Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Lucifer Yellow-en robust Paracellulær permeabilitet markør i en celle model af humant blod-hjerne barrieren

doi: 10.3791/58900 Published: August 19, 2019

Summary

Vi præsenterer en fluorescens analyse for at påvise, at Lucifer Yellow (LY) er en robust markør til at bestemme den tilsyneladende paracellulære permeabilitet af hCMEC/D3 Cell monolayers, en in vitro model af den menneskelige blod-hjerne barriere. Vi brugte denne analyse til at bestemme kinetikken af en konfluent enkeltlags dannelse i kulturperler hcmec/D3 celler.

Abstract

Blod-hjerne barrieren BBB består af endotelceller, der danner en barriere mellem det systemiske kredsløb og hjernen for at forhindre udveksling af ikke-væsentlige ioner og giftige stoffer. Stramme kryds (TJ) forsegle effektivt det paracellulære rum i monolag resulterer i en intakt barriere. Denne undersøgelse beskriver en ly-baseret fluorescens analyse, der kan anvendes til at bestemme dens tilsyneladende permeabilitet koefficient (Papp) og til gengæld kan bruges til at bestemme kinetikken af dannelsen af konfluent monolag og den resulterende stramme Junction barriere integritet i hCMEC/D3-monolayers. Vi demonstrerer yderligere en ekstra nytte af denne analyse for at bestemme TJ funktionel integritet i transficeret celler. Vores data fra LY Papp assay viser, at hCMEC/D3 celler seedet i en transwell setup effektivt begrænse ly paracellular transport 7 dage-post kultur. Som en ekstra nytte af den præsenterede analyse, vi også påvise, at DNA nanopartikel transfektering ikke ændrer sig paracellulær transport i hcmec/D3 monolayers.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Blod-hjerne barrieren (BBB) er den beskyttende barriere, der begrænser tilstrømningen af plasma komponenter til hjernevæv og består af hjerne endotelceller sammen med understøttende celler som pericytes. Den vigtigste rolle BBB er at tjene som en barriere, der forsegler rummet mellem perifert blod og centralnervesystemet (CNS) for at opretholde hæmostase af neurale mikromiljø1,2. Hjernen kapillær endotelceller forsegle effektivt paracellulære pathway via dannelse af intercellulære stramme kryds (TJs)1. Denne beskyttende barriere tillader glukose og udvalgte næringsstoffer til at komme ind i hjernen, mens det forhindrer de fleste ioner, giftige stoffer og narkotika fra passerer gennem denne stramme barriere. Bortset fra sin beskyttende rolle, den naturlige barriere funktion af BBB udgør en alvorlig udfordring i udviklingen af narkotika levering systemer rettet mod CNS.

In vitro cellekultur modeller af BBB er nyttige værktøjer til at studere sin biologi og til at forstå virkningerne af narkotikabehandling på TJ barriere integritet. Vi brugte den humane cerebral microvaskulære endotel cellelinje (hcmec/D3) som en in vitro-model, da det er en accepteret model af menneskelig hjerne endotelet3 og rekapitulerer mange funktioner i den menneskelige BBB. hcmec/D3is en af de mest almindeligt anvendte cellelinjer til modellering af BBB in vitro4,5,6,7,8,9. På trods af sin forholdsvis lave værdier af transendothelial elektrisk modstand (TEER), et mål for barriere tæthed, denne cellelinje bevarer de fleste af de morfologiske og funktionelle egenskaber af hjernen endotelceller, selv som en monokultur i fravær af dyrkede gliale celler6,7. Hcmec/D3-celle linjen udtrykker flere BBB-markører, herunder aktive transportører og receptorer indtil ca. passage 35 uden at gennemgå dedifferentiering til ustabile fænotyper6,7,9 ,10,11. Den mest slående Karakteristik af hcmec/D3 cellelinje som en in vitro BBB model er dens evne til at danne tjs5,9,11,12. Det skal bemærkes, at selv stamcelle-afledte BBB modeller viste højere permeabilitet i mange undersøgelser sammenlignet med hCMEC/D3 cellelinje og de udtrykker nogle BBB markører, de er endnu ikke at udvikle sig som den mest almindeligt BBB celle model13. Vigtigere, stamcelle afledte BBB modeller mangler at være karakteriseret med hensyn til maksimale passage numre, der tillader cellerne at opretholde stabile BBB fænotyper14.

Tre primære metoder er almindeligt anvendt til at bestemme TJ barriere integritet, herunder måling af teer, måling af tilsyneladende permeabilitet koefficient (Papp) af små hydrofile Tracer molekyler såsom saccharose, inulin, Lucifer gul, etc. og immun farvning af kendte molekylære markører af TJs såsom claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. Teer er en forholdsvis enkel og kvantitativ metode, der måler den elektriske modstand på tværs af cellen monolag dyrket på en porøs membran substrat5. TEER-værdier kan dog påvirkes af eksperimentelle variabler såsom sammensætningen af dyrkningsmediet og typen af måleinstrument. En sandsynlig kombination af disse faktorer fører til en bred fordeling af TEER værdier, der spænder fra 2 til 1150 Ω cm2 i hCMEC/D3-celle linjen, som dyrkes i 2-21 dage13. Immunofarvning er en visuel metode til at bestemme tilstedeværelsen af TJ proteiner ved at mærke det målrettede protein ved hjælp af antistoffer. Immun farvning involverer imidlertid en række eksperimentelle trin, herunder behovet for at fastsætte/permeabilize celler, der kan resultere i eksperimentelle artefakter, og de fluorescerende signaler kan falme over tid. Ovennævnte faktorer kan føre til subjektive fejl, der påvirker datakvaliteten.

Det primære fokus for dette arbejde er at præsentere en ly-baseret tilsyneladende permeabilitet analyse bestemme kinetikken af en flydende enkeltlags dannelse i dyrkede hcmec/D3 celler. Selv om andre avancerede in vitro-BBB-systemer, såsom Co-Culture-systemer, mikrofluidisk-systemer, er fysiologisk mere relevante efterligner med signifikant forbedret barriere funktion15,16,17, hcmec/D3 transwell setup er en enkel og pålidelig model til at estimere kinetikken af TJ dannelse og hurtigt screene virkningen af forskellige lægemiddel formuleringer på barriere funktion. Generelt er P-app- værdierne konsistente for forskellige hydrofilic-opløfter i hCMEC/D3-monolayers. For eksempel er de rapporterede P-app- værdier for forskellige lavmolekylære opløsningsmidler (såsom saccharose, Mannitol, ly osv.) i forskellige in vitro-BBB-modeller i rækkefølgen 10-4 cm/min5,18,19 , 20. i vores eksperimentelle opsætning, er hjernens endotelceller seedet på en kollagen-belagt Mikroporøs membran til celle fastgørelse og enkeltlags dannelse for at efterligne in vivo barrieren. Den tilføjede i den apikale side forventes at krydse de intercellulære stramme knude og ophobes i den basolaterale side. Større koncentrationer af LY i den basolaterale side indikerer en umoden, ikke-fuldt funktionel barriere, mens lavere koncentrationer afspejler begrænset transport på grund af tilstedeværelsen af funktionelle TJs, hvilket resulterer i en moden barriere.

LY er en hydrofile farvestof med særskilte excitation/emission toppe og undgår behovet for radioaktive Tracer molekyler som saccharose, Mannitol eller inulin. Således kan fluorescens værdier af LY bruges til direkte at beregne sin paracellulære permeabilitet på tværs af BBB monolayers. Sammenlignet med mange kommercielt tilgængelige farvestoffer, der anvendes i biomedicinske områder, der lider af små Stokes Skift såsom fluorescein21, er Stokes Shift of ly ca. 108 nm med tilstrækkelig spektral adskillelse, hvilket giver mulighed for at fluorescens data som en robust aflæsning for at bestemme den paracellulære permeabilitet. Vi brugte Western blotting som en ortogononal teknik til at demonstrere ændringer i udtryk for den stramme Junction markør protein, ZO-1, over kultur tid. ZO-1 udtryk detekteret via Western blotting bruges til at supplere ly Papp data og i kombination, disse data tyder på, at de observerede ændringer i ly papp værdier er reflekterende af dannelsen af en enkeltlags med gradvis stigning i udtryk for den stramme samle markør, ZO-1.

Som påpeget tidligere, det centrale fokus for dette arbejde er at demonstrere en ly analyse som en simpel teknik til at overvåge dannelsen af en flydende enkeltlags med funktionelle stramme kryds. Men for at demonstrere en ekstra nytte af den udviklede assay, vi målte LY Papp i DNA nanopartikel-transfected hCMEC/D3 monolayers. Nukleinsyrer kan kondenseres i polyelektrolyt nanopartikler med en diameter på 100-200 Nm via elektrostatisk interaktion mellem de positivt ladede grupper af polymerer og de negativt ladede fosfat grupper af nukleinsyrer22, 23. vi refererer til disse KOMPLEKSER som DNA nanopartikler (DNA NPS) i vores arbejde. Mens vores hensigt er at transficere celler og udtrykke det ønskede protein, skal vi sikre, at barriereegenskaberne af hcmec/D3 monolag ikke kompromitteres. Vores data tyder på, at en standard 4 h der gen transfektering regime ikkemålelig ændre den ly permeabilitet demonstrere nytten af ly Papp assay til at bestemme ændringer i TJ barriere integritet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. generel hCMEC/D3-cellekultur

  1. Genoplivning af frosne celler
    Bemærk: alle cellekultur vedligeholdelse og eksperimenter blev udført inde i en steril biosikkerhed hætte. Dyrkningsmedier, kosttilskud og reagenser blev enten købt som sterile produkter eller steriliseret via filtrering ved hjælp af et 0,22 μm membranfilter for at forhindre mikrobiel kontaminering.
    1. Der tilsættes 8,5 mL kollagenopløsning (0,15 mg/mL) i en vævskultur kolbe (75 cm2 vækstområde, fremover T75) og anbringes i en inkubator (37 °c, 5% Co2) i 1 time.
    2. Fjern kollagenopløsningen, og vask forsigtigt kolben med steriliseret fosfat-bufferet saltvand (PBS). 15 mL komplet vækstmedium tilsættes til kolben og efterlades i CO2 -inkubator i 15 min.
      Bemærk: det komplette medium (endelig koncentration) indeholdt endotel cellevækst basal medium-2 (500 ml) suppleret med føtal bovin serum (5%), penicillin-streptomycin (1%), hydrocortison (1,4 μM), syre ascorbinsyre (5 μg/ml), kemisk defineret lipid koncentrat (1/100), HEPES (10 mM) og grundlæggende fibroblast vækstfaktor (1 ng/mL).
    3. Flyt en cryovial af frosne hCMEC/D3-celler fra den flydende nitrogen tank, og tø hurtigt hætteglasset op i et 37 °C vandbad (< 1 min).
    4. Når kun en lille flake af is er synlig, hurtigt aspirere og overføre cellerne til kolben indeholdende præ-varmet medium. Ryst forsigtigt kolben, så cellerne blandes med vækstmediet.
    5. Kolben anbringes i inkubator (37 °C, 5% CO2), og cellerne observeres under et let mikroskop efter 2 timer for at sikre, at cellerne er fastgjort.
    6. Når cellerne er fastgøres til bunden af kolben, fjernes det gamle vækstmedium og tilsættes 10 mL frisk forvarmet vækstmedium for at erstatte dimethylsulfoxid i det gamle vækstmedium24.
    7. Efter 24 timer skal du kontrollere under et let mikroskop for at observere spindel formede celler og udskifte det gamle vækstmedium med forvarmet frisk vækstmedium.
  2. Vedligeholdelse af cellekultur
    1. Genopfyld vækstmediet hver anden dag indtil 100% sammenløbet. Kontroller cellerne under mikroskopet, før du fjerner det gamle vækstmedium og også efter tilsætning af frisk vækstmedium. Tag kolben ud af inkubatoren og Undersøg hCMEC/D3-cellerne under fasekontrast mikroskop for at sikre, at de ser sunde ud.
      Bemærk: de fleste celler bør fastgøres til bunden af kolben, har en spindel formet morfologi og ofte gange, lys refragere omkring deres membraner ses også. Vækstmediet skal være gennemsigtigt (ikke-uklart) og Rosa-orange i farve.
    2. Det gamle vækstmedium fjernes fra kolben, og 10 mL forvarmet frisk medium overføres til kolben.
      Bemærk: mediet skal tilsættes til den øverste side af kolben og ikke direkte på overfladen af cellerne for at undgå at påvirke celle vedhæftningen.
    3. Kolben sættes tilbage i vandret stilling, og den slibles forsigtigt flere gange, og hCMEC/D3-cellerne kontrolleres under mikroskopet, inden kolben returneres til inkubator (37 °C, 5% CO2).
    4. Overhold cellerne under et inverteret lysmikroskop hver gang før og efter håndtering af cellerne, både under almindeligt kultur arbejde og under eksperimenter. Registrere eventuelle mærkbare ændringer i celle nummer eller morfologi i laboratoriet notesbog.
  3. Celle passaging
    1. Der inkubates en ny T75 kolbe med 8,5 mL kollagenopløsning i 1 time i inkubator (37 °C, 5% CO2).
    2. Fjern kollagenopløsningen, og vask forsigtigt kolben med steriliseret PBS. 10 mL forvarmet hCMEC/D3-medium tilsættes til den nye kolbe, og kolben anbringes i inkubator (37 °C, 5% CO2).
    3. Tag kolben ud af inkubatoren og Undersøg hCMEC/D3-cellerne under en fasekontrast mikroskop for at kontrollere, om cellerne er 100% flydende.
    4. Fjern hCMEC/D3-celle mediet fra kolben, der indeholder celler, og vask hCMEC/D3-celler med 10 mL PBS.
      Bemærk: FBS tilsat til vækstmedium indeholder proteasehæmmere såsom α1-antitrypsin og α2-macroglobulin. Disse hæmmer trypsinization processen. Derfor er det vigtigt at vaske cellerne med PBS for at fjerne spor af FBS for at forhindre hæmning af trypsinization processen.
    5. Der tilsættes 1 mL 0,25% trypsin-opløsning indeholdende 0,02% EDTA og trypsinize i 2-5 min i inkubator (37 °C, 5% CO2) (Tap forsigtigt på kolben på siderne for at hjælpe med at løsne).
      Bemærk: Efterlad aldrig cellerne på trypsin/EDTA i mere end 6 minutter.
    6. Tilsæt 10 mL præ-varmet hCMEC/D3-medium for at standse trypsinization processen og resuspendere hCMEC/D3-cellen ved pipettering op og ned flere gange. Fjern derefter hele cellesuspensionen fra kolben til et 15 mL rør.
    7. 1 mL af cellesuspensionen overføres fra 15 mL-røret til den nye kolbe med forvarmet frisk medium (opdeling af cellerne 1:10), og den nye kolbe returneres tilbage til inkubator.
      Bemærk: før overførsel til den nye kolbe, pipetteres cellesuspensionen op og ned flere gange for at minimere celle koncentrations gradienter.

2. celle plating

  1. Placer vævskultur skær med mikroporøse membraner (porestørrelse: 0,4 μm, materiale: polyethylen terephthalat (PET)) i en 24-brønd kultur plade.
  2. Tilsæt 400 μL kollagen type i (0,15 mg/mL) i hvert vævskultur skær og Inkuber i 1 time i CO2 -inkubatoren (37 °c, 5% Co2). Klippe 24-brønd pladen forsigtigt for at tillade jævn spredning af kollagen opløsning over den mikroporøse membran i væv kultur skær.
  3. Fjern kollagenopløsningen, og vask forsigtigt den mikroporøse membran med 0,4 mL 1x PBS buffer.
  4. Plade hCMEC/D3 celler med tætheden af 50.000 celler/cm2 i cellen skær (15.000 celler i 500 μl medium).
    Bemærk: for at minimere forskellene i celle nummer i hver vævskultur indsats blev cellesuspensionen ophængt med en 10 mL pipette, før der blev tilføjet celler til skær.
  5. Placer 24-brønd pladen med vævskultur opsætning i en inkubator (37 °C, 5% CO2) for at tillade celle fastgørelse og-spredning.
  6. Inkuber pladen i 7 dage for at tillade cellerne at nå 100% konfluency. Fjern vækstmediet hver anden dag og Overfør 0,5 mL forvarmede friske medier til vævskultur skær.
  7. Gentag belægnings proceduren (trin 2.2-2.6) på en 12-brønd plade, 48-brønd plade og 96-brønd plade. Brug 12-brønd pladen til Western-blotting til at bestemme ændringer i ZO-1-udtryk. Brug 48-brønd pladen til DNA-NP-transfection. Brug 96-brønd pladen til ATP-analysen til at bestemme cellernes levedygtighed i transficeret celler.

3. kinetik af cellevækst.

  1. Frø cellerne i en densitet på 50.000 celle/cm2 i en kollagen-belagt 24-brønd vævskultur plade.
  2. På hver dag i forsøget fjernes vækstmediet, og cellerne vaskes forsigtigt to gange med 500 μL 1x PBS. Tilsæt derefter 30 μL 0,25% trypsin opløsning indeholdende 0,02% EDTA og Efterlad pladen i ca. 2-5 min i en inkubator (37 °C, 5% CO2).
    Bemærk: gradvis dannelse af konfluent-enkeltlags kan påvirke omfanget af celle frigørelse, og det er nødvendigt at øge mængden af trypsin/EDTA som angivet her: 30 μl for 1-5 dage efter såning, 60 μl for 6-7 dage efter såning og 100 μl for 8-10 dage efter såning .
  3. Tilsæt enten 470 μL, 440 μL eller 400 μL vækstmedium baseret på den mængde trypsin/EDTA-opløsning, som blev tilføjet i trin 3,2 for at tilberede 500 μL cellesuspension i hver brønd.
  4. Suspendere cellerne ved pipettering op og ned i hver brønd flere gange og observere cellerne under et mikroskop for at sikre, at alle celler er suspenderet i vækstmediet. Hvis nogle celler stadig er fastgjort til pladen bunden efter pipettering flere gange, forsigtigt skrabe cellerne ved hjælp af en plastik celle skraber for at lette celle løsrivelse.
  5. Fjern 0,1 mL cellesuspension fra 500 μL cellesuspension i trin 3,3 og tilsæt til et 1,5 mL rør. Derefter tilsættes 0,1 mL 0,4% Trypan blå opløsning til cellesuspensionen og blandes godt.
  6. Rengør en hemacytometer med 70% isopropylalkohol. Tilsæt 20 μL blanding fra trin 3,5 på hver side i V-rillen, og Find de 16 firkanter under mikroskopet. De 16 firkanter betragtes som ét gitter. Find to tilfældige gitre på hver side af hemacytometer og tælle alle de levende, ikke-blå celler.
    Bemærk: celler, der dukkede blå i farve fra udelukket fra optælling, < 1% af cellerne farves blåt på alle tidspunkter.
  7. Beregn celletætheden (celler/cm2) baseret på følgende formler.
    Gennemsnitlig antal celler/gitter = Equation 1 (EQ. 1)
    Fortyndingsfaktor = Equation 2 (EQ. 2)
    Celletæthed (levedygtige celler/cm2) =
    Equation 3
    (EQ. 3)
    Ligninger 1-3. Levedygtige celler er antallet af celler, der tælles i hvert gitter, antallet af gitre svarer til antallet af gitre placeret under mikroskopet, volumen af blanding af cellesuspension og 0,4% Trypan blå er volumen forberedt i trin 3,5, volumen af cellesuspension fjernet er mængden fjernet fra 500 μL cellesuspension i trin 3,5, mængden af cellesuspension i hver brønd er 500 μL cellesuspension fra trin 3,3, vækstområde af vævskultur plade er vækstområdet af enkelt brønd i 24-brønd plade.

4. Lucifer gul tilsyneladende permeabilitet (LY P app ) assay

  1. For at bestemme LY Papp på hver dag efter såning, skal du følge trinene starter 4,3. Til bestemmelse af P-app'en i transficeret hcmec/D3-celler tilsættes 8,3 μl af transfektering formuleringen (figur 1) blandet med 50 μl komplet vækstmedium og Inkubér i 4 h. transfektering formuleringer er beskrevet i punkt 5.
  2. Efter 4 h-transfektering vaskes den apikale side forsigtigt to gange med steril 1x PBS-buffer for at fjerne eventuel residualtransfection-blanding. Varierende mængder af PBS-buffer efterladt ved fjernelse kan påvirke koncentrationen af ly i den apikale side. Sørg for, at residualpbs-bufferen i vævskultur skær er helt fjernet. Aspirér forsigtigt de resterende reagenser og medium for at minimere cellernes løsrivelse.
    Bemærk: dette trin springes over ved måling af den synlige permeabilitet (P-app) for hCMEC/D3-celler hver dag.
  3. Fjern vækstmediet og tilsæt 1,5 mL forvarmet (37 °C) transport buffer (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mm mgcl2, 1 mm Nah2PO4,5mm glucose, pH 7,4) til den basolaterale side.
    Bemærk: mængden af transport buffer i alle basolaterale rum skal være lig med for at sikre nøjagtighed af permeabilitetskoefficiens beregning.
  4. Tilsæt 58,3 μl af 20 μM opløsning til den apikale side af hver transwell INSERT. Spar 50 μL af 20 μM-opløsningen til fluorescens målinger. Efter fjernelse af rest PBS buffer fra apikale side helt, tilsættes ly løsning så hurtigt som muligt for at undgå tørring hcmec/D3 celler. Sørg for nøjagtige volumener af ly-opløsning i den apikale side.
    Bemærk: for at minimere henfald af LY fluorescens intensitet bør lyseksponeringen begrænses. Når det rent pulver er rekonstitueret, skal opløsningen opbevares ved 4 °C, beskyttet mod lys.
  5. Der inkubates i en roterende plade shaker (37 °C, 100 rpm) i 60 min. Fjern derefter 30 μl af ly-prøven fra hvert apikale-rum. Derefter overføres 20 μM-opløsningen og de apiske side prøver til formærkede rør, og prøven fortyndes 10 gange ved hjælp af transport buffer.
    Bemærk: det er nødvendigt at fortynde 20 μM-stamopløsningen og de apiske side prøver, da disse prøvers høje fluorescens intensitet potentielt kan overbelaste og beskadige fluorescens mikropladsers fluorescendetektor.
  6. Fjern 500 μL fra hvert af de basolaterale rum, og Overfør prøven til formærkede rør.
    Bemærk: prøverne fjernes fra separate transwell på indikerede tidspunkter. Tidspunkterne er hver dag efter såning starter på dag 1 indtil dag 10.
  7. Forbered en række LY standarder for standardkurven (39,00 nM, 78,13 nM, 156,25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
  8. Der tilsættes 100 μL af hver standard (i to eksemplarer), apisk og basolsidet prøve til hver brønd i en sort 96-brønd plade (figur 1).
    Bemærk: sorte plader absorberer lys og reducerer baggrund og fluorescens crossover blandt brønde.
  9. Brug en fluorescens mikroplade læser (sæt punkter: excitation 428 nm, emission 536 nm) til at måle den LY fluorescens intensitet til at beregne Papp. Der anvendes en fluorescens plade læser til dette studie.
  10. Beregn Papp og% ly Recovery værdier som beskrevet i manuskriptet tekst.
    Ligning 4. Formler til beregning af P-app- værdier.
    Beregn den tilsyneladende permeabilitet (Papp) koefficient og% ly opsving ved hjælp af følgende ligninger. Det skal bemærkes, at Papp værdier kan beregnes enten baseret på masse25 eller koncentration af ly.
    Equation 4 EllerEquation 5
    VA -volumen i det apikale rum
    VB -volumen i det basolaterale rum
    A-overfladearealet af transwell-skærmembranen (0,3 cm2)
    Ma0 -den oprindelige masse i det apikale rum
    ΔMB/Δt-ændring af massen over tid i det basolaterale rum
    CA0-den indledende koncentration i det apikale rum
    ΔCB/Δt-ændring i koncentrationen over tid i det basolaterale rum.
    Ligning 5. Formler til beregning af% ly opsving.
    Genopretning (%) = Equation 6
    Maf er massen i det apiske rum ved sluttidspunktet, mBF er massen i det basolaterale rum ved sluttidspunktet, ma0 er den oprindelige masse i det apiske rum. 26 Bemærk: den oprindelige masse beregnes på grundlag af volumenet af 20 μM-opløsningen i trin 4,5. Dette eksperiment blev altid gjort ved hjælp af celler under passage nummer 35 og blev gennemført fire uafhængige gange.

5. calciumdepletering

  1. Fjern vækstmediet fra transwell skær og 12-brønd plade og vask forsigtigt den apikale side og 12-brønd plade ved hjælp af præ-varmet calcium frit medium (minimum Essential medium Eagle spinner (S-MEM) medium) for at fjerne calcium ioner fra transwell skær og 12-brønd plade.
  2. Tilsæt 500 μL eller 2 mL forvarmet S-MEM 1xmedium til skær eller 12-brønd plade og Inkuber i 24 timer i inkubator (37 °C, 5% CO2). Efter inkubation fjernes S-MEM 1x-mediet, og cellerne vaskes én gang med forvarmet 1x PBS-buffer.
  3. Følg trin 4.4-4.10 beskrevet i afsnit 4 for at få behandling og efterfølgende trin. Følg trin 8.1.2-8.2.4 beskrevet i afsnit 8 for Western blotting og efterfølgende trin.

6. transfection

  1. Fremstilling af DNA-nanopartikler (DNA-NP'er).
    1. Stamopløsningen af gWIZ-Luc plasmid fortyndes i 10 mM natriumacetat (NaAc) buffer (pH 5,0) og lader DNA-opløsningen stå i 10 min ved stuetemperatur (RT).
      Bemærk: DNA-NP, der indeholder overvejende enkelte DNA-molekyler, kan tilberedes ved DNA-koncentrationer 20-40 μg/mL23. Således skal gWIZ-Luc plasmid stamopløsning fortyndes. Den frosne gWIZ-Luc plasmid bestand skal optøet helt på is for at minimere temperatur stress. Vortex forsigtigt den fortyndede DNA-stamopløsning i 30 s på en standard bordplade vortexer indstillet på knop position 3-5.
    2. Beregn de ønskede N/P nøgletal, der bruges her som en numerisk parameter til at afspejle NP sammensætning.
      Equation 7
      Ligning 6. N/P ratio beregning: forholdet mellem modermærker af amin grupper af kationiske polymerer til dem af fosfat grupper af DNA. Masse af kationiske polymerer: samlet vejet mængde af kationisk polymer; (Masse/opladning) kationiske polymerer refererer til molekylvægten af kationisk polymer (poly (ethyleneglycol) 5k-blok-polyaspartamid med 48 diethylenetriamin sidekæder (peg-det)) normaliseret til antallet af ladede primære aminer (48) pr. kationisk polymer ( mol/mol), er denne værdi for vores polymer 306 da; DNA-masse: den samlede mængde DNA, der anvendes i formuleringen, ved at multiplicere volumen og koncentration i mg/mL (Masse/opladning) DNA refererer til den molekylære vægt af DNA normaliseret til antallet af fosfatgruppe pr dobbeltstrenget dna (325 da per nucleobase).
      Bemærk: DNA NP-forberedelses tabellen (tabel 1) indeholder formulerings opskriften til de forskellige prøver, som testes i vores eksperimenter. DNA NP blev fremstillet ved hjælp af en hurtig titrerings teknik. Den PIND-det polymeropløsning blev tilføjet langs væggene i røret, mens du holder røret i en horisontal position. Derefter blev røret skiftet til en lodret position, efterfulgt af hurtigt vortexning ved maksimal hastighed for 10s. DNA-NP fik lov til at stå i 30 min ved RT før brug. Tommelfingerreglen for DNA-NP-dosering er 0,5 μg DNA for ca. 1 cm2 vækstområde. Så for hver transwell indsætte/hver brønd i en 48-brønd plade/hver brønd i en 96-brønd plade, forberede DNA NP på N/P 10 indeholdende 0.157/0,5/0.195 μg/brønd af gWIZ-Luc DNA.
    3. For prøver, der indeholder angivet koncentration af Poloxamer P84 (P84), tilsættes P84 til DNA NP og vortex i 5 s. Den endelige koncentration af P84 i hver prøve er enten 0,01% eller 0,03% WT.
  2. DNA-NP-transfektering i en 48-brønd plade opsætning
    1. Frø cellerne med tætheden af 50.000 celle/cm2 i en 48 brønd plade og vokse indtil sammenløbet i inkubator (37 °c, 5% Co2).
    2. For hver behandlingsgruppe blandes 25 μL af den angivne prøve (transfection formulering) og 150 μL af komplet vækstmedium og 175 μL af denne blanding til hver brønd.
    3. Overhold hCMEC/D3-cellerne under et mikroskop for at sikre, at cellerne ser sunde ud og er 100% flydende på tidspunktet for forsøget.
    4. Fjern vækstmediet fra brønde og 175 μl transfektering blanding til hver brønd. Derefter Inkubér pladen i 4 timer i rugemaskine (37 °C, 5% CO2).
    5. Efter 4 timer fjernes transfektering blandingen og vaskes hcmec/D3-cellerne med forvarmet steril 1x PBS-buffer.
      Bemærk: for at minimere utilsigtet løsrivelse af hCMEC/D3-celler fra pladen/skæroverfladen under vaske trinene, skal du forsigtigt pipettere nok sterile PBS langs væggene i brøndene og fjerne eventuelle nanopartikler i de resterende kultur medier.
    6. Sæt forsigtigt pladen et par gange, og sug forsigtigt PBS-vasken ud og kassér den, og tilsæt 500 μL hCMEC/D3 præ-opvarmet kulturmedium.
    7. Mikroskopisk undersøge cellerne og registrere observationer på celle morfologi og eventuelle virkninger af transfection.
    8. Inkubér i 24 timer i 37 °C-celle kulturvækklæden for at tillade luciferaseproduktion. Efter 24 h, fjerne vækstmedium helt og vaske cellerne en gang med præ-varmet 1x PBS.
    9. Lysere de transficeret celler ved at tilføje 100 μl iskold der cellekultur lysis 1x reagens per brønd.
    10. Til måling af luciferaseprotein indholdet tilsættes 20 μl celle lysat og 100 μl der-analyse buffer (20 mm glycylglycin (pH 8), 1 mm mgcl2, 0,1 mm EDTA, 3,5 mm DTT, 0,5 mm ATP, 0,27 mm coenzym A) til et 1,5 ml rør.
    11. Læs luminescens af den prøve, der er beskrevet i trin 6.2.10 på et Luminometer med en enkelt auto injektor.
      Bemærk: luminescens skal integreres over 10 s før læsning.
    12. Måle den samlede mængde af cellulært protein i lysbilledet ved hjælp af en bicinchonininsyre assay (BCA assay) kit ved at følge producentens protokol.
    13. Beregn og ekspres der-genekspression som relative lysenheder (RLU) pr. samlet cellulært protein.

7. luminescerende ATP-analyse

  1. Frø cellerne med tætheden af 50.000 celle/cm2 i en 96 brønd plade og vokse indtil sammenløbet i inkubator (37 °c, 5% Co2).
  2. Transfect cellerne med 9,7 μl af transfektering formuleringen (Præparations detaljer er i punkt 6) og 58,4 μl af komplet vækstmedium for 4 h.
  3. Fjern transfektering blandingen og vask forsigtigt cellerne med præ-varmet PBS 1x buffer to gange for at fjerne behandlings reagenserne helt.
    Bemærk: forskellige volumener af rest buffer kan fortynde ATP-analyse reagenserne i forskelligt omfang og kan potentielt påvirke dataene.
  4. Bland 75 μL frisk forvarmet medium og ATP-analyse reagens i en 1:1-fortynding ved hjælp af en multikanals pipette. Sørg for, at væskeniveauet i alle flerkanals pipettespidser er det samme.
  5. Anbring pladen på en nuterende shaker i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter 15 minutters tilsætning af reagenserne overføres 60 μL af hver prøve til en hvid 96-brønd plade.
    Bemærk: hvide plader er bedre at afspejle output lys end klare eller sorte plader.
  6. Pop eventuelle luftbobler ved hjælp af en nål før du læser pladen. Læs pladen på et luminometer med en 1 s integrationstid. Læs pladen inden for 20 minutter efter tilsætning af ATP-analyse reagenser. Timing er afgørende for sammenligning på tværs af forskellige plader, fordi luminescens signalet er forbigående med en hurtig henfalds hastighed.
  7. Beregn procentdelen (%) cellelevedygtighed ved hjælp af denne formel: (luminescens af transficeret celler/luminescens af kontrol, ubehandlede celler) x 100.

8. Western blotting til måling af stramt Junction protein ZO-1

  1. Cellelyse og protein udvinding
    Bemærk: alle trin til proteinekstraktion fra celler skal udføres ved 2-8 °C.
    1. Frø cellerne med en densitet på 50.000 celle/cm2 i en kollagen-belagt 12-brønd vævskultur plade.
    2. På dag 3, dag 5, dag 7, dag 10 efter såning og på dag 7 (celler præ-inkuberet med calcium frit medium), fjerne vækstmediet og forsigtigt vaske cellerne to gange med 2 mL iskold 1x PBS. Tilsæt derefter 300 μL blanding af iskold 1x RIPA lysis buffer indeholdende 3 μg/mL aprotinin i hver brønd.
      Bemærk: blandingen skal være frisklavet og holdes på is. Aprotinin anvendes til at hæmme proteaser, der er til stede i lysater, fra at forringe interessen for proteinet.
    3. Efter to fryse-tø cyklusser (-80 °C), skrabe cellerne ved hjælp af en kold plastik celle skraber. Saml celle lysaterne i mikrofuge rørene. Derefter centrifugeres rørene ved 200 x g i 30 minutter ved 4 °c.
    4. Saml supernatanten i rene rør og Placer dem på is. Måle den samlede mængde af cellulært protein i lysaterne ved hjælp af BCA assay kit ved at følge producentens protokol.
  2. Western blotting til påvisning af stramt Junction protein ZO-1
    1. Denature aliquoter af total homogenater indeholdende 40 μg total protein med 1x Laemmli buffer ved 95 °C, 5 min og underlagt elektroforese i en reducerende 6-7,5% natriumdodecyl sulfat polyacrylamid gel (SDS-side) (90 V, 10 min gennem stabling gel, 120 V gennem løsning af geler).
      Bemærk: når du indlæser prøverne eller standarderne, skal du huske at indlæse langsomt og forsigtigt i hver bane, idet du er omhyggelig med ikke at bryde brønden i processen.
    2. De separerede proteiner overføres til en nitrocellulose membran med pH 8,5 Transfer buffer, som indeholder 192 mM glycin, 25 mM Tris base, 10% methanol og 0,1% SDS (75 V, 110 min ved stuetemperatur).
      Bemærk: rør ikke ved membranen. Brug 70% isopropanol-vasket plastik tang til at håndtere membranen. For at kunne overføre ZO-1-proteinet (MW 200 kDa) til membranen skal pH være omkring 8,3-8,5. Hvis overførselsbufferen er mere sur end det, ville overførslen ikke ske. Hvis stigen bands er synlige stadig på gelen, ville det være nyttigt at øge overførings tiden og SDS koncentration.
    3. Efter vask af membranen ved hjælp af Tris-bufferet saltvand indeholdende 0,1% Tween 20 (T-TBS), brug blokerende løsning (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris Buffered saltvand) at blokere membranerne for 60 min.
    4. Skær forsigtigt membranen i to strimler. Inkubatorer med to primære antistoffer (ZO-1 monoklonalt antistof, fortynding, 1:900 og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)-antistof, fortynding, 1:10.000) natten over ved 4 °C. Derefter inkubatér ZO-1 og GAPDH membraner med æsel anti-Mouse IgG (fortynding, 1:50000). Efter vask af membraner ved hjælp af T-TBS, billede membranerne i 700-kanalen på en 16-bit Imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For det første fastsatte vi effekten af dyrkning tid på LY permeabilitet til at bestemme den tilsyneladende kinetik af TJ dannelse. De gennemsnitlige Papp værdier fra dag 1 til 10-post såning er vist i figur 2a. På dag 1, den gennemsnitlige Papp var 4,25 x 10-4 cm/min og lidt faldt til 3,32 x 10-4 cm/min på dag 2. Den gennemsnitlige Papp værdi steg lidt til 3,93 x 10-4 cm/min på dag 3 og svingede uden væsentlige ændringer indtil dag 6. P-appens værdier faldt markant til 2,36 x 10-4 cm/min på dag 7 sammenlignet med dag 1 (p < 0,05), hvilket formentlig antyder, at barrieren blev strammere. Papp værdier stabiliseret i intervallet mellem 2,14 x 10-4 og 2,36 x 10-4 cm/min fra dag 7 til dag 10, hvilket indebar, at barrieren dannelse var komplet og funktionel resulterer i nedsat ly paracellulær transport. Vi beregnede procentdelen (%) På hver dag for at være ca. 80%, en værdi, der anses for optimal til pålideligt at beregne Papp- værdien27 (FiGure 2b). Recovery% er et vigtigt indeks i LY assay. For eksempel, hvis cellerne metabolisere mest, LY er immobiliseret i celler eller pinde til cellemembranen eller groft nedbrydes under inkubationen, ville det være ukorrekt at fortolke, at observeret svagt signal i basolaterale rum indikerer en stram barriere. Således opsving% giver mere tillid til, at vi ikke mister betydelige mængde af LY på grund af en eller flere af de ovennævnte muligheder og gør det muligt at trygt anslå LY Papp værdier. Som tidligere nævnt i introduktions afsnittet indikerer større koncentrationer af LY i den basolaterale side en ufuldstændig barriere, mens lavere koncentrationer afspejler begrænset transport, hvilket tyder på en moden, fuldstændig barriere på grund af tilstedeværelsen af funktionelle Tjs. Vi præsenterer også yderligere beviser ved hjælp af en ortogononal teknik, Western blotting detektion af ZO-1 protein (figur 4), at bekræfte, at de observerede ændringer i ly Papp korrelerer med dannelsen af stramme kryds.

Da Trans-INSERT-opsætningen ikke tillader direkte sporing af ændringer i celletætheden, fastsatte vi ændringer i celletætheden ved hjælp af en standard Trypan blå eksklusions analyse. Vi fastsatte derfor ændringerne i celletætheden på en transparent vævskultur plade, som let tillod os at overvåge cellevækst kinetikken. Stigningen i celletætheden fra 5,5 ± 1,0 x 104 celler/cm2 til 1,9 ± 0,2 x 105 celler/cm2 fra dag 1 til 10-post såning (figur 3) var lineær med en regressions koefficient på 0,94. Disse data tyder også på, at de observerede ændringer i ly Papp (figur 2a) er et resultat af dannelsen af en flydende enkeltlags i løbet af 10-dages periode. Vi observerede cellerne under en inverteret lys mikroskop på hver dag og visuelt dokumenteret en gradvis stigning i celle nummer og enkeltlags dannelse.

Vi brugte Western blotting til at opdage ændringer i ekspression af den stramme Junction protein ZO-1 over tid (figur 4). Ændringerne i ZO-1 ekspression bruges til ortogonelt supplere LY Papp data og for at sikre, at de observerede ændringer i ly papp indikerer dannelsen af en stram barriere. ZO-1-bånd intensiteterne blev analyseret ved densitometri og normaliseret i forhold til ekspression af et husholdnings-gen, GAPDH. De to bands i figur 3a repræsenterer de to zo-1 isoformer (zo-1α+ og zo-1α-)28. Densitometri analyse afslørede, at pixelværdien af ZO-1 steg fra dag 3-7 efter såning, hvilket tyder på, at TJ-proteinet ZO-1 blev dannet kontinuerligt fra dag 3-7. Efter calcium nedbrydning behandling på dag 7 efter såning, bandet af ZO-1 var næsten målbart, hvilket indikerer, at ZO-1 ikke var i stand til at danne i fravær af calcium ioner. Desuden faldt pixelværdien af ZO-1 markant ved dag 10 efter såning. De signal intensiteter af gapdh fra dag 3-10 dukkede var sammenlignelige, undtagen på dag 7, når cellerne blev behandlet med calcium-fri medium. En mulig årsag til den nedre GAPDH ekspression i calcium-behandlede celler kan skyldes det mindre totale protein (28,9 μg total protein), igen, sandsynligvis på grund af calcium udtømning. Samlet set viste bandet densitometri-analyse en gradvis stigning i ZO-1-ekspression (i forhold til GAPDH) indtil dag 7 og et fald i ekspression på dag 10, når celler dyrkede i komplet vækstmedium. Analysen afslørede også et lavere ekspression af ZO-1 (i forhold til GAPDH) på dag 7 i celler behandlet med calciumfri medium.

Mens fokus for dette arbejde er at præsentere ly Papp assay som en metode til at bestemme kinetikken af en enkeltlags dannelse, at demonstrere en ekstra nytte af den udviklede assay, vi besluttede, om DNA NP transfektering påvirket TJ barriere integritet ved at måle LY Papp gennem hCMEC/D3 celler 4 h post-transfection (figur 5). Vores DNA-NP'er indeholdende Poloxamer P84 mægle høje niveauer af genekspression i den svære at transfect hCMEC/D3 cellelinje (figur 6a). Specifikt, vi ønskede at afgøre, om de hydrofobe domæner poloxamer P84 i vores DNA NPS kan forstyrrer TJ integritet i transficeret celler. De%, der blev genfundet i hver behandlingsgruppe, var ca. 92%, hvilket tyder på, at de beregnede P-app- værdier er pålidelige (figur 5b). Vi bemærkede, at transfektering procedure ved hjælp af forskellige formuleringer ikke påvirkede ly Papp, i forhold til ikke-transfected celler udsat for ly alene. Ekstracellulært calcium er en kritisk komponent til vedligeholdelse af celle-celle-vejkryds i forskellige celletyper29,30,31, herunder hjernen Micro Vessel endotel celler. Således, opretholde celler i calciumfri medium (cfm) fører til forstyrrelse af tjs32,33. Derfor brugte vi celler, der blev behandlet med CFM i 24 timer, som en positiv kontrol.

Vores data viser, at LY Papp for celler inkuberet med cfm var 2-fold højere sammenlignet med kontrol celler inkuberet med den regelmæssige vækstmedium. Denne 100% stigning i Papp tyder på, at cellerne havde mistet deres tjs på grund af tabet af calcium ioner er nødvendige for dets dannelse. Især var den faktiske værdi (5,14 x 10-4 cm/min) lidt højere end den gennemsnitlige Papp værdi fra dag 1-6 efter såning (figur 2), når tjs endnu ikke var fuldt dannet. Omend ikke signifikant, celler transficeret med DNA NP indeholdende 0,01-0,03% poloxamer P84 viste en lille stigning i ly Papp værdier sammenlignet med de ubehandlede celler vedligeholdes i regelmæssig kulturmedium. Denne observation antydede, at DNA NP + P84 transfektering ikke havde nogen signifikant indvirkning på TJ-barriere integriteten. Samlet set de ly Papp værdier i de transficeret celler ca gennemsnit til 2.5 x10-4 cm/min og denne værdi svarede til den gennemsnitlige værdi noteret i dag 7-10 efter såning (figur 2), når ly Papp var den mindste, tyder på tilstedeværelsen af funktionelle TJs, der effektivt begrænset, paracellulær transport.

Vi præsenterer yderligere transfektering data for at vise, at manglen på ændringer i ly Papp (figur 5) er ikke en ligegyldig observation. På trods af de høje niveauer af transfektering observeret i DNA NPS + P84 gruppe, vi bemærkede ingen ændringer i ly Papp tyder på, at vores formuleringer ikke forstyrrer TJ barrieren. Den relativt lave transfektering effektivitet i de nøgne DNA-behandlede celler er typisk, fordi den anioniske karakter af plasmid DNA (på grund af fosfat grupper i sin rygrad) og dens hydrofile natur grænse cellulære optagelse. DNA kondenseret i DNA-NP medierede en 50-fold stigning i transfektering sammenlignet med nøgen pdna (figur 6). Tilsætning af 0,01% P84 til DNA-NP resulterede i en 18-fold stigning sammenlignet med DNA NP-alene (P < 0,01). Forøgelse af P84 koncentrationen til 0,03 WT.% resulterede i en 30-fold stigning sammenlignet med DNA NP-alene (P < 0,001). Disse resultater er bemærkelsesværdige, da hjernen endotelceller er en svær at transfect celletype.

Vi målte celle levedygtigheden af celler transficeret under forskellige betingelser for at bekræfte, at transfektering procedure ikke forårsager celle stress. Adenosin trifosfat (ATP) er energi valutaen i livet og afspejler cellulære metaboliske funktion. Vi brugte en luciferase-baseret ATP-analyse, hvor luminescens værdierne er direkte proportional med ATP-niveauerne. Possimo et al. rapporterede, at luminescens ATP-assay var et robust mål for metabolisk cellelevedygtighed34. Celle levedygtigheden af hCMEC/D3-celler transficeret ved de forskellige formuleringer var sammenlignelig med ubehandlede celler (figur 5b), hvilket tyder på, at ATP-niveauerne også var ens. Derfor er DNA-NP'er, der indeholder Poloxamer P84 (0,01% til 0,03% w/w), sikre genleverings formuleringer.

Figure 1
Figur 1 . Eksperimentel opsætning for ly P -appen undersøgelse. 24-brønd plade setup indeholdende transwell skær (tilpasset til at vise DNA nanopartikel transfektering som et eksempel, data i figur 5). Hver kolonne blev behandlet med den indikerede prøve for 4 h. kontrol indikerer hCMEC/D3 celler behandlet med komplet vækstmedium mens calcium udtømning 24 h indikerer, at cellerne blev inkuberet med calcium frit medium forud for LY eksponering. Den rigtige skabelon viser LY måling af fluorescens intensitet i en sort 96-brønd plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Den tilsyneladende kinetik af TJ-barriere dannelse bestemt ved hjælp af ly P -appen analyse. (a) ly P app gennem hcmec/D3 monolag kulturperler på transwell skær blev målt daglige post-såning celler. b)% inddrevet i hver behandlingsgruppe. Data repræsenterer gennemsnitlige ± SD af to uafhængige eksperimenter (n = 3/eksperiment). Der blev foretaget statistiske sammenligninger ved hjælp af uparret t-test (*P< 0,05, N.S. ikke signifikant). Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 . Kinetik af cellevækst bestemmes ved hjælp af en Trypan blå eksklusions analyse. hCMEC/D3 celler blev seedet i en 24-brønd plade ved en celletæthed på 50.000 celler/cm2. På hver dag i forsøget blev cellerne dissocieret og blandet med et tilsvarende volumen på 0,4% Trypan blå, før de regnede med levedygtige celler på et hemacytometer. Data repræsenterer gennemsnitligt ± SD af tre uafhængige målinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Tilsyneladende kinetik af zo-1 ekspression detekteret ved hjælp af Western blotting. a) hCMEC/D3-cellerne blev seedet i en 12-brønd plade ved en celletæthed på 50.000 celler/cm2. På hver dag i forsøget (dag 3, dag 5, dag 7 og dag 10-efter såning) blev cellerne lyseres med 400 μl af 1x Ripa-buffer indeholdende 3 μg/ml aprotinin. Celle lysater indeholdende 40 μg total protein blev indlæst på en 4-7,5% SDS-polyacrylamid gel. b) densitometri-analyse tillod normalisering af ekspression af zo-1-protein til gapdh. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5 . Virkninger af DNA-NP-transfektering på TJ-barriere tæthed målt ved hjælp af ly P -appen analyse. a) hcmec/D3-celler blev dyrket på transwell-skær i 7 dage, transficeret med peg-det indeholdende gwizluc plasmid-DNA med/uden pluroniske P84 i 4 timer og derefter erstattet med præ-opvarmet transport buffer, der indeholder 50 μM i 1 time. kontrol repræsenterer hCMEC/D3-cellerne inkuberet med vækstmedium i 4 timer efterfulgt af udsættelse (n = 4, *P< 0,05, N.S. ikke signifikant). b)% inddrevet i hver behandlingsgruppe, de fremlagte værdier er gennemsnitlige ± SD (n = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 6
Figur 6 . DNA-NP'er mægle høje niveauer af transgenekspression i hcmec/D3-monolag. a) hcmec/D3-celler blev dyrket 7 dage og transficeret med peg-det indeholdende gwizluc plasmid-DNA med/uden pluroniske P84 (N/P 10, DNA-dosis pr. brønd: 0,5 μg) i 4 timer blev transfektering-blandingen fjernet, og cellerne blev dyrket i 24 timer i fuld vækst medium før måling af genekspression. Niveauerne af der-genekspression blev udtrykt som relative lysenheder (RLU) nornaliseret til det totale cellulære proteinindhold. Data præsenterer gennemsnitlige ± SD af tre uafhængige eksperimenter. Der blev foretaget statistiske sammenligninger ved hjælp af uparret t-test (* * p< 0,01, * * * p< 0,001). b) DNA-NP'er er sikre transfektering formuleringer i hcmec/D3-monolayers. Virkningerne af DNA-DNA-NP-transfektering på cellernes levedygtighed blev evalueret ved hjælp af en luminescerende ATP-analyse. hCMEC/D3-celler blev transficeret med de indikerede prøver i 4 timer, hvorefter ATP-analysen blev udført ved at følge producentens protokol. Procent (%) cellernes levedygtighed blev beregnet på følgende måde: (luminescens af transficeret celler/luminescens af kontrol, ubehandlede celler) x100. Data repræsenterer gennemsnitlige ± SD af to uafhængige eksperimenter (n = 3/eksperiment). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Eksperimentel opsætning Eksempel navn Volumen på 1mg/mL plasmid-DNA (μL) Volumen på 10 mM NaAc buffer, pH 5 (μL) Volumen på 5 mg/mL polymer (μL) Volumen på 10% w/w. P84 (μL) Volumen af vækstmedium (μL)
Vævs kulturen indsætteren Kontrol, ubehandlede celler 0 0 0 0 58,3
Nøgne DNA 0,157 8,143 50
DNA NP 7,843 0,3
DNA NP + 0,01% P84 7,6681 0,1749
DNA NP + 0,03% P84 7,26 0,0583
48-brønd plade Kontrol, ubehandlede celler 0 0 0 0 175
Nøgne DNA 0,5 24,5 150
DNA NP 23,56 0,94
DNA NP + 0,01% P84 23,385 0,175
DNA NP + 0,03% P84 23,035 0,525
96-brønd plade Kontrol, ubehandlede celler 0 0 0 0 68,1
Nøgne DNA 0,195 58,4
DNA NP 9,35 0,37
DNA NP + 0,01% P84 8,9307 0,0681
DNA NP + 0,03% P84 9,0669 0,2043

Tabel 1. De NP-formuleringer, der anvendes til at indhente de indberettede data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En central rolle i BBB er at forhindre udveksling af ikke-væsentlige ioner og giftige stoffer mellem det systemiske kredsløb og hjernen til at opretholde hæmostase af neurale mikromiljø. Et af de karakteristiske træk ved BBB er evnen af de kapillar endotelceller til at danne stramme kryds (TJs), der effektivt forsegle den paracellulære rute transport. Vi demonstrerede en LY Papp assay som en kvantitativ metode til at bestemme den tilsyneladende KINETIK af TJ barriere dannelse i kulturperler hCMEC/D3 monolayers. ZO-1 ekspression detekteret via Western blotting ortogonalt valideret data fra ly Papp undersøgelser som diskuteret i detaljer i det følgende afsnit. Som en ekstra nytte af den udviklede assay, vi yderligere påvist, at DNA NP transfektering ikke måleligt ændre ly Papp angiver egnetheden af denne analyse til at bestemme ændringer i TJ barriereegenskaber i en eksperimentel opsætning.

Western blot data afslørede en klar stigning i ZO-1 ekspression på dag 3, 5, 7-efter såning og en lille reduktion på dagen 10-post såning (figur 4a). Fra figur 1, kan det ses, at ly Papp faldt fra dag 1-7 efter såning tyder dannelsen af tjs. Efter behandling med calciumdepletering viste LY P-appen en markant stigning (figur 2a), mens zo-1-ekspressionen viste markant reduktion (figur 4a). Ekstracellulært calcium er en kritisk komponent til vedligeholdelse af celle-celle-vejkryds i forskellige celletyper29,30,31, herunder hjernen Micro Vessel endotel celler. Mangel på calcium i vækstmediet forstyrrede og dissocierede TJs33. Som forventet var Papp værdien af calcium-depleterede celler signifikant højere end de ubehandlede celler og tæt på papp værdien af de tomme skær, der ikke indeholder celler (figur 2a). Den LY afslørede en stabil plateau i Papp værdier fra dag 7-10 efter såning (figur 2a) tyder på, at barrieren var fuldt dannet af dag 7, der resulterede i begrænset transport til den basolaterale side. De vestlige blot data viste et lille fald i ZO-1-ekspression på dag 10 sammenlignet med dag 7-efter såning. Denne forskel i observation er sandsynligvis på grund af bidraget fra andre ekstracellulære proteiner, bortset fra ZO-1, i at opretholde barriere tæthed. Sammenfattende har vi med held brugt data fra to ortogonale teknikker til at bestemme kinetikken af stramme Junction barriere dannelse i en menneskelig celle model af BBB. Mens LY Papp- analysen målte funktionaliteten af TJ-barrieren, sporede de vestlige blot data dannelsen af tjs ved hjælp af zo-1 som markør protein.

Som en ekstra nytte af den udviklede analyse, bekræftede vi, at DNA NP transfektering i hcmec/D3 monolag ikke påvirker integriteten af tjs (figur 5). Ubehandlede celler inkuberet med vækstmedium blev brugt som den negative kontrol og celler præ-inkuberet med calcium frit medium for 24 h blev brugt som en positiv kontrol. Celler, hvor TJs blev forstyrret som følge af calciumdepletering viste en 210% stigning i LY Papp i forhold til de ubehandlede celler. Vores data tyder på, at DNA NP transfektering enten i nærværelse af eller fravær af P84 påvirker ikke TJ integritet. Det skal bemærkes, at manglen på ly Papp ændringer i transficeret celler er ikke en ligegyldig observation. I virkeligheden, vores DNA NPS mægle betydelige niveauer af genekspression i den svære at transfect hcmec/D3 monolag9,35,36,37. DNA-NP'er, der indeholder 0,01 eller 0,03 WT.% P84 øget der-genekspression med henholdsvis ca. 18 og 30 gange sammenlignet med DNA-NPS alene (figur 6a). Vi har også påvist, at vores NP-behandlinger ikke påvirker de cellulære ATP-niveauer negativt, der anvendes her som indikator for funktionel cellelevedygtighed (figur 6b). Vores resultater understreger den udvidede nytte af denne ly Papp assay til at bestemme TJ barriere integritet i en eksperimentel transfektering setup.

Et kritisk skridt i udførelsen af ly assay er at holde den samme mængde af ly i apikale side og samme volumen af transport buffer i den basolaterale side på tværs af de forskellige tidspunkter i hele eksperimentet. Hvis der blev anvendt forskellige mængder af LY eller ulige transport buffer i brønde, ville beregningen af P-appen være upålidelig, hvilket resulterede i kunstigt store standardafvigelser. Et andet kritisk aspekt er at begrænse lys eksponering for at minimere henfald af LY fluorescens intensitet. Også, væsken skal fjernes helt, før du tilføjer nøjagtig samme volumen af ly opløsning og transport buffer i apikale side og basolaterale side, hhv. Dette sikrer, at fluorescens udlæser kan bruges pålideligt til Papp beregning. Et andet kritisk skridt i dette eksperiment er straks at måle den direkte fluorescens af de basolaterale prøver og undgå behovet for at fryse prøverne efter indsamlingen. Underkaste de LY-holdige prøver at fryse-tø cyklusser resulterer i en større intra-gruppe variation af fluorescens signal. En begrænsning af brugen af transwell setup er, at de levende celler er svære at blive visualiseret ved konventionel mikroskopi eller afbildet af Konfokal mikroskopi. Desuden er det ikke let oversætte til en opsætning, der tillader Co-dyrkning forskellige celletyper, medmindre blandet dyrkning af sige, gliaceller og endotelceller er en mulighed. Ikke desto mindre har LY-analysen følgende fordele: LY er et farvestof med særskilte excitation/emission toppe og et relativt stort Stokes Skift sammenlignet med farvestoffer som natriumfluorescein, som giver mulighed for en robust måling af sonden krydser BBB og undgår behovet for yderligere radioaktiv som for røbestoffer som saccharose eller mannitol. Højt opsving% s af LY giver pålidelige data til trygt at beregne Papp værdier.

Baseret på vores resultater konkluderer vi, at LY Papp- metoden er en enkel og robust analyse til at kvantificere den paracellulære permeabilitet på tværs af hCMEC/D3 Cell monolayers. Ved at bruge LY Papp metode, vi optimeret kulturen tid til dannelsen af intakt barriere, og vi viste en ekstra nytte af den udviklede assay ved at bestemme TJ integritet i DNA NP-transfected celle monolayers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for den finansielle støtte fra 2017 nye investigator Award fra American Association of Pharmacy, en Hunkele frygtede sygdom Award fra Duquesne University og School of Pharmacy start-up midler til Manickam laboratorium. Vi vil gerne takke Læklaboratoriet (Duquesne University) for Western blotting assistance og tillade brug af deres Odyssey 16-bit Imager. Vi vil også gerne inkludere en særlig påskønnelse af Kandarp Dave (Manickam Laboratory) for at få hjælp til Western blotting.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15, (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10, (1), 16 (2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10, (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10, (1), 16 (2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability? European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43, (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6, (8), 650 (2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. The Blood-Brain Barrier. Springer. 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25, (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140, (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4, (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).
  25. Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10, (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2, (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33, (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272, (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9, (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4, (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77, (2), 265-274 (2011).
Lucifer Yellow-en robust Paracellulær permeabilitet markør i en celle model af humant blod-hjerne barrieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter