Summary
我々は、ルシファーイエロー(LY)がヒト血液脳関門のインビトロモデルであるhCMEC/D3細胞単層の明らかな細胞透過性を決定する堅牢なマーカーであることを実証するために蛍光アッセイを提示する。このアッセイを用いて、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定した。
Abstract
血液脳関門BBBは、全身循環と脳の間の障壁を形成する内皮細胞からなる非必須イオンと有毒物質の交換を防ぐ。タイトジャンクション(TJ)は、単層の準細胞空間を効果的にシールし、そのままのバリアを生み出します。本研究では、LYベースの蛍光アッセイを用いて、その明らかな透過性係数(Pアプリ)を決定し、次にコンフルエント単層の形成と得られたタイトジャンクションの動態を決定するために使用することができる。hCMEC/D3単層におけるバリアの完全性。我々はさらに、トランスフェクト細胞におけるTJ機能完全性を決定するために、このアッセイの追加の有用性を実証する。LY Pアプリアッセイからの我々のデータは、トランスウェルセットアップで播種されたhCMEC/D3細胞が効果的にLY細胞輸送7日後培養を制限することを示しています。提示されたアッセイの付加的な有用性として、我々はまた、DNAナノ粒子トランスフェクションがhCMEC/D3単層におけるLY細胞細胞輸送を変化しないことを実証する。
Introduction
血液脳関門(BBB)は、脳組織への血漿成分の流入を制限する保護障壁であり、脳内皮細胞とペリサイトなどの支持細胞からなる。BBBの主な役割は、神経微小環境1、2の血球を維持するために末梢血と中枢神経系(CNS)の間の空間を密封する障壁として機能する。脳毛細血管内皮細胞は、細胞間タイトジャンクション(TJs)1の形成を介して細胞間経路を効果的にシールする。この保護バリアは、ブドウ糖と選択された栄養素が脳に入ることを可能にする一方で、イオン、有毒物質、薬物の大部分がこのタイトな障壁を通過するのを防ぎます。その保護的役割とは別に、BBBの自然なバリア機能は、CNSを標的とする薬物送達システムの開発において深刻な課題を提起する。
BBBのインビトロ細胞培養モデルは、その生物学を研究し、TJバリア完全性に対する薬物治療の影響を理解するのに役立つツールです。ヒト脳内皮細胞株(hCMEC/D3)をインビトロモデルとして用いたのは、ヒト脳内皮3の受け入れモデルであり、ヒトBBBの多くの機能を要約する。hCMEC/D3は、インビトロ4、5、6、7、8、9でBBBをモデリングするための最も一般的に使用される細胞株の一つです。バリア締めの尺度である経体皮電気抵抗(TEER)の比較的低い値にもかかわらず、この細胞株は脳内皮細胞の形態的および機能的特性のほとんどを保持し、共培養グリア細胞6,7.hCMEC/D3細胞株は、不安定な表現型6、7、9に脱分化を受けることなく、約35経過まで、活性トランスポーターおよび受容体を含む複数のBBBマーカーを発現する 、10、11.インビトロBBBモデルとしてのhCMEC/D3細胞株の最も顕著な特徴は、TJs5、9、11、12を形成する能力です。幹細胞由来BBBモデルは、hCMEC/D3細胞株と比較して多くの研究において高い透過性を示し、いくつかのBBBマーカーを発現するが、それらは最も一般的なBBB細胞モデル13としてまだ進化していない。重要なことに、幹細胞由来BBBモデルは、細胞が安定したBBB現象型14を維持することを可能にする最大通過数に関して特徴付けされたままである。
一般的に、TEERの測定、スクロース、イヌリン、ルシファーイエローなどの小さな親水性トレーサー分子の見かけ透過性係数(Pアプリ)の測定を含む、TJバリアの完全性を決定するために一般的に使用されています。クラウディン-5、ZO-1、オクルージン等のTJの既知の分子マーカーの免疫染色等5.TEERは、多孔質膜基板上で培養された細胞単層全体の電気抵抗を測定する比較的単純で定量的な方法5である。しかし、TEER値は培養培地の組成や測定器の種類などの実験変数の影響を受ける可能性があります。これらの因子の組み合わせは、2〜21日間培養されたhCMEC/D3細胞株において、2~1150 Ω cm2までのTEER値の広範な分布につながる。免疫染色は、抗体を用いて標的タンパク質を標識することによりTJタンパク質の存在を決定する視覚的方法である。しかし、免疫染色は、実験的なアーティファクトをもたらす可能性のある細胞を固定/透過する必要性を含む一連の実験ステップを伴い、蛍光シグナルは時間の経過とともに消えてしまいます。上記の要因は、データ品質に影響を与える主観的なエラーにつながる可能性があります。
本研究の主な焦点は、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定するLYベースの明らかな透過性アッセイを提示することである。共培養システム、マイクロ流体システムなどの他の高度なインビトロBBBシステムは、大幅に改善されたバリア機能15、16、17、hCMEC/D3を有する生理学的に関連性の高い模倣であるトランスウェルセットアップは、TJ形成の動態を推定し、バリア機能に対する異なる薬物製剤の効果を迅速にスクリーニングするためのシンプルで信頼性の高いモデルです。一般に、Pアプリ値は、hCMEC/D3単層における様々な親水性溶媒に対して一貫しています。例えば、インビトロBBBモデルにおける様々な低分子量溶質(スクロース、マンニトール、LYなど)に対する報告されたPアプリ値は、10-4 cm/min 5、18、19の順に示されます。,20.我々の実験セットアップでは、脳内皮細胞は、細胞の付着および単層形成のためのコラーゲンコーティングされた微多孔質膜上に播種され、生体内の障壁を模倣する。頂点側に添加されたLYは、細胞間のタイトジャンクションを横断し、側側に蓄積することが期待される。側側のLYの濃度が高いほど、未熟で完全に機能しない障壁を示し、低濃度は成熟した障壁をもたらす機能的なTJの存在による制限された輸送を反映する。
LYは、明確な励起/発光ピークを有する親水性染料であり、スクロース、マンニトールまたはイヌリンなどの放射ラベルトレーサー分子の必要性を回避します。したがって、LYの蛍光値は、BBB単層全体のその準細胞透過性を直接計算するために使用することができる。また、フルオレセイン21などの小さなストークスシフトに苦しむ生物医学分野で使用される多くの市販の染料と比較して、LYのストークスシフトは、十分なスペクトル分離を有する約108nmであり、したがって、LY蛍光データを細胞細胞透過性を決定するための堅牢な読み出し。我々は、培養時間にわたってタイトジャンクションマーカータンパク質ZO-1の発現の変化を実証するために、直交技術としてウェスタンブロッティングを使用した。ウェスタンブロッティングを介して検出されたZO-1式は、LY Pアプリデータを補完するために使用され、組み合わせることで、これらのデータは、LY Pアプリ値の観察された変化が、徐々に増加する単層の形成を反映していることを示唆している。タイトジャンクションマーカー、ZO-1の表現。
先に指摘したように、この研究の中心的な焦点は、機能的なタイトジャンクションを持つコンフルエント単層の形成を監視する簡単な技術としてLYアッセイを実証することです。しかし、開発されたアッセイのさらなる有用性を実証するために、DNAナノ粒子トランスフェクトhCMEC/D3単層におけるLY Pアプリを測定した。核酸は、正に帯電したポリマー群と核酸22の負に帯電したリン酸基との間の静電相互作用を介して、直径100〜200nmのポリ電解質ナノ粒子に凝縮することができる。23.これらの複合体をDNAナノ粒子(DNADNA)と呼んでいます。私たちの意図は、細胞をトランスフェクトし、所望のタンパク質を発現することですが、hCMEC/D3単層のバリア特性が損なわれないようにする必要があります。我々のデータは、標準的な4時間ルシフェラーゼ遺伝子トランスフェクション体制が、TJバリア完全性の変化を決定するためにLY Pアプリアッセイの有用性を実証するLY透過性を測定可能に変化しないことを示唆している。
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Protocol
1.一般的なhCMEC/D3細胞培養
- 凍結細胞の蘇生
注:すべての細胞培養維持および実験は無菌バイオセーフティフード内で行われた。培養培養剤、サプリメントおよび試薬は、無菌製品として購入するか、または微生物汚染を防止するために0.22 μm膜フィルターを用いて濾過を介して殺菌された。- 組織培養フラスコ(75cm2成長面積、今後はT75と呼ばれる)にコラーゲン溶液(0.15mg/mL)を8.5mL加え、インキュベーター(37°C、5%CO2)に1時間置きます。
- コラーゲン溶液を取り出し、殺菌されたリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でフラスコを静かに洗います。フラスコに完全成長培地の15mLを加え、CO2インキュベーターに15分間放置します。
注:完全な培地(最終濃度)は、胎児ウシ血清(5%)、ペニシリン連鎖マイシン(1%)、ヒドロコルチゾン(1.4μM)、酸アスコルビン(5 μg/mL)、化学的に定義された脂質を補充した内皮細胞成長基底培地-2(500mL)を含有した。濃縮物(1/100)、HEPES(10mM)および基本的な線維芽細胞増殖因子(1 ng/mL)。 - 液体窒素タンクから凍結したhCMEC/D3細胞の凍結を移動し、37°Cの水浴(<1分)でバイアルを急速に解凍します。
- 氷の小さなフレークだけが見えたら、すぐに吸引し、事前に温められた媒体を含むフラスコに細胞を移します。フラスコをゆっくりと振り、細胞と増殖培地との混合を可能にする。
- フラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れ、2時間後に光顕微鏡で細胞を観察し、細胞が付着していることを確認します。
- 細胞がフラスコの底部に付着したら、古い成長培地を取り出し、古い成長培地24でジメチルスルホキシドを置き換えるために、新鮮な予め温められた成長培地の10 mLを加える。
- 24時間後、小顕微鏡でスピンドル状の細胞を観察し、古い成長培地を予め温めた新鮮な成長培地に置き換えます。
- 細胞培養維持
- 100%合流するまで、成長培地を1日おきに補充する。古い成長培地を除去する前に、また新鮮な成長培地を追加した後、顕微鏡下の細胞を確認してください。インキュベーターからフラスコを取り出し、位相コントラスト顕微鏡下でhCMEC/D3細胞を調べて、健康に見えるようにします。
注:細胞の大部分は、フラスコの底部に取り付けられるべきであり、紡錘形の形態を持っており、しばしば、その膜の周りに屈折する光も見られる。成長媒体は、透明(非曇り)とピンクオレンジ色の色でなければなりません。 - フラスコから古い成長培地を取り出し、予め温めた新鮮な培地の10mLをフラスコに移します。
注: 培地はフラスコの上面に追加し、セルの表面に直接追加する必要はありません。 - フラスコを水平位置に戻し、数回静かに揺さぶり、フラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)に戻す前に、顕微鏡下のhCMEC/D3細胞を確認してください。
- 通常の培養作業中と実験中の両方で、細胞を取り扱う前後に毎回反転光顕微鏡下で細胞を観察します。実験室のノートに細胞番号または形態の顕著な変化を記録します。
- 100%合流するまで、成長培地を1日おきに補充する。古い成長培地を除去する前に、また新鮮な成長培地を追加した後、顕微鏡下の細胞を確認してください。インキュベーターからフラスコを取り出し、位相コントラスト顕微鏡下でhCMEC/D3細胞を調べて、健康に見えるようにします。
- セルの通過
- 新しいT75フラスコをインキュベーターで1時間8.5mLのコラーゲン溶液でインキュベートします(37°C、5%CO2)。
- コラーゲン溶液を取り出し、殺菌されたPBSでフラスコを静かに洗います。新しいフラスコに予め温められたhCMEC/D3培地の10 mLを加え、フラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れなさい。
- インキュベーターからフラスコを取り出し、相コントラスト顕微鏡下でhCMEC/D3細胞を調べて、細胞が100%コンフルエントであるかどうかを確認します。
- フラスコ含有細胞からhCMEC/D3細胞培地を取り出し、10mLのPBSでhCMEC/D3細胞を洗浄します。
注:成長培地に添加されたFBSには、α1-抗トリプシンおよびα2マクログロブリンなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれている。これらはトリプシン化プロセスを阻害する。したがって、トリプシン化プロセスの阻害を防ぐためにFBSの痕跡を除去するためにPBSで細胞を洗浄することが不可欠である。 - 0.02%EDTAを含む0.25%トリプシン溶液の1 mLを加え、インキュベーター(37°C、5%CO2)で2〜5分間トリプシン化する(剥離を助けるために両側にそっとフラスコをタップします)。
注:6分以上トリプシン/EDTA上の細胞を放置しないでください。 - 予め温められたhCMEC/D3培地の10 mLを加えてトリプシン化プロセスを停止し、hCMEC/D3セルを数回上下にピペッティングして再中断します。次に、フラスコからセル懸濁液全体を15mLチューブに取り出します。
- 15 mLチューブから新しいフラスコに1mLのセル懸濁液を予め温めた新鮮な培地(セル1:10を分割)で移し、新しいフラスコをインキュベーターに戻します。
注:新しいフラスコに転送する前に、細胞濃度の勾配を最小限に抑えるために、細胞懸濁液を数回上下にピペットします。
2. 細胞めっき
- 組織培養インサートを微多孔膜(細孔サイズ:0.4μm、材料:ポリエチレンテレフタレート(PET)))を24ウェル培養プレートに入れます。
- 各組織培養インサートにコラーゲンタイプI(0.15mg/mL)の400μLを加え、CO2インキュベーター(37°C、5%CO2)で1時間インキュベートします。24ウェルプレートを穏やかに揺さぶり、組織培養挿入物中の微多孔膜上にコラーゲン溶液を広げることさえ可能にする。
- コラーゲン溶液を取り出し、1x PBSバッファーの0.4 mLで微多孔膜を静かに洗浄します。
- 細胞挿入物中の50,000セル/cm2の密度を持つプレートhCMEC/D3細胞(培地500μL中15,000細胞)。
注:各組織培養インサートにおける細胞数の差を最小限に抑えるために、細胞懸濁液を10mLピペットで再懸濁し、挿入物に細胞を追加した。 - 組織培養セットアップを施した24ウェルプレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れ、細胞の付着と増殖を可能にします。
- 細胞が100%合流に達するように7日間プレートをインキュベートします。1日おきに成長培地を取り出し、0.5mLの予め温められた新鮮な培地を組織培養インサートに移す。
- 12ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレートでめっき手順(ステップ2.2~2.6)を繰り返します。西洋ブロッティングには12ウェルプレートを使用して、ZO-1式の変化を決定します。DNA NPトランスフェクションには48ウェルプレートを使用してください。ATPアッセイの96ウェルプレートを使用して、トランスフェクト細胞における細胞生存率を決定します。
3. 細胞増殖の動態。
- コラーゲンコーティングされた24ウェル組織培養プレートに50,000細胞/cm2の密度で細胞を播種する。
- 実験の各日に、成長培地を除去し、1x PBSの500 μLで細胞を2回静かに洗浄する。次いで、0.02%EDTAを含む0.25%トリプシン溶液の30 μLを加え、インキュベーター(37°C、5%CO2)で約2〜5分間プレートを残します。
注:コンフルエント単層の段階的な形成は、細胞剥離の程度に影響を与える可能性があり、ここに示すようにトリプシン/EDTAの体積を増加させる必要があります:1-5日の種子後30μL、6-7日後の播種後6-7日間、100 μLの播種後8-10日目. - ステップ3.2で添加したトリプシン/EDTA溶液の体積に基づいて、成長培地の470 μL、440 μL、または400 μLのいずれかを追加し、各ウェルに500 μLの細胞懸濁液を調作成します。
- 各井戸を数回上下にピペッティングして細胞を懸濁し、顕微鏡下で細胞を観察し、すべての細胞が増殖培地に懸濁していることを確認します。何回かピペッティングした後も一部の細胞がプレート底部に取り付けられている場合は、プラスチック製のセルスクレーパーを使用してセルを優しく削り取り、細胞の剥離を容易にします。
- ステップ3.3で500 μLセルサスペンションから0.1 mLのセルサスペンションを取り外し、1.5 mLチューブに追加します。次に、0.4%のトリパンブルー溶液の0.1 mLをセル懸濁液に加え、よく混ぜます。
- 70%のイソプロピルアルコールでヘマシトメーターをきれいにします。V溝の両側のステップ3.5から20 μLの混合物を追加し、顕微鏡下に16の正方形を見つけます。16 の正方形は 1 つのグリッドと見なされます。ヘマシトメーターの両側に2つのランダムグリッドを見つけ、すべての生きている、非青色の細胞を数えます。
注:カウントから除外された色で青色に見えた細胞、<1%の細胞は、すべての時点で青色に染色した。 - 次の数式に基づいてセル密度(セル/cm2)を計算します。
セル/グリッドの平均数
= (Eq.1)
希釈係数=
(Eq.2)
細胞密度(生存細胞/cm2) =
(Eq.3)
方程式 1-3.生存細胞は、各グリッドでカウントされる細胞数であり、グリッド数は顕微鏡下に位置するグリッドの数に対応し、細胞懸濁液と0.4%トリパンブルーの混合物の体積はステップ3.5で調製された体積であり、除去された細胞懸濁液の体積はステップ3.5で500μL細胞懸濁液から除去された体積は、各ウェルにおける細胞懸濁液の体積がステップ3.3から500μL細胞懸濁液であり、組織培養板の増殖面積は24ウェルプレートにおける単一ウェルの成長面積である。
= (Eq.1)
(Eq.2)
4.ルシファーイエロー見かけの透過性(LY Pアプリ)アッセイ
- シード後の各日に LY Pアプリを決定する場合は、4.3 から開始する手順に従います。トランスフェクトされたhCMEC/D3細胞におけるPアプリを決定するために、トランスフェクション製剤(図1)の8.3μLを完全増殖培地の50μLと混合し、4時間のインキュベートを行うトランスフェクション製剤をセクション5に記載する。
- 4時間トランスフェクションの後、無菌1x PBSバッファーを使用して頂点側を2回静かに洗浄し、残留トランスフェクション混合物を除去する。除去後に残されたPBSバッファーの量の変化は、頂点側のLYの濃度に影響を与える可能性がある。組織培養挿入物中の残留PBSバッファーが完全に除去されるように注意してください。細胞の剥離を最小限に抑えるために、残留試薬と培地を慎重に吸引します。
注:hCMEC/D3細胞の毎日の明らかな透過性(Pアプリ)を測定する場合、このステップはスキップされます。 - 成長培地を取り外し、予め温められた(37°C)輸送バッファー(25 mM HEPES、145 mM NaCl、3 mM KCl、1mM CaCl 2、0.5 mM MgCl 2、1 mM NaH2PO4、5mMブドウ糖、pH 7.4)を腹部側に加えます。
注: 透過性係数計算の精度を確保するために、すべての基部区画内のトランスポート バッファの体積は等しくする必要があります。 - 各トランスウェルインサートの頂点側に20 μM LY溶液の58.3 μLを追加します。蛍光測定のために20 μM LY溶液の50 μLを保存します。残留PBSバッファーを頂点側から完全に除去した後、hCMEC/D3細胞の乾燥を避けるために、できるだけ迅速にLY溶液を追加します。頂点側のLY溶液の正確な容積を確保します。
注:LY蛍光強度の減衰を最小限に抑えるために、光の露出は制限されるべきです。LY粉末を再構成したら、溶液は光から保護された4°Cで保存する必要があります。 - ロータリープレートシェーカー(37°C、100rpm)で60分間インキュベートします。次に、各頂点コンパートメントからLYサンプルの30μLを取り出します。次に、20 μM LY 溶液と頂点側サンプルをあらかじめラベル付けされたチューブに移し、輸送バッファーを使用してサンプルを10倍希釈します。
注:これらのサンプルの高い蛍光強度は、蛍光マイクロプレートリーダーの蛍光検出器を過負荷にし、損傷する可能性があるため、20 μM LYストック溶液と頂点側サンプルを希釈する必要があります。 - 各バソラテラルコンパートメントから500μLを取り出し、サンプルをあらかじめラベル付けされたチューブに移します。
注: サンプルは、指定された時点で別々のトランスウェルから削除されます。タイムポイントは、1日目から10日目まで始まる各日のシード後です。 - 標準曲線(39.00 nM、78.13 nM、156.25 nM、312 nM、625 nM、1250 nM、2500 nM)の一連のLY規格を準備します。
- 各標準の100 μL(複製)、頂点および塩盤サンプルを黒い96ウェルプレートで各ウェルに加えます(図1)。
注:黒い版は光を吸収し、井戸間の背景および蛍光クロスオーバーを減らす。 - 蛍光マイクロプレートリーダー(設定点:励起428nm、発光536nm)を使用して、LY蛍光強度を測定してPアプリを計算する。本研究には蛍光プレートリーダーを用いる。
- 原稿テキストに記載されているように、Pアプリと%LY回復値を計算します。
方程式 4.Pアプリの値を計算するための数式。
次の式を使用して、見かけ透過性 (P アプリ) 係数と %LY リカバリを計算します。なお、Pアプリ値は質量25またはLY濃度に基づいて算出することができる。
または
VA - 頂点コンパートメント内のボリューム
VB - バソラテラルコンパートメント内のボリューム
A - トランスウェル挿入膜の表面積(0.3cm 2)
MA0 - 頂点コンパートメントの初期質量
ΔMB/Δt - 浴場コンパートメントにおける時間の経過に応る質量の変化
CA0 - 頂点コンパートメント内の初期濃度
ΔCB/Δt - 浴場内の時間の経過に応ぼす濃度の変化。
方程式 5.% LY リカバリを計算するための数式。
回復 (%) =
MAfは、終点における頂点区画における質量であり、MBfは終点における浴場区画における質量であり、MA0は頂点区画における初期質量である。 26注: 初期質量は、ステップ 4.5 の 20 μM LY 溶液の体積に基づいて計算されます。この実験は、常に通過数35以下の細胞を用いて行い、4回の独立回を行った。
または
5. カルシウム枯渇
- トランスウェルインサートと12ウェルプレートから成長培地を取り出し、予め温められたカルシウムフリー培地(最小必須ミディアムイーグルスピナー(S-MEM)培地)を使用して、トランスウェルインサートからカルシウムイオンを除去するために、頂点側と12ウェルプレートを穏やかに洗浄します。と12ウェルプレート。
- インサートまたは12ウェルプレートに500 μLまたは2mLの予め温められたS-MEM 1xmediaを加え、インキュベーター(37°C、5%CO2)で24時間インキュベートします。インキュベーション後、S-MEM 1x培地を取り出し、予め温めた1x PBSバッファーを使用して細胞を一度洗浄する。
- LY 治療およびその後の手順については、セクション 4 に記載されている手順 4.4~4.10 に従います。西洋のブロッティングとその後の手順については、セクション 8 で説明されている手順 8.1.2-8.2.4 に従ってください。
6. トランスフェクション
- DNAナノ粒子(DNADNA)の調製。
- 10mM酢酸ナトリウム(NaAc)バッファー(pH 5.0)でgWIZ-Lucプラスミドのストック溶液を希釈し、DNA溶液を室温(RT)で10分間立たせます。
注:主に単一のDNA分子を含むDNA NPは、DNA濃度20〜40 μg/mL23で調製することができる。したがって、gWIZ-Lucプラスミドストック溶液を希釈する必要があります。凍結したgWIZ-Lucプラスミドストックは、温度ストレスを最小限に抑えるために氷上で完全に解凍する必要があります。ノブ位置3-5に設定された標準的なベンチトップボルテキサー上で30sの希釈DNAストック溶液を穏やかに渦。 - NP組成を反映する数値パラメータとしてここで使用される、所望のN/P比を計算します。
方程式 6.N/P比計算:カチオン性ポリマーのアミン基のモルとDNAのリン酸基のモルの比率。カチオン性ポリマーの質量は、カチオン性ポリマーの総計量量を意味します。(質量/充電)カチオン性ポリマーは、カチオン性ポリマー(ポリ(エチレネグリーコール)5kブロック-ポリアスパルタミドの分子量を指し、48ジエチレネトリアミン側鎖(PEG-DET)を有する)は、カチオン性ポリマー当たり荷電原アミン(48)の数に正規化された(モル/モル)、ポリマーのこの値は306 Daです。DNAの質量は、mg/mLの体積と濃度を乗算して得られた製剤に使用されるDNAの総量を意味します。(質量/充電)DNAは、二本鎖DNA当たりのリン酸基数に正規化されたDNAの分子量を指す(ヌクレオベース当たり325Da)。
注:DNA NP調製表(表1)には、実験で試験した異なるサンプルの製剤レシピが含まれています。DNANPは、迅速な滴定技術を用いて調製した。PEG-DETポリマー溶液は、チューブを水平位置に保持しながら、チューブの壁に沿って添加しました。その後、チューブを垂直位置に切り替え、その後、10sの最高速度で素早く渦を起ました。DNANPは、使用前にRTで30分間立つことを許可した。DNA NPの使用に関する経験則は、ca.1 cm2成長領域に対して0.5 μgのDNAです。したがって、48ウェルプレート/各ウェルの各ウェルインサート/各ウェルに対して、gWIZ-Luc DNAの0.157/0.5/0.195 μg/ウェルを含むN/P 10でDNA NPを調製します。 - ポロクサマーP84(P84)の示された濃度を含むサンプルの場合は、5sのDNA NPおよび渦にP84を加加える。各試料におけるP84の最終濃度は、0.01%または0.03%wtのいずれかである。
- 10mM酢酸ナトリウム(NaAc)バッファー(pH 5.0)でgWIZ-Lucプラスミドのストック溶液を希釈し、DNA溶液を室温(RT)で10分間立たせます。
- 48ウェルプレートセットアップにおけるDNA NPトランスフェクション
- 50,000セル/cm2の密度を48ウェルプレートにシードし、インキュベーター(37°C、5%CO2)で合流するまで増殖する。
- 各処理群について、示されたサンプルの25μL(トランスフェクション製剤)と150μLの完全増殖培地と175μLの完全成長培地を各ウェルに混合する。
- 顕微鏡下でhCMEC/D3細胞を観察し、細胞が健康に見え、実験時に100%コンフルエントであることを確認します。
- 各ウェルにウェルと175 μLトランスフェクション混合物から成長培地を取り除きます。次いで、インキュベーター(37°C、5%CO2)で4時間プレートをインキュベートする。
- 4時間後、トランスフェクション混合物を除去し、予め温められた無菌1x PBSバッファーでhCMEC/D3細胞を洗浄します。
注:洗浄工程中にプレート/インサート表面からhCMEC/D3細胞が偶発的に剥離することを最小限に抑えるために、ウェルの壁に沿って十分な無菌PBSを慎重にピペットし、残留培養培地内のナノ粒子を除去します。 - プレートを数回ゆっくりと揺さぶり、慎重に吸引してPBS洗浄を廃棄し、hCMEC/D3予温められた培養培地の500 μLを追加します。
- 細胞を顕微鏡的に調べ、細胞形態およびトランスフェクションの可能な影響に関する観察を記録する。
- 37°C細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートし、ルシフェラーゼ産生を可能にする。24時間後、成長培地を完全に除去し、予め温めた1x PBSで細胞を一度洗う。
- 100μLの氷冷ルシフェラーゼ細胞培養リシス1x試薬をウェル当たり100μL添加してトランスフェクト細胞をライスする。
- ルシフェラーゼタンパク質含有量の測定のために、20 μLの細胞リザートおよび100 μLのルシフェラーゼアッセイバッファー(20 mMグリチルグリシン(pH 8)、1mM MgCl 2、0.1mM EDTA、3.5 mM DTT、0.5 mM ATP、0.27 mMコエンザイムA)を1.5mMMに加える。
- 単一の自動注入器を使用したルミノメーターのステップ6.2.10に記載されているサンプルの発光度を読みます。
注:発光は、読み取る前に10s以上に統合する必要があります。 - メーカーのプロトコルに従って、ビシンコニン酸アッセイ(BCAアッセイ)キットを使用して、リサート中の細胞タンパク質の総量を測定します。
- ルシフェラーゼ遺伝子発現を総細胞タンパク質当たりの相対光単位(RLU)として計算および発現する。
7. ルミネッセンスATPアッセイ
- 96ウェルプレートに50,000セル/cm2の密度を持つ細胞を播種し、インキュベーター(37°C、5%CO2)で合流するまで増殖する。
- トランスフェクション製剤の9.7 μL(製剤の詳細はセクション6にある)と58.4 μLの完全増殖培地を4時間でトランスフェクトする。
- トランスフェクション混合物を取り除き、予め温めたPBS 1xバッファーで細胞を2回静かに洗浄し、治療試薬を完全に除去します。
注: 残留バッファーの量が異なると、ATP アッセイ試薬が異なる範囲に希釈され、データに影響を与える可能性があります。 - マルチチャンネルピペットを使用して1:1希釈で新鮮な予温め媒体とATPアッセイ試薬の75 μLを混合します。すべてのマルチチャンネルピペットチップの液体レベルが同じであることを確認します。
- プレートを室温で15分間、ナタテリングシェーカーの上に置きます。試薬を添加して15分後、各試料の60μLを白い96ウェルプレートに移します。
注:白いプレートは、透明または黒のプレートよりも出力光を反射する方が良いです。 - プレートを読む前に針を使って気泡をポップします。1 sの積分時間のルミノメーターの版を読む。ATPアッセイ試薬を添加した後、20分以内にプレートを読みます。発光信号は速い減衰速度で過渡であるため、タイミングは異なるプレート間の比較に重要です。
- パーセント (%)この式を用いた細胞生存率:(トランスフェクト細胞の発光/対照の発光、未処理細胞)x 100。
8. タイトジャンクションタンパク質ZO-1の測定のためのウェスタンブロッティング
-
細胞リシスとタンパク質抽出
注:細胞からのタンパク質抽出のためのすべてのステップは、2-8 °Cで行う必要があります。- コラーゲンコーティングされた12ウェル組織培養プレートに50,000細胞/cm2の密度で細胞を播種する。
- 3日目、5日目、7日目、10日目の播種後および7日目(カルシウムフリー培地で事前にインキュベートした細胞)に、成長培地を取り出し、2mLの氷冷1x PBSで細胞を穏やかに洗浄する。次いで、各ウェルに3μg/mLのアプロチニンを含む氷冷1x RIPAリシスバッファーの300μL混合物を加える。
注:混合物は、新鮮に作られ、氷の上に保持する必要があります。アプロチニンは、目的のタンパク質を分解することからリサテスに存在するプロテアーゼを阻害するために使用されます。 - 2回の凍結融解サイクル(-80°C)の後、冷たいプラスチックセルスクレーパーを使用して細胞を掻きます。マイクロフュージチューブで細胞のライサットを収集します。次いで、チューブを200xgで遠心分離し、4°Cで30分間使用します。
- きれいなチューブに上清を収集し、氷の上に置きます。製造元のプロトコルに従って、BCAアッセイキットを使用して、ライサテス中の細胞タンパク質の総量を測定します。
-
タイトジャンクションタンパク質ZO-1の検出のためのウェスタンブロッティング
- 95°Cで1x Laemmliバッファーを有する全タンパク質の40 μgを含有する全同質生成物の変性アリクォート、5分、還元6-7.5%のドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)で電気泳動を受ける(90V、積み重ねゲルを介して10分、120Vを介してゲルを溶解)。
注:サンプルや規格をロードするときは、プロセスで井戸を壊さないことに注意して、各レーンにゆっくりと慎重にロードすることを忘れないでください。 - 分離されたタンパク質を、192 mMグリシン、25 mMトリスベース、10%メタノールおよび0.1%SDS(室温で75V、110分)を含むpH 8.5転写バッファーを有するニトロセルロース膜に移す。
注:膜に触れないでください。70%のイソプロパノール洗浄プラスチック鉗子を使用して膜を処理します。ZO-1タンパク質(MW 200 kDa)を膜に正常に伝達するためには、pHは8.3〜8.5程度である必要があります。転送バッファーがそれよりも酸性である場合、転送は行われません。ラダーバンドがまだゲル上に見える場合は、転送時間とSDS濃度を高めるのに役立ちます。 - 0.1%Tween 20(T-TBS)を含むトリス緩衝生理食液を用いて膜を洗浄した後、ブロッキング溶液(1:1 LiCOR-Odysseyブロック:1xトリス緩衝生理食液)を使用して60分間膜を遮断する。
- 慎重に2つのストリップに膜をカットします。2つの一次抗体(ZO-1モノクローナル抗体、希釈、1:900、グリセラルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)抗体、希釈、1:10,000)を4°Cで一晩インキュベートする。次いで、ZO-1およびGAPDH膜をロバ系抗マウスIgG(希釈、1:50,000)でインキュベートする。T-TBSを使用して膜を洗浄した後、16ビットイメージャーで700チャンネルの膜を画像化します。
- 95°Cで1x Laemmliバッファーを有する全タンパク質の40 μgを含有する全同質生成物の変性アリクォート、5分、還元6-7.5%のドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)で電気泳動を受ける(90V、積み重ねゲルを介して10分、120Vを介してゲルを溶解)。
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Representative Results
まず、TJ形成の明らかな運動性を決定するために、LY透過性に対する培養時間の効果を決定した。1 日目から 10 ポストシードまでの平均 LY Pアプリの値を図 2aに示します。1日目の平均Pアプリは4.25 x 10-4 cm/minで、2日目は3.32 x 10-4 cm/minにわずかに低下しました。平均Pアプリの値は3日目に3.93 x 10-4 cm/minにわずかに増加し、6日目まで有意な変化なしで変動しました。Pアプリの値は、おそらく1日目(P< 0.05)と比較して、7日目に2.36 x 10-4 cm/minに大幅に減少しました。Pアプリの値は、7日目から10日目までの2.14 x 10-4と2.36 x 10-4 cm/minの間の範囲で安定化し、バリア形成が完了し、機能的にLY準細胞輸送が減少することを示唆した。パーセンテージ (%)LYは、Ca.80%となる毎日に回収され、Pアプリ値27(Fi gure 2b)を確実に算出するのに最適と考えられる値である。回収%は、LYアッセイにおける重要な指標である。例えば、細胞が最もLYを代謝する場合、LYは細胞内で固定化されるか、またはインキュベーション中に細胞膜またはLYに付着すると、浴場内で観察された低LYシグナルが狭い障壁を示すと解釈することは不正確であろう。したがって、リカバリ%は、上記の1つ以上の可能性のためにLYのかなりの量を失わなかったことをより自信を与え、LY Pアプリの値を自信を持って推定することができます。導入セクションで前述したように、側側のLYの濃度が高いほど不完全な障壁を示し、低濃度は制限された輸送を反映し、機能的な存在による成熟した完全な障壁を示唆するTJSまた、直交技術を用いた追加のエビデンス、ZO-1タンパク質のウェスタンブロッティング検出(図4)を用いて、LY Pアプリの観察された変化がタイトジャンクションの形成と相関することを確認した。
トランスウェルインサートのセットアップでは細胞密度の変化を直接追跡できないため、標準的なトリパンブルー除外アッセイを使用して細胞密度の変化を決定しました。そこで、透明組織培養プレート上の細胞密度の変化を決定し、細胞増殖運動を容易にモニタリングすることができました。細胞密度が5.5±1.0 x 104セル/cm2~1.9±0.9×105細胞/cm2日目から10ポストシード(図3)までの細胞密度の増加は、回帰係数0.94と直線的であった。 これらのデータはまた、LY Pアプリ(図2a)における観察された変化が、10日間にわたってコンフルエント単層の形成の結果であることを示唆している。我々は、毎日反転光顕微鏡下で細胞を観察し、細胞数と単層形成の徐々に増加を視覚的に文書化した。
ウェスタンブロッティングを用いて、タイトジャンクションタンパク質ZO-1の経度変化を検出した(図4)。ZO-1式の変化は、LY Pアプリデータを直交的に補完し、LY Pアプリで観察された変化がタイトなバリアの形成を示すようにするために使用されます。ZO-1バンド強度を密度分析により分析し、ハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現に対して正規化した。図3aの2つのバンドは、2つのZO-1アイソフォーム(ZO-1α+およびZO-1α- 28)を表しています。デンシトメトリー分析では、ZO-1の画素値が3~7日目から増加することが明らかになって、TJタンパク質ZO-1が3~7日目から継続的に形成されたことが示唆された。播種後7日目のカルシウム枯渇処理後、ZO-1のバンドはほとんど検出できず、これは、ZO-1がカルシウムイオンの存在下で形成できなかったことを示している。また、ZO-1の画素値は10日目に顕著に減少した。 3日目から10日目のGAPDHのシグナル強度は、細胞をカルシウム不全培地で処理した7日目を除いて、同等であった。カルシウム処理細胞におけるGAPDH発現が低い理由として考えられるのは、カルシウム枯渇が原因である可能性が高い、総タンパク質(28.9μg総タンパク質)が少ないためである可能性があります。全体として、バンドデンシトメトリー分析は、7日目までZO-1発現(GAPDHに対して)が徐々に増加し、細胞が完全増殖培地で培養した10日目の発現の減少を明らかにした。分析はまた、カルシウムフリー培地で処理された細胞で7日目にZO-1(GAPDHに対して)の低発現を明らかにした。
本研究の焦点は、単層形成の運動性を決定する方法としてLY Pアプリアッセイを提示する一方で、開発されたアッセイのさらなる有用性を実証するために、DNANPトランスフェクションがTJバリアに影響を与えたかどうかを決定した。hCMEC/D3細胞4時間ポストトランスフェクションを介してLY Pアプリを測定することにより、完全性(図5)。ポロクサマーP84を含むDNANは、トランスフェクトしにくいhCMEC/D3細胞株で高レベルの遺伝子発現を媒知します(図6a)。具体的には、DNANP中のポロクサマーP84の疎水性ドメインがトランスフェクト細胞におけるTJの完全性を乱す可能性があるかどうかを調べたいと考えました。各治療群で回収された%LYは92%であり、計算されたPアプリ値が信頼できるものであることを示唆した(図5b)。我々は、様々な製剤を用いるトランスフェクション手順は、LY単独で曝露された非トランスフェクト細胞に対して、LY Pアプリに影響を与えなかったことに留意した。細胞外カルシウムは、脳微細血管内皮細胞を含む様々な細胞型29、30、31における細胞接点の維持に不可欠な成分である。したがって、カルシウムフリー培地(CFM)で細胞を維持すると、TJs32、33の破壊につながる。そこで、24時間CFMで処理した細胞を陽性対照として用いた。
我々のデータは、CFMでインキュベートされた細胞のLY Pアプリが、通常の増殖培地でインキュベートされた対照細胞と比較して2倍高かいことを示している。Pアプリのこの100%の増加は、細胞がその形成に必要なカルシウムイオンの損失のためにTJを失ったことを示唆しています。特に、実際の値(5.14 x 10-4 cm/min)は、TJがまだ完全に形成されていない1-6ポストシード(図2)の平均Pアプリ値よりもわずかに高かった。有意ではないが、0.01-0.03%ポロクサマーP84を含むDNANPをトランスフェクトした細胞は、通常の培養培地で維持される未処理細胞と比較してLY Pアプリ値のわずかな増加を示した。この観察は、DNA NP+ P84トランスフェクションがTJバリア完全性に有意な影響を及ぼさなかったことを示唆した。全体的に、トランスフェクトされた細胞内のLY Pアプリの値は、およそ平均2.5x10-4 cm/minであり、この値は、LY Pアプリが最も少ない日7-10ポストシード(図2)の間に指摘された平均値に対応しました。LY細胞輸送を効果的に制限する機能的TJの存在を示唆する。
LY Pアプリ(図5) の変更の欠如が重要でない観測値ではないことを示すために、追加のトランスフェクション データを提示します。DNA NPs+P84群で観察されたトランスフェクションの高レベルにもかかわらず、我々の製剤がTJバリアを乱さないことを示唆するLY Pアプリの変化は認められなかった。裸のDNA処理細胞におけるトランスフェクション効率が比較的低いのは、プラスミドDNAのアニオン性(その背骨内のリン酸基による)とその親水性性質が細胞の取り込み制限を制限するため、典型的である。DNA NPに凝縮されたDNAは、裸のpDNAと比較してトランスフェクションの50倍の増加を仲介した(図6)。DNA NP に 0.01% P84 を追加すると、DNA NP 単独 (P< 0.01) と比較して 18 倍の増加が得られた。P84濃度を0.03wt.%に増加させた結果、DNA NP単独(P<0.001)と比較して30倍の増加をもたらした。これらの結果は、脳内皮細胞がトランスフェクト細胞型に難しいことを考えると注目に値する。
異なる条件下でトランスフェクトされた細胞の細胞生存率を測定し、トランスフェクション手順が細胞ストレスを引き起こさないことを確認した。アデノシン三リン酸 (ATP) 生命のエネルギー通貨であり、細胞代謝機能を反映します。.ルシフェラーゼベースのATPアッセイを用いたところ、発光値がATPレベルに直接比例する。Possimoらは、発光ATPアッセイが代謝細胞生存率34の堅牢な尺度であると報告した。様々な製剤によってトランスフェクトされたhCMEC/D3細胞の細胞生存率は未処理細胞(図5b)に匹敵し、ATPレベルも同様であったことが示唆された。従って、ポロクサマーP84を含有するDNA(0.01%~0.03%w/w)を含むDNAは、安全な遺伝子送達製剤である。
図 1.LY P の実験的セットアップアプリ研究.トランスウェルインサートを含む24ウェルプレートセットアップ(例としてDNAナノ粒子トランスフェクションを示すように適合し、図5のデータ)。各カラムを4時間の照度で示したサンプルで処理したコントロールは、完全な増殖培地で処理されたhCMEC/D3細胞を示し、カルシウム枯渇24hは、細胞がLY曝露前にカルシウム遊離培地でインキュベートされたことを示す。右のテンプレートは、黒い96ウェルプレートでLY蛍光強度測定を示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.LY Pを用いて決定されたTJバリア形成の明らかな運動学アプリアッセイ.(a)LY Pトランスウェルインサートで培養したhCMEC/D3単層を介したアプリを、播種後細胞を毎日測定した。(b) %LYは、各治療群で回収された。データは、2つの独立した実験(n=3/実験)の平均±SDを表す。統計的な比較は、ペアでないt検定を使用して行われました(*P< 0.05、N.S.は有意ではありません)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.トリパンブルー除外アッセイを用いて決定した細胞増殖の動態。hCMEC/D3細胞を50,000細胞/cm2の細胞密度で24ウェルプレートに播種した。実験の各日に、細胞を解離し、血球計で生存細胞を数える前に0.4%のトリパンブルーと同じ体積で混合した。データは、3つの独立した測定値の平均±SDを表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.ウェスタンブロッティングを用いて検出されたZO-1発現の明らかな運動学。(a) hCMEC/D3細胞を50,000細胞/cm2の細胞密度で12ウェルプレートに播種した。実験の各日(3日目、5日目、7日目および10日目播種)に、細胞を3μg/mLアプロチニンを含む1x RIPAバッファーの400 μLでライズした。全タンパク質の40μgを含む細胞分解物を4-7.5%SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードした。(b) バンドデンシトメトリー分析により、GAPDHに対するZO-1タンパク質の正規化が可能となった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.LY Pを用いて測定したTJバリア締め付けに対するDNANPトランスフェクションの効果アプリアッセイ.(a) hCMEC/D3細胞をトランスウェルインサートで7日間培養し、Pluronic P84を含むgWIZLucプラスミドDNAを含むPEG-DETを4時間トランスフェクトし、50 μM LYを1時間で含む予め温められた輸送バッファーに置き換えた。hCMEC/D3細胞を4時間増殖培地でインキュベートし、続いてLY曝露(n=4、P<0.05、N.S.は有意ではない)。(b)各処置群で回収された%LY、提示される値は平均±SD(n=4)である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.DNA NP は、hCMEC/D3 単層における高レベルのトランスジーン発現を仲介します。(a) hCMEC/D3細胞を7日間培養し、プルロンP84(N/P10、井戸当たりのDNA線量:0.5μg)を含むPEG-DETを含むPEG-DETを4時間、トランスフェクション混合物を除去し、細胞を完全増殖で24時間培養した。遺伝子発現を測定する前に媒体。ルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルは、全細胞タンパク質含有量に対して相対光単位(RLU)として発現した。データは、3つの独立した実験の平均±SDを提示する。統計的比較は、ペアなしのt検定(** P< 0.01、*** P< 0.001)を使用して行われました。(b) DNA NPは、hCMEC/D3単層における安全なトランスフェクション製剤である。DNA DNA NPトランスフェクションが細胞生存率に及ぼす影響を、発光ATPアッセイを用いて評価した。hCMEC/D3細胞を4時間の示されたサンプルでトランスフェクトし、その後、ATPアッセイは製造業者のプロトコルに従って行った。パーセント (%)細胞生存率は、次のように計算した:(トランスフェクト細胞の発光/対照の発光、未処理細胞)x100。データは、2つの独立した実験(n=3/実験)の平均±SDを表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 実験的なセットアップ | サンプル名 | 1mg/mLプラスミドDNAの体積(μL) | 10 mM NaAc バッファーの容積、pH 5(μL) | 5 mg/mL ポリマーの体積 (μL) | P84(μL)の容積10%に関する | 増殖培養量(μL) |
| 組織培養は、 | 制御、未処理細胞 | 0 | 0 | 0 | 0 | 58.3 |
| 裸のDNA | 0.157 | 8.143 | 50 | |||
| DNA NP | 7.843 | 0.3 | ||||
| DNA NP + 0.01%P84 | 7.6681 | 0.1749 | ||||
| DNA NP + 0.03%P84 | 7.26 | 0.0583 | ||||
| 48ウェルプレート | 制御、未処理細胞 | 0 | 0 | 0 | 0 | 175 |
| 裸のDNA | 0.5 | 24.5 | 150 | |||
| DNA NP | 23.56 | 0.94 | ||||
| DNA NP + 0.01%P84 | 23.385 | 0.175 | ||||
| DNA NP + 0.03%P84 | 23.035 | 0.525 | ||||
| 96ウェルプレート | 制御、未処理細胞 | 0 | 0 | 0 | 0 | 68.1 |
| 裸のDNA | 0.195 | 58.4 | ||||
| DNA NP | 9.35 | 0.37 | ||||
| DNA NP + 0.01%P84 | 8.9307 | 0.0681 | ||||
| DNA NP + 0.03%P84 | 9.0669 | 0.2043 |
表 1.報告されたデータを得るために使用されるNP製剤。
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Discussion
BBBの重要な役割は、神経微小環境の無血症を維持するために、全身循環と脳との間の非必須イオンおよび有害物質の交換を防止することです。BBBの特徴の一つは、毛細血管内皮細胞が輸送の準細胞経路を効果的に密封するタイトジャンクション(TJ)を形成する能力である。培養hCMEC/D3単層におけるTJバリア形成の明らかな動態を決定する定量的方法としてのLY Pアプリアッセイを実証した。西洋ブロッティングを介して検出されたZO-1式は、次の段落で詳しく説明したように、LY Pアプリスタディからのデータを検証した。開発されたアッセイのさらなる有用性として、我々はさらに、DNA NPトランスフェクションが実験セットアップにおけるTJバリア特性の変化を決定するために、このアッセイの適合性を示すLY Pアプリを測定可能に変更しないことを実証した。
ウェスタンブロットデータは、3日目、5日目、7ポストシードにおけるZO-1発現の明らかな増加と10ポストシード(図4a)のわずかな減少を明らかにした。図1から、LY PアプリがTJの形成を示唆する1日目から7日目の播種後から減少したことが分かる。カルシウム枯渇処理後、LY Pアプリは顕著な増加を示し(図2a)、ZO-1発現は顕著な減少を示した(図4a)。細胞外カルシウムは、脳微細血管内皮細胞を含む様々な細胞型29、30、31における細胞接点の維持に不可欠な成分である。成長培地中のカルシウムの欠乏は、TJs33を破壊し、解離した。予想通り、カルシウム枯渇細胞のPアプリ値は未処理細胞よりも有意に高く、細胞を含まないブランクインサートのPアプリ値に近い(図2a)。LYは、7日目からPアプリの値で安定した高原を明らかにしました (図2a)7日目までにバリアが完全に形成され、その結果、腹側へのLY輸送が制限されたことが示唆されました。ウェスタンブロットデータは、7日目の播種と比較して、10日目のZO-1発現のわずかな減少を示した。この観察の違いは、ZO-1を除く他の細胞外タンパク質の寄与がバリア締め付けの維持に寄与しているためと考えられる。要約すると、我々はBBBのヒト細胞モデルにおけるタイトな接合バリア形成の動態を決定するために、2つの直交技術からのデータを使用することに成功した。LY PアプリアッセイはTJバリアの機能を測定したが、ウェスタンブロットデータはマーカータンパク質としてZO-1を用いてTJの形成を追跡した。
開発されたアッセイの追加の有用性として、hCMEC/D3単層におけるDNA NPトランスフェクションがTJsの完全性に影響を及ぼさないことを確認した(図5)。増殖培地でインキュベートした未処理細胞は、24時間カルシウム遊培地で予めインキュベートした陰性対照および細胞として用いた、陽性対照として用いた。カルシウム枯渇の結果TJが破壊された細胞は、未処理細胞と比較してLY Pアプリで210%増加した。我々のデータは、P84の有無のDNANPトランスフェクションがTJの完全性に影響を与えないことを示唆している。トランスフェクト細胞におけるLY Pアプリの変化の欠如は、重要な観察ではないことに留意すべきである。実際、我々のDNADNAは、トランスフェクトしにくいhCMEC/D3単層9、35、36、37における有意なレベルの遺伝子発現を媒次的に媒次的に調べている。0.01または0.03 wt. % P84を含むDNADNAは、DNAN単独と比較して、それぞれ18倍および30倍のルシフェラーゼ遺伝子発現を増加させた(図6a)。我々はまた、我々のNP治療が細胞ATPレベルに悪影響を及ぼさないことを実証し、ここで機能性細胞生存率の指標として使用する(図6b)。我々の結果は、実験的なトランスフェクションセットアップにおけるTJバリア完全性を決定するために、このLY Pアプリアッセイの拡張された有用性を強調する。
LYアッセイの実行における重要なステップの1つは、実験全体の様々な時点にわたって、同じ量のLYを頂点側に保ち、バソ側側の輸送バッファーの量を同じ量に保つことです。異なる量のLYまたは不等量のトランスポートバッファが井戸で使用された場合、Pアプリの計算は信頼性が低く、人為的に大きな標準偏差が生じます。もう一つの重要な側面は、LY蛍光強度の減衰を最小限に抑えるために光暴露を制限することです。また、液体は、それぞれ頂点側と側側に全く同じ量のLY溶液と輸送バッファーを追加する前に完全に除去する必要があります。これにより、蛍光読み出しを Pアプリの計算に確実に使用できます。この実験のもう一つの重要なステップは、直ちに浴場サンプルのLY蛍光を測定し、採取後にサンプルを凍結する必要性を回避することです。LY含有サンプルを凍結解凍サイクルに応じると、蛍光シグナルのグループ内変動が大きくなります。トランスウェルセットアップを使用する1つの制限は、従来の顕微鏡検査で生細胞を視覚化したり、共焦点顕微鏡で画像化することが困難である。また、グリア細胞と内皮細胞を混合しない限り、異なる細胞型を共培養できるセットアップに容易に変換することは容易ではない。それにもかかわらず、LYアッセイには次のような利点があります:LYは、明確な励起/放出ピークを有する染料であり、フルオレセインナトリウムのような染料と比較して比較的大きなストークスシフトであり、BBBを横断するプローブの堅牢な測定を可能にし、回避します。スクロースやマンニトールなどのトレーサーの場合のように追加のラジオラベルの必要性。LY の高い回復 %s は、Pアプリの値を自信を持って計算するための信頼性の高いデータを提供します。
我々の知見に基づいて、LY Pアプリ法はhCMEC/D3細胞単層にわたって細胞細胞透過性を定量化するシンプルで堅牢なアッセイであると結論付けた。LY Pアプリ法を用いて、無傷のバリア形成のための培養時間を最適化し、DNANPトランスフェクト細胞単層におけるTJ整合性を決定することにより、開発されたアッセイのさらなる有用性を実証した。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、米国薬学会の2017年新研究者賞、デュケイン大学のハンケル恐れ病賞、マニッカム研究所の薬学部のスタートアップファンドからの財政的支援に感謝しています。私たちは、リーク研究所(デュケスネ大学)の西洋のブロッティング支援とオデッセイ16ビットイメージャーの使用を許可してくれたことに感謝します。また、カンダルプ・デイブ(マニッカム研究所)に対する感謝の気持ちを、西洋のブロッティングの助けを借りておきたい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
References
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