Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Lucifer geel-een robuuste Paracellulaire permeabiliteit marker in een Celmodel van de menselijke bloed-hersen barrière

doi: 10.3791/58900 Published: August 19, 2019

Summary

We presenteren een fluorescentie test om aan te tonen dat Lucifer Yellow (LY) een robuuste marker is om de schijnbare paracellulaire permeabiliteit van hCMEC/D3 celmonolagen te bepalen, een in vitro model van de menselijke bloed-hersen barrière. We gebruikten deze assay om de kinetiek van een confluente monolaag-formatie in gekweekte hcmec/D3-cellen te bepalen.

Abstract

De bloed-hersen barrière BBB bestaat uit endotheliale cellen die een barrière vormen tussen de systemische circulatie en de hersenen om de uitwisseling van niet-essentiële ionen en giftige stoffen te voorkomen. Nauwe kruisingen (TJ) dichten de paracellulaire ruimte in de monolagen effectief, wat resulteert in een intacte barrière. Deze studie beschrijft een LY-gebaseerde fluorescentie test die kan worden gebruikt om de schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (P-app) te bepalen en kan op zijn beurt worden gebruikt om de kinetiek van de vorming van confluente monolagen te bepalen en de resulterende nauwe junctie barrière-integriteit in monolayers van hCMEC/D3. Verder demonstreren we een aanvullend nut van deze assay om de functionele integriteit van TJ in getranssinfecteerde cellen te bepalen. Onze gegevens uit de LY Papp assay toont aan dat de hCMEC/D3-cellen die in een trans well-opstelling zijn gesekt, effectief de grens van de paracellulaire transport 7 dagen-post cultuur beperken. Als aanvullend nut van de gepresenteerde testtonen we ook aan dat de transfectie van de DNA-nanodeeltjes het paracellulaire transport in monolayers van hCMEC/D3 niet verandert.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bloed-hersen barrière (BBB) is de beschermende barrière de instroom van plasma componenten in het hersenweefsel te beperken en bestaat uit hersen endotheliale cellen samen met ondersteunende cellen zoals pericytes. De belangrijkste rol van BBB is om te dienen als een barrière die de ruimte tussen perifeer bloed en het centrale zenuwstelsel (CNS) verzegelt om hemostase van de neurale micro omgeving1,2te handhaven. De hersen capillaire endotheel cellen verzegelen effectief de paracellulaire route via de vorming van intercellulaire strakke knooppunten (TJs)1. Deze beschermende barrière maakt het mogelijk glucose en geselecteerde voedingsstoffen in de hersenen, terwijl het voorkomt dat de meerderheid van de ionen, giftige stoffen en drugs van het passeren van deze strakke barrière. Afgezien van zijn beschermende rol, vormt de natuurlijke barrièrefunctie van de BBB een ernstige uitdaging in de ontwikkeling van systemen voor het leveren van geneesmiddelen gericht op het CZS.

In vitro celkweek modellen van de BBB zijn handige hulpmiddelen om de biologie te bestuderen en om de effecten van medicamenteuze behandeling op de integriteit van TJ Barrier te begrijpen. We gebruikten de humane cerebrale microvasculaire endotheliale cellijn (hcmec/D3) als een in vitro model, omdat het een geaccepteerd model is van Human Brain endotheel3 en vele functies van de menselijke BBB herformuleert. hcmec/D3is een van de meest gebruikte cellijnen voor het modelleren van de BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Ondanks de relatief lage waarden van transendotheliale elektrische weerstand (TEER), een maat voor barrière dichtheid, behoudt deze cellijn het grootste deel van de morfologische en functionele eigenschappen van hersen endotheliale cellen, zelfs als een monocultuur bij afwezigheid van gecocultureerde gliacellen6,7. De cellijn hcmec/D3 drukt meerdere BBB-markers uit, inclusief actieve transporters en receptoren tot ongeveer passage 35 zonder dedifferentiatie te ondergaan aan unstable fenotypes6,7,9 ,10,11. Het meest opvallende kenmerk van de hcmec/D3-cellijn als een in vitro BBB-model is de mogelijkheid om tjs5,9,11,12te vormen. Opgemerkt moet worden dat hoewel stamcel-afgeleide BBB-modellen een hogere permeabiliteit vertoonden in veel studies in vergelijking met de cellijn van hCMEC/D3 en ze enkele BBB-markers uitdrukken, ze zijn nog niet te evolueren als de meest voorkomende BBB-cel model13. Belangrijk is dat stamcel afgeleide BBB-modellen nog steeds worden gekarakteriseerd met betrekking tot maximale passage nummers die de cellen in staat stellen stabiele BBB-fenotypes14te handhaven.

Drie primaire methoden worden vaak gebruikt om de integriteit van de TJ-barrière te bepalen, waaronder de meting van de TEER, de meting van de schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (P-app) van kleine hydrofiele Tracer moleculen zoals sucrose, inuline, Lucifer geel, etc. en immunokleuring van bekende moleculaire markers van TJs zoals Claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER is een relatief eenvoudige en kwantitatieve methode die de elektrische weerstand meet over de celmonolagen gekweekt op een poreus membraan substraat5. De TEER waarden kunnen echter worden beïnvloed door experimentele variabelen zoals de samenstelling van het kweekmedium en het type meetinstrument. Een waarschijnlijke combinatie van deze factoren leidt tot een brede verdeling van de TEER waarden variërend van 2 tot 1150 Ω cm2 in de hCMEC/D3 cellijn gekweekt voor 2-21 dagen13. Immunokleuring is een visuele methode om de aanwezigheid van TJ-eiwitten te bepalen door het beoogde eiwit te labelen met antilichamen. Bij immunokleuring gaat het echter om een reeks experimentele stappen, waaronder de noodzaak om cellen op te lossen/te permeiseren die kunnen resulteren in experimentele artefacten en de fluorescerende signalen kunnen vervagen na verloop van tijd. De bovenstaande factoren kunnen leiden tot subjectieve fouten die de kwaliteit van gegevens beïnvloeden.

De primaire focus van dit werk is het presenteren van een ly-based schijnbare permeabiliteit assay bepalen de kinetiek van een confluente monolaag vorming in gekweekte hcmec/D3 cellen. Hoewel andere geavanceerde in vitro BBB-systemen, zoals co-cultuur systemen, microfluïdische systemen, fysiologisch relevantere mimieken zijn met een significant verbeterde barrièrefunctie15,16,17, de hcmec/D3 trans well Setup is een eenvoudig en betrouwbaar model om de kinetiek van TJ Formation te schatten en het effect van verschillende geneesmiddel formuleringen op de barrièrefunctie snel op te schermen. In het algemeen zijn de waarden van de P-app consistent voor verschillende hydrofiele opgeloste stoffen in monolagen van hcmec/D3. Bijvoorbeeld, de gerapporteerde Papp waarden voor verschillende laagmoleculaire massa opgeloste stoffen (zoals sucrose, mannitol, ly, etc.) in verschillende in vitro BBB modellen zijn in de orde van 10-4 cm/min5,18,19 , 20. in onze experimentele opstelling worden de hersen endotheel cellen op een microporeus membraan met collageen coating voor celbevestiging en monolaag vorming gesest om de in vivo barrière na te bootsen. De LY toegevoegd in de apicale kant wordt naar verwachting doorkruisen de intercellulaire strakke kruisingen en accumuleren in de basolaterale kant. Grotere concentraties van LY in de basolaterale kant duiden op een onrijpe, niet-volledig functionele barrière, terwijl lagere concentraties het beperkte transport weerspiegelen als gevolg van de aanwezigheid van functionele TJs resulterend in een volwassen barrière.

LY is een hydrofiele kleurstof met verschillende excitatie/emissie pieken en vermijdt de noodzaak van van Tracer moleculen zoals sucrose, mannitol of inuline. Zo kunnen de fluorescentie waarden van LY worden gebruikt om de paracellulaire permeabiliteit over de BBB-monolagen direct te berekenen. Ook, in vergelijking met veel commercieel verkrijgbare kleurstoffen die worden gebruikt in biomedische velden die lijden aan kleine Stokes verschuivingen zoals fluoresceïne21, de Stokes verschuiving van ly is ongeveer 108 nm met voldoende spectrale scheiding, waardoor ly fluorescentie gegevens als een robuuste uitlezen om de paracellulaire permeabiliteit te bepalen. We gebruikten Western blotting als een orthogonale techniek om veranderingen in de expressie van de nauwe Junction marker eiwit, ZO-1, over cultuur tijd aan te tonen. ZO-1-expressie gedetecteerd via Western blotting wordt gebruikt om de ly p-app -gegevens aan te vullen en in combinatie suggereren deze gegevens dat de waargenomen veranderingen in de ly p-app -waarden een afspiegeling zijn van de vorming van een monolaag met een geleidelijke toename van expressie van de nauwe Junction marker, ZO-1.

Zoals eerder gezegd, is de centrale focus van dit werk het aantonen van een ly assay als een eenvoudige techniek om de vorming van een confluente monolaag met functionele strakke kruisingen te monitoren. Om echter een aanvullend nut van de ontwikkelde assay aan te tonen, hebben we de LY P-app gemeten in monolayers met DNA-nanodeeltjes-Getransfunteerde hCMEC/D3. Nucleïnezuren kunnen worden gecondenseerd in poly elektrolyt nanodeeltjes met een diameter van 100-200 nm via elektrostatische interactie tussen de positief geladen groepen polymeren en de negatief geladen fosfaat groepen van nucleïnezuren22, 23. we verwijzen naar deze complexen als DNA-nanodeeltjes (DNA NPs) in ons werk. Hoewel het onze bedoeling is om cellen te transfect en het gewenste eiwit uit te drukken, moeten we ervoor zorgen dat de barrière-eigenschappen van de monolagen van hcmec/D3 niet in het gedrang komen. Onze gegevens suggereren dat een standaard 4 h plaats gentransfectie regime niet meetbaar de ly permeabiliteit van het nut van de ly Papp assay verandert om veranderingen in de integriteit van TJ Barrier te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. algemene celcultuur van hCMEC/D3

  1. Reanimatie van bevroren cellen
    Opmerking: alle celkweek onderhoud en experimenten werden uitgevoerd binnen een steriele bioveiligheid Hood. Cultuur media, supplementen en reagentia werden ofwel gekocht als steriele producten of gesteriliseerd via filtratie met behulp van een 0,22 μm membraanfilter om microbiële besmetting te voorkomen.
    1. Voeg 8,5 mL collageen oplossing (0,15 mg/mL) toe in een weefselkweek kolf (75 cm2 groeigebied; hierna aangeduid als T75) en plaats het in een incubator (37 °c, 5% Co2) voor 1 uur.
    2. Verwijder de collageen oplossing en was de kolf voorzichtig met gesteriliseerde fosfaatgebufferde Saline (PBS). Voeg 15 mL volledig groeimedium toe aan de kolf en laat 15 minuten in de CO2 -incubator staan.
      Opmerking: het volledige medium (eindconcentratie) bevatte endotheliale celgroei basale medium-2 (500 mL) aangevuld met foetaal runderserum (5%), penicillaire-streptomycine (1%), hydrocortison (1,4 μM), ascorbinezuur (5 μg/mL), chemisch gedefinieerd lipide concentraat (1/100), HEPES (10 mM) en basis fibroblast-groeifactor (1 ng/mL).
    3. Verplaats een cryovial van bevroren hCMEC/D3-cellen uit de vloeibare stikstof tank en Ontdooi de injectieflacon snel in een waterbad van 37 °C (< 1 min).
    4. Zodra slechts een kleine schilfer van ijs zichtbaar is, aspireren en overbrengen van de cellen naar de kolf met voorverwarmde medium. Schud de kolf voorzichtig om het mengen van de cellen met het groeimedium mogelijk te maken.
    5. Plaats de kolf in de incubator (37 °C, 5% CO2) en observeer de cellen onder een lichte Microscoop na 2 uur om ervoor te zorgen dat de cellen zijn bevestigd.
    6. Zodra de cellen aan de onderkant van de kolf zijn bevestigd, verwijdert u het oude groeimedium en voegt u 10 mL vers voorverwarmde groeimedium toe om dimethylsulfoxide te vervangen in het oude groeimedium24.
    7. Na 24 uur, Controleer onder een lichte Microscoop om spindel vormige cellen te observeren en vervang het oude groeimedium door voorverwarmde verse groeimedium.
  2. Celkweek onderhoud
    1. Vul het groeimedium om de andere dag tot 100% samenvloeiing. Controleer de cellen onder de Microscoop voordat u het oude groeimedium verwijdert en ook na het toevoegen van vers groeimedium. Haal de kolf uit de incubator en onderzoek de hCMEC/D3-cellen onder de fasecontrastmicroscoop om ervoor te zorgen dat ze gezond lijken.
      Opmerking: de meerderheid van de cellen moet worden gehecht aan de bodem van de kolf, hebben een spindel-vormige morfologie en vaak tijden, licht refracteren rond hun membranen wordt ook gezien. Groeimedium moet transparant (niet-bewolkt) en roze-oranje in kleur.
    2. Verwijder het oude groeimedium uit de kolf en breng 10 mL voorverwarmd vers medium over in de kolf.
      Opmerking: het medium moet worden toegevoegd aan de bovenzijde van de kolf en niet direct op het oppervlak van de cellen om te voorkomen dat de celbijlage wordt aangetast.
    3. Draai de kolf weer in de horizontale positie en maak deze voorzichtig meerdere malen af en controleer de hCMEC/D3-cellen onder de Microscoop voordat u de kolf terugzendt naar de incubator (37 °C, 5% CO2).
    4. Observeer de cellen onder een omgekeerde lichtmicroscoop elke keer voor en na het hanteren van de cellen, zowel tijdens regulier cultuur werk als tijdens experimenten. Noteer alle merkbare veranderingen in het celnummer of de morfologie in de laboratorium notebook.
  3. Celpassaging
    1. Inculeer een nieuwe T75 kolf met 8,5 mL collageen oplossing voor 1 uur in de incubator (37 °C, 5% CO2).
    2. Verwijder de collageen oplossing en was de kolf voorzichtig met gesteriliseerde PBS. Voeg 10 mL voorverwarmde hCMEC/D3-medium toe aan de nieuwe kolf en plaats de kolf in de incubator (37 °C, 5% CO2).
    3. Haal de kolf uit de incubator en onderzoek de hCMEC/D3-cellen onder een fasecontrastmicroscoop om te controleren of de cellen 100% Confluent zijn.
    4. Verwijder het hCMEC/D3-celmedium uit de kolf met cellen en was hCMEC/D3-cellen met 10 mL PBS.
      Opmerking: FBS toegevoegd aan groeimedium bevat proteaseremmers zoals Α1-anti trypsine en α2-macroglobuline. Deze remmen het trypsinisatie proces. Het is dus essentieel om de cellen te wassen met PBS om sporen van FBS te verwijderen om de remming van het trypsinisatie proces te voorkomen.
    5. Voeg 1 mL 0,25% trypsine oplossing met 0,02% EDTA en trypsinize toe voor 2-5 min in de incubator (37 °C, 5% CO2) (raak de kolf zachtjes aan de zijkanten aan om loslating te helpen).
      NB: laat de cellen nooit langer dan 6 minuten op trypsine/EDTA staan.
    6. Voeg 10 mL voorverwarmde hCMEC/D3-medium toe om het trypsinisatie proces te stoppen en de hCMEC/D3-cel te hervatten door meerdere malen op en neer te pipetteren. Verwijder vervolgens de volledige celsuspensie uit de kolf in een buis van 15 mL.
    7. Breng 1 mL celsuspensie van de buis van 15 mL naar de nieuwe kolf met voorverwarmde verse drager (cellen splitsen 1:10) en breng de nieuwe kolf terug naar de incubator.
      Opmerking: Pipetteer de celsuspensie meerdere malen op en neer om de gradiënten van de celconcentratie te minimaliseren voordat u de nieuwe kolf overbrengt.

2. celplating

  1. Plaats weefselkweek inserts met microporeuze membranen (poriegrootte: 0,4 μm, materiaal: polyethyleentereftalaat (PET)) in een 24-Well cultuur plaat.
  2. Voeg 400 μL collageen type I (0,15 mg/mL) toe in elk weefselkweek inzetstuk en incuberen gedurende 1 uur in de CO2 -incubator (37 °c, 5% Co2). Rock de 24-goed plaat zachtjes om zelfs het verspreiden van de collageen oplossing over het microporeuze membraan in de weefselkweek inserts.
  3. Verwijder de collageen oplossing en was het microporeuze membraan voorzichtig met 0,4 mL 1x PBS-buffer.
  4. Plaat hCMEC/D3 cellen met de dichtheid van 50.000 cellen/cm2 in de celinserts (15.000 cellen in 500 μL medium).
    Opmerking: om de verschillen in het aantal cellen in elke weefselkweek insert te minimaliseren, werd de celsuspensie geresuspendeerd met een pipet van 10 mL voordat de cellen aan de wisselplaten werden toegevoegd.
  5. Plaats de 24-put plaat met weefselkweek opstelling in een incubator (37 °C, 5% CO2) om celhechting en proliferatie mogelijk te maken.
  6. Inbroed de plaat gedurende 7 dagen, zodat de cellen 100% confluency bereiken. Verwijder het groeimedium om de dag en breng 0,5 mL voorverwarmde verse media over in weefselkweek inserts.
  7. Herhaal de beplating procedure (stappen 2.2-2.6) op een 12-well plate, 48-well plate en 96-well plate. Gebruik de 12-put plaat voor Western blotting om de veranderingen in ZO-1 expressie te bepalen. Gebruik de 48-well plate voor DNA NP transfection. Gebruik de 96-well plate voor de ATP-test om de levensvatbaarheid van de cel in getransfunde cellen te bepalen.

3. kinetiek van celgroei.

  1. Zaadcellen met een dichtheid van 50.000 cel/cm2 in een collageen-gecoate 24-Well weefselcultuur plaat.
  2. Verwijder op elke dag van het experiment het groeimedium en spoel de cellen voorzichtig tweemaal met 500 μL 1x PBS. Voeg vervolgens 30 μL 0,25% trypsine-oplossing met 0,02% EDTA toe en laat de plaat ongeveer 2-5 min achter in een incubator (37 °C, 5% CO2).
    Opmerking: geleidelijke vorming van een confluente monolaag kan de mate van celloslating beïnvloeden en het is noodzakelijk om de volumes trypsine/EDTA te verhogen zoals hier aangegeven: 30 μL gedurende 1-5 dagen na het zaaien, 60 μl voor 6-7 dagen na het zaaien en 100 μl voor 8-10 dagen na het zaaien .
  3. Voeg 470 μL, 440 μL of 400 μL groeimedium toe op basis van het volume trypsine/EDTA-oplossing dat in de stap 3,2 is toegevoegd om 500 μL celsuspensie in elke put te bereiden.
  4. Onderbreek de cellen door elke put meerdere malen omhoog en omlaag te pipetteren en de cellen onder een microscoop te observeren om ervoor te zorgen dat alle cellen in het groeimedium worden opgehangen. Als sommige cellen nog steeds aan de bodem van het plaatje zijn bevestigd na het pipetteren, schrapen u de cellen zachtjes met een plastic cel schraper om celloslating te vergemakkelijken.
  5. Verwijder 0,1 mL celsuspensie van 500 μL celsuspensie in stap 3,3 en voeg toe aan een tube van 1,5 mL. Voeg vervolgens 0,1 mL 0,4% Trypan blauwe oplossing toe aan de celsuspensie en meng goed.
  6. Reinig een hemacytometer met 70% isopropylalcohol. Voeg 20 μL mengsel van stap 3,5 aan elke kant in de V-groef toe en zoek de 16 vierkantjes onder de Microscoop. De 16 vierkantjes worden beschouwd als één raster. Lokaliseer twee willekeurige rasters aan elke kant van de hemacytometer en Tel alle levende, niet-blauwe cellen.
    Opmerking: cellen die blauw zijn in kleur van uitgesloten van telling, < 1% van de cellen gekleurd blauw op alle tijdstippen.
  7. Bereken de celdichtheid (cellen/cm2) op basis van de volgende formules.
    Gemiddeld aantal cellen/raster = Equation 1 (EQ. 1)
    Verdunnings factor = Equation 2 (EQ. 2)
    Celdichtheid (levensvatbare cellen/cm2) =
    Equation 3
    (EQ. 3)
    Vergelijkingen 1-3. Levensvatbare cellen zijn het aantal cellen geteld in elk raster, aantal rasters corresponderen met het aantal rasters onder de Microscoop, volume van het mengsel van celsuspensie en 0,4% Trypan blauw is het volume bereid in stap 3,5, volume van de celsuspensie verwijderd is het volume verwijderd uit 500 μL celsuspensie in stap 3,5, het volume van celsuspensie in elke put is de 500 μL celsuspensie uit stap 3,3, groeigebied van weefselkweek plaat is het groeigebied van single well in 24-well plate.

4. Lucifer gele schijnbare permeabiliteit (LY P app ) assay

  1. Volg de stappen die beginnen met 4,3 voor het bepalen van de LY P-app op elke dag na de seeding. Voeg voor het bepalen van de P-app in gegeneerde hCMEC/D3-cellen 8,3 μl van de transfectie formulering (Figuur 1) toe, vermengd met 50 μL volledig groeimedium en inincubatie gedurende 4 uur. transfectie formuleringen worden beschreven in rubriek 5.
  2. Na de 4 h-transfectie, voorzichtig de apicale zijde tweemaal wassen met behulp van steriele 1x PBS-buffer om een residueel transfectie mengsel te verwijderen. Wisselende hoeveelheden PBS-buffer die na verwijdering achterblijven, kunnen de concentratie van LY in de apicale kant beïnvloeden. Zorg ervoor dat de resterende PBS-buffer in weefselkweek inserts volledig wordt verwijderd. Zorgvuldig aspireren residuele reagentia en medium om celloslating te minimaliseren.
    Opmerking: deze stap wordt overgeslagen bij het meten van de dagelijkse schijnbare permeabiliteit (P-app) van hCMEC/D3-cellen.
  3. Verwijder het groeimedium en voeg 1,5 mL voorverwarmde (37 °C) transport buffer (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mm MgCl2, 1 mm Nah2po4, 5 mm glucose, pH 7,4) toe aan de basolaterale zijde.
    Opmerking: het volume van de transport buffer in alle basolaterale compartimenten moet gelijk zijn om de nauwkeurigheid van de berekening van de permeabiliteit coëfficiënt te waarborgen.
  4. Voeg 58,3 μL 20 μM LY-oplossing toe aan de apicale zijde van elke trans well-wisselplaat. Bespaar 50 μL van de 20 μM LY-oplossing voor fluorescentie metingen. Nadat u de resterende PBS-buffer volledig uit de apicale kant hebt verwijderd, moet u de oplossing zo snel mogelijk toevoegen om te voorkomen dat de hCMEC/D3-cellen worden gedroogd. Zorg voor nauwkeurige volumes van LY oplossing in de apicale kant.
    Opmerking: om het verval van de intensiteit van de licht fluorescentie te minimaliseren, moet de belichting beperkt zijn. Zodra het LY poeder is gereconstitueerd, moet de oplossing worden bewaard bij 4 °C, beschermd tegen licht.
  5. Inincuberen in een roterende plaat Shaker (37 °C, 100 rpm) voor 60 min. Verwijder vervolgens 30 μL van het LY-monster uit elk apicaal compartiment. Breng vervolgens de 20 μM LY-oplossing en de apicale steekproeven over naar voorgelabelde buizen en Verdun het monster 10-voudig met behulp van de transport buffer.
    Opmerking: het is noodzakelijk om de 20 μM-stamoplossing en de apicale steek monsters te verdunnen omdat de hoge fluorescentie intensiteit van deze monsters mogelijk overbelast kan raken en de fluorescentiedetector van de fluorescentie microplaat-lezer beschadigt.
  6. Verwijder 500 μL uit elk basolateraal compartiment en breng het monster over naar voorgelabelde buizen.
    Opmerking: monsters worden op aangegeven tijdstippen uit de afzonderlijke trans well verwijderd. De tijdpunten zijn elke dag na de seeding vanaf dag 1 tot dag 10.
  7. Maak een reeks van LY-normen voor de standaard curve (39,00 nM, 78,13 nM, 156,25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
  8. Voeg 100 μL van elke standaard (in tweevoud), apicale en basolateraal monster toe aan elk goed in een zwarte 96-goed plaat (Figuur 1).
    Let op: zwarte platen absorberen licht en verminderen achtergrond en fluorescentie crossover tussen putten.
  9. Gebruik een fluorescentie-microplaat lezer (instelpunten: excitatie 428 nm, emissie 536 nm) om de intensiteit van de fluorescentie te meten om de P-appte berekenen. Voor deze studie wordt een fluorescentie plaat lezer gebruikt.
  10. Bereken de P-app en% ly herstel waarden zoals beschreven in de manuscript tekst.
    Vergelijking 4. Formules voor het berekenen van P-app -waarden.
    Bereken de schijnbare permeabiliteit (Papp) coëfficiënt en de% ly Recovery met behulp van de volgende vergelijkingen. Opgemerkt moet worden dat de Papp waarden kunnen worden berekend hetzij op basis van massa25 of concentratie van ly.
    Equation 4 OfEquation 5
    VA -volume in het apicale compartiment
    VB -volume in het basolaterale compartiment
    A-de oppervlakte van de transwell insert membraan (0,3 cm2)
    Ma0 -de initiële massa in het apicale compartiment
    ΔMB/Δt-de verandering van de massa in de tijd in het basolaterale compartiment
    CA0-de initiële concentratie in het apicale compartiment
    ΔCB/Δt-de verandering in de concentratie in de tijd in het basolaterale compartiment.
    Vergelijking 5. Formules voor het berekenen van% ly Recovery.
    Herstel (%) = Equation 6
    Maf is de massa in het apicale compartiment aan het eindpunt, mBF is de massa in het basolateraal compartiment op het eindpunt, ma0 is de initiële massa in het apicale compartiment. 26 Opmerking: de initiële massa wordt berekend op basis van het volume van de 20 μM ly-oplossing in de stap 4,5. Dit experiment werd altijd gedaan met behulp van cellen onder passage nummer 35 en werd uitgevoerd vier onafhankelijke tijden.

5. calcium depletie

  1. Verwijder het groeimedium van de transwell inserts en 12-well plaat en was zachtjes de apicale kant en 12-well plaat met behulp van voorverwarmde calcium vrije medium (minimaal Essential medium Eagle spinner (S-MEM) medium) om calciumionen uit de transwell inserts te verwijderen en 12-well plaat.
  2. Voeg 500 μL of 2 mL voorverwarmde S-MEM 1xmedium toe aan de wisselplaten of 12-well plaat en incuberen gedurende 24 uur in de incubator (37 °C, 5% CO2). Na incubatie, verwijder de S-MEM 1x medium en was de cellen eenmaal met voorverwarmde 1x PBS buffer.
  3. Volg de stappen 4.4-4.10 beschreven in rubriek 4 voor een LY-behandeling en de daaropvolgende stappen. Volg de stappen 8.1.2-8.2.4 beschreven in sectie 8 voor Western blotting en volgende stappen.

6. transfectie

  1. Bereiding van de DNA-nanodeeltjes (DNA NPs).
    1. Verdun de stamoplossing van gWIZ-Luc plasmide in 10 mM Natriumacetaat (NaAc) buffer (pH 5,0) en laat de DNA-oplossing 10 minuten staan bij kamertemperatuur (RT).
      Opmerking: de DNA-NP met overwegend enkelvoudige DNA-moleculen kan worden bereid in DNA-concentraties 20-40 μg/mL23. Dus, gWIZ-Luc plasmide stamoplossing moet worden verdund. De bevroren gWIZ-Luc plasmide kolf moet volledig op ijs ontdooid worden om temperatuur stress te minimaliseren. Draai de verdunde DNA-voorraadoplossing voor 30 sec. op een standaard tafel vortexer op de knop positie 3-5 zachtjes.
    2. Bereken de gewenste N/P-verhoudingen, hier gebruikt als een numerieke parameter om de NP-compositie weer te geven.
      Equation 7
      Vergelijking 6. Berekening van de N/P-ratio: de verhouding van de mol van de amine groepen van kationische polymeren tot die van de fosfaat groepen van DNA. Massa van kationische polymeren: totale gewogen hoeveelheid kationisch polymeer; (Massa/lading) cationische polymeren verwijst naar het molecuulgewicht van kationisch polymeer (poly (ethyleeneglycol) 5k-Block-polyaspartamide met 48 diëthyleentriamine ZIJKETENS (peg-Det)) genormaliseerd naar het aantal geladen primaire amines (48) per kationisch polymeer ( mol/mol), is deze waarde voor ons polymeer 306 da; Massa van het DNA: totale hoeveelheid DNA die wordt gebruikt in de formulering verkregen door vermenigvuldiging van het volume en de concentratie in mg/mL; (Massa/lading) DNA verwijst naar het molecuulgewicht van DNA genormaliseerd naar het aantal fosfaatgroep per dubbel gestrande dna (325 da per nucleobase).
      Opmerking: de tabel met DNA NP-voorbereiding (tabel 1) bevat het formulerings recept voor de verschillende monsters die in onze experimenten zijn getest. DNA NP werd bereid met behulp van een snelle titratie techniek. De PEG-DET Polymer oplossing werd toegevoegd langs de wanden van de buis terwijl het houden van de buis in een horizontale positie. Vervolgens werd de buis overgeschakeld naar een verticale positie, gevolgd door snel grondig op maximale snelheid voor 10s. De DNA-NP mocht vóór gebruik 30 minuten bij RT staan. De vuistregel voor DNA NP dosering is 0,5 μg DNA voor ca. 1 cm2 groeigebied. Dus, voor elke trans well insert/elk goed in een 48-goed plaat/elk goed in een 96-put plaat, bereiden DNA NP op N/P 10 met 0.157/0.5/0.195 μg/put van gWIZ-Luc DNA.
    3. Voor monsters met de aangegeven concentratie van Poloxamer P84 (P84), voeg P84 toe aan DNA NP en Vortex voor 5 sec. De uiteindelijke concentratie van P84 in elk monster is ofwel 0,01% of 0,03% WT.
  2. DNA NP-trans fectie in een 48-well plate Setup
    1. Zaai de cellen met de dichtheid van 50.000 cel/cm2 in een 48 goed plaat en groei tot samenvloeiing in de incubator (37 °c, 5% Co2).
    2. Meng voor elke behandelingsgroep 25 μL van het aangegeven monster (transfectie formulering) en 150 μL volledig groeimedium en 175 μL van dit mengsel tot elk goed.
    3. Observeer de hCMEC/D3-cellen onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen gezond lijken en 100% Confluent Health zijn op het moment van het experiment.
    4. Verwijder het groeimedium uit putten en 175 μL transfectie mengsel aan elk putje. Vervolgens incueren de plaat voor 4 h in de incubator (37 °C, 5% CO2).
    5. Verwijder na 4 uur het transfectie mengsel en was de hCMEC/D3-cellen met voorverwarmde steriele 1x PBS-buffer.
      Opmerking: om de onbedoelde loslating van de hCMEC/D3-cellen te minimaliseren van de plaat/insert-oppervlakte tijdens de wasstappen, Pipetteer voldoende steriele PBS langs de wanden van de putjes en verwijder eventuele nanodeeltjes in de rest kweekmedia.
    6. Draai de plaat een paar keer zachtjes en zuig de PBS-Wash voorzichtig op en gooi deze weg en voeg 500 μL hCMEC/D3 voorverwarmde kweekmedium toe.
    7. Microscopisch onderzoeken van de cellen en het opnemen van waarnemingen op celmorfologie en mogelijke effecten van transfectie.
    8. Incuberen gedurende 24 uur in de cel cultuur Incubator van 37 °c om plaats-productie mogelijk te maken. Verwijder na 24 uur het groeimedium volledig en was de cellen één keer met vooraf opgewarmde 1x PBS.
    9. Lyse de getransfunde cellen door toevoeging van 100 μL ijskoude plaats celcultuur lysis 1x reagens per put.
    10. Voor het meten van het eiwitgehalte van plaats, Voeg 20 μL cellysaat en 100 μL plaats-test buffer (20 mm glycylglycine (pH 8), 1 mm MgCl2, 0,1 mm EDTA, 3,5 mm DTT, 0,5 mm ATP, 0,27 mm coenzym A) toe aan een tube van 1,5 ml.
    11. Lees de luminescentie van het monster beschreven in de stap 6.2.10 op een Luminometer met een enkele auto-injector.
      Opmerking: de luminescentie moet gedurende 10 sec. vóór het lezen worden geïntegreerd.
    12. Meet de totale hoeveelheid cellulair eiwit in het lysaat met behulp van een bicinchoninic acid assay (BCA assay) Kit door het Protocol van de fabrikant te volgen.
    13. Bereken en Express plaats genexpressie als relatieve licht eenheden (rlu) per totaal cellulair eiwit.

7. luminescente ATP-test

  1. Zaai de cellen met de dichtheid van 50.000 cel/cm2 in een 96 goed plaat en groei tot samenvloeiing in de incubator (37 °c, 5% Co2).
  2. Transfect de cellen met 9,7 μL van de transfectie formulering (bereidings Details zijn in rubriek 6) en 58,4 μL volledig groeimedium voor 4 uur.
  3. Verwijder het transfectie mengsel en spoel de cellen voorzichtig af met voorverwarmde PBS 1x buffer tweemaal om de behandelings reagentia volledig te verwijderen.
    Opmerking: verschillende volumes van de residuele buffer kunnen de reagentia van de ATP-assay in verschillende mate verdunnen en kunnen de gegevens mogelijk beïnvloeden.
  4. Meng 75 μL vers voorverwarmde medium en ATP-test reagens in een 1:1-verdunning met behulp van een multikanaalspipet. Zorg ervoor dat het vloeistofniveau in alle pipetpunten met meerdere kanalen hetzelfde is.
  5. Plaats de plaat gedurende 15 minuten op kamertemperatuur op een nutating Shaker. Na 15 minuten van het toevoegen van de reagentia, breng 60 μL van elk monster in een witte 96-goed plaat.
    Opmerking: witte platen zijn beter om het uitgangs licht weer te geven dan heldere of zwarte platen.
  6. Gebruik een naald voordat u de plaat leest om luchtbellen te gebruiken. Lees de plaat op een luminometer met een 1 s integratie tijd. Lees de plaat binnen 20 min na het toevoegen van de ATP-assay reagentia. Timing is van cruciaal belang voor vergelijking over verschillende platen, omdat het luminescentie signaal van voorbijgaande aard is met een snel verval percentage.
  7. Bereken het percentage (%) levensvatbaarheid van de cel met behulp van deze formule: (luminescentie van getransfuneerde cellen/luminescentie van de controle, onbehandelde cellen) x 100.

8. Western blotting voor meting van nauwe Junction proteïne ZO-1

  1. Cellyse en EiwitExtractie
    Opmerking: alle stappen voor EiwitExtractie uit cellen moeten worden uitgevoerd bij 2-8 °C.
    1. Zaadcellen met een dichtheid van 50.000 cel/cm2 in een collageen-gecoate 12-well weefselcultuur plaat.
    2. Op dag 3, dag 5, dag 7, dag 10 na het zaaien en op dag 7 (cellen vooraf geïnincubeerd met calcium vrij medium), verwijder het groeimedium en spoel de cellen voorzichtig tweemaal met 2 mL ijskoude 1x PBS. Voeg vervolgens 300 μL mengsel van ijskoude 1x RIPA lysisbuffer met 3 μg/mL aprotinine in elke put.
      Opmerking: het mengsel moet vers worden gemaakt en op ijs worden gehouden. Aprotinine wordt gebruikt voor de remming van proteasen aanwezig in lysaten van vernederende het eiwit van belang.
    3. Na twee vries-dooi cycli (-80 °C), schrapen de cellen met behulp van een koude plastic cel Scraper. Verzamel de celllysates in microfugebuis tubes. Centrifugeer vervolgens de buisjes op 200 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c.
    4. Verzamel het supernatant in schone buizen en plaats ze op ijs. Meet de totale hoeveelheid cellulair eiwit in de lysaten met behulp van de BCA-assay kit door het Protocol van de fabrikant te volgen.
  2. Western blotting voor het opsporen van nauwe Junction proteïne ZO-1
    1. Denature aliquots van totaal homogeniseren met 40 μg totaal eiwit met 1x Laemmli-buffer bij 95 °C, 5 min en onderworpen aan elektroforese in een reducerende 6-7,5% natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel (SDS-PAGE) (90 V, 10 min door stapelen gel, 120 V tot het oplossen van gels).
      Let op: bij het laden van de monsters of normen, vergeet niet om langzaam en zorgvuldig te laden in elke rijstrook, oppassen niet te breken de put in het proces.
    2. Breng de afgescheiden eiwitten over naar een nitrocellulose membraan met een pH 8,5 overdrachts buffer die 192 mM Glycine, 25 mM tris Base, 10% methanol en 0,1% SDS (75 V, 110 min bij kamertemperatuur) bevat.
      Opmerking: Raak het membraan niet aan. Gebruik 70% isopropanol-gewassen plastic tang om het membraan te behandelen. Om het ZO-1-eiwit (MW 200 kDa) met succes over te brengen naar het membraan, moet de pH rond 8.3-8.5 zijn. Als de overdrachts buffer meer zuur is dan dat, zou de overdracht niet gebeuren. Als de ladder banden zichtbaar nog op de gel zijn, zou het nuttig zijn om de overdrachtstijd en de SDS-concentratie te verhogen.
    3. Na het wassen van het membraan door gebruik te maken van tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (T-TBS), gebruik blokkerende oplossingen (1:1 licor-Odyssey Block: 1x tris gebufferde Saline) om de membranen te blokkeren voor 60 min.
    4. Snijd het membraan voorzichtig in twee stroken. Inincuberen met twee primaire antilichamen (ZO-1 monoklonaal antilichaam, verdunning, 1:900, en glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) antilichaam, verdunning, 1:10.000) 's nachts bij 4 °C. Inbroed vervolgens de ZO-1 en GAPDH membranen met ezel anti-muis IgG (verdunning, 1:50000). Na het wassen van de membranen met behulp van T-TBS, afbeelding van de membranen in de 700 kanaal op een 16-bit Imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ten eerste bepaalden we het effect van de kweektijd op de duidelijke permeabiliteit om de schijnbare kinetiek van TJ Formation te bepalen. De gemiddelde ly P-app -waarden van dag 1 tot 10-post-zaaien worden weergegeven in Figuur 2a. Op dag 1, de gemiddelde P-app was 4,25 x 10-4 cm/min en lichtjes gedaald tot 3,32 x 10-4 cm/min op dag 2. De gemiddelde P-app -waarde is lichtjes gestegen tot 3,93 x 10-4 cm/min op dag 3 en fluctueerde zonder significante wijzigingen tot dag 6. De waarden van de P-app daalden aanzienlijk tot 2,36 x 10-4 cm/min op dag 7 in vergelijking met dag 1 (p < 0,05) waarschijnlijk suggereren dat de barrière strakker werd. De P-app -waarden stabiliseerde in het bereik tussen 2,14 x 10-4 en 2,36 x 10-4 cm/min van dag 7 tot dag 10, wat impliceerde dat de barrière vorming volledig en functioneel was, wat resulteerde in een verlaagd paracellulair transport. We berekende het percentage (%) Elke dag worden hersteld om ca. 80% te zijn, een waarde die als optimaal wordt beschouwd om de P-app -waarde27 (figure 2b)betrouwbaar te berekenen. Herstel% is een belangrijke index in LY assay. Bijvoorbeeld, als cellen metaboliseren het meest, LY is geïmmobiliseerd in cellen of stokken aan de celmembraan of duidelijk degradeert tijdens de incubatie, het zou onnauwkeurig zijn om te interpreteren dat waargenomen laag LY signaal in basolaterale compartiment duidt op een strakke barrière. Dus, herstel% geeft meer vertrouwen dat we niet significant bedrag van LY te verliezen als gevolg van een of meer van de bovenstaande mogelijkheden en maakt het mogelijk om goed te schatten Papp waarden. Zoals eerder vermeld in de inleiding sectie, een grotere concentraties van LY in de basolaterale kant duidt op een onvolledige barrière terwijl lagere concentraties weerspiegelen beperkt vervoer, suggereren een volwassen, volledige barrière als gevolg van de aanwezigheid van functionele TJs. We presenteren ook aanvullend bewijs met behulp van een orthogonale techniek, westerse blotting detectie van ZO-1 eiwit (Figuur 4), om te bevestigen dat de waargenomen veranderingen in de ly Papp correlaten met de vorming van strakke kruisingen.

Omdat de trans well insert Setup niet toelaat om veranderingen in celdichtheid direct bij te houden, bepaalden we veranderingen in celdichtheid met behulp van een standaard Trypaanse blauwe uitsluitings test. Daarom bepaalden we de veranderingen in celdichtheid op een transparante weefselkweek plaat die ons gemakkelijk toeliet om de celgroei kinetiek te monitoren. De toename van de celdichtheid van 5,5 ± 1,0 x 104 cellen/cm2 tot 1,9 ± 0,2 x 105 cellen/cm2 van dag 1 tot 10-post zaaien (Figuur 3) was lineair met een regressie coëfficiënt van 0,94. Deze gegevens suggereren ook dat de waargenomen veranderingen in de ly Papp (Figuur 2a) het gevolg zijn van de vorming van een confluente monolaag over de periode van 10 dagen. We observeerden de cellen onder een omgekeerde lichtmicroscoop op elke dag en visueel gedocumenteerd een geleidelijke toename van de celaantallen en monolaag vorming.

We gebruikten Western blotting om veranderingen in de uitdrukking van de nauwe junctie proteïne ZO-1 na verloop van tijd te detecteren (Figuur 4). De veranderingen in de ZO-1-uitdrukking worden gebruikt om de LY P-app -gegevens orthogonaal aan te vullen en om ervoor te zorgen dat de waargenomen veranderingen in ly p-app de vorming van een strakke barrière aangeven. ZO-1 band intensiteiten werden geanalyseerd door densitometrie en genormaliseerd ten opzichte van de uitdrukking van een huishoudelijk gen, GAPDH. De twee bands in Figuur 3a vertegenwoordigen de twee zo-1 isovormen (zo-1α+ en zo-1α-)28. Densitometrie analyse toonde aan dat de pixelwaarde van ZO-1 steeg van dag 3-7 na het zaaien, wat suggereert dat de TJ Protein ZO-1 voortdurend gevormd werd vanaf dag 3-7. Na een calcium depletie behandeling op dag 7 na het zaaien, was de band van ZO-1 bijna niet detecteerbaar, wat aangeeft dat ZO-1 niet in staat was om te vormen bij afwezigheid van calciumionen. Bovendien daalde de pixelwaarde van ZO-1 aanzienlijk op dag 10 na de seeding. De signaal intensiteiten van gapdh vanaf dag 3-10 verschenen vergelijkbaar, behalve op dag 7, toen de cellen werden behandeld met calcium vrij medium. Een mogelijke reden voor de lagere GAPDH-expressie in calciumbehandelde cellen kan het gevolg zijn van het geringere totaal eiwit (28,9 μg totaal eiwit), opnieuw, waarschijnlijk als gevolg van calcium depletie. Over het algemeen onthulde de analyse van de band densitometrie een geleidelijke toename van de ZO-1-uitdrukking (ten opzichte van GAPDH) tot dag 7 en een afname van de expressie op dag 10 wanneer cellen in een volledig groeimedium werden gekweekt. De analyse toonde ook een lagere uitdrukking van ZO-1 (ten opzichte van GAPDH) op dag 7 in cellen behandeld met calcium-vrij medium.

Terwijl de focus van dit werk is om de ly Papp assay te presenteren als een methode om de kinetiek van een monolaag-formatie te bepalen, om een aanvullend nut van de ontwikkelde assay te demonstreren, hebben we bepaald of DNA NP-transfectie de TJ-barrière beïnvloedde integriteit door het meten van de LY Papp via hCMEC/D3 cellen 4 h post-transfection (Figuur 5). Onze DNA NPs met Poloxamer P84 bemiddelde hoge niveaus van genexpressie in de moeilijk te transfect hCMEC/D3 cellijn (Figuur 6a). Concreet wilden we bepalen of de hydrofobe domeinen van Poloxamer P84 in ons DNA NPs kunnen perturb TJ integriteit in getranssinfecteerde cellen. De% LY herstelde in elke behandelingsgroep was ca. 92%, wat suggereert dat de berekende P-app -waarden betrouwbaar zijn (Figuur 5b). We merkten op dat de transfectie procedure met behulp van verschillende formuleringen niet van invloed op de LY Papp, ten opzichte van niet-getranssinfecteerde cellen blootgesteld aan ly alleen. Extracellulair calcium is een essentieel onderdeel voor het onderhoud van celcelverbindingen in verschillende celtypen29,30,31, inclusief de endotheliale cellen van het hersen microvat. Zo leidt het behoud van cellen in het calcium vrije medium (CFM) tot de verstoring van tjs32,33. Daarom gebruikten we cellen die met CFM voor 24 uur werden behandeld als een positieve controle.

Uit onze gegevens blijkt dat de LY P-app voor cellen met CFM 2-voudig hoger was in vergelijking met controle cellen die met het reguliere groeimedium werden geïnineerd. Deze 100% toename in Papp suggereert dat de cellen hun tjs hadden verloren vanwege het verlies van calciumionen die nodig zijn voor de vorming. Met name de werkelijke waarde (5,14 x 10-4 cm/min) was iets hoger dan de gemiddelde P-app waarde vanaf dag 1-6 post zaaien (Figuur 2) toen de tjs nog niet volledig gevormd waren. Hoewel niet significant, cellen met DNA NP met 0,01-0,03% Poloxamer P84 toonde een kleine toename in LY Papp waarden in vergelijking met de onbehandelde cellen onderhouden in reguliere kweekmedium. Deze waarneming suggereerde dat DNA NP + P84 transfectie geen significant effect had op de integriteit van TJ Barrier. Over het algemeen, de LY Papp waarden in de getransfundeerde cellen ongeveer gemiddeld 2.5 X10-4 cm/min en deze waarde kwam overeen met de gemiddelde waarde genoteerd tijdens dag 7-10 na het zaaien (Figuur 2) wanneer de ly Papp was de minste, suggereert de aanwezigheid van functionele TJs die effectief beperkt paracellular transport.

We presenteren aanvullende transfectie gegevens om aan te tonen dat het ontbreken van veranderingen in LY Papp (Figuur 5) geen onbetekenbare observatie is. Ondanks de hoge niveaus van transfectie waargenomen in de DNA NPs + P84 groep, we constateerden geen veranderingen in LY Papp suggereren dat onze formuleringen niet perturb de TJ barrière. De relatief lage transfectie-efficiëntie in de naakte DNA-behandelde cellen is typerend omdat de anionische aard van plasmide DNA (als gevolg van fosfaat groepen in de ruggengraat) en de hydrofiele aard ervan de cellulaire opname beperken. DNA gecondenseerd in DNA NP bemiddelde een 50-voudige toename in Transfectie in vergelijking met naakte pDNA (Figuur 6). Toevoeging van 0,01% P84 aan het DNA NP resulteerde in een 18-voudige toename in vergelijking met het DNA NP-alleen (P < 0,01). Het verhogen van de P84-concentratie tot 0,03 gew.% resulteerde in een 30-voudige toename in vergelijking met het DNA NP-alleen (P < 0,001). Deze resultaten zijn opmerkelijk gezien het feit dat hersen endotheliale cellen een moeilijk te transfect celtype zijn.

We hebben de levensvatbaarheid van cellen gemeten onder verschillende omstandigheden om te bevestigen dat de transfectie-procedure geen celstress veroorzaakt. Adenosinetrifosfaat (ATP) is de energie valuta van het leven en weerspiegelt cellulaire metabole functie. We gebruikten een Luciferase-gebaseerde ATP-test waarbij de luminescentie waarden direct evenredig zijn aan ATP-niveaus. Possimo et al. meldde dat de luminescentie ATP-test een robuuste maatstaf was voor de levensvatbaarheid van de metabole cellen34. De levensvatbaarheid van de cel van de hCMEC/D3-cellen, die door de verschillende formuleringen werd getransfteerd, was vergelijkbaar met onbehandelde cellen (Figuur 5b), wat suggereert dat de ATP-niveaus ook vergelijkbaar waren. Daarom is DNA NPs met Poloxamer P84 (0,01% tot 0,03% w/w) veilig gen levering formuleringen.

Figure 1
Figuur 1 . Experimentele opstelling voor ly P app studie. 24-well plate Setup met trans well inserts (aangepast om de DNA-nanodeeltjes transfectie als voorbeeld te tonen, gegevens in Figuur 5). Elke kolom werd behandeld met het aangegeven monster voor 4 uur. het besturingselement geeft hCMEC/D3-cellen aan die met een volledig groeimedium worden behandeld, terwijl calcium depletie 24 uur aangeeft dat de cellen voorafgaand aan de blootstelling met calcium vrij medium zijn geïncasseerd. De juiste sjabloon toont de intensiteit van de fluorescentie meting in een zwarte 96-well plate. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 . De schijnbare kinetiek van de TJ Barrier-formatie, bepaald met de ly P app assay. (a) ly P app via hcmec/D3 monolagen gekweekt op trans well inserts werden gemeten dagelijks post-seeding cellen. b) in elke behandelingsgroep% ly is teruggevonden. Gegevens vertegenwoordigen gemiddeld ± SD van twee onafhankelijke experimenten (n = 3/experiment). Statistische vergelijkingen werden gemaakt met behulp van ongepaarde t-toets (*P< 0,05, N.S. niet significant). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figure 3
Figuur 3 . Kinetiek van celgroei bepaald met behulp van een Trypaanse blauwe uitsluitings test. de hCMEC/D3-cellen werden in een 24-put-plaat in een celdichtheid van 50.000 cellen/cm2geseeid. Op elke dag van het experiment werden cellen losgekoppeld en vermengd met een gelijk volume van 0,4% Trypan Blue voordat ze levensvatbare cellen op een hemacytometer tellen. De gegevens vertegenwoordigen gemiddeld ± SD van drie onafhankelijke metingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 . Schijnbare kinetiek van zo-1 expressie gedetecteerd met behulp van Western blotting. a) de cellen van hCMEC/D3 werden in een 12-put-plaat in een celdichtheid van 50.000 cellen/cm2geseeid. Op elke dag van het experiment (dag 3, dag 5, dag 7 en dag 10-na zaaien) werden cellen gelyseerd met 400 μL van 1x RIPA-buffer met 3 μg/mL aprotinin. Cellysaten die 40 μg totaal eiwit bevatten, werden op een 4-7,5% SDS-polyacrylamidegel geladen. (b) analyse van band densitometrie toegestaan het normaliseren van de uitdrukking van zo-1 eiwit naar gapdh. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figure 5
Figuur 5 . Effecten van DNA NP-transfectie op de dichtheid van TJ Barrier gemeten met de ly P app assay. a) de hcmec/D3-cellen werden gedurende 7 dagen gecultiveerde op transwell-inserts, getransteerd met Peg-Det met gWIZLuc plasmide DNA met/zonder Pluronic P84 voor 4 uur en vervolgens vervangen door voorverwarmde transport buffer met 50 μM ly voor 1 uur. besturingselement vertegenwoordigt de hCMEC/D3 cellen geïnineerd met groeimedium gedurende 4 uur, gevolgd door een duidelijke blootstelling (n = 4, *P< 0,05, N.S. niet significant). b)% ly in elke behandelingsgroep is teruggevonden, zijn de weergegeven waarden gemiddeld ± SD (n = 4). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 

Figure 6
Figuur 6 . DNA-NPs bemiddelde hoge niveaus van transgenexpressie in monolagen van hcmec/D3. a) de hcmec/D3-cellen werden 7 dagen gekweekt en met Peg-Det met gWIZLuc plasmide DNA met/zonder Pluronic P84 (N/P 10, DNA-dosis per put: 0,5 μg) voor 4 uur gecultiveerde, werd het transfectie mengsel verwijderd en werden cellen gedurende 24 uur gekweekt in volledige groei medium vóór het meten van genexpressie. Niveaus van de genexpressie van plaats werd uitgedrukt als relatieve licht eenheden (rlu) nornalized tot totale cellulaire eiwitgehalte. Data presenteert gemiddeld ± SD van drie onafhankelijke experimenten. Statistische vergelijkingen werden gemaakt met behulp van ongepaarde t-toets (* * p< 0,01, * * * p< 0,001). b) DNA NPs zijn veilige transfectie formuleringen in monolayers van hCMEC/D3. Effecten van DNA-DNA NP-transfectie op de levensvatbaarheid van de cel werden geëvalueerd met behulp van een luminescente ATP-test de hCMEC/D3-cellen werden met de aangegeven monsters voor 4 uur getransffecteerd, waarna de ATP-test werd uitgevoerd door het Protocol van de fabrikant te volgen. Procent (%) de levensvatbaarheid van de cellen werd als volgt berekend: (luminescentie van getransfcuteerde cellen/luminescentie van de controle, onbehandelde cellen) x100. Gegevens vertegenwoordigen gemiddeld ± SD van twee onafhankelijke experimenten (n = 3/experiment). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Experimentele Setup Voorbeeld naam Volume van 1 mg/mL plasmide DNA (μL) Volume van 10 mM NaAc-buffer, pH 5 (μL) Volume van 5 mg/mL polymeer (μL) Volume van 10% w/w. P84 (μL) Volume groeimedium (μL)
Weefselkweek voegteen Controle, onbehandelde cellen 0 0 0 0 58,3
Naakt DNA 0,157 8,143 50
DNA NP 7,843 0,3
DNA NP + 0,01% P84 7,6681 0,1749
DNA NP + 0,03% P84 7,26 0,0583
48-goed bord Controle, onbehandelde cellen 0 0 0 0 175
Naakt DNA 0,5 24,5 150
DNA NP 23,56 0,94
DNA NP + 0,01% P84 23,385 0,175
DNA NP + 0,03% P84 23,035 0,525
96-goed bord Controle, onbehandelde cellen 0 0 0 0 68,1
Naakt DNA 0,195 58,4
DNA NP 9,35 0,37
DNA NP + 0,01% P84 8,9307 0,0681
DNA NP + 0,03% P84 9,0669 0,2043

Tabel 1. De NP-formuleringen die worden gebruikt voor het verkrijgen van de gerapporteerde gegevens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een belangrijke rol van de BBB is om te voorkomen dat de uitwisseling van niet-essentiële ionen en giftige stoffen tussen de systemische circulatie en de hersenen om hemostase van neurale micro-omgeving te handhaven. Een van de karakteristieke kenmerken van de BBB is het vermogen van de capillaire endotheliale cellen om strakke kruispunten (TJs) te vormen die effectief de paracellulaire route van het transport verzegelen. We toonden een LY Papp assay als een kwantitatieve methode om de schijnbare kinetiek van TJ Barrier vorming in gekweekte hCMEC/D3 monolayers te bepalen. ZO-1-expressie gedetecteerd via Western blotting orthogonaal gevalideerd de gegevens van de LY Papp studies zoals in detail besproken in de volgende paragraaf. Als aanvullend nut van de ontwikkelde assay hebben we verder aangetoond dat DNA NP-transfectie de LY P-app niet meetbaar heeft veranderd, wat de geschiktheid van deze assay aangeeft om veranderingen in de eigenschappen van TJ Barrier in een experimentele opstelling te bepalen.

Gegevens van Western Blot toonden een duidelijke toename van de zo-1-uitdrukking aan op dagen 3, 5, 7-post zaaien en een lichte reductie op dag 10-post zaaien (figuur 4a). Uit Figuur 1, kan worden gezien dat de ly Papp daalde van dag 1-7 post-seeding suggereren de vorming van tjs. Na de behandeling met calcium depletie toonde de LY P-app een duidelijke toename (Figuur 2a), terwijl de zo-1-uitdrukking een duidelijke reductie vertoonde (Fig. 4a). Extracellulair calcium is een essentieel onderdeel voor het onderhoud van celcelverbindingen in verschillende celtypen29,30,31, inclusief de endotheliale cellen van het hersen microvat. Gebrek aan calcium in het groeimedium verstoorde en dissocieerde de TJs33. Zoals verwacht was de P-app -waarde van calcium-verarmd cellen significant hoger dan de onbehandelde cellen en dicht bij de p-app -waarde van de blanco wisselplaten die geen cellen bevatten (Figuur 2a). De LY onthulde een stabiel plateau in P-app -waarden vanaf dag 7-10 na het zaaien (Figuur 2a), wat suggereert dat de barrière volledig was gevormd door dag 7, wat resulteerde in beperkt transport naar de basolaterale kant. De gegevens van de Western Blot toonden een lichte afname in ZO-1-expressie op dag 10 in vergelijking met dag 7-post seeding. Dit verschil in observatie is waarschijnlijk te wijten aan de bijdrage van andere extracellulaire eiwitten, afgezien van ZO-1, bij het handhaven van barrière dichtheid. Samenvattend hebben we met succes gegevens van twee orthogonale technieken gebruikt om de kinetiek van de nauwe junctie barrière vorming in een humaan celmodel van de BBB te bepalen. Terwijl de LY Papp assay de functionaliteit van de TJ Barrier heeft gemeten, traceerde de Western Blot-gegevens de vorming van de tjs met zo-1 als marker-eiwit.

Als aanvullend nut van de ontwikkelde assay bevestigden we dat DNA NP-trans fectie in monolagen van hcmec/D3 geen invloed heeft op de integriteit van tjs (Figuur 5). Onbehandelde cellen met groeimedium werden gebruikt als de negatieve controle en cellen die vooraf werden geïnincubeerd met calcium vrij medium voor 24 uur, werden gebruikt als een positieve controle. Cellen waarin de TJs werden verstoord als gevolg van de calcium depletie toonde een 210% toename in LY Papp in vergelijking met de onbehandelde cellen. Onze gegevens suggereren dat DNA NP-trans fectie ofwel in aanwezigheid of afwezigheid van P84 geen invloed heeft op de integriteit van TJ. Opgemerkt dient te worden dat het ontbreken van LY Papp veranderingen in getransfunteerde cellen is niet een onbetekenbare observatie. In feite, onze DNA-NPs bemiddelde significante niveaus van genexpressie in de moeilijk te transfect hcmec/D3 monolagen9,35,36,37. DNA NPS bevattende 0,01 of 0,03 WT.% P84 toegenomen plaats genexpressie door ca. 18-en 30-voudige, respectievelijk, in vergelijking met DNA NPS alleen (Figuur 6a). We hebben ook aangetoond dat onze NP-behandelingen geen nadelige invloed hebben op de cellulaire ATP-niveaus, hier gebruikt als een indicator van de levensvatbaarheid van de functionele cel (Figuur 6b). Onze resultaten onderstrepen het uitgebreide nut van deze ly Papp assay om de integriteit van de TJ Barrier in een experimentele transfectie Setup te bepalen.

Een cruciale stap in de uitvoering van de LY-assay is om dezelfde hoeveelheid LY in apicale zijde en gelijke volume van de transport buffer in de basolaterale kant over de verschillende tijdspunten in het hele experiment te houden. Als er verschillende hoeveelheden LY of ongelijke volumes van transport buffer in putten werden gebruikt, zou de berekening van de P-app onbetrouwbaar zijn, wat resulteert in kunstmatig grote standaarddeviaties. Een ander belangrijk aspect is het beperken van de blootstelling aan licht om het verval van de intensiteit van de sterk fluorescentie te minimaliseren. Ook moet de vloeistof volledig worden verwijderd voordat exact hetzelfde volume van de LY-oplossing en de transport buffer in apicale zijde en basolateraal zijde worden toegevoegd. Dit zorgt ervoor dat de fluorescentie-uitlezen betrouwbaar kan worden gebruikt voor de berekening van de P-app . Een andere belangrijke stap in dit experiment is om onmiddellijk de LY fluorescentie van de basolaterale monsters te meten en te voorkomen dat de monsters na het verzamelen moeten worden bevroren. Het onderwerpen van de LY-bevattende monsters aan Vries-ontdooien cycli resulteert in een grotere intra-groepvariatie van het fluorescentie signaal. Een beperking van het gebruik van de trans well Setup is dat de levende cellen moeilijk te visualiseren zijn door conventionele microscopie of afbeelding gemaakt door confocale microscopie. Bovendien, het niet gemakkelijk vertalen in een Setup die het mogelijk maakt coculturing verschillende celtypen tenzij gemengde kweek van zeggen, gliacellen en endotheel cellen is een mogelijkheid. Niettemin heeft de LY assay de volgende voordelen: LY is een kleurstof met verschillende excitatie/emissie pieken en een relatief grote Stokes verschuiving in vergelijking met kleurstoffen zoals natrium fluorescein, die een robuuste meting van de sonde oversteken van de BBB mogelijk maakt en vermijdt de behoefte aan extra radio label zoals in het geval van tracers zoals sucrose of mannitol. Hoog herstel% s van LY biedt betrouwbare gegevens om vol vertrouwen P-app -waarden te berekenen.

Op basis van onze bevindingen concluderen we dat de LY Papp -methode een eenvoudige en robuuste assay is om de paracellulaire permeabiliteit over hCMEC/D3-celmonolagen te kwantificeren. Door gebruik te maken van de LY Papp -methode, hebben we de cultuur tijd voor de vorming van intacte barrière geoptimaliseerd en hebben we een aanvullend nut van de ontwikkelde assay aangetoond door de TJ-integriteit in DNA NP-getransfunteerde celmonolagen te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de 2017 nieuwe Investigator Award van de American Association of Pharmacy, een Hunkele dreaded Disease Award van de Duquesne University en de start-up fondsen voor de school of Pharmacy voor het Manickam Laboratory. We willen graag het lek laboratorium (Duquesne University) bedanken voor Western blotting Assistance en het gebruik van hun Odyssey 16-bit Imager toestaan. We willen ook een speciale nota van waardering voor Kandarp Dave (Manickam Laboratory) voor hulp bij Western blotting opnemen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15, (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10, (1), 16 (2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10, (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10, (1), 16 (2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability? European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43, (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6, (8), 650 (2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. The Blood-Brain Barrier. Springer. 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25, (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140, (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4, (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).
  25. Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10, (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2, (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33, (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272, (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9, (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4, (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77, (2), 265-274 (2011).
Lucifer geel-een robuuste Paracellulaire permeabiliteit marker in een Celmodel van de menselijke bloed-hersen barrière
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter