالتطبيق LY P وجنبا إلى جنب، وتشير هذه البيانات إلى أن التغييرات التي لوحظت في قيمالتطبيق LY P يعكس تشكيل طبقة أحادية مع زيادة تدريجية في التعبير عن علامة تقاطع ضيق، ZO-1.

وكما أشير في وقت سابق، فإن التركيز الرئيسي لهذا العمل هو إظهار اختبار LY كتقنية بسيطة لرصد تشكيل طبقة أحادية المنافية مع تقاطعات ضيقة وظيفية. ومع ذلك، لإظهار فائدة إضافية من اختبار المتقدمة، قمنا بقياسالتطبيق LY P في الحمض النووي نانوجسيم transfecd hCMEC / D3 أحادية الطبقات. يمكن تكثيف الأحماض النووية في جسيمات نانوية متعددة الكهرباء بقطر 100-200 نانومتر عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي بين مجموعات البوليمرات المشحونة بشكل إيجابي ومجموعات الفوسفات المشحونة سلبا من الأحماض النووية22، 23.نشير إلى هذه المجمعات كجسيمات نانوية الحمض النووي (DNA NPs) في عملنا. في حين أن نيتنا هي نقل الخلايا والتعبير عن البروتين المطلوب، يجب علينا أن نضمن عدم المساس بخصائص الحاجز من الطبقات الأحادية hCMEC/D3. تشير بياناتنا إلى أن نظام الانف الجيني القياسي 4 h luciferase لا يغير بشكل ملموس نفاذية LY مما يدل على فائدة اختبارالتطبيق LY P لتحديد التغييرات في سلامة حاجز TJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.General hCMEC /D3 ثقافة الخلية

  1. إنعاش الخلايا المجمدة
    ملاحظة: تم إجراء جميع صيانة ثقافة الخلايا والتجارب داخل غطاء أمان حيوي معقم. تم شراء وسائل الإعلام الثقافية والمكملات الغذائية والكواشف كمنتجات معقمة أو تعقيمها عن طريق الترشيح باستخدام فلتر غشاء 0.22 م لمنع التلوث الميكروبي.
    1. إضافة 8.5 مل من محلول الكولاجين (0.15mg /mL) في قارورة زراعة الأنسجة (75 سم2 منطقة النمو؛ يشار إليها من الآن فصاعدا باسم T75) ووضعها في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)لمدة 1 ساعة.
    2. إزالة محلول الكولاجين وغسل بلطف قارورة مع معقم الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). أضف 15 مل من وسط النمو الكامل إلى القارورة واتركها في حاضنة CO2 لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: الوسط الكامل (التركيز النهائي) يحتوي على بطانة الخلية النمو القاعدية المتوسطة-2 (500 مل) تستكمل مع مصل البقر الجنين (5٪)، البنسلين-ستربيتوبيسين (1٪)، هيدروكورتيزون (1.4 درجة مئوية)، حمض الاسكوربيك (5 ميكروغرام / مل)، الدهون المعرفة كيميائيا التركيز (1/100)، HEPES (10 MM) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (1 نانوغرام/مل).
    3. نقل الفيع السريع من خلايا hCMEC/D3 المجمدة من خزان النيتروجين السائل وذوبان القارورة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية (< 1 دقيقة).
    4. مرة واحدة فقط رقاقة صغيرة من الجليد مرئية، يستنشق بسرعة ونقل الخلايا إلى قارورة تحتوي على وسط قبل تسخينها. يهز بلطف قارورة للسماح خلط الخلايا مع وسط النمو.
    5. وضع قارورة في الحاضنة (37 درجةمئوية، 5٪ CO 2) ومراقبة الخلايا تحت المجهر الخفيف بعد 2 ساعة للتأكد من أن يتم إرفاق الخلايا.
    6. مرة واحدة الخلايا تعلق على الجزء السفلي من قارورة، وإزالة متوسط النمو القديم وإضافة 10 مل من المتوسطة النمو الطازجة قبل تسخينها لتحل محل ثنائي ميثيل سولفوكسيد في وسط النمو القديم24.
    7. بعد 24 ساعة، تحقق تحت المجهر الخفيف لمراقبة الخلايا على شكل المغزل واستبدال وسط النمو القديم مع متوسط النمو الطازجة قبل تسخينها.
  2. صيانة ثقافة الخلايا
    1. تجديد وسط النمو كل يومين حتى التقاء 100٪. تحقق من الخلايا تحت المجهر قبل إزالة متوسط النمو القديم وأيضا بعد إضافة وسط نمو جديد. إخراج قارورة من الحاضنة وفحص خلايا hCMEC / D3 تحت مجهر التباين المرحلة لضمان أنها تبدو صحية.
      ملاحظة: يجب أن تعلق غالبية الخلايا إلى الجزء السفلي من قارورة، لديها مورفولوجيا على شكل المغزل وفي كثير من الأحيان، وينظر أيضا الانكسار الضوء حول أغشيةها. يجب أن تكون متوسطة النمو شفافة (غير غائمة) والوردي البرتقالي في اللون.
    2. إزالة متوسط النمو القديم من قارورة ونقل 10 مل من المتوسطة الطازجة قبل تسخينها في قارورة.
      ملاحظة: يجب إضافة الوسيط إلى الجانب العلوي من القارورة وليس مباشرة على سطح الخلايا لتجنب التأثير على مرفق الخلية.
    3. تحويل قارورة مرة أخرى إلى موقف أفقي وصخرة بلطف عدة مرات والتحقق من خلايا hCMEC / D3 تحت المجهر قبلإعادة قارورة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
    4. مراقبة الخلايا تحت المجهر الضوئي المقلوب في كل مرة قبل وبعد التعامل مع الخلايا، سواء أثناء العمل الثقافي العادي وخلال التجارب. تسجيل أي تغييرات ملحوظة في رقم الخلية أو مورفولوجيا في دفتر المختبر.
  3. خلية تمرير
    1. احتضان قارورة T75 جديدة مع 8.5 مل من محلول الكولاجين لمدة 1 ساعة فيالحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
    2. إزالة محلول الكولاجين وغسل بلطف قارورة مع PBS معقمة. إضافة 10 مل من hCMEC / D3 قبل تسخينها المتوسطة إلى قارورة جديدة ووضع قارورة فيالحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
    3. إخراج قارورة من الحاضنة وفحص خلايا hCMEC / D3 تحت مجهر التباين المرحلة للتحقق مما إذا كانت الخلايا هي 100٪ مترافق.
    4. إزالة hCMEC / D3 متوسط الخلية من قارورة تحتوي على خلايا وغسل خلايا hCMEC / D3 مع 10 مل من PBS.
      ملاحظة: FBS المضافة إلى متوسط النمو يحتوي على مثبطات البروتياز مثل α1-أنتيتريبسين وα2-ماكروغلوبولين. هذه تمنع عملية التربسيني. وبالتالي، فمن الضروري لغسل الخلايا مع PBS لإزالة آثار FBS لمنع تثبيط عملية التغريب.
    5. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين الحل الذي يحتوي على 0.02٪ EDTA وtrypsinize لمدة2-5 دقيقة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) (اضغط على قارورة بلطف على الجانبين للمساعدة في مفرزة).
      ملاحظة: لا تترك الخلايا على التربسين/EDTA لأكثر من 6 دقائق.
    6. إضافة 10 مل من hCMEC/D3 قبل تسخينها المتوسطة لوقف عملية التربسينية وإعادة تعليق خلية hCMEC/D3 عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات. ثم قم بإزالة تعليق الخلية بالكامل من القارورة إلى أنبوب 15 مل.
    7. نقل 1 مل من تعليق الخلية من أنبوب 15 مل إلى قارورة جديدة مع متوسط الطازجة قبل تسخينها (تقسيم الخلايا 1:10) والعودة قارورة جديدة مرة أخرى إلى الحاضنة.
      ملاحظة: قبل نقل إلى قارورة جديدة، ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا عدة مرات لتقليل التدرجات تركيز الخلية.

2. خلية الطلاء

  1. مكان إدراج ثقافة الأنسجة مع الأغشية المسامية (حجم المسام: 0.4 م، المواد: البولي ايثيلين تيريفثالات (PET)) في لوحة ثقافة 24 جيدا.
  2. إضافة 400 درجة مئوية من الكولاجين من النوع الأول (0.15 ملغ / مل) في كل إدراج ثقافة الأنسجة وحضانة لمدة 1 ساعة في حاضنة CO2 (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). هز لوحة 24 جيدا بلطف للسماح حتى انتشار محلول الكولاجين على الغشاء المسامي في إدراج ثقافة الأنسجة.
  3. إزالة محلول الكولاجين وغسل بلطف غشاء microporous مع 0.4 مل من 1X PBS العازلة.
  4. خلايا hCMEC/D3 ذات الكثافة 50,000 خلية/سم2 في الخلية إدراج (15,000 خلية في 500 ميكرولتر من المتوسط).
    ملاحظة: لتقليل الاختلافات في رقم الخلية في كل إدراج زراعة الأنسجة، تم إعادة تعليق تعليق الخلية مع ماصة 10 مل قبل إضافة الخلايا إلى إدراج.
  5. ضع اللوحة ذات الـ 24 بئرًا مع إعداد زراعة الأنسجة في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% ثاني أكسيدالكربون)للسماح بإرفاق الخلايا وانتشارها.
  6. احتضان لوحة لمدة 7 أيام للسماح للخلايا للوصول إلى 100٪ الملاءمة. إزالة متوسط النمو كل يوم ونقل 0.5 مل من وسائل الإعلام الطازجة قبل تسخينها في إدراج ثقافة الأنسجة.
  7. كرر إجراء الطلاء (الخطوات 2.2-2.6) على لوحة 12 جيدا، لوحة 48 جيدا ولوحة 96 جيدا. استخدم لوحة 12 بئرًا للنشاف الغربي لتحديد التغييرات في تعبير ZO-1. استخدام لوحة 48 جيدا لDNA NP التغوط. استخدم لوحة 96-well للحصول على اختبار ATP لتحديد صلاحية الخلايا في الخلايا المنكرة.

3. حركية نمو الخلايا.

  1. بذور الخلايا في كثافة 50،000 خلية / سم2 في الكولاجين المغلفة 24 جيدا لوحة ثقافة الأنسجة.
  2. في كل يوم من التجربة، قم بإزالة متوسط النمو وغسل الخلايا بلطف مرتين مع 500 درجة مئوية من 1x PBS. ثم، إضافة 30 درجة مئوية من 0.25٪ التربسين الحل الذي يحتوي على 0.02٪ EDTA وترك لوحة لحوالي2-5 دقيقة في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
    ملاحظة: قد يؤثر التشكيل التدريجي للطبقة الأحادية المنافية على مدى انفصال الخلايا، ومن الضروري زيادة كميات التربسين/EDTA على النحو المبين هنا: 30 ميكرولتر لمدة 1-5 أيام بعد البذر، و60 ميكرولتر لمدة 6-7 أيام بعد البذر، و100 يورو لتر لمدة 8-10 أيام بعد البذر .
  3. إضافة إما 470 μL، 440 درجة مئوية أو 400 درجة مئوية من متوسط النمو على أساس حجم التربسين / EDTA الحل المضافة في الخطوة 3.2 لإعداد 500 درجة مئوية من تعليق الخلية في كل بئر.
  4. تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في كل بئر عدة مرات ومراقبة الخلايا تحت المجهر للتأكد من تعليق جميع الخلايا في وسط النمو. إذا كانت بعض الخلايا لا تزال تعلق على أسفل لوحة بعد الأنابيب عدة مرات، كشط بلطف الخلايا باستخدام مكشطة الخلية البلاستيكية لتسهيل انفصال الخلية.
  5. إزالة 0.1 مل من تعليق الخلية من تعليق الخلية 500 درجة مئوية في الخطوة 3.3 وإضافة إلى أنبوب 1.5 مل. ثم، إضافة 0.1 مل من 0.4٪ تريبان الحل الأزرق إلى تعليق الخلية ومزيج جيدا.
  6. تنظيف مقياس الهيماسيمع الكحول isopropyl 70٪. إضافة 20 درجة مئوية من الخليط من الخطوة 3.5 على كل جانب في الأخدود الخامس وتحديد موقع المربعات 16 تحت المجهر. وتعتبر المربعات الـ 16 شبكة واحدة. حدد موقع شبكتين عشوائيتين على كل جانب من مقياس الهوة وعد جميع الخلايا الحية غير الزرقاء.
    ملاحظة: الخلايا التي ظهرت باللون الأزرق من المستبعدة من العد، <1% من الخلايا الملطخة باللون الأزرق في جميع نقاط الوقت.
  7. حساب كثافة الخلية (الخلايا/سم2)استناداً إلى الصيغ التالية.
    متوسط عدد الخلايا/الشبكة Equation 1 = (Eq.1)
    عامل التخفيف = Equation 2 (Eq.2)
    كثافة الخلايا (الخلاياالقابلة للحياة /سم 2) =
    Equation 3
    (مق.ق.ع-3)
    المعادلات 1-3 الخلايا القابلة للحياة هي عدد الخلايا التي يتم عدها في كل شبكة، وعدد الشبكات تتوافق مع عدد الشبكات الموجودة تحت المجهر، وحجم خليط من تعليق الخلية و 0.4٪ تريبان الأزرق هو حجم أعدت في الخطوة 3.5، وحجم تعليق الخلية إزالة هو حجم إزالتها من تعليق الخلية 500 درجة مئوية في الخطوة 3.5، وحجم تعليق الخلية في كل بئر هو تعليق الخلية 500 درجة مئوية من الخطوة 3.3، منطقة النمو من لوحة زراعة الأنسجة هو منطقة النمو من بئر واحد في لوحة 24 جيدا.

4. لوسيفر الصفراء نفاذية واضحة (LY P التطبيق) تقييم

  1. لتحديدالتطبيق LY P على كل يوم بعد البذر، اتبع الخطوات التي تبدأ 4.3. لتحديدالتطبيق P في خلايا hCMEC/D3 المنقولة، إضافة 8.3 ميكرولتر من تركيبة التغوط (الشكل1)مختلطة مع 50 ميكرولتر من متوسط النمو الكامل والحضانة لمدة 4 ح. ويرد وصف تركيبات الانفسيون في القسم 5.
  2. بعد 4 ساعات من التغوط، اغسل بلطف الجانب apical مرتين باستخدام معقمة 1X PBS العازلة لإزالة أي خليط التغوط المتبقية. يمكن أن تؤثر وحدات التخزين المتفاوتة للحاجز PBS الذي ترك بعد الإزالة على تركيز LY في الجانب apical. الحرص على التأكد من إزالة المخزن المؤقت PBS المتبقية في إدراج زراعة الأنسجة تماما. يستنشق بعناية الكواشف المتبقية والمتوسطة للحد من انفصال الخلية.
    ملاحظة: يتم تخطي هذه الخطوة عند قياس نفاذيةواضحة كل يوم (P التطبيق) من خلايا hCMEC/D3.
  3. إزالة متوسط النمو وإضافة 1.5 مل من قبل الاحماء (37 درجة مئوية) النقل العازلة (25 M HEPES، 145 ملشمال شعبة الكلر، 3 مل ككل، 1 مليون متر كل+سي 2، 0.5 مليون متر من كل+سي 2، 1 مليون مترشمالبو4،5 مل الجلوكوز، درجة الحموضة 7.4) إلى الجانب البسول.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون حجم المخزن المؤقت للنقل في جميع المقصورات الجانبية متساوياً لضمان دقة حساب معامل النفاذية.
  4. إضافة 58.3 درجة مئوية من 20 μM LY الحل إلى الجانب apical من كل إدراج transwell. وفر 50 ميكرولتر من محلول LY 20 درجة مئوية لقياسات الفلورة. بعد إزالة المخزن المؤقت PBS المتبقية من الجانب apical تماما، إضافة LY الحل في أسرع وقت ممكن لتجنب تجفيف خلايا hCMEC /D3. ضمان وحدات تخزين دقيقة من حل LY في الجانب apical.
    ملاحظة: لتقليل اضمحلال شدة الفلورة LY، يجب أن يكون التعرض للضوء محدوداً. بمجرد إعادة تشكيل مسحوق LY، يجب تخزين الحل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية، محمية من الضوء.
  5. حضانة في شاكر لوحة دوارة (37 درجة مئوية، 100 دورة في الدقيقة) لمدة 60 دقيقة. ثم، قم بإزالة 30 ميكرولتر من عينة LY من كل مقصورة apical. ثم نقل الحل LY 20 μM وعينات الجانب apical إلى أنابيب وصفت مسبقا والتخفيف من عينة 10 أضعاف باستخدام المخزن المؤقت النقل.
    ملاحظة: مطلوب لتخفيف محلول المخزون LY 20 μM والعينات الجانبية apical لأن كثافة الفلورة العالية من هذه العينات قد يحتمل أن الزائد وتلف كاشف الفلورة من قارئ الفلورة.
  6. إزالة 500 درجة مئوية من كل مقصورة basolateral ونقل العينة إلى أنابيب وصفت مسبقا.
    ملاحظة: تتم إزالة العينات من transwell منفصلة في نقاط الوقت المشار إليها. النقاط الزمنية هي كل يوم بعد البذر بدءا من اليوم 1 حتى اليوم 10.
  7. إعداد سلسلة من معايير LY للمنحنى القياسي (39.00 nM, 78.13 nM, 156.25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
  8. إضافة 100 درجة مئوية من كل معيار (في تكرار)، عينة apical وbasolateralإلى كل بئر في لوحة سوداء 96 جيدا (الشكل 1).
    ملاحظة: لوحات سوداء تمتص الضوء والحد من الخلفية وكروس الفلورية بين الآبار.
  9. استخدام قارئ لوحة ميكروتورسين (مجموعة النقاط: الإثارة 428 نانومتر، الانبعاثات 536 نانومتر) لقياس كثافة الفلورة LY لحسابالتطبيقP . يتم استخدام قارئ لوحة الفلورة لهذه الدراسة.
  10. حسابقيم استرداد التطبيق P و %LY كما هو موضح في نص المخطوطة.
    المعادلة الرابعة صيغ لحساب قيمالتطبيق P.
    حساب معامل النفاذية الظاهرة (Pالتطبيق)واسترداد %LY باستخدام المعادلات التالية. وتجدر الإشارة إلى أن قيمالتطبيق P يمكن حسابها إما على أساس كتلة25 أو تركيز LY.
    Equation 4 اوEquation 5
    VA - حجم في مقصورة apical
    VB - حجم في المقصورة الباضية
    أ - المساحة السطحية لغشاء إدراج transwell(0.3 سم 2)
    MA0 - الكتلة الأولية في المقصورة apical
    ΔMB/Δt - تغيير الكتلة مع مرور الوقت في المقصورة الباضية
    CA0 - التركيز الأولي في المقصورة apical
    ΔCB/Δt - التغير في التركيز مع مرور الوقت في المقصورة الباضية.
    المعادلة الخامسة صيغ لحساب ٪ LY الانتعاش.
    الاسترداد (٪) = Equation 6
    MAf هو الكتلة في مقصورة apical في نهاية نقطة زمنية, MBf هو كتلة في مقصورة basolateral في نقطة نهاية الوقت, MA0 هو الكتلة الأولية في مقصورة apical. 26 ملاحظة: يتم حساب الكتلة الأولية استناداً إلى حجم حل LY 20 μM في الخطوة 4.5. وقد أجريت هذه التجربة دائما باستخدام الخلايا تحت الممر رقم 35 وأجريت أربع مرات مستقلة.

5- استنفاد الكالسيوم

  1. إزالة متوسط النمو من إدراج transwell و12 جيدا لوحة وغسل بلطف الجانب apical و12 جيدا لوحة باستخدام ما قبل تسخينها الكالسيوم خالية من المتوسطة (الحد الأدنى الأساسية المتوسطة النسر سبينر (S-MEM) المتوسطة) لإزالة أيونات الكالسيوم من إدراج transwell و12 جيدا لوحة.
  2. إضافة 500 درجة مئوية أو 2 مل من S-MEM قبل تسخينها 1xmedium إلى إدراج أو 12 جيدا لوحة وحضانة لمدة 24 ساعة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). بعد الحضانة، قم بإزالة متوسط S-MEM 1x واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام المخزن المؤقت PBS 1x الذي تم تسخينه مسبقًا.
  3. اتبع الخطوات 4.4-4.10 الموضحة في القسم 4 لعلاج LY والخطوات اللاحقة. اتبع الخطوات 8.1.2-8.2.4 الموضحة في القسم 8 للنشاف الغربي والخطوات اللاحقة.

6. التغوط

  1. إعداد الجسيمات النانوية للحمض النووي (DNA NPs).
    1. تخفيف محلول المخزون من gWIZ-Luc plasmid في 10 mM خلات الصوديوم (NaAc) العازلة (درجة الحموضة 5.0) والسماح للحل الحمض النووي للوقوف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: يمكن إعداد الحمض النووي الوطني الذي يحتوي على جزيئات الحمض النووي المفردة في الغالب بتركيزات الحمض النووي 20-40 ميكروغرام/مل23. وبالتالي، فإن محلول الأسهم gWIZ-Luc بلازميد يحتاج إلى تخفيف. يجب إذابة مخزون gWIZ-Luc بلازميد المجمد ة تمامًا على الجليد لتقليل إجهاد درجة الحرارة. دوامة بلطف حل مخزون الحمض النووي المخفف لمدة 30 s على دوامة مقاعد البدلاء القياسية المنصوص عليها في موقف مقبض الباب 3-5.
    2. حساب نسب N/P المطلوبة، المستخدمة هنا كمعلمة رقمية لتعكس تكوين NP.
      Equation 7
      المعادلة السادسة N / P حساب نسبة: نسبة الشامات من مجموعات أمين البوليمرات الموجبة إلى تلك المجموعات الفوسفات من الحمض النووي. كتلة البوليمرات الموجبة يعني مجموع كمية وزنه من البوليمر الموجبة. (كتلة / تهمة) البوليمرات الموجبة يشير إلى الوزن الجزيئي للبوليمر الموجبة (بولي (إيثيلينغليكول) 5K-كتلة-بولياسبارامميد مع 48 سلاسل جانبية ثنائي إيثيلينتريامين (PEG-DET)) تطبيع إلى عدد من الأمينات الأولية المشحونة (48) لكل بوليمر الموجبة ( مول / مول)، وهذه القيمة للبوليمر لدينا هو 306 دا. كتلة الحمض النووي تعني الكمية الإجمالية للحمض النووي المستخدم في التركيبة التي تم الحصول عليها عن طريق مضاعفة الحجم والتركيز في مغ/مل؛ (كتلة / تهمة) الحمض النووي يشير إلى الوزن الجزيئي للحمض النووي تطبيع إلى عدد من مجموعة الفوسفات لكل الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (325 دا لكل نيوكليوباسي).
      ملاحظة: يحتوي جدول إعدادالحمض النووي (الجدول 1) على وصفة صياغة للعينات المختلفة التي تم اختبارها في تجاربنا. تم إعداد الحمض النووي NP باستخدام تقنية المعايرة السريعة. تمت إضافة حل البوليمر PEG-DET على طول جدران الأنبوب أثناء عقد الأنبوب في وضع أفقي. ثم تم تحويل الأنبوب إلى موقف عمودي، تليها دوامة بسرعة في السرعة القصوى لمدة 10S. سمح للحمض النووي الوطني للوقوف لمدة 30 دقيقة في RT قبل الاستخدام. قاعدة الإبهام لالدوز الحمض النووي NP هو 0.5 ميكروغرام الحمض النووي لمنطقة النمو 1 سم 2. لذلك، لكل transwell إدراج / كل بئر في لوحة 48 جيدا / كل بئر في لوحة 96 جيدا، وإعداد الحمض النووي NP في N / P 10 التي تحتوي على 0.157/0.5/0.195 ميكروغرام / بئر من الحمض النووي gWIZ لوك.
    3. بالنسبة للعينات التي تحتوي على تركيز مشار إليه من Poloxamer P84 (P84)، أضف P84 إلى الحمض النووي NP والدوامة لمدة 5 ق. التركيز النهائي للP84 في كل عينة هو إما 0.01٪ أو 0.03٪ الوزن.
  2. الحمض النووي NP التغوط في إعداد لوحة 48 جيدا
    1. بذور الخلايا مع كثافة 50،000 خلية / سم2 في لوحة 48 جيدا وتنمو حتى التقاء في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
    2. لكل مجموعة علاج، مزيج 25 درجة مئوية من العينة المشار إليها (تركيبة التغوط عبر) و 150 ميكرولتر من متوسط النمو الكامل و 175 ميكرولتر من هذا الخليط إلى كل بئر.
    3. مراقبة خلايا hCMEC /D3 تحت المجهر لضمان أن الخلايا تبدو صحية و100٪ مترافقة في وقت التجربة.
    4. إزالة متوسط النمو من الآبار و175 درجة مئوية خليط التغوط إلى كل بئر. ثم، حضانة لوحة لمدة 4 ساعة في الحاضنة (37درجة مئوية، 5٪ CO 2).
    5. بعد 4 ساعة، قم بإزالة خليط الانعطاف واغسل خلايا hCMEC/D3 بمخزن بسعة 1x PBS معقم مسبقًا.
      ملاحظة: لتقليل انفصال عرضي من خلايا hCMEC/D3 من سطح اللوحة/الإدراج أثناء خطوات الغسيل، ماصة بعناية بما فيه الكفاية PBS معقمة على طول جدران الآبار وإزالة أي جسيمات نانوية في وسائل الإعلام الثقافة المتبقية.
    6. هز ّ اللوحة برفق عدة مرات واستنشق بعناية وتجاهل غسل PBS وأضف 500 لتر من hCMEC/D3 وسط الثقافة الدافئة مسبقاً.
    7. فحص مجهري الخلايا وتسجيل الملاحظات على مورفولوجيا الخلية وأي آثار محتملة للتغوط.
    8. حضانة لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية للسماح إنتاج لوسيفيراز. بعد 24 ساعة، إزالة متوسط النمو تماما وغسل الخلايا مرة واحدة مع ما قبل تسخين ها 1X PBS.
    9. Lyse الخلايا المنقولة عن طريق إضافة 100 درجة مئوية من الجليد البارد luciferase خلية ثقافة lysis 1X الكاشف لكل بئر.
    10. لقياس محتوى البروتين لوسيفيراز، إضافة 20 ميكرولتر من lysate الخلية و 100 ميكرولتر من لوسيفيراز اختبار العازلة (20 مل غليسيليكلغليسين (درجة الحموضة 8)، 1 مل مغكل2،0.1 mM EDTA، 3.5 mM DTT، 0.5 mM ATP، 0.27 mM الإنزيم المساعد A) في أنبوب 1.5 مل.
    11. قراءة الإنارة من العينة الموصوفة في الخطوة 6.2.10 على مقياس الإنارة مع واحد لصناعة السيارات في الحقن.
      ملاحظة: يجب أن تكون متكاملة الإنارة أكثر من 10 s قبل القراءة.
    12. قياس الكمية الإجمالية من البروتين الخلوي في lysate باستخدام اختبار حمض bicinchoninic (اختبار BCA) عدة باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
    13. حساب والتعبير عن التعبير الجيني لوسيفيراز كوحدات الضوء النسبي (RLU) لكل بروتين خلوي إجمالي.

7. الإنارة ATP التبيّاق

  1. بذور الخلايا مع كثافة 50،000 خلية / سم2 في لوحة بئر 96 وتنمو حتى التقاء في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  2. [ترنسفيكت] الخلايا مع 9.7 [فل] من ال [ترّفكأيشن] صياغة (تحضير تفاصيل في قسم 6) و58.4 [فل] من كاملة حالة نموّ وسط ل 4 [ه].
  3. إزالة خليط التغوط وغسل بلطف الخلايا مع PRE-الدافئة PBS 1X العازلة مرتين لإزالة الكواشف العلاج تماما.
    ملاحظة: وحدات تخزين مختلفة من المخزن المؤقت المتبقية يمكن أن تضعف الكواشف فحص ATP إلى نطاق مختلف ويمكن أن تؤثر على البيانات.
  4. امزج 75 ميكرو لتر من الكاشف الطازج المتوسط المُدفأ مسبقاً وكاشف فحص ATP في تخفيف 1:1 باستخدام ماصة متعددة القنوات. تأكد من أن مستوى السائل في جميع نصائح ماصة متعددة القنوات هو نفسه.
  5. ضع اللوحة على شاكر الصالل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة من إضافة الكواشف، نقل 60 درجة مئوية من كل عينة في لوحة بيضاء 96 جيدا.
    ملاحظة: لوحات بيضاء هي أفضل لتعكس ضوء الإخراج من لوحات واضحة أو سوداء.
  6. البوب أي فقاعات الهواء باستخدام إبرة قبل قراءة لوحة. قراءة لوحة على مقياس الإنارة مع 1 s وقت التكامل. قراءة لوحة في غضون 20 دقيقة بعد إضافة الكواشف AS التوقيت أمر بالغ الأهمية للمقارنة عبر لوحات مختلفة، لأن إشارة الإنارة عابرة مع معدل الاضمحلال السريع.
  7. حساب النسبة المئوية (٪) صلاحية الخلية باستخدام هذه الصيغة: (الإنارة من الخلايا المنقولة / الإنارة من السيطرة، والخلايا غير المعالجة) × 100.

8. النشاف الغربية لقياس البروتين تقاطع ضيق ZO-1

  1. تحليل الخلايا واستخراج البروتين
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات لاستخراج البروتين من الخلايا في 2-8 درجة مئوية.
    1. بذور الخلايا في كثافة 50،000 خلية / سم2 في الكولاجين المغلفة 12 جيدا لوحة ثقافة الأنسجة.
    2. في اليوم 3، اليوم 5، اليوم 7، اليوم 10 ما بعد البذر وفي اليوم 7 (الخلايا pre-cubated مع وسط خال من الكالسيوم)، وإزالة متوسط النمو وغسل الخلايا بلطف مرتين مع 2 مل من الجليد البارد 1X PBS. ثم، إضافة 300 درجة مئوية خليط من الجليد البارد 1X RIPA lysis العازلة التي تحتوي على 3 ميكروغرام / مل aprotinin في كل بئر.
      ملاحظة: يجب أن يتم الخليط الطازج والاحتفاظ بها على الجليد. يستخدم Aprotinin لمنع البروتياز الموجودة في lysates من تدهور البروتين من الفائدة.
    3. بعد دورتين تجميد ذوبان (-80 درجة مئوية)، كشط الخلايا باستخدام مكشطة خلية بلاستيكية باردة. جمع lysates الخلية في أنابيب microfuge. ثم، الطرد المركزي الأنابيب في 200 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    4. جمع supernatant في أنابيب نظيفة ووضعها على الجليد. قياس الكمية الإجمالية للبروتين الخلوي في lysates باستخدام مجموعة اختبار BCA باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. النشاف الغربية للكشف عن البروتين تقاطع ضيق ZO-1
    1. التحلل aliquots من مجموع المتجانسات التي تحتوي على 40 ميكروغرام من البروتين الكلي مع 1X Lemmli العازلة في 95 درجة مئوية، 5 دقيقة وتخضع للكتروفوريس في خفض 6-7.5٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات بوليأكريلاميد هلام (SDS-PAGE) (90 V، 10 دقيقة من خلال هلام التراص، 120 V من خلال حل المواد الهلامية).
      ملاحظة: عند تحميل العينات أو المعايير تذكر تحميل ببطء وبعناية في كل حارة، مع الحرص على عدم كسر البئر في العملية.
    2. نقل البروتينات المنفصلة على غشاء النيتروسيلولوز مع احتياطي نقل درجة الحموضة 8.5 الذي يحتوي على 192 مل غليسين، 25 mM قاعدة تريس، 10٪ الميثانول و 0.1٪ SDS (75 V، 110 دقيقة في درجة حرارة الغرفة).
      ملاحظة: لا تلمس الغشاء. استخدام 70٪ isopropanol غسلها ملقط البلاستيك للتعامل مع الغشاء. من أجل نقل بنجاح البروتين ZO-1 (MW 200 kDa) إلى الغشاء، ينبغي أن يكون درجة الحموضة حوالي 8.3-8.5. إذا كان المخزن المؤقت نقل أكثر حمضية من ذلك، لن يحدث النقل. إذا كانت نطاقات سلم مرئية لا تزال على هلام، سيكون من المفيد زيادة وقت النقل وتركيز SDS.
    3. بعد غسل الغشاء باستخدام الخيوط المخزنة مؤقتا المالحة التي تحتوي على 0.1٪ توين 20 (T-TBS)، استخدم محلول حظر (1:1 LiCOR-أوديسي كتلة: 1X تريس المخزنة المالحة المخزنة) لمنع الأغشية لمدة 60 دقيقة.
    4. قطع الغشاء بعناية إلى شريطين. حضانة مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية (ZO-1 الأجسام المضادة أحادية النسيلة، تخفيف، 1: 900، وغليسيرالدهايد 3 فوسفات dehydrogenase (GAPDH) الأجسام المضادة، تخفيف، 1: 10،000) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. ثم، احتضان الأغشية ZO-1 وGAPDH مع حمار المضادة للماوس IgG (تخفيف، 1:50،000). بعد غسل الأغشية باستخدام T-TBS، صورة الأغشية في قناة 700 على صورة 16 بت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أولا، حددنا تأثير وقت الزراعة على نفاذية LY لتحديد الحركية الظاهرة لتشكيل TJ. يتم عرض قيمالتطبيق LY P المتوسط من اليوم 1 إلى 10 آخر البذر في الشكل 2a. في اليوم 1، كانمتوسط P التطبيق 4.25 × 10-4 سم / دقيقة وانخفض قليلا إلى 3.32 × 10-4 سم / دقيقة في اليوم 2. متوسط قيمةالتطبيق P زيادة طفيفة إلى 3.93 × 10-4 سم / دقيقة في اليوم 3 وتقلبت مع عدم وجود تغييرات كبيرة حتى اليوم 6. انخفضت قيمالتطبيق P بشكل كبير إلى 2.36 × 10-4 سم / دقيقة في اليوم 7 مقارنة مع اليوم 1 (P < 0.05) ربما تشير إلى أن الحاجز أصبح أكثر إحكاما. استقرت قيمالتطبيق P في النطاق بين 2.14 × 10-4 و 2.36 × 10-4 سم / دقيقة من اليوم 7 إلى اليوم 10، مما يعني أن تشكيل الحاجز كان كاملا ووظيفية مما أدى إلى انخفاض LY النقل شبه الخلوي. حسبنا النسبة المئوية (بالنسبة المئوية) LY تعافى في كل يوم ليكون حوالي 80٪، وهي القيمة التي تعتبر الأمثل لحساب موثوق قيمةالتطبيق P27 (فيgure 2b). الانتعاش٪ هو مؤشر مهم في LY التبيّن. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا استقلاب معظم LY، يتم تعطيل LY في الخلايا أو العصي على غشاء الخلية أو LY تتحلل أثناء الحضانة، سيكون من غير الدقيق لتفسير أن لاحظ إشارة LY منخفضة في مقصورة المناطق البسالية يشير إلى حاجز ضيق. وهكذا، الانتعاش٪ يعطي المزيد من الثقة بأننا لم نفقد كمية كبيرة من LY بسبب واحد أو أكثر من الاحتمالات المذكورة أعلاه ويسمح لتقدير بثقة القيمالتطبيق LY P. وكما لوحظ سابقاً في قسم المقدمة، تشير تركيزات أكبر من LY في الجانب البطي إلى وجود حاجز غير كامل في حين تعكس التركيزات المنخفضة النقل المقيد، مما يشير إلى وجود حاجز ناضج وكامل بسبب وجود وظائف تي جي جي. كما نقدم أدلة إضافية باستخدام تقنية متعامدة، الكشف عن النشاف الغربية من البروتين ZO-1 (الشكل4)، للتأكد من أن التغييرات التي لوحظت فيالتطبيق LY P يرتبط مع تشكيل تقاطعات ضيقة.

بما أن إعداد إدراج transwell لا يسمح بتتبع التغيرات في كثافة الخلايا مباشرةً، فقد حددنا التغيرات في كثافة الخلايا باستخدام فحص استبعاد أزرق قياسي من Trypan. لذلك حددنا التغيرات في كثافة الخلايا على لوحة زراعة الأنسجة الشفافة التي سمحت لنا بسهولة لمراقبة حركية نمو الخلايا. وكانت الزيادة في كثافة الخلايا من 5.5 ± 1.0 × 104 خلايا/سم2 إلى 1.9 ± 0.2 × 105 خلايا/سم2 من اليوم 1 إلى 10 مرحلة البذر (الشكل3)خطية مع معامل انحدار قدره 0.94. وتشير هذه البيانات أيضا إلى أن التغييرات التي لوحظت فيالتطبيق LY P (الشكل2أ)هي نتيجة لتشكيل طبقة أحادية النفايات على مدى فترة 10 أيام. لاحظنا الخلايا تحت المجهر الضوئي المقلوب في كل يوم ووثقت بصريا زيادة تدريجية في عدد الخلايا وتشكيل أحادية الطبقة.

استخدمنا النشاف الغربية للكشف عن التغيرات في التعبير عن البروتينتقاطع ضيق ZO-1 مع مرور الوقت (الشكل 4). يتم استخدام التغييرات في التعبير ZO-1 لتكملة orthogonally بياناتالتطبيق LY P وضمان أن التغييرات التي لوحظت فيالتطبيق LY P يشير إلى تشكيل حاجز ضيق. تم تحليل كثافات الفرقة ZO-1 بواسطة قياس الكثافة وتطبيع نسبة إلى التعبير عن جين التدبير المنزلي، GAPDH. يمثل النطاقان في الشكل 3a isoforms ZO-1 (ZO-1α+ و ZO-1α-)28. كشف تحليل قياس الكثافة أن قيمة بكسل ZO-1 زادت من اليوم 3-7 بعد البذر، مما يشير إلى أن البروتين TJ ZO-1 شكلت باستمرار من اليوم 3-7. بعد معالجة استنفاد الكالسيوم في اليوم 7 بعد البذر، كان نطاق ZO-1 غير قابل للكشف تقريبا، مما يشير إلى أن ZO-1 لم يكن قادرا على تشكيل في غياب أيونات الكالسيوم. وعلاوة على ذلك، انخفضت قيمة بكسل من ZO-1 بشكل ملحوظ في اليوم 10 بعد البذر. كانت كثافة إشارة GAPDH من اليوم 3-10 تبدو قابلة للمقارنة، إلا في اليوم 7 عندما تم التعامل مع الخلايا مع المتوسطة خالية من الكالسيوم. قد يكون السبب المحتمل لانخفاض التعبير GAPDH في الخلايا المعالجة بالكالسيوم بسبب البروتين الكلي أقل (28.9 ميكروغرام من البروتين الكلي)، مرة أخرى، من المرجح أن يكون بسبب استنفاد الكالسيوم. بشكل عام، كشف تحليل قياس الكثافة الفرقة زيادة تدريجية في التعبير ZO-1 (نسبة إلى GAPDH) حتى اليوم 7 وانخفاض في التعبير في اليوم 10 عندما الخلايا المستزرعة في وسط النمو الكامل. وكشف التحليل أيضا عن انخفاض التعبير من ZO-1 (نسبة إلى GAPDH) في اليوم 7 في الخلايا المعالجة مع المتوسطة خالية من الكالسيوم.

في حين أن التركيز من هذا العمل هو تقديم تقييمالتطبيق LY P كوسيلة لتحديد حركية تشكيل أحادية الطبقة، لإظهار فائدة إضافية من فحص المتقدمة، حددنا ما إذا كان الحمض النووي NP transfection أثرت على حاجز TJ النزاهة عن طريق قياس LY Pالتطبيق من خلال hCMEC / D3 الخلايا 4 ح بعد الانعطاف (الشكل5). لدينا الحمض النووي NPs التي تحتوي على Poloxamer P84 التوسط مستويات عالية من التعبير الجيني في خط الخلية hCMEC /D3 من الصعب أن تنتقل (الشكل6a). على وجه التحديد، أردنا أن نحدد ما إذا كانت المجالات الكارهة للماء من Poloxamer P84 في الحمض النووي لدينا NPs قد تعكر سلامة TJ في الخلايا المتحولة. كانت نسبة LY المستردة في كل مجموعة معالجة حوالي 92%، مما يشير إلى أن قيمتطبيق P المحسوبة موثوقة (الشكل5ب). لاحظنا أن إجراء التغوط باستخدام تركيبات مختلفة لم يؤثر علىالتطبيقLY P ، بالنسبة للخلايا غير المنقولة المعرضة لLY وحدها. الكالسيوم خارج الخلية هو عنصر حاسم للحفاظ على تقاطعات الخلايا في مختلف أنواع الخلايا29،30،31،بما في ذلك الخلايا البطانية الميكروفيس الدماغ. وهكذا، فإن الحفاظ على الخلايا في وسط خال من الكالسيوم (CFM) يؤدي إلى تعطيل TJs32،33. لذلك، استخدمنا الخلايا المعالجة مع CFM لمدة 24 ساعة كتحكم إيجابي.

تظهر بياناتنا أنتطبيق LY P للخلايا الحاضنة مع CFM كان أعلى بمقدار 2 أضعاف مقارنة بخلايا التحكم الحاضنة مع وسط النمو العادي. هذه الزيادة 100٪ فيالتطبيق P تشير إلى أن الخلايا قد فقدت TJs بسبب فقدان أيونات الكالسيوم اللازمة لتشكيلها. وتجدر الإشارة إلى أن القيمة الفعلية (5.14 × 10-4 سم / دقيقة) كانت أعلى قليلا من متوسط قيمةالتطبيق P من اليوم 1-6 آخر البذر (الشكل2)عندما لم يتم تشكيل TJs بعد بالكامل. على الرغم من أنها ليست كبيرة، وأظهرت الخلايا المنقولة مع الحمض النووي NP التي تحتوي على 0.01-0.03٪ Poloxamer P84 زيادة صغيرة في قيمالتطبيق LY P مقارنة مع الخلايا غير المعالجة التي تم الحفاظ عليها في وسط الثقافة العادية. وتشير هذه الملاحظة إلى أن الحمض النووي NP + P84 transfection لم يكن له تأثير كبير على سلامة حاجز TJ. بشكل عام، قيمالتطبيق LY P في الخلايا المنقولة متوسط تقريبا إلى 2.5x10-4 سم / دقيقة وهذه القيمة تتوافق مع متوسط القيمة التي لوحظت خلال اليوم 7-10 ما بعد البذر (الشكل2)عندما كانالتطبيق LY P أقل، مما يشير إلى وجود TJs الوظيفية التي قيدت بشكل فعال LY النقل شبه الخلوي.

نقدم بيانات إضافية عن التغوط لإظهار أن عدم وجود تغييرات فيالتطبيق LY P (الشكل5) ليست ملاحظة غير منطقية. على الرغم من المستويات العالية من الانفص لوحظ في مجموعة NPs DNA + P84، لاحظنا أي تغييرات فيالتطبيق LY P مما يشير إلى أن تركيباتنا لا تعكر صفو TJ. كفاءة الانففيات منخفضة نسبيا في الخلايا العارية المعالجة بالحمض النووي هي نموذجية لأن الطبيعة الأيونية للحمض النووي بلازميد (بسبب مجموعات الفوسفات في عمودها الفقري) وطبيعتها المائية تحد من التناول الخلوي. الحمض النووي المكثف في الحمض النووي NP توسط زيادة 50 أضعاف في التغوط بالمقارنة مع pDNA عارية (الشكل6). إضافة 0.01٪ P84 إلى NP الحمض النووي أدى إلى زيادة 18 أضعاف بالمقارنة مع الحمض النووي NP وحدها (P & lt; 0.01). وأدى زيادة تركيز P84 إلى 0.03 الوزن في المائة إلى زيادة قدرها 30 ضعفاً مقارنة بالحمض النووي الوطني وحده (P< 0.001). هذه النتائج جديرة بالملاحظة بالنظر إلى أن الخلايا البطانية في الدماغ هي نوع من الخلايا التي يصعب نقلها.

قمنا بقياس صلاحية الخلايا للخلايا التي يتم نقلها في ظروف مختلفة للتأكد من أن إجراء التغوط لا يسبب إجهاد الخلايا. أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) هو عملة الطاقة في الحياة ويعكس وظيفة التمثيل الغذائي الخلوية. استخدمنا تقييم ATP المستند إلى لوسيفيراز حيث تتناسب قيم الإنارة بشكل مباشر مع مستويات ATP. وذكرت Possimo وآخرون أن اختبار ATP الإنارة كان مقياسا قويا من صلاحية الخلايا الأيضية34. وكانت صلاحية الخلايا لخلايا hCMEC/D3 التي تنقلها الصيغ المختلفة قابلة للمقارنة مع الخلايا غير المعالجة (الشكل5ب)،مما يشير إلى أن مستويات ATP كانت متشابهة أيضاً. ولذلك، فإن الحمض النووي الذي يحتوي على Poloxamer P84 (0.01٪ إلى 0.03٪ ث / ث) هي تركيبات آمنة لتسليم الجينات.

Figure 1
الشكل 1 . الإعداد التجريبي لـ LY P التطبيق دراسة. إعداد لوحة 24-well تحتوي على إدراج transwell (تكييفها لإظهار الحمض النووي نانوجسيم التغوط كمثال، والبيانات في الشكل 5). وقد عولج كل عمود بالعينة المشار إليها لمدة 4 ح. وتشير السيطرة إلى أن خلايا hCMEC/D3 المعالجة بنمو متوسط كامل بينما يشير استنفاد الكالسيوم 24 ساعة إلى أن الخلايا كانت مُقَبَّعة بوسيلة خالية من الكالسيوم قبل التعرض لها. يصور القالب الأيمن قياس شدة الفلورة LY في لوحة سوداء 96-well. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . تحديد حركية واضحة لتشكيل حاجز TJ باستخدام P LY التطبيق اةي ؛ زمنك (أ) LY P تم قياس التطبيق من خلال hCMEC / D3 الطبقات الأحادية المستزرعة على إدراج transwell كل يوم خلايا ما بعد البذر. (ب) % LY تعافى في كل مجموعة العلاج. تمثل البيانات متوسط ± SD من تجربتين مستقلتين (n = 3/experiment). أجريت مقارنات إحصائية باستخدام اختبار t غير المقترن (*P< 0.05, N.S. غير مهم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 3
الشكل 3 . يتم تحديد حركية نمو الخلايا باستخدام عملية تحديد الاستبعاد الأزرق في تريبان. تم زرع خلايا hCMEC/D3 في لوحة 24 بئر في كثافة الخلية من 50،000 خلية / سم2. في كل يوم من أيام التجربة، تم فصل الخلايا وخلطها مع حجم متساو من 0.4٪ الأزرق تريبان قبل عد الخلايا القابلة للحياة على مقياس الهيميسي. البيانات تمثل متوسط ± SD من ثلاثة قياسات مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 . تم الكشف عن حركية واضحة للتعبير ZO-1 باستخدام النشاف الغربي. (أ) تم زرع خلايا hCMEC/D3 في لوحة 12 بئرًا بكثافة خلايا تبلغ 50,000 خلية/سم2. في كل يوم من التجربة (اليوم 3، اليوم 5، اليوم 7 ويوم 10-آخر البذر)، تم lysed الخلايا من قبل 400 درجة مئوية من 1X RIPA العازلة التي تحتوي على 3 ميكروغرام / مل aprotinin. تم تحميل الليسات الخلية التي تحتوي على 40 ميكروغرام من البروتين الكلي على هلام SDS-polyacrylamide 4-7.5٪. (ب) سمح تحليل قياس الكثافة الفرقة تطبيع التعبير من البروتين ZO-1 إلى GAPDH. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 5
الشكل 5 . آثار الحمض النووي NP transfection على ضيق حاجز TJ قياس باستخدام P LY التطبيق اةي ؛ زمنك (أ) تم زراعة خلايا hCMEC/D3 على إدراجات ترانسويل لمدة 7 أيام، تم نقلها باستخدام PEG-DET التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد gWIZLuc مع/بدون Pluronic P84 لمدة 4 ساعة ثم تم استبدالها بمخزن مؤقت للنقل مسخن مسبقاً يحتوي على 50 ميكرو متر LY لمدة ساعة واحدة. الخلايا hCMEC/D3 الحاضنة مع متوسط النمو لمدة 4 ساعة تليها التعرض LY (n = 4، *P<0.05، N.S. ليست كبيرة). (ب) ٪ LY تعافى في كل مجموعة العلاج، والقيم المعروضة هي متوسط ± SD (n = 4). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 6
الشكل 6 . الحمض النووي NPs التوسط مستويات عالية من التعبير عبر الجينات في hCMEC / D3 أحادية الطبقات. (أ) تم زراعة خلايا hCMEC/D3 7 أيام وتنتقل مع PEG-DET التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد gWIZLuc مع / بدون Pluronic P84 (N/P 10، جرعة الحمض النووي لكل بئر: 0.5 ميكروغرام) لمدة 4 ساعة، تمت إزالة خليط التغوط والخلايا لمدة 24 ساعة في النمو الكامل المتوسطة قبل قياس التعبير الجيني. تم التعبير عن مستويات التعبير الجيني لوسيفيراز كوحدات الضوء النسبي (RLU) nornalized إلى محتوى البروتين الخلوي الكلي. البيانات يعرض متوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة. أجريت مقارنات إحصائية باستخدام اختبار t غير المقترن (** P< 0.01, *** P< 0.001). (ب) الحمض النووي NPs هي تركيبات نقل آمنة في الطبقات الأحادية hCMEC/D3. تم تقييم آثار الحمض النووي الحمض النووي NP التغوط على قدرة الخلية على البقاء باستخدام اختبار ATP الإنارة. تم نقل خلايا hCMEC/D3 مع العينات المشار إليها لمدة 4 ساعة بعد ذلك تم إجراء فحص ATP من قبل بروتوكول الشركة المصنعة التالية. النسبة المئوية (بالنسبة المئوية) تم حساب صلاحية الخلية على النحو التالي: (الإنارة من الخلايا المنقولة / الإنارة من السيطرة، والخلايا غير المعالجة) x100. تمثل البيانات متوسط ± SD من تجربتين مستقلتين (n = 3/experiment). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الإعداد التجريبي اسم نموذج حجم 1 ملغ / مل بلازميد الحمض النووي (ميكرولتر) حجم المخزن المؤقت NaAc 10 mM، درجة الحموضة 5 (ميكرولتر) حجم 5 ملغ / مل بوليمر (ميكرولتر) حجم 10٪ ث / ث. P84 (ميكرولتر) حجم النمو المتوسط (μL)
زراعةالأنسجة إدراج التحكم، الخلايا غير المعالجة 0 0 0 0 58.3
الحمض النووي العاري 0.157 8.143 50
الحمض النووي NP 7.843 0.3
الحمض النووي NP + 0.01٪ P84 7.6681 0.1749
الحمض النووي NP + 0.03٪ P84 7.26 0.0583
48 جيدا لوحة التحكم، الخلايا غير المعالجة 0 0 0 0 175
الحمض النووي العاري 0.5 24.5 150
الحمض النووي NP 23.56 0.94
الحمض النووي NP + 0.01٪ P84 23.385 0.175
الحمض النووي NP + 0.03٪ P84 23.035 0.525
96 جيدا لوحة التحكم، الخلايا غير المعالجة 0 0 0 0 68.1
الحمض النووي العاري 0.195 58.4
الحمض النووي NP 9.35 0.37
الحمض النووي NP + 0.01٪ P84 8.9307 0.0681
الحمض النووي NP + 0.03٪ P84 9.0669 0.2043

الجدول 1 التركيبات NP المستخدمة للحصول على البيانات المبلغ عنها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دور رئيسي لBBB هو منع تبادل الأيونات غير الضرورية والمواد السامة بين الدورة الدموية الجهازية والدماغ للحفاظ على انحلال البيئة الدقيقة العصبية. واحدة من السمات المميزة لBBB هو قدرة الخلايا البطانية الشعرية لتشكيل تقاطعات ضيقة (TJs) التي ختم على نحو فعال الطريق شبه الخلوي للنقل. أظهرنا فحصالتطبيق LY P كطريقة كمية لتحديد الحركية الظاهرة لتكوين حاجز TJ في الطبقات الأحادية hCMEC/D3 المستزرعة. تم الكشف عن تعبير ZO-1 عبر النشاف الغربي بشكل أقاصي للبيانات من دراساتتطبيق LY P كما تمت مناقشتهب بالتفصيل في الفقرة التالية. كفائدة إضافية من فحص المتقدمة، أظهرنا كذلك أن الحمض النووي NP transfection لم تغير بشكل ملموسالتطبيق LY P مما يدل على ملاءمة هذا الدواء لتحديد التغيرات في خصائص حاجز TJ في الإعداد التجريبي.

كشفت بيانات اللطخة الغربية عن زيادة واضحة في تعبير ZO-1 في الأيام 3 و5 و7-post البذر وانخفاض طفيف في اليوم 10-آخر البذر (الشكل4a). من الشكل 1، يمكن أن نرى أنالتطبيق LY P انخفض من اليوم 1-7 بعد البذر مما يشير إلى تشكيل TJs. بعد معالجة استنفاد الكالسيوم، أظهرالتطبيق LY P زيادة ملحوظة (الشكل2a)في حين أظهر التعبير ZO-1 انخفاضا ملحوظا (الشكل4a). الكالسيوم خارج الخلية هو عنصر حاسم للحفاظ على تقاطعات الخلايا في مختلف أنواع الخلايا29،30،31،بما في ذلك الخلايا البطانية الميكروفيس الدماغ. نقص الكالسيوم في متوسط النمو تعطل وتفكك تجي33. كما هو متوقع، كانت قيمةالتطبيق P من الخلايا المستنفدة للكالسيوم أعلى بكثير من الخلايا غير المعالجة وعلى مقربة من قيمةالتطبيق P من إدراج فارغة لا تحتوي على خلايا (الشكل2a). كشفت LY هضبة ثابتة في قيمالتطبيق P من اليوم 7-10 ما بعد البذر (الشكل2أ)مما يشير إلى أن الحاجز قد شكلت بالكامل بحلول اليوم 7 التي أسفرت عن تقييد LY النقل إلى الجانب البابيلي. وأظهرت بيانات اللطخة الغربية انخفاضا طفيفا في التعبير ZO-1 في اليوم 10 مقارنة مع اليوم 7-آخر البذر. ومن المرجح أن يرجع هذا الاختلاف في الملاحظة إلى مساهمة البروتينات الأخرى خارج الخلية، باستثناء ZO-1، في الحفاظ على ضيق الحاجز. وباختصار، لقد استخدمنا بنجاح البيانات من اثنين من التقنيات المتعامدة لتحديد حركية تشكيل حاجز تقاطع ضيق في نموذج الخلية البشرية من BBB. في حين أن فحصالتطبيق LY P قياس وظيفة حاجز TJ، بيانات وصمة عار الغربية تتبع تشكيل TJs باستخدام ZO-1 كبروتين علامة.

كفائدة إضافية من اختبار المتقدمة، أكدنا أن الحمض النووي NP transfection في hCMEC / D3 الطبقات الأحادية لا يؤثر على سلامة TJs (الشكل 5). تم استخدام الخلايا غير المعالجة الحاضنة مع متوسط النمو كسيطرة سلبية والخلايا قبل الحاضنة مع وسط خال من الكالسيوم لمدة 24 ساعة تم استخدامها كسيطرة إيجابية. وأظهرت الخلايا التي تعطلت TJs نتيجة لاستنفاد الكالسيوم زيادة بنسبة 210٪ فيالتطبيق LY P مقارنة مع الخلايا غير المعالجة. تشير بياناتنا إلى أن نقل الحمض النووي NP إما في وجود أو غياب P84 لا يؤثر على سلامة TJ. وتجدر الإشارة إلى أن عدم وجود تغييراتالتطبيق LY P في الخلايا المنقولة ليست ملاحظة غير منطقية. في الواقع، لدينا الحمض النووي NPs التوسط مستويات كبيرة من التعبير الجيني في hCMEC /D3 أحادية الطبقات من الصعب أن تنتقل9،35،36،37. الـ DNA NPs التي تحتوي على 0.01 أو 0.03 الوزن٪ P84 زيادة التعبير الجيني لوسيفيراز بحوالي 18-30 أضعاف، على التوالي، مقارنة مع الحمض النووي فقط (الشكل6أ). كما أظهرنا أن علاجات نا NP لا تؤثر سلبا على مستويات ATP الخلوية، وتستخدم هنا كمؤشر على صلاحية الخلايا الوظيفية (الشكل6ب). نتائجنا تؤكد على فائدة موسعة من هذا LY Pالتطبيق اختبار لتحديد سلامة حاجز TJ في إعداد transfection التجريبية.

خطوة حاسمة واحدة في تنفيذ LY التصاق هو الحفاظ على نفس الكمية من LY في الجانب apical وحجم متساو من العازلة النقل في الجانب basolateral عبر نقاط زمنية مختلفة في التجربة بأكملها. إذا تم استخدام كميات مختلفة من LY أو كميات غير متساوية من المخزن المؤقت للنقل في الآبار، فإن حسابالتطبيق P لا يمكن الاعتماد عليها، مما يؤدي إلى انحرافات قياسية كبيرة بشكل مصطنع. جانب آخر حاسم هو الحد من التعرض للضوء للحد من اضمحلال كثافة الفلورة LY. أيضا، السائل يحتاج إلى إزالتها تماما قبل إضافة نفس الحجم بالضبط من حل LY والمخزن المؤقت النقل في الجانب apical والجانب basolateral، على التوالي. وهذا يضمن أن قراءة الفلورة يمكن استخدامها بشكل موثوق لحسابالتطبيق P. وثمة خطوة حاسمة أخرى في هذه التجربة هي قياس الفلورة LY للعينات الباضية وتجنب الحاجة إلى تجميد العينات بعد جمعها. ويؤدي إخضاع العينات المحتوية على LY لدورات الذوبان المجمد إلى اختلاف أكبر داخل المجموعة في إشارة الفلورة. أحد القيود على استخدام إعداد transwell هو أن الخلايا الحية من الصعب أن تصور عن طريق الفحص المجهري التقليدية أو تصويرها عن طريق الفحص المجهري البؤري. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس من السهل ترجمة إلى الإعداد الذي يسمح بالمشاركة في زراعة أنواع الخلايا المختلفة ما لم مختلطة زراعة القول، والخلايا الغليفية والبطانية هو احتمال. ومع ذلك، فإن اختبار LY له المزايا التالية: LY هو صبغة مع قمم الإثارة / الانبعاثات متميزة وتحول ستوكس كبيرة نسبيا بالمقارنة مع الأصباغ مثل الفلوريسين الصوديوم، والذي يسمح لقياس قوي للمسبار عبور BBB ويتجنب الحاجة إلى تسمية إشعاعية إضافية كما هو الحال في التتبع مثل السكروز أو مانيتول. يوفر استرداد عالي %s من LY بيانات موثوقة لحساب قيمتطبيق P بثقة.

بناء على النتائج التي توصلنا إليها، نخلص إلى أن طريقةالتطبيق LY P هو اختبار بسيط وقوي لتحديد مدى نفاذية الخلايا الباراسيلوال عبر الخلايا أحادية الخلية hCMEC/D3. باستخدام طريقةالتطبيق LY P، قمنا بتحسين وقت الثقافة لتشكيل حاجز سليم، وأظهرنا فائدة إضافية من الاختبار المتقدمة من خلال تحديد سلامة TJ في الحمض النووي NP-transfected الخلايا أحادية الطبقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويشكر المؤلفون على الدعم المالي المقدم من جائزة المحقق الجديد لعام 2017 من الرابطة الأمريكية للصيدلية، وجائزة هوكلمني للأمراض المخيفة من جامعة دوكين، وأموال بدء كلية الصيدلة لمختبر مانيكام. نود أن نشكر مختبر تسرب (جامعة Duquesne) للمساعدة الغربية النشاف والسماح باستخدام الصور أوديسي 16 بت. ونود أيضا أن ندرج مذكرة تقدير خاصة لكاندارب ديف (مختبر مانيكام) للمساعدة في النشاف الغربية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability? European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. The Blood-Brain Barrier. , Springer. 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).
  25. Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 150، اللوسيفير الأصفر، نفاذية شبه الخلايا، حاجز الدم في الدماغ، hCMEC/D3، الجسيمات النانوية الحمض النووي، الانعتراب.
لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, W., Han, L., Bae, Y.,… More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter