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Bioengineering

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

doi: 10.3791/58900 Published: August 19, 2019

Summary

Wir präsentieren einen Fluoreszenz-Test, um zu zeigen, dass Lucifer Yellow (LY) ein robuster Marker ist, um die scheinbare parazelluläre Durchlässigkeit von hCMEC/D3-Zellmonolayern zu bestimmen, einem In-vitro-Modell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. Wir verwendeten diesen Assay, um die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen zu bestimmen.

Abstract

Die Blut- und Hirnschranke BBB besteht aus Endothelzellen, die eine Barriere zwischen dem systemischen Kreislauf und dem Gehirn bilden, um den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zu verhindern. Enge Knoten (TJ) versiegeln effektiv den parazellulären Raum in den Monolayern, was zu einer intakten Barriere führt. Diese Studie beschreibt einen LY-basierten Fluoreszenz-Assay, der zur Bestimmung seinesscheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) verwendet werden kann und wiederum verwendet werden kann, um die Kinetik der Bildung von konfluenten Monolayern und die daraus resultierende enge Kreuzung zu bestimmen. Barriereintegrität in hCMEC/D3-Monolayern. Darüber hinaus zeigen wir einen zusätzlichen Nutzen dieses Assays, um die funktionelle Integrität von TJ in transfizierten Zellen zu bestimmen. Unsere Daten aus dem LY P App-Test zeigen, dass die hCMEC/D3-Zellen, die in einem Transwell-Setup gesät wurden, den LY-Parazelltransport effektiv auf 7 Tage nach der Kultur beschränken. Als zusätzlichen Nutzen des vorgestellten Tests zeigen wir auch, dass die DNA-Nanopartikeltransfektion den LY-Parazelltransport in hCMEC/D3-Monolayern nicht verändert.

Introduction

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Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist die Schutzbarriere, die den Zustrom von Plasmakomponenten in das Gehirngewebe begrenzt und besteht aus Hirn-Endothelzellen zusammen mit unterstützenden Zellen wie Pericyten. Die Hauptrolle von BBB ist es, als Barriere zu dienen, die den Raum zwischen peripherem Blut und zentralem Nervensystem (ZNS) versiegelt, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung1,2zu erhalten. Die Hirnkapillaren-Endothelzellen versiegeln den parazellulären Weg effektiv durch Bildung interzellulärer enger Verbindungen (TJs)1. Diese Schutzbarriere ermöglicht glukose und ausgewählte Nährstoffe in das Gehirn zu gelangen, während es verhindert, dass die Mehrheit der Ionen, toxische Substanzen und Medikamente durch diese enge Barriere passieren. Neben ihrer Schützenrolle stellt die natürliche Barrierefunktion des BBB eine große Herausforderung bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen dar, die auf das ZNS abzielen.

In-vitro-Zellkulturmodelle der BBB sind hilfreiche Werkzeuge, um ihre Biologie zu studieren und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Integrität der TJ-Barriere zu verstehen. Wir verwendeten die menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzelllinie (hCMEC/D3) als In-vitro-Modell, da es sich um ein akzeptiertes Modell des menschlichen Gehirnendothel3 handelt und viele Funktionen des menschlichen BBB rekapituliert. hCMEC/D3ist eine der am häufigsten verwendeten Zelllinien für die Modellierung der BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Trotz ihrer vergleichsweise niedrigen Werte des transendotheliaalen elektrischen Widerstands (TEER), einem Maß für die Dichtheit der Barriere, behält diese Zelllinie die meisten morphologischen und funktionellen Eigenschaften von Hirnendothelzellen bei, selbst als Monokultur kokultivierte Gliazellen6,7. Die hCMEC/D3-Zelllinie drückt mehrere BBB-Marker einschließlich aktiver Transporter und Rezeptoren bis etwa Durchgang 35 aus, ohne eine Dedifferenzierung zu instabilen Phänotypen6,7,9 ,10,11. Das auffälligste Merkmal der hCMEC/D3-Zelllinie als In-vitro-BBB-Modell ist ihre Fähigkeit, TJs5,9,11,12zu bilden. Es sollte beachtet werden, dass, obwohl Stammzellen-abgeleitete BBB-Modelle in vielen Studien eine höhere Permeabilität zeigten als hCMEC/D3-Zelllinieund sie einige BBB-Marker ausdrücken, sie sich aber noch als das häufigste BBB-Zellmodell entwickeln 13 . Wichtig ist, dass stammzellenabgeleitete BBB-Modelle in Bezug auf maximale Durchgangszahlen gekennzeichnet werden müssen, die es den Zellen ermöglichen, stabile BBB-Phänotypen zu erhalten14.

Drei primäre Methoden werden häufig verwendet, um die Integrität der TJ-Barriere zu bestimmen,einschließlich der Messung von TEER, Messung des scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) von kleinen hydrophilen Tracermolekülen wie Saccharose, Inulin, Luzifergelb, usw. und Immunfärbung bekannter molekularer Marker von TJs wie claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER ist eine relativ einfache und quantitative Methode, die den elektrischen Widerstand über die Zellmonolayer misst, die auf einem porösen Membransubstrat kultiviert sind5. TEER-Werte können jedoch durch experimentelle Variablen wie die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Art des Messinstruments beeinflusst werden. Eine wahrscheinliche Kombination dieser Faktoren führt zu einer breiten Verteilung der TEER-Werte von 2 bis 1150 cm2 in der hCMEC/D3-Zelllinie, die für 2-21 Tage kultiviert wurde13. Immunostaining ist eine visuelle Methode, um das Vorhandensein von TJ-Proteinen zu bestimmen, indem das zielgerichtete Protein mit Antikörpern gekennzeichnet wird. Immunstaining beinhaltet jedoch eine Reihe von experimentellen Schritten, einschließlich der Notwendigkeit, Zellen zu fixieren/permeabilisieren, die zu experimentellen Artefakten führen können und die fluoreszierenden Signale können im Laufe der Zeit verblassen. Die oben genannten Faktoren können zu subjektiven Fehlern führen, die sich auf die Datenqualität auswirken.

Der Hauptfokus dieser Arbeit liegt auf der Präsentation eines LY-basierten scheinbaren Permeabilitäts-Assays, der die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen bestimmt. Obwohl andere fortschrittliche In-vitro-BBB-Systeme, wie Co-Kultursysteme, mikrofluidische Systeme, physiologisch relevantere Mimik mit deutlich verbesserter Barrierefunktion15,16,17, das hCMEC/D3 sind transwell Setup ist ein einfaches und zuverlässiges Modell, um die Kinetik der TJ-Bildung zu schätzen und schnell die Wirkung verschiedener Arzneimittelformulierungen auf die Barrierefunktion abzuschirmen. Im Allgemeinen sind die P-App-Werte für verschiedene hydrophile Solutes in hCMEC/D3-Monolayern konsistent. Beispielsweise sind die gemeldeten P-App-Werte für verschiedene niedermolekulare Massensolutes (z. B. Saccharose, Mannitol, LY, etc.) in verschiedenen In-vitro-BBB-Modellen in der Größenordnung von 10-4 cm/min5,18,19 , 20. In unserem Versuchsaufbau werden die Endothelzellen des Gehirns auf einer kollagenbeschichteten mikroporösen Membran zur Zellanhaftung und Monolayerbildung gesät, um die In-vivo-Barriere nachzuahmen. Es wird erwartet, dass die in der apikalen Seite hinzugefügte LY die interzellulären engen Knoten durchqueren und sich in der basolateralen Seite ansammeln. Größere Konzentrationen von LY in der basolateralen Seite deuten auf eine unreife, nicht voll funktionsfähige Barriere hin, während niedrigere Konzentrationen einen eingeschränkten Transport aufgrund des Vorhandenseins funktioneller TJs widerspiegeln, was zu einer ausgereiften Barriere führt.

LY ist ein hydrophiler Farbstoff mit ausgeprägten Anregungs-/Emissionsspitzen und vermeidet die Notwendigkeit, Tracermoleküle wie Saccharose, Mannitol oder Inulin radioaktiv zu beschriften. So können die Fluoreszenzwerte von LY verwendet werden, um seine parazelluläre Permeabilität über die BBB-Monolayer direkt zu berechnen. Im Vergleich zu vielen kommerziell erhältlichen Farbstoffen, die in biomedizinischen Bereichen verwendet werden, die unter kleinen Stokes-Schichten wie Fluorescein21leiden, beträgt die Stokes-Verschiebung von LY etwa 108 nm mit ausreichender spektraler Trennung, so dass LY-Fluoreszenzdaten als robustes Auslesen zur Bestimmung der parazellulären Durchlässigkeit. Wir verwendeten Western Blotting als orthogonale Technik, um Veränderungen in der Expression des engen Knotenmarkerproteins ZO-1 im Laufe der Kulturzeit zu demonstrieren. ZO-1-Expression, die über Western Blotting erkannt wird, wird verwendet, um die LY P-App-Daten zu ergänzen, und in Kombination deuten diese Daten darauf hin, dass die beobachteten Veränderungen der LY P-App-Werte die Bildung einer Monolayer mit allmählicher Ausdruck der engen Anschlussmarkierung ZO-1.

Wie bereits erwähnt, liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit darin, einen LY-Assay als einfache Technik zur Überwachung der Bildung einer konfluenten Monoschicht mit funktionellen engen Knoten zu demonstrieren. Um jedoch einen zusätzlichen Nutzen des entwickelten Tests zu demonstrieren, haben wir die LY PApp in DNA-Nanopartikel-transfizierten hCMEC/D3-Monolayern gemessen. Nukleinsäuren können durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Polymergruppen und den negativ geladenen Phosphatgruppen von Nukleinsäuren 22 zu Polyelektrolyt-Nanopartikeln kondensiert werden22, 23. Wir bezeichnen diese Komplexe in unserer Arbeit als DNA-Nanopartikel (DNA-NPs). Während wir die Zelle transfetieren und das gewünschte Protein ausdrücken wollen, müssen wir sicherstellen, dass die Barriereeigenschaften der hCMEC/D3-Monolayer nicht beeinträchtigt werden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass ein standard4 h luziferase Gentransfektionsregime die LY-Permeabilität nicht messbar verändert, die den Nutzen des LY P App-Assays demonstriert, um Veränderungen in der TJ-Barriereintegrität zu bestimmen.

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Protocol

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1.Allgemeine hCMEC/D3 Zellkultur

  1. Reanimation von gefrorenen Zellen
    HINWEIS: Alle Zellkulturpflege- und Experimente wurden in einer sterilen Biosicherheitshaube durchgeführt. Kulturmedien, Nahrungsergänzungsmittel und Reagenzien wurden entweder als sterile Produkte gekauft oder über Filtration mit einem 0,22 m Membranfilter sterilisiert, um mikrobielle Kontaminationen zu verhindern.
    1. 8,5 ml Kollagenlösung (0,15mg/ml) in einen Gewebekulturkolben (75 cm2 Wachstumsbereich; fortan T75) geben und 1 h in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2) geben.
    2. Entfernen Sie die Kollagenlösung und waschen Sie den Kolben vorsichtig mit sterilisierter Phosphat-gepufferter Saline (PBS). 15 ml komplettes Wachstumsmedium in den Kolben geben und 15 min im CO2-Inkubator abgeben.
      ANMERKUNG: Das komplette Medium (Endkonzentration) enthielt Endothelzellwachstum Basal Medium-2 (500 ml), ergänzt durch fetales Rinderserum (5%), Penicillin-Streptomycin (1%), Hydrocortison (1,4 m), säureascorbunter (5 g/ml), chemisch definiertes Lipid (1/100), HEPES (10 mM) und Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (1 ng/ml).
    3. Bewegen Sie eine Kryovial von gefrorenen hCMEC/D3-Zellen aus dem flüssigen Stickstofftank und tauen Sie die Durchstechflasche schnell in einem 37 °C-Wasserbad auf (< 1 min).
    4. Sobald nur noch eine winzige Eisflocke sichtbar ist, saugen Sie die Zellen schnell an und übertragen Sie sie in den Kolben, der vorgewärmtes Medium enthält. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um eine Vermischung der Zellen mit dem Wachstumsmedium zu ermöglichen.
    5. Legen Sie den Kolben in den Inkubator (37 °C, 5%CO2) und beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop nach 2 h, um sicherzustellen, dass die Zellen befestigt sind.
    6. Sobald die Zellen an der Unterseite des Kolbens befestigen, entfernen Sie das alte Wachstumsmedium und fügen Sie 10 ml frisches vorgewärmtes Wachstumsmedium hinzu, um Dimethylsulfoxid im alten Wachstumsmedium24zu ersetzen.
    7. Nach 24 h unter einem Lichtmikroskop auf spindelförmige Zellen überprüfen und das alte Wachstumsmedium durch vorgewärmtes frisches Wachstumsmedium ersetzen.
  2. Zellkulturpflege
    1. Füllen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag bis zu 100% Zusammenfluss auf. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bevor Sie das alte Wachstumsmedium entfernen und auch nach Zugabe von frischem Wachstumsmedium. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und untersuchen Sie hCMEC/D3-Zellen unter Phasenkontrastmikroskop, um sicherzustellen, dass sie gesund erscheinen.
      HINWEIS: Die meisten Zellen sollten an der Unterseite des Kolbens befestigt werden, haben eine spindelförmige Morphologie und oft wird auch Licht um ihre Membranen brechen. Wachstumsmedium sollte transparent (nicht bewölkt) und rosa-orange in der Farbe sein.
    2. Altes Wachstumsmedium aus dem Kolben nehmen und 10 ml vorgewärmtes frisches Medium in den Kolben übertragen.
      HINWEIS: Das Medium sollte auf der Oberseite des Kolbens und nicht direkt auf der Oberfläche der Zellen hinzugefügt werden, um die Zellbindung zu vermeiden.
    3. Drehen Sie den Kolben wieder in horizontale Position und schaukeln Sie ihn mehrmals sanft und überprüfen Sie hCMEC/D3-Zellen unter dem Mikroskop, bevor Sie den Kolben zum Inkubator zurückgeben (37 °C, 5% CO2).
    4. Beobachten Sie die Zellen unter einem invertierten Lichtmikroskop jedes Mal vor und nach der Handhabung der Zellen, sowohl während der regulären Kulturarbeit als auch während der Experimente. Zeichnen Sie alle spürbaren Änderungen in der Zellzahl oder Morphologie im Labor-Notebook auf.
  3. Zellpassaging
    1. Inkubieren Sie einen neuen T75-Kolben mit 8,5 ml Kollagenlösung für 1 h im Inkubator (37 °C, 5% CO2).
    2. Entfernen Sie die Kollagenlösung und waschen Sie den Kolben vorsichtig mit sterilisiertem PBS. 10 ml vorgewärmtes hCMEC/D3-Medium in den neuen Kolben geben und den Kolben in den Inkubator legen (37 °C, 5% CO2).
    3. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und untersuchen Sie hCMEC/D3-Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen zu 100% konfluent sind.
    4. HCMEC/D3-Zellmedium aus dem Kolben entfernen, der Zellen enthält, und hCMEC/D3-Zellen mit 10 ml PBS waschen.
      HINWEIS: FBS, das dem Wachstumsmedium zugesetzt wird, enthält Protease-Inhibitoren wie z. B. Antitrypsin und 2-Macroglobulin. Diese hemmen den Trypsinisierungsprozess. Daher ist es wichtig, die Zellen mit PBS zu waschen, um Spuren von FBS zu entfernen, um die Hemmung des Trypsinisierungsprozesses zu verhindern.
    5. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-Lösung mit 0,02% EDTA hinzu und versuchen Sie 2-5 min imInkubator (37 °C, 5% CO2 ) (tippen Sie vorsichtig auf den Kolben an den Seiten, um die Ablösung zu unterstützen).
      HINWEIS: Lassen Sie die Zellen niemals mehr als 6 min auf Trypsin/EDTA.
    6. Fügen Sie 10 ml vorgewärmtes hCMEC/D3-Medium hinzu, um den Trypsinisierungsprozess zu stoppen und die hCMEC/D3-Zelle durch mehrmalses Pipetieren nach oben und unten wieder aufzuhängen. Entfernen Sie dann die gesamte Zellsuspension aus dem Kolben in ein 15 ml-Rohr.
    7. 1 ml der Zellsuspension aus dem 15 ml Rohr auf den neuen Kolben mit vorgewärmten frischen Medien (Spaltenzellen 1:10) übertragen und den neuen Kolben zurück zum Inkubator zurückgeben.
      HINWEIS: Bevor Sie auf den neuen Kolben übertragen, pipette die Zellsuspension mehrmals nach oben und unten, um Zellkonzentrationsgradienten zu minimieren.

2. Zellbeschichtung

  1. Gewebekultureinsätze mit mikroporösen Membranen (Porengröße: 0,4 m, Material: Polyethylenterephthalat (PET)) in eine 24-Well-Kulturplatte geben.
  2. Fügen Sie 400 l Kollagen Typ I (0,15 mg/ml) in jede Gewebekulturbeilage und inkubieren Sie für 1 h im CO2-Inkubator (37 °C, 5% CO2). Rocken Sie die 24-Well-Platte sanft, um eine gleichmäßige Ausbreitung der Kollagenlösung über die mikroporöse Membran in den Gewebekultureinsätzen zu ermöglichen.
  3. Entfernen Sie die Kollagenlösung und waschen Sie die mikroporöse Membran vorsichtig mit 0,4 ml 1x 1x PBS Puffer.
  4. Platte hCMEC/D3-Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in den Zelleinsätzen (15.000 Zellen in 500 l Medium).
    HINWEIS: Um die Unterschiede in der Zellzahl in jedem Gewebekultureinsatz zu minimieren, wurde die Zellsuspension mit einer 10 ml Pipette resuspendiert, bevor zellen zu den Einsätzen hinzugefügt wurde.
  5. Legen Sie die 24-Well-Platte mit Gewebekultur-Setup in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2), um Zellanhaftung und Proliferation zu ermöglichen.
  6. Inkubieren Sie die Platte für 7 Tage, damit die Zellen 100% Konfluenz erreichen können. Entfernen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag und übertragen Sie 0,5 ml vorgewärmte Frischmedien in Gewebekultureinsätze.
  7. Wiederholen Sie den Beschichtungsvorgang (Schritte 2.2-2.6) auf einer 12-Well-Platte, einer 48-Well-Platte und einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie die 12-Well-Platte für Western Blotting, um Änderungen im ZO-1-Ausdruck zu bestimmen. Verwenden Sie die 48-Well-Platte für die DNA-NP-Transfektion. Verwenden Sie die 96-Well-Platte für den ATP-Assay, um die Zelllebensfähigkeit in transfizierten Zellen zu bestimmen.

3. Kinetik des Zellwachstums.

  1. Samen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in einer kollagenbeschichteten 24-Well-Gewebekulturplatte.
  2. Entfernen Sie an jedem Tag des Experiments das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 l 1x PBS. Dann fügen Sie 30 l 0,25% Trypsin-Lösung mit 0,02% EDTA hinzu und lassen Sie die Platte ca. 2-5 min in einem Inkubator (37 °C, 5% CO2).
    ANMERKUNG: Die allmähliche Bildung der konfluenten Monoschicht kann das Ausmaß der Zellablösung beeinflussen, und es ist notwendig, die Mengen von Trypsin/EDTA, wie hier angegeben, zu erhöhen: 30 L für 1-5 Tage nach der Aussaat, 60 l für 6-7 Tage nach der Aussaat und 100 L für 8-10 Tage nach der Aussaat .
  3. Fügen Sie entweder 470 l, 440 l oder 400 L Wachstumsmedium auf der Grundlage des Volumens der Trypsin/EDTA-Lösung hinzu, die im Schritt 3.2 hinzugefügt wurde, um 500 l Zellsuspension in jedem Bohrkörper vorzubereiten.
  4. Suspendieren Sie die Zellen, indem Sie in jedem Brunnen mehrmals nach oben und unten pfeifen, und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen im Wachstumsmedium suspendiert sind. Wenn einige Zellen nach dem Pipetieren noch mehrmals am Plattenboden befestigt sind, kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Kunststoffzellenschaber, um die Zellablösung zu erleichtern.
  5. Entfernen Sie 0,1 ml Zellsuspension von 500 l Zellsuspension in Schritt 3.3 und fügen Sie zu einem 1,5 ml Rohr hinzu. Dann 0,1 ml 0,4% Trypan-Blaulösung in die Zellsuspension geben und gut mischen.
  6. Reinigen Sie ein Hemacytometer mit 70% Isopropylalkohol. Fügen Sie 20 l Mischung aus Schritt 3,5 auf jeder Seite in der V-Nut hinzu und lokalisieren Sie die 16 Quadrate unter dem Mikroskop. Die 16 Quadrate werden als ein Raster betrachtet. Suchen Sie zwei zufällige Gitter auf jeder Seite des Hemacytometers und zählen Sie alle lebenden, nicht blauen Zellen.
    HINWEIS: Zellen, die blau in der Farbe von der Zählung ausgeschlossen erschienen, <1% der Zellen blau zu allen Zeitpunkten gebeizt.
  7. Berechnen Sie die Zelldichte (Zellen/cm2) basierend auf folgenden Formeln.
    Durchschnitt der Zellen/Raster Equation 1 = (Eq.1)
    Verdünnungsfaktor= Equation 2 (Eq.2)
    Zelldichte (lebensfähige Zellen/cm2) =
    Equation 3
    (Eq.3)
    Gleichungen 1-3. Lebensfähige Zellen sind die Anzahl der Zellen in jedem Raster gezählt, Anzahl der Gitter entsprechen der Anzahl der Gitter unter dem Mikroskop, Volumen der Mischung von Zellsuspension und 0,4% Trypan blau ist das Volumen in Schritt 3.5 vorbereitet, Volumen der Zellsuspension entfernt wird das Volumen von 500 l Zellsuspension in Schritt 3.5 entfernt, das Volumen der Zellsuspension in jedem Brunnen ist die 500 l Zellsuspension aus Schritt 3.3, Wachstumsbereich der Gewebekulturplatte ist der Wachstumsbereich von Einzelbrunnen in 24-Well-Platte.

4. Luzifer gelb scheinbare Durchlässigkeit (LY P App ) Assay

  1. Um die LYP-App an jedem Tag nach dem Seeding zu bestimmen, führen Sie die Schritte ab 4.3 aus. Zur Bestimmung der P-App in transfizierten hCMEC/D3-Zellen fügen Sie 8,3 l der Transfektionsformulierung (Abbildung 1) mit 50 l vollständigem Wachstumsmedium und Inkubation für 4 h vermischt hinzu. Transfektionsformulierungen sind in Abschnitt 5 beschrieben.
  2. Waschen Sie nach der 4 h-Transfektion die apikale Seite vorsichtig zweimal mit einem sterilen 1x PBS-Puffer, um restliche Transfektionsmischungen zu entfernen. Unterschiedliche Volumina des PBS-Puffers, die nach der Entfernung zurückbleiben, können die Konzentration von LY auf der apikalen Seite beeinflussen. Achten Sie darauf, dass der verbleibende PBS-Puffer in Gewebekultureinsätzen vollständig entfernt wird. Saugen Sie sorgfältig Restreagenzien und Medium, um die Zellablösung zu minimieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird bei der Messung der alltäglichenscheinbaren Durchlässigkeit (P-App ) von hCMEC/D3-Zellen übersprungen.
  3. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und fügen Sie 1,5 ml vorgewärmten (37 °C) Transportpuffer (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 1 mM NaH2PO4, 5 mM Glukose, pH 7,4) zur basolateralen Seite hinzu.
    ANMERKUNG: Das Volumen des Transportpuffers in allen basolateralen Kompartimenten sollte gleich sein, um die Genauigkeit der Berechnung des Permeabilitätskoeffizienten zu gewährleisten.
  4. Fügen Sie der apikalen Seite jedes Transwell-Einsatzes 58,3 L von 20 -M LY-Lösung hinzu. Sparen Sie 50 l der 20-Mm-LY-Lösung für Fluoreszenzmessungen. Nachdem Sie den Rest-PBS-Puffer vollständig von der apikalen Seite entfernt haben, fügen Sie die LY-Lösung so schnell wie möglich hinzu, um das Trocknen von hCMEC/D3-Zellen zu vermeiden. Stellen Sie genaue Volumina der LY-Lösung auf der apikalen Seite sicher.
    HINWEIS: Um den Zerfall der LY-Fluoreszenzintensität zu minimieren, sollte die Lichtexposition begrenzt sein. Nach der Rekonstituierung des LY-Pulvers sollte die Lösung bei 4 °C gelagert werden, geschützt vor Licht.
  5. Inkubieren Sie in einem Drehplatten-Shaker (37 °C, 100 Rpm) für 60 min. Entfernen Sie dann 30 l der LY-Probe aus jedem apikalen Fach. Dann die 20-M-LY-Lösung und die apikalen Seitenproben in vorbeschriftete Rohre übertragen und die Probe mit einem Transportpuffer 10-fach verdünnen.
    HINWEIS: Es ist erforderlich, die 20-M-LY-Stammlösung und die apikalen Seitenproben zu verdünnen, da die hohe Fluoreszenzintensität dieser Proben den Fluoreszenzdetektor des Fluoreszenz-Mikroplattenlesers potenziell überlasten und beschädigen kann.
  6. Entfernen Sie 500 l aus jedem basolateralen Fach und übertragen Sie die Probe in vorbeschriftete Rohre.
    HINWEIS: Proben werden zu angegebenen Zeitpunkten aus einem separaten Transwell entfernt. Die Zeitpunkte sind jeden Tag nach der Aussaat ab Tag 1 bis Tag 10.
  7. Bereiten Sie eine Reihe von LY-Standards für die Standardkurve vor (39,00 nM, 78,13 nM, 156,25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
  8. Fügen Sie jedem Bohrwert in einer schwarzen 96-Well-Platte 100 l jeder Standard-, apikalen und basolateralen Probe hinzu (Abbildung1).
    HINWEIS: Schwarze Platten absorbieren Licht und reduzieren Hintergrund- und Fluoreszenz-Crossover zwischen Brunnen.
  9. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Mikroplattenleser (Sollwerte: Anregung 428 nm, Emission 536 nm), um die LY-Fluoreszenzintensität zu messen, um dieP-Appzu berechnen. Für diese Studie wird ein Fluoreszenzplattenleser verwendet.
  10. Berechnen Sie die P-App- und %LY-Wiederherstellungswerte, wie im Manuskripttext beschrieben.
    Gleichung 4. Formeln für die Berechnung von P-App-Werten.
    Berechnen Sie den koeffizientenKoeffizienten der scheinbaren Durchlässigkeit (P-App) und die %LY-Wiederherstellung anhand der folgenden Gleichungen. Es sollte beachtet werden, dass die P-App-Werte entweder auf der Grundlage von Masse25 oder der Konzentration von LY berechnet werden können.
    Equation 4 oderEquation 5
    VA - Volumen im apikalen Fach
    VB - Volumen im basolateralen Fach
    A - die Oberfläche der Transwell-Insert-Membran (0,3 cm2)
    MA0 - die Anfangsmasse im apikalen Fach
    MB/t - die Veränderung der Masse im Zeitverlauf im basolateralen Fach
    CA0 - die Anfangskonzentration im apikalen Fach
    CB/t - die Veränderung der Konzentration im Zeitverlauf im basolateralen Fach.
    Gleichung 5. Formeln für die Berechnung von % LY-Wiederherstellung.
    Erholung (%) = Equation 6
    MAf ist die Masse im apikalen Fach am Endzeitpunkt, MBf ist die Masse im basolateralen Fach am Endzeitpunkt, MA0 ist die Anfangsmasse im apikalen Fach. 26 Hinweis: Die Anfangsmasse wird auf der Grundlage des Volumens der 20-M-LY-Lösung im Schritt 4.5 berechnet. Dieses Experiment wurde immer mit Zellen unter Durchgangsnummer 35 durchgeführt und wurde viermal unabhängig durchgeführt.

5. Kalziummangel

  1. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Transwell-Einsätzen und der 12-Well-Platte und waschen Sie die apikale Seite und die 12-Well-Platte vorsichtig mit vorgewärmtem calciumfreiem Medium (Minimum Essential Medium Eagle Spinner (S-MEM) medium), um Calciumionen aus den Transwell-Einsätzen zu entfernen und 12-Well-Platte.
  2. 500 l oder 2 ml vorgewärmtes S-MEM 1xmedium zu den Einsätzen oder 12-Well-Platten geben und 24 h im Inkubator brüten (37 °C, 5% CO2). Nach der Inkubation das 1x-Medium S-MEM entfernen und die Zellen einmal mit vorgewärmten 1x PBS-Puffer waschen.
  3. Befolgen Sie die schritte 4.4-4.10, die in Abschnitt 4 für die LY-Behandlung und die nachfolgenden Schritte beschrieben sind. Führen Sie die Schritte 8.1.2-8.2.4 aus, die in Abschnitt 8 für Western Blotting und nachfolgende Schritte beschrieben sind.

6. Transfektion

  1. Herstellung von DNA-Nanopartikeln (DNA-NPs).
    1. Verdünnen Sie die Stammlösung von gWIZ-Luc Plasmid in 10 mM Natriumacetat (NaAc) Puffer (pH 5.0) und lassen Sie die DNA-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur (RT) stehen.
      HINWEIS: Die DNA NP, die überwiegend einzelne DNA-Moleküle enthält, kann in DNA-Konzentrationen von 20-40 g/ml23hergestellt werden. Daher muss die gWIZ-Luc Plasmid-Stammlösung verdünnt werden. Der gefrorene gWIZ-Luc Plasmidbestand muss komplett auf Eis aufgetaut werden, um Temperaturstress zu minimieren. Wirbeln Sie die verdünnte DNA-Lagerlösung für 30 s auf einem Standard-Benchtop-Wirbeltexer auf Knopfposition 3-5 sanft.
    2. Berechnen Sie die gewünschten N/P-Verhältnisse, die hier als numerischer Parameter verwendet werden, um die NP-Zusammensetzung widerzuspiegeln.
      Equation 7
      Gleichung 6. N/P-VerhältnisBerechnung: das Verhältnis der Maulwürfe der Amingruppen kationischer Polymere zu dem der Phosphatgruppen der DNA. Masse der kationischen Polymere: Gesamtgewwägete Menge kationischer Polymere; (Masse/Ladung) kationische Polymere bezieht sich auf das Molekulargewicht von kationischem Polymer (Poly (Ethylenglycol)5k-Block-Polyaspartamid mit 48 Diethylenetiamin-Seitenketten (PEG-DET)), normalisiert auf die Anzahl der geladenen Primäramine (48) pro kationisches Polymer ( mol/mol), ist dieser Wert für unser Polymer 306 Da; Dna-Masse bezeichnet die Gesamtmenge der DNA, die in der Formulierung verwendet wird, die durch Multiplikation des Volumens und der Konzentration in mg/ml gewonnen wird; (Masse/Ladung) DNA bezieht sich auf das Molekulargewicht der DNA normalisiert auf Anzahl der Phosphatgruppe pro doppelsträngige DNA (325 Da pro Nukleobase).
      HINWEIS: Die DNA NP-Vorbereitungstabelle (Tabelle 1) enthält das Rezept für die verschiedenen Proben, die in unseren Experimenten getestet wurden. DNA NP wurden mit einer schnellen Titrationstechnik hergestellt. Die PEG-DET Polymerlösung wurde entlang der Rohrwände hinzugefügt, während das Rohr in einer horizontalen Position gehalten wurde. Dann wurde das Rohr in eine vertikale Position geschaltet, gefolgt von einem schnellen Wirbel bei maximaler Geschwindigkeit für 10s. Die DNA NP durfte vor der Anwendung 30 min bei RT stehen. Die Faustregel für die DNA-NP-Dosierung beträgt 0,5 g DNA für ca. 1 cm2 Wachstumsfläche. So bereiten Sie für jeden Transwell-Einsatz/jeden Brunnen in einer 48-Well-Platte/jeder Bohrung in einer 96-Well-Platte DNA-NP bei N/P 10 vor, die 0,157/0,5/0,195 g/Well von gWIZ-Luc DNA enthält.
    3. Für Proben mit einer angegebenen Konzentration von Poloxamer P84 (P84) fügen Sie P84 zu DNA NP und Wirbel für 5 s hinzu. Die Endkonzentration von P84 in jeder Probe beträgt entweder 0,01 % oder 0,03 % wt.
  2. DNA-NP-Transfektion in einem 48-Well-Platten-Setup
    1. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in einer 48-Well-Platte und wachsen Sie bis zum Zusammenfluss im Inkubator (37 °C, 5% CO2 ).
    2. Mischen Sie für jede Behandlungsgruppe 25 l der angegebenen Probe (Transfektionsformulierung) und 150 l des gesamten Wachstumsmediums und 175 l dieser Mischung zu jedem Brunnen.
    3. Beobachten Sie die hCMEC/D3-Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen zum Zeitpunkt des Experiments gesund und zu 100 % konfluent erscheinen.
    4. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus Brunnen und 175 L Transfektionsmischung zu jedem Brunnen. Dann inkubieren Sie die Platte für 4 h im Inkubator (37 °C, 5% CO2).
    5. Nach 4 h das Transfektionsgemisch entfernen und die hCMEC/D3-Zellen mit vorgewärmten sterilen 1x PBS-Puffer waschen.
      HINWEIS: Um die versehentliche Ablösung von hCMEC/D3-Zellen von der Platten-/Einfügefläche während der Waschschritte zu minimieren, pipetten Sie sorgfältig ausreichend sterile PBS entlang der Wände der Brunnen und entfernen Sie alle Nanopartikel in den Restkulturmedien.
    6. Die Platte ein paar Mal vorsichtig schaukeln und vorsichtig ansaugen und entsorgen Sie die PBS-Waschanlage und fügen Sie 500 L hCMEC/D3 vorgewärmtes Kulturmedium hinzu.
    7. Mikroskopisch untersuchen Sie die Zellen und zeichnen Beobachtungen auf Zellmorphologie und mögliche Auswirkungen der Transfektion auf.
    8. 24 h im 37 °C Zellkultur-Inkubator inkubieren, um die Luziferase-Produktion zu ermöglichen. Nach 24 h das Wachstumsmedium vollständig entfernen und die Zellen einmal mit vorgewärmtem 1x PBS waschen.
    9. Lyse die transfizierten Zellen durch Zugabe von 100 l eiskalte Luziferase-Zellkultur Lyse 1x Reagenz pro Brunnen.
    10. Zur Messung des Luciferase-Proteingehalts 20 l Zelllysat und 100 l Luziferase-Assay-Puffer (20 mM Glycylglycin (pH 8), 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 3,5 mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,27 mM Coenzym A) in ein 1,5 ml-Rohr geben.
    11. Lesen Sie die Lumineszenz der Probe, die im Schritt 6.2.10 auf einem Luminometer mit einem einzigen Auto-Injektor beschrieben wird.
      HINWEIS: Die Lumineszenz sollte vor dem Lesen über 10 s integriert werden.
    12. Messen Sie die Gesamtmenge des zellulären Proteins im Lysat mit einem Bicinchoninsäure-Assay(BCA-Assay)-Kit, indem Sie dem Herstellerprotokoll folgen.
    13. Berechnen und exprimieren Sie die Luziferase-Genexpression als Relative Light Units (RLU) pro gesamtem zellulären Protein.

7. Lumineszierender ATP-Assay

  1. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in einer 96-Well-Platte und wachsen Sie bis zum Zusammenfluss im Inkubator (37 °C, 5% CO2 ).
  2. Transfekte die Zellen mit 9,7 l der Transfektionsformulierung (Vorbereitungsdetails sind in Abschnitt 6) und 58,4 l des gesamten Wachstumsmediums für 4 h.
  3. Entfernen Sie das Transfektionsgemisch und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit vorgewärmten PBS 1x Puffer zweimal, um die Behandlungsreagenzien vollständig zu entfernen.
    HINWEIS: Verschiedene Mengen des Restpuffers könnten die ATP-Assay-Reagenzien in unterschiedlichem Ausmaß verdünnen und die Daten potenziell beeinflussen.
  4. Mischen Sie 75 l frisches vorgewärmtes Medium und ATP-Assay-Reagenz in einer 1:1-Verdünnung mit einer Mehrkanalpipette. Stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand in allen Mehrkanal-Pipettenspitzen gleich ist.
  5. Legen Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur auf einen nussigen Shaker. Nach 15 min Zugabe der Reagenzien 60 l jeder Probe in eine weiße 96-Well-Platte geben.
    HINWEIS: Weiße Platten sind besser, Ausgangslicht als klare oder schwarze Platten zu reflektieren.
  6. Pop alle Luftblasen mit einer Nadel vor dem Lesen der Platte. Lesen Sie die Platte auf einem Luminometer mit einer Integrationszeit von 1 s. Lesen Sie die Platte innerhalb von 20 min nach Zugabe von ATP-Assay-Reagenzien. Timing ist entscheidend für den Vergleich zwischen verschiedenen Platten, da das Lumineszenzsignal mit einer schnellen Zerfallsrate transient ist.
  7. Berechnen Sie den Prozentsatz (%) Zelllebensfähigkeit nach dieser Formel: (Lumineszenz transfizierter Zellen/Lumineszenz der Kontrolle, unbehandelte Zellen) x 100.

8. Western Blotting zur Messung des engen Knotenproteins ZO-1

  1. Zelllyse und Proteinextraktion
    HINWEIS: Alle Schritte zur Proteinextraktion aus Zellen müssen bei 2-8 °C durchgeführt werden.
    1. Samen Sie die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in einer kollagenbeschichteten 12-Well-Gewebekulturplatte.
    2. An Tag 3, Tag 5, Tag 7, Tag 10 nach der Aussaat und an Tag 7 (Zellen mit kalziumfreiem Medium vorbebrütet), entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit 2 ml eiskaltem 1x PBS. Dann fügen Sie 300 l Mischung aus eiskaltem 1x RIPA-Lysepuffer, der 3 g/ml Aprotinin in jedem Brunnen enthält.
      HINWEIS: Die Mischung sollte frisch hergestellt und auf Eis gehalten werden. Aprotinin wird verwendet, um proteasen, die in Lysaten vorhanden sind, daran zu hindern, das Protein von Interesse zu degradieren.
    3. Nach zwei Gefrierzyklen (-80 °C) kratzen Sie die Zellen mit einem kalten Kunststoffzellenschaber. Sammeln Sie die Zelllysate in Mikrofugenröhren. Zentrifugieren Sie dann die Rohre bei 200 x g für 30 min bei 4 °C.
    4. Sammeln Sie den Überstand in saubere Rohre und legen Sie sie auf Eis. Messen Sie die Gesamtmenge des zellulären Proteins in den Lysaten mit dem BCA-Assay-Kit, indem Sie dem Herstellerprotokoll folgen.
  2. Western Blotting zum Nachweis von engen Knotenprotein ZO-1
    1. Denaturierende Aliquoten der Gesamthomogenate mit einem Gesamtprotein gehaltiumieren 40 g mit 1x Laemmli-Puffer bei 95 °C, 5 min und elektrophorese mittels Elektrophorese in einem reduzierenden 6-7,5% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) (90 V, 10 min durch Stapelgel, 120 V durch Gele lösen).
      HINWEIS: Denken Sie beim Laden der Proben oder Standards daran, langsam und vorsichtig in jede Spur zu laden, wobei Sie darauf achten, den Brunnen dabei nicht zu brechen.
    2. Übertragen Sie die abgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran mit pH 8,5 Transferpuffer, der 192 mM Glycin, 25 mM Tris Base, 10% Methanol und 0,1% SDS (75 V, 110 min bei Raumtemperatur) enthält.
      HINWEIS: Berühren Sie die Membran nicht. Verwenden Sie 70% Isopropanol-gewaschene Kunststoffzange, um die Membran zu handhaben. Um das ZO-1-Protein (MW 200 kDa) erfolgreich auf die Membran zu übertragen, sollte der pH-Wert bei 8,3-8,5 betragen. Wenn der Transferpuffer saurer ist, würde eine Übertragung nicht stattfinden. Wenn die Leiterbänder noch auf dem Gel sichtbar sind, wäre es hilfreich, die Transferzeit und die SDS-Konzentration zu erhöhen.
    3. Nach dem Waschen der Membran mit Tris-gepufferter Salin, die 0,1%Tween 20 (T-TBS) enthält, verwenden Sie die Blockierlösung (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris gepufferte Saline), um die Membranen für 60 min zu blockieren.
    4. Schneiden Sie die Membran vorsichtig in zwei Streifen. Inkubieren Sie mit zwei primären Antikörpern (ZO-1 monoklonaler Antikörper, Verdünnung, 1: 900, und Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) Antikörper, Verdünnung, 1: 10.000) über Nacht bei 4 °C. Dann inkubieren Sie die ZO-1- und GAPDH-Membranen mit Esel-Anti-Maus-IgG (Verdünnung, 1:50.000). Nach dem Waschen der Membranen mit T-TBS, stellen Sie die Membranen im 700-Kanal auf einem 16-Bit-Imager ab.

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Representative Results

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Zuerst haben wir den Effekt der Kultivierungszeit auf die LY-Permeabilität bestimmt, um die scheinbare Kinetik der TJ-Bildung zu bestimmen. Die durchschnittlichen LY P-App-Werte vom Tag 1 bis 10-Post-Seeding sind in Abbildung 2adargestellt. Am ersten Tag betrug die durchschnittlicheP-App 4,25 x 10-4 cm/min und fiel am 2. Tag leicht auf 3,32 x 10-4 cm/min. Der mittlere P-App-Wert stieg am 3. Tag leicht auf 3,93 x 10-4 cm/min und schwankte ohne signifikante Änderungen bis zum 6. Tag. Die P-App-Werte verringerten sich signifikant auf 2,36 x 10-4 cm/min an Tag 7 im Vergleich zu Tag 1 (P < 0,05), was wahrscheinlich darauf hindeutet, dass die Barriere enger wurde. Die P-App-Werte stabilisierten sich im Bereich zwischen 2,14 x 10-4 und 2,36 x 10-4 cm/min vom 7. bis zum 10. Tag, was bedeutete, dass die Barrierebildung vollständig und funktional war, was zu einem verringerten LY-Parazelltransport führte. Wir berechneten den Prozentsatz (%) LY an jedem Tag wiederhergestellt, um ca. 80% zu sein, ein Wert, der als optimal angesehen wird, um den P-App-Wert27 (Figure 2b)zuverlässig zu berechnen. Recovery% ist ein wichtiger Index im LY-Assay. Wenn beispielsweise Zellen die meisten LY verstoffwechseln, LY in Zellen immobilisiert wird oder an der Zellmembran klebt oder LY während der Inkubation abnimmt, wäre es ungenau zu interpretieren, dass ein beobachtetes niedriges LY-Signal im basolateralen Fach auf eine enge Barriere hindeutet. Daher gibt Recovery% mehr Vertrauen, dass wir aufgrund einer oder mehrerer der oben genannten Möglichkeiten keine signifikante Menge an LY verloren haben, und ermöglicht es, die Ly P-App-Werte sicher zu schätzen. Wie bereits im Einleitungsabschnitt erwähnt, weisen höhere Ly-Konzentrationen auf der basolateralen Seite auf eine unvollständige Barriere hin, während niedrigere Konzentrationen einen eingeschränkten Transport widerspiegeln, was auf eine ausgereifte, vollständige Barriere aufgrund des Vorhandenseins Tjs. Wir stellen auch zusätzliche Beweise mit einer orthogonalen Technik, Western Blotting Detektion von ZO-1 Protein (Abbildung 4), um zu bestätigen, dass die beobachteten Veränderungen in DER LYP-App mit der Bildung von engen Knoten korreliert.

Da das Transwell-Insert-Setup es nicht erlaubt, Änderungen der Zelldichte direkt nachzuverfolgen, haben wir Änderungen der Zelldichte mithilfe eines standardmäßigen Trypan Blue-Ausschluss-Assays ermittelt. Wir haben daher die Veränderungen der Zelldichte auf einer transparenten Gewebekulturplatte bestimmt, die es uns leicht ermöglichte, die Zellwachstumskinetik zu überwachen. Die Erhöhung der Zelldichte von 5,5 x 1,0 x 104 Zellen/cm2 auf 1,9 x 0,2 x 105 Zellen/cm2 vom Tag 1 bis 10-post-Saat (Abbildung 3) war linear mit einem Regressionskoeffizienten von 0,94. Diese Daten deuten auch darauf hin, dass die beobachteten Veränderungen in der LYP-App (Abbildung 2a) das Ergebnis der Bildung einer konfluenten Monoschicht über den 10-Tage-Zeitraum sind. Wir beobachteten die Zellen unter einem invertierten Lichtmikroskop an jedem Tag und dokumentierten visuell einen allmählichen Anstieg der Zellzahl und Monolayerbildung.

Wir verwendeten Western Blotting, um Veränderungen in der Expression des engen Knotenproteins ZO-1 im Laufe der Zeit zu erkennen (Abbildung 4). Die Änderungen im ZO-1-Ausdruck werden verwendet, um die LY P-App-Daten orthogonal zu ergänzen und sicherzustellen, dass die beobachteten Änderungen in der LYP-App auf die Bildung einer engen Barriere hinweisen. DIE ZO-1-Bandintensitäten wurden durch Densitometrie analysiert und relativ zur Expression eines Housekeeping-Gens, GAPDH, normalisiert. Die beiden Bänder in Abbildung 3a stellen die beiden ZO-1-Isoformen (ZO-1x + und ZO-1-)28dar. Die Densitometrie-Analyse ergab, dass der Pixelwert von ZO-1 von Tag 3-7 nach der Aussaat angestiegen ist, was darauf hindeutet, dass sich das TJ-Protein ZO-1 kontinuierlich vom Tag 3-7 gebildet hat. Nach der Kalziumabbaubehandlung am 7. Tag nach der Aussaat war das Band von ZO-1 fast nicht nachweisbar, was darauf hindeutet, dass ZO-1 sich ohne Kalziumionen nicht bilden konnte. Darüber hinaus ist der Pixelwert von ZO-1 am Tag 10 nach dem Aussaat deutlich gesunken. Die Signalintensitäten von GAPDH vom 3. bis 10. Tag waren vergleichbar, außer am 7. Tag, an dem die Zellen mit kalziumfreiem Medium behandelt wurden. Ein möglicher Grund für die niedrigere GAPDH-Expression in mit Kalzium behandelten Zellen könnte auf das geringere Gesamtprotein (28,9 g Gesamtprotein) zurückzuführen sein, wahrscheinlich auch aufgrund des Kalziummangels. Insgesamt ergab die Banddensitometrie-Analyse eine allmähliche Zunahme der ZO-1-Expression (relativ zu GAPDH) bis zum 7. Tag und eine Abnahme der Expression am 10. Tag, wenn Zellen in vollständigem Wachstumsmedium kultiviert wurden. Die Analyse ergab auch eine niedrigere Expression von ZO-1 (relativ zu GAPDH) an Tag 7 in Zellen, die mit kalziumfreiem Medium behandelt wurden.

Während der Schwerpunkt dieser Arbeit darin besteht, den LY PApp Assay als Methode zur Bestimmung der Kinetik einer Monolayer-Formation zu präsentieren, um einen zusätzlichen Nutzen des entwickelten Assays zu demonstrieren, haben wir festgestellt, ob die DNA-NP-Transfektion die TJ-Barriere beeinflusste. Integrität durch Messung der LY PApp durch hCMEC/D3-Zellen 4 h nach der Transfektion (Abbildung 5). Unsere DNA-NPs, die Poloxamer P84 enthalten, vermitteln hohe Genexpressioninraten in der schwer transfekten hCMEC/D3-Zelllinie (Abbildung 6a). Insbesondere wollten wir feststellen, ob die hydrophoben Domänen von Poloxamer P84 in unseren DNA-NPs die TJ-Integrität in transfizierten Zellen stören können. Die in jeder Behandlungsgruppe wiedergewonnene %LY betrug ca. 92%, was darauf hindeutet, dass die berechneten P-App-Werte zuverlässig sind (Abbildung 5b). Wir stellten fest, dass das Transfektionsverfahren mit verschiedenen Formulierungen die LY PAppnicht beeinflusste, relativ zu nicht transfizierten Zellen, die nur LY ausgesetzt waren. Extrazelluläres Kalzium ist eine kritische Komponente für die Aufrechterhaltung von Zell-Zell-Verbindungen in verschiedenen Zelltypen29,30,31, einschließlich der Hirnmikrogefäß-Endothelzellen. So führt die Aufrechterhaltung von Zellen in kalziumfreiem Medium (CFM) zur Störung von TJs32,33. Daher verwendeten wir Zellen, die mit CFM für 24 h behandelt wurden, als positive Kontrolle.

Unsere Daten zeigen, dass die LY PApp für Zellen, die mit CFM inkubiert wurden, 2-mal höher war als Kontrollzellen, die mit dem regulären Wachstumsmedium inkubiert wurden. Diese 100%ige Zunahme derP-App legt nahe, dass die Zellen ihre TJs verloren hatten, weil Kalziumionen verloren gingen, die für ihre Bildung benötigt wurden. Bemerkenswert ist, dass der tatsächliche Wert (5,14 x 10-4 cm/min) etwas höher war als der durchschnittliche P-App-Wert vom Tag 1-6 nach der Aussaat (Abbildung 2), als die TJs noch nicht vollständig ausgebildet waren. Obwohl nicht signifikant, zeigten Zellen, die mit DNA NP transfiziert wurden, 0,01-0,03% Poloxamer P84 einen winzigen Anstieg der LY P App-Werte im Vergleich zu den unbehandelten Zellen, die in regulären Kulturmedien gehalten werden. Diese Beobachtung deutete darauf hin, dass die DNA-NP+ P84-Transfektion keine signifikante neuflische Wirkung auf die Integrität der TJ-Barriere hatte. Insgesamt betrugen die LY P-App-Werte in den transfizierten Zellen ungefähr 2,5x10-4 cm/min, und dieser Wert entsprach dem Durchschnittswert, der während des Tages 7-10 nach dem Aussaat (Abbildung2) festgestellt wurde, als die LYP-App am wenigsten war, die Anwesenheit von funktionalen TJs, die den ly parazellulären Transport effektiv einschränken.

Wir stellen zusätzliche Transfektionsdaten vor, um zu zeigen, dass das Fehlen von Änderungen in der LYP-App (Abbildung 5) keine inkonsequente Beobachtung ist. Trotz der hohen Transfektioninlagen, die in der DNA-NPs+P84-Gruppe beobachtet wurden, stellten wir keine Änderungen in der LY PApp fest, die darauf hindeuteten, dass unsere Formulierungen die TJ-Barriere nicht stören. Die relativ geringe Transfektionseffizienz in den nackten DNA-behandelten Zellen ist typisch, weil die anionische Natur der Plasmid-DNA (aufgrund von Phosphatgruppen in ihrem Rückgrat) und ihre hydrophile Natur die zelluläre Aufnahme begrenzen. DNA kondensiert in DNA NP vermittelte eine 50-fache Zunahme der Transfektion im Vergleich zu nackten pDNA (Abbildung 6). Die Zugabe von 0,01% P84 in die DNA NP führte zu einem 18-fachen Anstieg im Vergleich zu DNA NP-alone (P< 0.01). Die Erhöhung der P84-Konzentration auf 0,03 Gew.% führte zu einem 30-fachen Anstieg im Vergleich zu DNA NP-alone (P< 0,001). Diese Ergebnisse sind bemerkenswert, da Gehirn Endothelzellen sind ein schwer zu transfekte Zelltyp.

Wir haben die Zelllebensfähigkeit von Zellen gemessen, die unter verschiedenen Bedingungen transfiziert wurden, um zu bestätigen, dass das Transfektionsverfahren keine Zellspannung verursacht. Adenosintriphosphat (ATP) ist die Energiewährung des Lebens und spiegelt die zelluläre Stoffwechselfunktion wider. Wir verwendeten einen auf Luziferase basierenden ATP-Assay, bei dem die Lumineszenzwerte direkt proportional zu ATP-Werten sind. Possimo et al. berichteten, dass der Lumineszenz-ATP-Assay ein robustes Maß für die Lebensfähigkeit der Metabolischen Zellen war34. Die Zelllebensfähigkeit von hCMEC/D3-Zellen, die durch die verschiedenen Formulierungen transfiziert wurden, war vergleichbar mit unbehandelten Zellen (Abbildung 5b), was darauf hindeutet, dass auch die ATP-Werte ähnlich waren. Daher sind DNA-NPs, die Poloxamer P84 (0,01% bis 0,03% w/w) enthalten, sichere Genabgabeformulierungen.

Figure 1
Abbildung 1 . Versuchsaufbau für LY P App Studie. 24-Well-Platten-Setup mit Transwell-Einsätzen (angepasst, um DNA-Nanopartikeltransfektion als Beispiel zu zeigen, Daten in Abbildung 5). Jede Säule wurde mit der angegebenen Probe für 4 h behandelt. Kontrolle zeigt hCMEC/D3-Zellen an, die mit vollständigem Wachstumsmedium behandelt wurden, während Kalziumabbau 24 h anzeigt, dass die Zellen vor der LY-Exposition mit kalziumfreiem Medium inkubiert wurden. Die rechte Vorlage zeigt die Messung der LY-Fluoreszenzintensität in einer schwarzen 96-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 . Scheinbare Kinetik der TJ-Barrierebildung, die mit dem LY P bestimmt wird App assay. (a) LY P App durch hCMEC/D3-Monolayer, die auf Transwell-Einsätzen kultiviert wurden, wurden täglich nach dem Aussaat von Zellen gemessen. (b) %LY in jeder Behandlungsgruppe wiederhergestellt. Die Daten stellen den Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten dar (n=3/Experiment). Statistische Vergleiche wurden mit ungepaartem t-Test (*P< 0,05, N.S. nicht signifikant) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Figure 3
Abbildung 3 . Kinetik des Zellwachstums mit einem Trypan blue exclusion assay bestimmt. hCMEC/D3-Zellen wurden in einer 24-Well-Platte mit einer Zelldichte von 50.000 Zellen/cm2ausgesät. An jedem Tag des Experiments wurden die Zellen mit einem gleichen Volumen von 0,4% Trypan blau dissoziiert und gemischt, bevor lebensfähige Zellen auf einem Hemacytometer gezählt wurden. Die Daten stellen den Durchschnitt von drei unabhängigen Messungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 . Scheinbare Kinetik des ZO-1-Ausdrucks, der mit western blotting erkannt wurde. (a) Die hCMEC/D3-Zellen wurden in einer 12-Well-Platte mit einer Zelldichte von 50.000 Zellen/cm2ausgesät. An jedem Tag des Experiments (Tag 3, Tag 5, Tag 7 und Tag 10-Post-Saat) wurden die Zellen mit 400 l 1x RIPA-Puffer lysiert, der 3 g/ml Aprotin in enthält. Zelllysate, die 40 g Gesamtprotein enthalten, wurden auf ein 4-7,5% SDS-Polyacrylamid-Gel geladen. (b) Die Analyse der Banddensitometrie ermöglichte die Normalisierung der Expression von ZO-1-Protein zu GAPDH. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Figure 5
Abbildung 5 . Auswirkungen der DNA-NP-Transfektion auf die TJ-Barrieredichtheit, gemessen mit dem LY P App assay. (a) hCMEC/D3-Zellen wurden 7 Tage lang auf Transwell-Einsätzen kultiviert, mit PEG-DET transfiziert, die gWIZLuc Plasmid-DNA mit/ohne Pluronische P84 für 4 h enthalten und dann durch einen vorgewärmten Transportpuffer mit 50 'M LY für 1 h ersetzt. die hCMEC/D3-Zellen mit Wachstumsmedium für 4 h, gefolgt von LY-Exposition (n=4, *P<0.05, N.S. nicht signifikant). (b) %LY in jeder Behandlungsgruppe wiederhergestellt, die dargestellten Werte sind durchschnittliche SD (n = 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Figure 6
Abbildung 6 . DNA-NPs vermitteln hohe Transgenexpression in hCMEC/D3-Monolayern. (a) hCMEC/D3-Zellen wurden 7 Tage lang kultiviert und mit PEG-DET transfiziert, die gWIZLuc Plasmid-DNA mit/ohne Pluronische P84 (N/P 10, DNA-Dosis pro Brunnen: 0,5 g) für 4 h enthielten, Transfektionsgemisch entfernt und Zellen für 24 h bei vollständigem Wachstum kultiviert vor der Messung der Genexpression. Der Gehalt an Luziferase-Genexpression wurde als relative Lichteinheiten (RLU) nornalisiert zum gesamten zellulären Proteingehalt exprimiert. Die Daten zeigen die durchschnittliche SD von drei unabhängigen Experimenten. Statistische Vergleiche wurden mit ungepaartem t-Test (** P< 0,01, *** P< 0,001) durchgeführt. (b) DNA-NPs sind sichere Transfektionsformulierungen in hCMEC/D3-Monolayern. Die Auswirkungen der DNA-NP-Transfektion auf die Zelllebensfähigkeit wurden mit einem lumineszierenden ATP-Assay untersucht. hCMEC/D3-Zellen wurden mit den angegebenen Proben für 4 h transfiziert, woraufhin der ATP-Test nach dem Herstellerprotokoll durchgeführt wurde. Prozent (%) Die Zelllebensfähigkeit wurde wie folgt berechnet: (Lumineszenz transfizierter Zellen/Lumineszenz der Kontrolle, unbehandelte Zellen)x100. Die Daten stellen den Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten dar (n=3/Experiment). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Experimentelle Einrichtung Beispielname Volumen von 1mg/ml Plasmid-DNA (L) Volumen von 10 mM NaAc-Puffer, pH 5(L) Volumen von 5 mg/ml Polymer (l) Volumen von 10% w/w. P84 (l) Volumen des Wachstumsmediums (L)
Gewebekultur fügteine Kontrolle, unbehandelte Zellen 0 0 0 0 58.3
Nackte DNA 0.157 8.143 50
DNA NP 7.843 0.3
DNA NP + 0,01%P84 7.6681 0.1749
DNA NP + 0,03%P84 7.26 0.0583
48-Well-Platte Kontrolle, unbehandelte Zellen 0 0 0 0 175
Nackte DNA 0.5 24.5 150
DNA NP 23.56 0.94
DNA NP + 0,01%P84 23.385 0.175
DNA NP + 0,03%P84 23.035 0.525
96-Well-Platte Kontrolle, unbehandelte Zellen 0 0 0 0 68.1
Nackte DNA 0.195 58.4
DNA NP 9.35 0.37
DNA NP + 0,01%P84 8.9307 0.0681
DNA NP + 0,03%P84 9.0669 0.2043

Tabelle 1. Die NP-Formulierungen, die zur Erfassung der gemeldeten Daten verwendet werden.

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Discussion

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Eine Schlüsselrolle des BBB besteht darin, den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zwischen der systemischen Zirkulation und dem Gehirn zu verhindern, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Eines der charakteristischen Merkmale des BBB ist die Fähigkeit der Kapillaren-Endothelzellen, enge Knoten (TJs) zu bilden, die den parazellulären Transportweg effektiv versiegeln. Wir demonstrierten einen LY P App-Assay als quantitative Methode zur Bestimmung der scheinbaren Kinetik der TJ-Barrierebildung in kultivierten hCMEC/D3-Monolayern. DER über Western Blotting erkannte ZO-1-Ausdruck validierte orthogonal die Daten aus den LY P-App-Studien, wie im folgenden Absatz ausführlich beschrieben. Als zusätzlichen Nutzen des entwickelten Tests haben wir außerdem gezeigt, dass die DNA-NP-Transfektion die LY P-App nicht messbar verändert hat, was auf die Eignung dieses Tests hinweist, um Veränderungen der TJ-Barriereeigenschaften in einem experimentellen Setup zu bestimmen.

Die westlichen Blot-Daten zeigten einen deutlichen Anstieg der ZO-1-Expression an den Tagen 3, 5, 7-post-Seeding und eine leichte Verringerung am Tag 10-post Seeding (Abbildung 4a). Aus Abbildung 1kann man sehen, dass die LY PApp ab Tag 1-7 nach dem Aussaat abgenommen hat, was auf die Bildung von TJs hindeutet. Nach der Behandlung des Kalziumabbaus zeigte die LYP-App einen deutlichen Anstieg (Abbildung 2a), während die ZO-1-Expression eine deutliche Reduktion zeigte ( Abbildung4a). Extrazelluläres Kalzium ist eine kritische Komponente für die Aufrechterhaltung von Zell-Zell-Verbindungen in verschiedenen Zelltypen29,30,31, einschließlich der Hirnmikrogefäß-Endothelzellen. Der Mangel an Kalzium im Wachstumsmedium störte und distanzierte die TJs33. Wie erwartet war der P-App-Wert von kalziumerschöpften Zellen deutlich höher als die unbehandelten Zellen und nahe am P-App-Wert der leeren Inserts, die keine Zellen enthalten ( Abbildung2a). Die LY zeigte ein stetiges Plateau in P-App-Werten vom Tag 7-10 nach der Aussaat (Abbildung 2a), was darauf hindeutet, dass sich die Barriere bis Tag 7 vollständig gebildet hatte, was zu einem eingeschränkten LY-Transport zur basolateralen Seite führte. Die Western Blot-Daten zeigten einen leichten Rückgang der ZO-1-Expression an Tag 10 im Vergleich zum Tag 7-post seeding. Dieser Unterschied in der Beobachtung ist wahrscheinlich auf den Beitrag anderer extrazellulärer Proteine, abgesehen von ZO-1, bei der Aufrechterhaltung der Barrieredichtheit zurückzuführen. Zusammenfassend haben wir erfolgreich Daten aus zwei orthogonalen Techniken verwendet, um die Kinetik der engen Grenzbarrierebildung in einem menschlichen Zellmodell der BBB zu bestimmen. Während der LY P App-Assay die Funktionalität der TJ-Barriere misst, verfolgten die Western-Blot-Daten die Bildung der TJs mit ZO-1 als Markerprotein.

Als zusätzlichen Nutzen des entwickelten Tests haben wir bestätigt, dass die DNA-NP-Transfektion in hCMEC/D3-Monolayern die Integrität von TJs nicht beeinträchtigt (Abbildung 5). Unbehandelte Zellen, die mit Wachstumsmedium inkubiert wurden, wurden als Negativkontrolle verwendet und Zellen, die mit kalziumfreiem Medium für 24 h vorbezichtiert wurden, wurden als positiv eitern. Zellen, in denen die TJs infolge des Kalziummangels gestört wurden, zeigten einen Anstieg der LYP App um 210 % im Vergleich zu den unbehandelten Zellen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die DNA-NP-Transfektion entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von P84 die TJ-Integrität nicht beeinträchtigt. Es sollte beachtet werden, dass das Fehlen von Änderungen der LYP-App in transfizierten Zellen keine belanglose Beobachtung ist. Tatsächlich vermitteln unsere DNA-NPs signifikante Konzentrationen der Genexpression in den schwer transfekten hCMEC/D3-Monolayern9,35,36,37. DNA-NPs mit 0,01 bzw. 0,03 Gew. % P84 erhöhten die Luziferase-Genexpression um ca. 18- bzw. 30-fache im Vergleich zu DNA-NPs allein (Abbildung6a). Wir haben auch gezeigt, dass unsere NP-Behandlungen die zellulären ATP-Spiegel, die hier als Indikator für die funktionelle Zelllebensfähigkeit verwendet werden, nicht negativ beeinflussen (Abbildung6b). Unsere Ergebnisse unterstreichen den erweiterten Nutzen dieses LY P App-Assays zur Bestimmung der TJ-Barriereintegrität in einem experimentellen Transfektions-Setup.

Ein kritischer Schritt bei der Ausführung des LY-Assays besteht darin, die gleiche Menge an LY in der apikalen Seite und das gleiche Volumen des Transportpuffers in der basolateralen Seite über die verschiedenen Zeitpunkte des gesamten Experiments zu halten. Wenn unterschiedliche Mengen an LY oder ungleiche Mengen an Transportpuffer in Brunnen verwendet würden, wäre die Berechnung der P-App unzuverlässig, was zu künstlich großen Standardabweichungen führen würde. Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Begrenzung der Lichtexposition, um den Zerfall der LY-Fluoreszenzintensität zu minimieren. Außerdem muss die Flüssigkeit vollständig entfernt werden, bevor exakt das gleiche Volumen der LY-Lösung und der Transportpuffer in die apikale bzw. basolaterale Seite hinzugefügt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Fluoreszenzauslesung zuverlässig für die P-App-Berechnung verwendet werden kann. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Experiment ist die sofortige Messung der LY-Fluoreszenz der basolateralen Proben und die Notwendigkeit, die Proben nach der Entnahme einzufrieren. Die Unterwerfung der LY-haltigen Proben zu Gefrier-Tau-Zyklen führt zu einer größeren gruppeninternen Variation des Fluoreszenzsignals. Eine Einschränkung der Verwendung des Transwell-Setups ist, dass die lebenden Zellen durch konventionelle Mikroskopie schwer zu visualisieren oder durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden können. Darüber hinaus ist es nicht einfach, in ein Setup zu übersetzen, das die Ko-Kultivierung verschiedener Zelltypen ermöglicht, es sei denn, eine gemischte Kultivierung von sagen, gliale und endotheliale Zellen ist eine Möglichkeit. Dennoch hat der LY-Assay folgende Vorteile: LY ist ein Farbstoff mit deutlichen Anregungs-/Emissionsspitzen und einer relativ großen Stokes-Verschiebung im Vergleich zu Farbstoffen wie Natriumfluorescein, was eine robuste Messung der Sonde über die BBB ermöglicht und die Notwendigkeit eines zusätzlichen Radiolabels wie bei Tracern wie Saccharose oder Mannitol. Hohe Wiederherstellung %s von LY liefert zuverlässige Daten, um P-App-Werte sicher zu berechnen.

Basierend auf unseren Erkenntnissen kommen wir zu dem Schluss, dass die LY P App-Methode ein einfacher und robuster Test zur Quantifizierung der parazellulären Permeabilität in hCMEC/D3-Zellmonolayern ist. Mit der LY P App-Methode optimierten wir die Kulturzeit für die Bildung intakter Barriere und demonstrierten einen zusätzlichen Nutzen des entwickelten Assays, indem wir die TJ-Integrität in DNA-NP-transfizierten Zellmonolayern ermittelten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch den New Investigator Award 2017 der American Association of Pharmacy, einen Hunkele Dreaded Disease Award der Duquesne University und die School of Pharmacy Start-up-Fonds für das Manickam-Labor. Wir möchten dem Leak-Labor (Duquesne University) für die Unterstützung durch western Blotting danken und die Verwendung ihres Odyssey 16-Bit-Imagers ermöglichen. Wir möchten auch eine besondere Dankesnote für Kandarp Dave (Manickam Labor) für die Hilfe bei western blotting.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

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References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15, (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10, (1), 16 (2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10, (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10, (1), 16 (2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability? European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43, (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6, (8), 650 (2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. The Blood-Brain Barrier. Springer. 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25, (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140, (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4, (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).
  25. Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10, (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2, (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33, (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272, (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9, (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4, (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77, (2), 265-274 (2011).
Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere
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Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

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